乙肝肝硬化患者腸道微生物宏基因組學(xué)的研究縮略詞表

縮略詞表

英文縮寫英文全稱

BMIBodyMassIndex身體質(zhì)量指數(shù)

BSHBilesalthydrolase膽酸鹽水解酶

ClustersofOrthologousGroupsof

COG蛋白質(zhì)直系同源簇

proteins

CTLscytotoxicTlymphocytes細(xì)胞毒素T淋巴細(xì)胞

ECEnzymeCommission酶學(xué)委員會(huì)

EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸

KyotoEncyclopediaofGenesand京都基因和基因組百科

K匕GG

Genomes全書美國國立生物技

術(shù)信息中心

NationalCenterforBiotechnology

NCRI

Information

PBMCPeripheralBloodMononuclearCell外周血單核細(xì)胞

PCAPrincipleComponentAnalysis主成分分析

PVPPPolyvinylpyrrolidone聚乙烯聚此咯烷酮

SBSSequencingbysynthesis邊合成邊測序

ShortOligonucleotideAlignment

SOAP短寡核甘酸組裝程序

Program

乙肝肝硬化患者腸道微生物宏基因組學(xué)的研究中文摘要

摘要

人體作為一個(gè)超個(gè)體，其生理健康不僅會(huì)受到外界環(huán)境與自身基因的影

響，也會(huì)受到機(jī)體自身寄居微生物的影響。人體內(nèi)的微生物組可以看做是一

個(gè)虛擬的器官，執(zhí)行著機(jī)體的多種代謝功能。而人體大部分的細(xì)菌是寄居在

腸道的，腸道微生物基因組被譽(yù)為人類的“第二基因組”。

正常成年人結(jié)腸內(nèi)pH在5.5?7.0之間，并且腸道菌群結(jié)構(gòu)趨于近似，擬

桿菌屬占腸道菌群30%,而腸桿菌屬和腸球菌屬的含量少于1%。腸道中的專

性厭氧菌本身對于維持腸道菌群結(jié)構(gòu)的平衡起著至關(guān)重要的作用，專性厭氧

菌作為腸道中的菌膜屏障，主要通過兩種途徑來阻止腸道潛在致病菌（通常

為兼性厭氧或需氧菌）及毒素在腸上皮細(xì)胞的粘附，其一，通過與腸上皮細(xì)

胞緊密結(jié)合，占據(jù)空間；其二，通過競爭營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物，降

低腸道pHo

據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)顯示，全球每年約有60萬人死于慢性HBV感染。

截止至2010年，中國有1.2億人感染HBV。HBV侵襲肝臟后在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)

制，從根本上損害肝臟功能，其誘導(dǎo)的機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答會(huì)產(chǎn)生兩種效果:

殺死肝細(xì)胞和清除HBV病毒，經(jīng)過數(shù)年的遷延，發(fā)展為肝硬化。在我國，

肝硬化患者中血清HBVDNA陽性率高達(dá)76.7%o

肝硬化主要從以下三個(gè)方面影響腸道微環(huán)境：（1）門脈高壓，導(dǎo)致靜脈

回流受阻，胃腸道淤血，組織水腫，胃腸蠕動(dòng)減慢，進(jìn)一步引起腸道通透性

增加，pH值改變；（2）肝功能受損，導(dǎo)致膽汁酸分泌減少、對內(nèi)毒素的清除

能力下降等，影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)和代謝；（3）宿主抵抗力降低。以上三個(gè)

因素共同作用，導(dǎo)致腸道微環(huán)境改變，腸道菌群失調(diào)。而在此影響下，乙肝

肝硬化患者腸道中具體發(fā)生了怎樣的改變，目前還沒有一個(gè)完整準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)。

宏基因組學(xué)的研究方法具有明顯的優(yōu)勢，是解決這一問題的一個(gè)很好的

方法。宏基因組學(xué)是指直接提取環(huán)境樣品中的宏基因組進(jìn)行高通量測序和生

物信息學(xué)分析。傳統(tǒng)微生物學(xué)以及微生物基因組學(xué)都是以可培養(yǎng)的微生物克

隆產(chǎn)物為基礎(chǔ)的，而目前自然界中有大于99%的細(xì)菌在實(shí)驗(yàn)室無法檢出，培

養(yǎng)的局限性使人們錯(cuò)過了捕捉眾多微生物多樣性的機(jī)會(huì)。由于宏基因組學(xué)

可以揭示先前隱藏在微環(huán)境中的物種多樣性，是理解整個(gè)生命世界的一次

改革，使人們在觀察微生物世界時(shí)擁有更為寬廣的視野。宏基因組學(xué)研究

的測序數(shù)據(jù)龐大而且復(fù)雜，包含代表著10,000個(gè)物種的DNA片段。從如此

龐大復(fù)雜的數(shù)據(jù)中收集、提取有用的生物學(xué)信息無疑向研究者提出了很大

的挑戰(zhàn)。

2

乙肝肝硬化患者腸道微生物宏基因組學(xué)的研究中文摘要

因此，本課題首次利用宏基因組學(xué)的方法分析了乙肝肝硬化患者的腸道

菌群結(jié)構(gòu)變化及功能代謝變化。選取16例乙肝肝硬化患者作為病例組，20

例健康人作為對照組，分別來自于中國人民解放軍302醫(yī)院消化科的病人和

病人的家屬。研究對象均為40-60歲，身體質(zhì)量指數(shù)在18.5-24.9kgm-2

之間，無明顯的飲食偏好。病例組要求患者血清HBVDNA陽性，肝組織

學(xué)上存在彌漫性纖維化及假小葉形成，臨床診斷為乙肝后肝硬化，無并發(fā)

癥，無結(jié)腸炎等胃腸道疾病，無其它感染性疾病。要求乙肝肝硬化患者和

正常人在留取腸道糞便樣品的前一周未服用抗生素、類固醇等激素、中草藥

制劑（包括口服，肌肉注射或靜脈注射），未服用微生態(tài)制劑或酸奶等益生

菌。提取病例組和對照組的腸道微生物宏基因組DNA,進(jìn)行高通量Solexa

測序，并對測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括稀釋分析，主成分分析，

顯著差異基因的物種注釋，eggNOG功能注釋，KEGG代謝通路的注釋及分

析等。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，乙肝肝硬化患者腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，

主要表現(xiàn)為擬桿菌屬顯著減少（尸＜0.05）,韋榮氏球菌屬和腸桿菌科顯著增加

（尸＜0.05）,另外，乙肝肝硬化患者腸道微生物的功能代謝發(fā)生改變，與氨基

酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、無機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、次級代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、能

量及異生物質(zhì)的代謝等功能相關(guān)的基因相對豐度顯著增加（尸＜0.01）,而與細(xì)

胞壁/膜的生物起源、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、復(fù)制、重組和修復(fù)等功能相關(guān)的基因相

對豐度顯著減少（P＜0.05）,膽汁酸代謝分析發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者腸道微生物中

次級膽汁酸代謝通路相關(guān)的基因相對豐度顯著減少（尸=0.013）。

初級膽汁酸在肝臟中合成，隨膽汁進(jìn)入腸道，在膽酸鹽水解酶的解離和

脫羥基作用下分解為次級膽汁酸。擬桿菌屬產(chǎn)生膽酸鹽水解酶，而膽酸鹽水

解酶介導(dǎo)的解離和脫羥基作用為擬桿菌屬提供碳源、氮源和能量來源，二者

相互依存，一方減少，另一方也隨之削弱。

腸道中的膽鹽達(dá)到一定濃度后會(huì)聚合成極性微膠粒，腸道中的脂肪酸、

甘油一酯等代謝產(chǎn)物與微膠粒結(jié)合被運(yùn)載到腸粘膜表面而被吸收。韋榮氏球

菌屬會(huì)水解聚合的膽鹽，阻礙微膠粒形成。乙肝肝硬化患者腸道中韋榮氏球

菌屬顯著增加，因此微膠粒合成受阻，膽汁滯留，膽道部分阻塞，從而加重

肝硬化。

有研究表明，韋榮氏球菌屬和腸桿菌科通常在人體空腸分離物中檢測到，

而它們在肝硬化患者結(jié)腸中的顯著增加，可能是細(xì)菌易位的結(jié)果。韋榮氏球

菌屬和腸桿菌科均為革蘭氏陰性細(xì)菌，可以產(chǎn)生內(nèi)毒素。在正常人當(dāng)中，由

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乙肝肝硬化患者腸道微生物宏基因組學(xué)的研究中文摘要

于肝臟Kupffer細(xì)胞的清除功能，內(nèi)毒素在血液中的含量極其微弱，小于

0.1EU/mL不會(huì)形成內(nèi)毒素血癥影響到正常人的身體健康。而肝硬化患者肝臟

清除功能降低，門-體側(cè)枝循環(huán)形成，門脈高壓導(dǎo)致腸壁水腫和通透性增加，

在這些因素的共同作用下，內(nèi)毒素入血增加。一方面，內(nèi)毒素會(huì)誘導(dǎo)一些細(xì)

胞因子（如TNF,IL-1和IL-6）的分泌，這些細(xì)胞因子會(huì)引起細(xì)胞外基質(zhì)的

合成和降解異常，從而促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)程。另一方面，腸道中韋榮氏球菌

屬和腸桿菌科過度繁殖，產(chǎn)生的過量內(nèi)毒素會(huì)抑制腸上皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成,

因此腸壁屏障受損，進(jìn)一步威脅到腸道微環(huán)境，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)。另外，

內(nèi)毒素抑制腸上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，從而改變腸壁上的載體錨定點(diǎn)，導(dǎo)致

氨基酸和碳水化合物等物質(zhì)在運(yùn)輸過程中出現(xiàn)異?；蛉毕?。

乙肝肝硬化患者腸道微生物富集物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝功能相關(guān)的基因，而缺

失細(xì)菌周期相關(guān)的基因。由此推測，由于門脈高壓，肝功能障礙，宿主抵抗

力降低等因素共同作用，腸道微環(huán)境發(fā)生改變，對腸道菌群的生長造成了一

個(gè)逆環(huán)境，在這種壓力條件下，促進(jìn)了一些腸道菌群對物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的作

用加強(qiáng)，形成更為廣泛的代謝途徑。

本課題首次從一個(gè)綜合的角度和寬廣的視野向人們展現(xiàn)了肝硬化患者腸

道微環(huán)境的變化，并發(fā)現(xiàn)肝硬化與腸道菌群失調(diào)之間存在多個(gè)惡性循環(huán)，肝

硬化患者的微生態(tài)治療對于疾病的預(yù)后至關(guān)重要。

關(guān)鍵詞：宏基因組學(xué)；擬桿菌屬；韋榮氏球菌屬；乙肝肝硬化；膽酸鹽水解

酶

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乙肝肝硬化患者腸道微生物宏基因組學(xué)的研究英文摘要

HumanGutMicrobiomeAssociatedwithHepatitisBLiver

Cirrhosis

Abstract

Asasuperorganism,human9sphysicalhealthisaffectednotonlybyexternal

environmentandautologousgenes,butalsobyalienmicrobial.Microbiome

sojournwithhuman,regardedasavirtualorgan,carriesoutvariousmetabolic

functions.Mostbacteriaaredwellsinthegut,andthegutmicrobiomeishoumed

ashuman'ssecondgenome.

ThecolonpHofnormalindividualsis6.5?7.5,andtheintestinal

microbiomecompositiontendstoapproximate,asshownbyBacteroidesspp.

accountingfor50%,whereasEnterobacterandEnterococcusspp.lessthan1%.As

acrediblebacteriabarrier,theobligateanaerobesplayanimportantrolein

maintainingtheintestinalmicrobiomecompositionbalance.Ontheonehand,the

intestinalobligateanaerobestightlyadheretotheenterocytetopreventpotential

pathogenicbacteriaintegratingwithenterocyte;ontheotherhand,intestinal

obligateanaerobesinhibitpotentialpathogenicbacteriaadheringtoenterocyte

throughstrivingfornutrimentfollowedbyproducingacidmetaboliteandreducing

intestinalpH.

AsreportedbyWorldHealthOrganism,about600,000peoplediedrelatedto

chronicHBVinfectioneveryyearintheworld.By2010,Chinahas120million

peoplewereinfectedwithHBV.Aferinvadeintoliver,HBVcanreproduceinthe

livercellsandfurtherinduceadaptiveimmuneresponse,whichwillproducetwo

effects:killinglivercellsandclearingHBV,leadingtolivercirrhosisoverseveral

years.ChinahasahighserumHBVDNApositiverateof76.7%amongpatients

withlivercirrhosis.

Themainclinicalsyndromesofcirrhosisareportalhypertension,liver

functionimpairmentandresisitancereductioninhuman.Portalhypertensionwill

leadtogastrointestinalstasis,edema,stomachandintestineslowdown,intestinal

permeabilityincrease,thentheintestinalpHchangesandintestinalmicrobes

crypticforms.Theimpairedliverfunctionisacrucialreasonofthereduced

secretionofbileandbileacids,aswellasthedecreasedabilityforliver

detoxification.Takentogether,alltheseconfoundingfactorsareresponsibleforthe

changesinintestinalmicro-environmentandmicrobialcommunityimbalance.

Microbesinthehumangutundergoselectivepressurefromlivercirrhosis,yetits

specificcircumstancesandmolecularmechanismsintheintestinalmicrobial

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乙肝肝硬化患者腸道微生物宏基因組學(xué)的研究英文摘要

communityremainobscure,highlightingtheimportanceofametagenomic

analysistounderstandmicrobialcommunitiesundertheinfluenceofliver

cirrhosis.

Metagenomicsisastudyofthemetagenome,extracteddirectlyfrom

environmentalsamples,processedwithhigh-throughputsequencingand

bioinformationanalysis.BothTraditionalmicrobiologyandmicrobegenomicsare

basedonmicrobecloningproductsandvariousmicrobialdiversitiesaremissed

duetotheculturedlimitations.Atpresent,morethan99%bacteriacan'tbe

culturedanddetectedinlab.Becauseofitsabilitytodisclosurethespecies

diversityhiddeninmicro-environmentpreviously,metagenomics,asarevolution

forunderstandingthewholelivingworld,provideawiderviewforustoobserve

microbialworld.Collectingandextractingvaluableinformationfromenormous

andcomplicateddataundoubtedlyrepresentasignificantchallengeforresearchers.

Herewepresentthefirstmetagenomicresearchontheintestinalbacterial

communitiesfrompatientswithhepatitisBlivercirrhosis.Thirty-sixfaecal

samples(sixteenpatientswithhepatitisBcirrhosisandtwentynormalindividuals,

respectivelyfromGastroenterologydeptof302HospitalofPLAandthepatients9

familymembers),40~60yearsold,withabodymassindex(BMI)=18.5~24.9

kgm-2,andwithoutfoodpreferences,wereselectedforthisstudy.Patientshad

positiveserumHBVDNA,liverdiffusefibrosisandfalselobulesformationfound

byhistologyandnocomplications,othergastrointestinaldiseasesormetabolic

diseases.TheChild-Pughscoringsystemwasusedtoassesstheprognosisof

cirrhosis.Allhealthysubjectshadnormalliverbiochemistrytestswithoutevidence

ofhepaticorotherdiseases.Noneofthesubjectshadreceivedantibiotics,

probiotics,steroidsorotherhormones(includingoral,intramuscularorintravenous

injection)fbratleastoneweekbeforesampling.Patientsandnormalindividuals

wereeachaskedtoprovideafrozenfreshstoolsample,andmicrobiota

metagenomeswereextractedimmediately.Metagenomesweresubjectedto

high-throughputSolexasequencingandbioinformationanalysis,including

rarefactionanalysis,principalcomponentanalysis,speciesannotation,eggNOG

functionannotation,KEGGpathwayannotationofsignificantgenes,andsoon.

OurstudysuggestedthatthefaecalmicrobiotaofpatientswithhepatitisB

cirrhosiscontainsamarkedabsenceofBacteroides(P<0.05)andenrichmentof

Veillonella(P<0.05)andEnterohacteriaceae(P<0.05).Functionaland

metabolicanalysisshoewedthatpatientswithcirrhosishadasignificant

enrichmentofgenesannotatedtoaminoacidtransportandmetabolism,

inorganicionstransportandmetabolism,secondarymetabolitetransportand

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乙肝肝硬化患者腸道微生物宏基因組學(xué)的研究英文摘要

metabolism,energymetabolism,xenobioticmetabolism(P<0,01),aswellasa

significantabsenceofgenesannotatedtocellwall/membranebiogenesis,signal

transductionmechanism,reproduction,recombinationandrepair(P<0.05).Bile

acidmetabolismanalysisshowedthatpatientswithlivercirrhosishadasignificant

absenceofBSHs(P=0.013).

Primarybileacid,producedinliver,flowedintointestinewithbile,andbroke

downtosecondarybileacidintheroleofBSH.BacteroidesproduceBSH,and

BSH-mediateddissociationroleprovidescarbon,nitrogen,sulfursourceandenergy

forBacteroides.Soonreduces,theotheroneweakens.

Sodiumcholate,duetoitsmolecularstructurecharacteristics,canaggregate

toformmicelleswhenreachesacertainconcentrationandVeillonellaspp.can

hydrolyzeconjugatedbilesaltsandpromotethebilestranded,whichwillleadto

bileductobstructionandaggravatelivercirrhosis.

Thedisorderedintestinalmicrobialcommunitystructureinpatientsimplied

thedecreasedintestinalwallresistanceandchangedintestinalmicro-environment,

whichisconducivetobacteriagrowthduetothereducedsecretionofantibodies

(suchasIgA),lysozyme,andmucusanddestructedacid-basebalanceunderthe

influenceoflivercirrhosis.Additionally,thereducedintestinalbloodperfusion,

mesentericischemiaanddecreasedbowelmovementscausedbylivercirrhosis

giverisetoasignificantincreaseofopportunisticpathogenssuchasgram-negative

aerobicandfacultativeanaerobicEnterobacteriaceaeandanaerobicbacilli

Veillonella.ThesignificantenrichmentofVeillonellaandEnterobacteriaceae.

whichusuallyisolatedfromjejunaseparatorofhealthyadults,incolonfrom

patientswithlivercirrhosismightbetheresultofbacteriatranslocation.

Lipopolysaccharide(LPS),partoftheoutermembraneofgram-negative

bacteriaVeillonellaandEnterobacteriaceae.istheprototypicalformofendotoxin

anditsabilitytocausediseasehasbeenconfirmed.Gram-negativebacteriarelease

endotoxinduringactivecellgrowth,autolysis,orexternallysismediatedby

complementandlysozyme,andphagocyticdigestionofbacterialcells.Immune

dysfunction,inhibitedKupffercellsfunctionandtheformationofcollateral

circulationcausedbylivercirrhosisarehighlyresponsiblefbrthedecreasedability

ofendotoxinclearance,andhighconcentrationsofintestinalendotoxinenterinto

systemiccirculation.LPSbindstothelipid-bindingprotein(LBP)inhumanserum,

andtriggersincreasedsecretionofsomepro-inflammatorycytokines(suchasTNF,

IL-1andIL-6),contributingtothepathophysiologyofliverfibrosisandcirrhosis.

Also,excessendotoxinwillinhibittheintestinalepithelialsynthesis,sothe

intestinalcellbarrierisdamaged,whichwillfurthermaketheintestinalmicrobes

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乙肝肝硬化患者腸道微生物宏基因組學(xué)的研究英文摘要

imbalanced.Theinhibitionofintestinalepithelialsynthesiscausedbyexcess

endotoxinwillalsomakethecarrieranchorpointchanged,leadingtothedefection

ofaminoacidandcarbohydratetransportion.

PatientswithhepatitisBlivercirrhosishadasignificantenrichmentofgenes

annotatedtothefunctionoftransportandmetabolism,andabsenceofgenes

annotatedtocellcircle.Intestinalmicrohabitatofpatientschangedunderthe

influenceofportalhypertension,arrestedliverfunctionandhostresistance

declining,creatinganinverseenvironmenttotheintestinalmicrobiota

development,andpromotingtheformationofmoreextensivemetabolicpathway.

Herewepresentthefirstmetagenomicresearchontheintestinalbacterial

communitiesfrompatientswithhepatitisBlivercirrhosis.Indeed,intestinal

microbiomeactsasavirtualsysteminhumanandregulatesthebody'smetabolic

balancebygeneadjustmentandmicrobesrestructuring,whichareimportantinthe

diseaseprognosis,andthisiscurrentlyunderinvestigation.

Keywords：Metagenomics;Bacteroides\Veillonella;hepatitisBlivercirrhosis;

bilesalthydrolases

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乙肝肝硬化患者腸道微生物宏基因組學(xué)的研究前言

_2_￡__

月II三

人體的生理健康狀態(tài)受到環(huán)境與基因的雙重影響，而基因不僅僅是指人

自身的基因，還包括機(jī)體內(nèi)大量共生細(xì)菌的基因。人體的大部分細(xì)菌是寄居

在腸道的，腸道微生物群落與人自身存在著互惠共生的密切關(guān)系，并與人體

的健康息息相關(guān)比久腸道細(xì)菌的基因如此重要，2010年，QinJ兇等人將其

命名為人類的“第二基因組”。當(dāng)宿主處于健康狀態(tài)下時(shí)，腸道菌群亦處

于平衡狀態(tài)，而當(dāng)宿主受到疾病侵襲時(shí)，腸道菌群失調(diào)、紊亂，通常表現(xiàn)

為一些需氧菌（如腸桿菌、腸球菌和變形桿菌等）及梭狀芽胞桿菌的顯著

增加，同時(shí)，作為有益種群的雙歧桿菌、乳桿菌顯著減少，而在疾病恢復(fù)

期，處于失調(diào)、紊亂狀態(tài)的腸道菌群難以在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)平衡，因此造成

病情的拖延、加重，甚至惡化，對宿主健康產(chǎn)生惡劣影響。

HBV感染在亞洲和非洲的部分國家蔓延，約1/3的世界人口在他們生命中

的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)被HBV感染。2004年，全世界約有3.5億人感染HBV,傳播途徑

包括垂直傳播（母嬰傳播）和水平傳播（咬傷、性接觸、濫用藥物）。一定

地區(qū)內(nèi)HBV的主要傳播途徑會(huì)影響到慢性HBV感染的流行性。在美國大陸和

西歐等低流行區(qū)，低于2%的人群有慢性HBV感染，濫用藥物和不安全性行為

是主要傳播途徑；在東歐、俄羅斯、日本等中流行區(qū)，約2%?7%的人群有慢

性HBV感染，在兒童之間顯著蔓延；在中國和東南亞等高流行區(qū)，大于8%的

人群有慢性HBV感染，母嬰傳播是最主要的傳播途徑，而同樣是高流行區(qū)的

非洲I，HBV在兒童間的傳播極為顯著。截止至2010年，中國有1.2億人感染HBV,

其次是印度和印度尼西亞，分別是4000萬和1200萬人存在慢性感染。據(jù)世界

衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)顯示，每年約有60萬人死于慢性HBV感染。

慢性HBV感染可能沒有任何臨床癥狀，也可能表現(xiàn)為慢性肝炎，幾年之

后發(fā)展為肝硬化。HBV的感染很大程度上也增加了肝癌的發(fā)病率。HBV通過

病毒表面抗原的preS區(qū)域與宿主細(xì)胞相結(jié)合（然而HBV的受體目前尚不清楚），

進(jìn)而通過內(nèi)吞作用內(nèi)化，HBV通過在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制從根本上損害肝臟功能，

HBV-preS特異的受體在肝細(xì)胞表達(dá)，機(jī)體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，尤其是病毒

特異的細(xì)胞毒素T淋巴細(xì)胞（cytotoxicTlymphocytes,CTLs）會(huì)殺死HBV感

染相關(guān)的大部分肝細(xì)胞，并產(chǎn)生抗病毒細(xì)胞因子清除HBV感染。經(jīng)過數(shù)年的

病情遷延，正常的肝臟組織被纖維組織、瘢痕組織和再生結(jié)節(jié)所替代，導(dǎo)致

肝硬化，并且肝臟功能受損。在我國，肝硬化患者血清中HBVDNA陽性率高

達(dá)76.7%。肝硬化通常是不可逆的，其嚴(yán)重性與病因無關(guān)，而與肝功能障礙相

9

乙肝肝硬化患者腸道微生物宏基因組學(xué)的研究前言

關(guān)⑷，治療原則主要集中于阻止病情的進(jìn)展和并發(fā)癥的發(fā)生。肝硬化的病理學(xué)

標(biāo)志是瘢痕組織替代了正常的肝臟軟組織，門脈高壓，

阻止血流通過肝臟，導(dǎo)致胃腸道淤血，組織水腫，胃腸蠕動(dòng)減慢，腸道通透

性增加，同時(shí)，肝功能損害導(dǎo)致對內(nèi)毒素的清除功能下降，膽汁和膽酸分泌

減少⑸，腸道微生物的代謝受到影響，再加上宿主防御能力降低，多種因素共

同作用，導(dǎo)致腸腔內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，腸道菌群失調(diào)。

以往對于肝硬化引起腸道菌群改變的認(rèn)識(shí)不夠完整，并且沒有功能及代

謝等方面的分析，而宏基因組學(xué)的研究方法可以幫助人們從宏觀、整體的角

度了解乙肝后肝硬化患者腸道中菌群結(jié)構(gòu)的改變以及功能代謝方面的變化。

宏基因組學(xué)研究是指直接提取環(huán)境樣品中的宏基因組進(jìn)行高通量測序和

生物信息學(xué)分析。傳統(tǒng)微生物學(xué)以及微生物基因組學(xué)都是以可培養(yǎng)的微生物

克隆產(chǎn)物為基礎(chǔ)的，而目前自然界中大于99%的細(xì)菌在實(shí)驗(yàn)室無法檢出，培

養(yǎng)的局限性使人們錯(cuò)過了捕捉眾多微生物多樣性的機(jī)會(huì)。而宏基因組學(xué)可

以揭示先前隱藏在微環(huán)境中的物種多樣性，是理解整個(gè)生命世界的一次改

革，為人們觀察微生物世界提供了更為寬廣的視角。首個(gè)宏基因組學(xué)的高

通量測序是通過巨大并行的454焦磷酸測序法實(shí)現(xiàn)的⑹，另外兩個(gè)用于環(huán)境

樣品宏基因組學(xué)研究的測序技術(shù)是第二代IlluminaGA(GenomeAnalyzer)

和AppliedBiosystemsSOLiD系統(tǒng)⑺。454焦磷酸測序法通常產(chǎn)生100?

200bp的reads,Illumina和SOLiD產(chǎn)生25?75bp的reads181,其產(chǎn)生DNA

片段的長度顯著短于Sanger測序法，后者reads長度約為750bp,然而測序

量的增加則彌補(bǔ)了這一局限性，焦磷酸測序可產(chǎn)生200?500M的堿基，

Illumina測序平臺(tái)可產(chǎn)生20-50G堿基。另外，這些測序技術(shù)的另外一個(gè)優(yōu)

勢是在測序之前無需克隆DNAo

宏基因組學(xué)研究的測序數(shù)據(jù)龐大而且復(fù)雜，包含代表著10,000個(gè)物種

的DNA片段。牛瘤胃宏基因組學(xué)研究測序結(jié)果產(chǎn)生279G堿基對，人類腸

道微生物基因目錄定義了3.3M的基因，是由567.7G的測序數(shù)據(jù)組裝產(chǎn)生

的。從如此龐大復(fù)雜的數(shù)據(jù)集中收集、提取有用的生物學(xué)信息無疑向研究

者提出了很大的挑戰(zhàn)。

比較宏基因組學(xué)研究使人們可以更加深刻的理解復(fù)雜微生物群落的功能

及其對機(jī)體健康的作用，可以在序列組成水平進(jìn)行(比較G+C含量或基因

組大小)，也可以在物種多樣性及功能組成水平進(jìn)行。種群結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)

育多樣性的比較可以基于16S,或其它的系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記基因，而對于低多樣

性的群體，可以進(jìn)行宏基因組數(shù)據(jù)集的基因組重構(gòu)⑶。宏基因組功能比較可

以通過將

10

乙肝肝硬化患者腸道微生物宏基因組學(xué)的研究前言

序列與參考數(shù)據(jù)集（如COG和KEGG）比對,分析各個(gè)類別中基因的相對豐度，

評估顯著性差異口叫這種以基因?yàn)橹行牡难芯糠椒ㄖ攸c(diǎn)在于將微生物群落作

為一個(gè)整體分析其功能，而不是將物種分類分析。已有文獻(xiàn)研究表明，在相

似的環(huán)境中，微生物群落的功能組成相似陰。因此，比較宏基因組學(xué)研究使人

們有能力認(rèn)識(shí)到不同的棲息環(huán)境在微生物群落結(jié)構(gòu)及功能變化中所起的作用。

本研究首次利用宏基因組學(xué)的方法，采用高通量Solexa測序以及生物信

息學(xué)分析，對乙肝肝硬化患者腸道微生物群落結(jié)構(gòu)及功能代謝的變化進(jìn)行

了全面分析。長期連續(xù)的監(jiān)測機(jī)體腸道菌群結(jié)構(gòu)的組成及變化，可以及早

發(fā)現(xiàn)機(jī)體的異常改變，實(shí)現(xiàn)疾病的早期預(yù)測以及對腸道菌群整體結(jié)構(gòu)和功

能的準(zhǔn)確精細(xì)測定，同時(shí)也可以為疾病的腸道微生態(tài)治療提供理論依據(jù)。

11

乙肝肝硬化患者腸道微生物宏基因組學(xué)的研究前言

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12

乙肝肝硬化患者腸道微生物宏基因組學(xué)的研究第一部分

第一部分腸道菌群宏基因組DNA的基因數(shù)據(jù)產(chǎn)出

乙肝肝硬化主要從以下三個(gè)方面影響腸道微環(huán)境：（1）門脈高壓，靜脈

回流受阻，胃腸道淤血，組織水腫，胃腸蠕動(dòng)減慢，進(jìn)一步引起腸道通透性

增加，pH值改變；（2）肝功能受損，導(dǎo)致膽汁酸分泌減少、對內(nèi)毒素的清除

能力下降等，影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)和代謝；（3）宿主抵抗力降低。然而，乙

肝肝硬化患者腸道微環(huán)境具體發(fā)生了怎樣的改變，目前還沒有一個(gè)完整準(zhǔn)確

的認(rèn)識(shí)。宏基因組學(xué)是幫助人們?nèi)嬲J(rèn)識(shí)腸道微環(huán)境的一個(gè)很好的方法，它

不要求物種的分離，而是直接提取環(huán)境樣品中的宏基因組進(jìn)行高通量測序和

生物信息學(xué)分析，使人們從一個(gè)整體、宏觀的角度認(rèn)識(shí)腸道微環(huán)境。

1.1材料與方法

1.1.1實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用到的實(shí)驗(yàn)儀器列于表l-lo

表1-1實(shí)驗(yàn)儀器與耗材

儀器與耗材出產(chǎn)公司

生物安全柜Thermo公司

高壓蒸汽滅菌鍋Sanyo公司

臺(tái)式冷凍離心機(jī)Thermo公司

柜式低溫離心機(jī)6500KuBoTa公司

純水儀Milli-Q公司

臺(tái)式恒溫振蕩器江蘇太倉試驗(yàn)設(shè)備廠

移液器Eppendorf公司

核酸定量儀ND-1000GENE公司

玻璃珠SIGMA公司

濾器(0.22|im)美國PALL公司

13

乙肝肝硬化患者腸道微生物宏基因組學(xué)的研究第一部分

分析電子天平Sartorins公司

核酸電泳儀北京六一儀器廠

凝膠成像儀Bio-Rad公司平

衡磁力攪拌器常州國華電器有限公司

本實(shí)驗(yàn)所用到的實(shí)驗(yàn)試劑列于表1-20

表1-2實(shí)驗(yàn)試劑

試劑名稱出產(chǎn)公司

EDTA國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

Tris-HClAMRESCO公司

溶菌酶AMRESCO公司

蛋白酶KAMRESCO公司

NaCl西隴化工股份有限公司

異硫鼠酸胭SIGMA公司

十二烷基肌氨酸鈉SIGMA公司

冰醋酸北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司

異丙醇國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

無水乙醇國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

RNA酶AMRESCO公司

磷酸國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

PVPPSIGMA公司

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乙肝肝硬化患者腸道微生物宏基因組學(xué)的研究第一部分

醋酸鉀國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

1.1.2實(shí)驗(yàn)步驟

1.1.2.1研究對象的選取

選取乙肝肝硬化患者作為病例組，選取正常成年人作為對照組，分別來

自于中國人民解放軍302醫(yī)院消化科病人和病人的家屬。要求研究對象均

為40~60歲，BMI（BodyMassIndex,身體質(zhì)量指數(shù)）在18.5?24.9kgm2

之間，無明顯的飲食偏好。病例組要求患者血清HBVDNA陽性，肝組織學(xué)

上存在彌漫性纖維化及假小葉形成，臨床診斷為乙肝后肝硬化，無并發(fā)癥,

無結(jié)腸炎等胃腸道疾病，無其它感染性疾病。要求乙肝肝硬化患者和正常

人在留取腸道糞便樣品的前一周未服用抗生素、類固醇等激素、中草藥制劑

（包括口服，肌肉注射或靜脈注射），未服用微生態(tài)制劑或酸奶等益生菌。肝

硬化Child-Pugh評分標(biāo)準(zhǔn)見表l-3o

表1-3肝硬化的Child-Pugh評分標(biāo)準(zhǔn)

臨床生化指標(biāo)

計(jì)分肝性腦病總膽紅素白蛋白凝血酶原時(shí)間

腹水

（分期）（pmol/L）（g/L）延長（秒）

1分無無<34>35<4

2分1-2輕度34-5028-354-6

3分3-4中重度>50<28>6

肝硬化的Child-Pugh分級標(biāo)準(zhǔn)涉及到五項(xiàng)臨床指標(biāo)，分別為：

（1）肝性腦病分期肝性腦病主要是由于血液中有毒物質(zhì)堆積，而受損的肝臟

無法清除造成

的。肝性腦病分為四個(gè)時(shí)期，一期：意識(shí)的輕微缺失，欣快或者焦慮，注意

力持續(xù)時(shí)間縮短；二期：昏睡或者冷漠，時(shí)間或空間判斷上出現(xiàn)輕微障礙，

人格輕微改變，行為障礙；三期：嗜睡，但對于言語刺激有反應(yīng)，明顯的定

向障礙；四期：昏迷，對言語刺激和有害刺激無反應(yīng)。

（2）腹水的有無及嚴(yán)重程度一般情況下，正常人腹腔內(nèi)的液體少于200ml,

超過200ml時(shí)即為腹水。

15

乙肝肝硬化患者腸道微生物宏基因組學(xué)的研究第一部分

輕度腹水為300?500ml,部分患者沒有明顯的不適,僅可通過超聲或CT判斷；

中度為500?3000ml,患者自覺腹脹，可以通過腹部側(cè)面膨脹和移動(dòng)性濁音觀測到;

重度為3000ml以上，顯著可見，患者感到呼吸困難，并伴有下肢腫脹。

（3）總膽紅素

血液中的紅細(xì)胞衰老或被破壞后，血紅蛋白中的亞鐵血紅素在脾臟的網(wǎng)

狀內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間接膽紅素（非結(jié)合型膽紅素），間接膽紅素不溶于水，

與白蛋白結(jié)合被運(yùn)輸?shù)礁闻K。在肝臟葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶的作用下，間接膽紅

素與葡萄糖醛酸結(jié)合，轉(zhuǎn)化為可溶于水的直接膽紅素（結(jié)合型膽紅素），直

接膽紅素和間接膽紅素之和就是總膽紅素。

（4）白蛋白含量血清白蛋白由肝臟合成，是最豐富的血漿蛋白，通常占血漿

蛋白的60%。

正常白蛋白參考值范圍為35?50g/L。肝硬化患者肝功能降低，導(dǎo)致白蛋白合

成受阻，血清白蛋白含量降低。

（5）凝血酶原時(shí)間

正常的凝血酶原時(shí)間為11-13秒。肝硬化患者肝臟功能受損，導(dǎo)致凝血

因子合成受阻，凝血酶原時(shí)間延長。

以上五項(xiàng)得分相加計(jì)算出肝硬化Child-Pugh分級：A級：5?6分，一年

存活率為100%,兩年存活率為85%；B級：7?9分，一年存活率為81%,

兩年存活率為57%；C級：＞10分（包括10分），一年存活率為45%,兩年存活

率為35%。

1.1.2.2腸道菌群宏基因組DNA的提取

乙肝肝硬化患者及正常人留取新鮮的糞便樣品，并在收集后2h內(nèi)送入實(shí)

驗(yàn)室，立即提取宏基因組DNA。

腸道微生物宏基因組DNA提取步驟如下：

（1）細(xì)胞的裂解與破碎

在50ml離心管內(nèi)按如下配方配制裂解液體系：

2.5ml異硫氟酸胭裂解液

5ml5%十二烷基肌氨酸鈉

0.4ml10%十二烷基肌氨酸鈉

0.54mlEDTA

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乙肝肝硬化患者腸道微生物宏基因組學(xué)的研究第一部分

切取糞便樣品(體積約為兩個(gè)黃豆粒大小)加入裂解液體系。

振蕩5min,糞便樣品中加入250口1溶菌酶(100mg/ml),冰上靜止5min。振

蕩5min,冰上靜止5min,重復(fù)3次。

37℃水浴Iho

(2)去除蛋白質(zhì)、細(xì)胞碎片和研磨雜質(zhì)

加入250m蛋白酶K(50mg/ml),37℃水浴lh。

稱取1g玻璃珠(425?600^111)加入樣品中。振蕩5min,冰上靜止5min,重

復(fù)一次。

稱取150mgPVPP加入樣品中，振蕩5min,離心(4℃,lOOOOrpm,lOmin),棄

沉淀，在上清中加入2mlTENPC50mMTris-HCLpH8.0,20mMEDTApH8.0,

lOOmMNaCl,1%PVPP),離心(4℃,lOOOOrpm,30min),棄沉淀，在上清中加

入等體積異丙醇(約10ml),混勻，室溫靜置15min,離心(4℃,lOOOOrpm,

30min),棄上清，在沉淀中加入4.5ml磷酸緩沖液和500ul醋酸鉀，使pH值調(diào)

至中性。4℃過夜，使宏基因組DNA充分析出。

離心(4℃,14000rpm,30min),棄沉淀，上清中加入45ul醋酸鈉和1ml

冰凍無水乙醇，-20℃靜置30min,離心棄上清，依次用70%乙醇(500gl)和

無水乙醇(500g1)清洗沉淀。待乙醇充分揮發(fā)后用適當(dāng)純水溶解DNA。

(3)去除樣品中的RNA

加入28RNA酶(10mg/ml),37度水浴30min。宏基因

組DNA樣品置于-80C儲(chǔ)存。本實(shí)驗(yàn)所需試劑配制方法

如下：磷酸鹽緩沖液：pH8.0,1M

-9.32mLNa2HPO4：14.2gNa2HPO4力口100mLH2O,混勻

-0.68mLNaH2P04：12gNaH2PO4力口100mLH2O,混勻

-90mLH2O

混勻，室溫保存。

EDTA：pH8.0,0.5M

稱取7.306gEDTA于100mL燒杯中，再加入40mLMilliQ滅菌水，

17

乙肝肝硬化患者腸道微生物宏基因組學(xué)的研究第一部分

用熱磁力攪拌器攪拌至完全溶解，待溶液冷卻后，用NaOH調(diào)節(jié)pH

值至8.0,最后定容至50mL。

Tris-HCL：pH8.0,IM

稱取6.05gTris堿于100mL燒杯中，加入40mLMilliQ滅菌水，用

熱磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞芙猓芤豪鋮s后，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至

8.0,最后定容至50mL。

TENP(50mMTris-HCLpH8.0,20mMEDTApH8.0,lOOmMNaCL,1%

PVPP)

-20mLH2O

-1.5mLTris-HCLpH8.0,IM

-1.2mLEDTApH8.0,0.5M

-0.6mLNaCL5M

-0.3gPVPP

定容至30mL,使用0.22gm濾器過濾。

4M異硫氟酸弧

-12.37g異硫氟酸胭(注意有毒)

-13.5mLH2O

-2.6mLTris-HCLpH8.0,IM

攪拌至完全溶解，60?70℃水浴加熱10分鐘后滅菌處理，4℃避光保

存。

NaCL5M

14.6gNaCL加50mLMiHiQ滅菌水，使用0.22pim濾器過濾。

10%十二烷基肌氨酸鈉

2g十二烷基肌氨酸鈉加入20mLMilliQ滅菌水，使用0.22pm濾器過

濾。

5%十二烷基肌氨酸鈉

稱取1g十二烷基肌氨酸鈉加入20mL磷酸鹽緩沖液(pH8.0,1M),

使用0.22gm濾器過濾。

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乙肝肝硬化患者腸道微生物宏基因組學(xué)的研究