分子生物學(xué)第四次課DNA復(fù)制的特點(diǎn)：1.DNA半保留復(fù)制2.半不連續(xù)復(fù)制3.需要引物4.多為雙向等速?gòu)?fù)制5.有一定的復(fù)制起始點(diǎn)6.DNA復(fù)制的保真性分子生物學(xué)第四次課2.DNA復(fù)制的幾種方式(1).線性DNA復(fù)制的方式多數(shù)為雙向復(fù)制，多個(gè)起始位點(diǎn)，復(fù)制叉處有眼狀結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)制眼。分子生物學(xué)第四次課線性DNA復(fù)制子末端復(fù)制1.轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀或多聚分子2.在DNA末端形成發(fā)夾式結(jié)構(gòu)3.在某種蛋白的介入下，在真正的末端復(fù)制4.真核生物線性染色體由端粒酶負(fù)責(zé)新合成鏈5

端RNA引物切除后的填補(bǔ)分子生物學(xué)第四次課

端粒結(jié)構(gòu)3

5

3

5

端粒結(jié)構(gòu)端粒酶是含RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶與細(xì)胞老化有關(guān)端粒（telomeres）：是真核細(xì)胞染色體末端所特有的結(jié)構(gòu)，有許多串（1000串或更多）短的重復(fù)序列組成，通常3′末端鏈?zhǔn)歉缓珿的短序列。端粒酶:含有RNA和蛋白質(zhì)（起DNA聚合酶的作用）兩種組分，RNA分子約150b，含有與重復(fù)端粒結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的一個(gè)片斷，可作為端粒鏈合成的模板。分子生物學(xué)第四次課分子生物學(xué)第四次課(2).環(huán)狀DNA復(fù)制方式A.θ復(fù)制分子生物學(xué)第四次課B.滾環(huán)復(fù)制也叫σ復(fù)制

分子生物學(xué)第四次課C.置換式（Displacementform

）又稱D環(huán)復(fù)制

兩條鏈的合成高度不對(duì)稱,一條鏈迅速合成出互補(bǔ)鏈,另一條則形成游離的單鏈環(huán)(D-環(huán))

線粒體和葉綠體

DNA的復(fù)制方式分子生物學(xué)第四次課DNA復(fù)制的調(diào)控原核生物的調(diào)控，DNA鏈的延伸速度恒定，復(fù)制叉的數(shù)量決定細(xì)胞生長(zhǎng)和增值速度。

ColEI質(zhì)粒DNA的復(fù)制調(diào)控DNA編碼兩個(gè)負(fù)調(diào)控因子，Rop蛋白和反義RNADNA復(fù)制方向起始點(diǎn)RNA前體100200300400500600-500-400-300-200-100RNA1Rop基因Rop蛋白63個(gè)aaRnaseH分子生物學(xué)第四次課真核細(xì)胞DNA的復(fù)制調(diào)控真核細(xì)胞的生活周期分為4個(gè)時(shí)期G1復(fù)制預(yù)備期、S復(fù)制期、G2有絲分裂準(zhǔn)備期、M有絲分裂期真核生物復(fù)制有3個(gè)水平的調(diào)控細(xì)胞生活周期水平調(diào)控，決定細(xì)胞停留在G1期還是進(jìn)入S期染色體水平，決定不同染色體或同一染色體不同部位的復(fù)制子按一定順序起始復(fù)制復(fù)制子水平調(diào)控，決定復(fù)制的起始與否MG1G2S分子生物學(xué)第四次課聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學(xué)技術(shù)典型的PCR由（1）高溫變性（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是：將待擴(kuò)增的模板DNA置高溫下（通常為93℃-94℃）使其變性解成單鏈；人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補(bǔ)結(jié)合，兩個(gè)引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴(kuò)增片段的長(zhǎng)短；耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入，以目的基因?yàn)槟０鍙?’→3’方向延伸

PCR能在（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因擴(kuò)增達(dá)到納克、微克、毫克級(jí)的特異性DNA片段。因此，PCR技術(shù)一經(jīng)問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。它不僅可以用于基因的分離克隆和核苷酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建。分子生物學(xué)第四次課課后復(fù)習(xí)題：DNA半保留復(fù)制DNA的半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制子復(fù)制叉如果細(xì)菌環(huán)狀染色體的復(fù)制是雙向的，并且從固定的復(fù)制起點(diǎn)開始，每個(gè)復(fù)制叉以16um/min的速度移動(dòng)，細(xì)菌染色體長(zhǎng)1280um,完成整個(gè)染色體復(fù)制需要多少時(shí)間？當(dāng)細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基每20min分裂一次，也就是說第一輪復(fù)制尚未完成就開始第二輪復(fù)制，此時(shí)染色體有幾個(gè)復(fù)制叉？分子生物學(xué)第四次課DNA損傷的后果信號(hào)傳導(dǎo)異常長(zhǎng)時(shí)效應(yīng)老化腫瘤疾病DNA修復(fù)機(jī)制短期效應(yīng)異常增生和代謝生理功能紊亂細(xì)胞死亡細(xì)胞增殖減少基因表達(dá)異?；蚪M不穩(wěn)定分子生物學(xué)第四次課五、DNA的修復(fù)DNA修復(fù)系統(tǒng)功能錯(cuò)配修復(fù)恢復(fù)錯(cuò)配堿基切除修復(fù)切除突變的堿基核苷酸切除修復(fù)修復(fù)被破壞的DNADNA直接修復(fù)修復(fù)嘧啶二體或甲基化DNA大腸桿菌中DNA的修復(fù)系統(tǒng)分子生物學(xué)第四次課1.錯(cuò)配修復(fù)大腸桿菌DNA甲基化位點(diǎn)新合成的DNAMis-pairedbases分子生物學(xué)第四次課錯(cuò)配修復(fù)分子生物學(xué)第四次課2.直接修復(fù)紫外線可引起DNA的交聯(lián),DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)。分子生物學(xué)第四次課

DNA紫外線損傷的光復(fù)合酶直接修復(fù)分子生物學(xué)第四次課3.堿基切除修復(fù)指切除和替換由內(nèi)源性化學(xué)物作用產(chǎn)生的DNA堿基損傷,是切除修復(fù)的一種。受損堿基移除是由多個(gè)酶來完成的。主要針對(duì)DNA單鏈斷裂和小的堿基改變及氧化性損傷。分子生物學(xué)第四次課缺失堿基位點(diǎn)DNA糖苷水解酶分子生物學(xué)第四次課BaseExcisionRepair分子生物學(xué)第四次課4.核苷酸切除修復(fù)

體內(nèi)識(shí)別DNA損傷最多的修復(fù)通路

主要修復(fù)扭曲雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA損傷

修復(fù)時(shí)切除含有損傷堿基的那一段DNA。分子生物學(xué)第四次課分子生物學(xué)第四次課分子生物學(xué)第四次課核苷酸切除修復(fù)(基因組修復(fù)–人)分子生物學(xué)第四次課

5.DNA的重組修復(fù)是復(fù)制后的修復(fù)DNA鏈的損傷并未除去一直只存在母鏈上?。∪舾纱笙喈?dāng)于被稀釋。胸腺嘧啶二聚體分子生物學(xué)第四次課

6.SOS修復(fù)

為DNA的損傷所誘導(dǎo)，而產(chǎn)生缺乏校對(duì)功能的DNA聚合酶，它能在DNA損傷部位進(jìn)行復(fù)制而避免了死亡，可是卻帶來了高的突變率（所以會(huì)有2種結(jié)果：修復(fù)或變異（進(jìn)化），這屬于傾向差錯(cuò)的修復(fù)。分子生物學(xué)第四次課1、反向重復(fù)序列與二級(jí)結(jié)構(gòu)

反向重復(fù)序列（invertedrepeatitivesequenceorinvertedrepeatsIR）又稱回文序列（廻文）：指兩段同樣的核苷酸序列同時(shí)存在于一個(gè)分子中，但具有相反的方向.

有時(shí)也有不完全相同的情況RNA和DNA中都可能存在

此外還可有directedrepeatitivesequence---正向重復(fù)序列一些DNA序列的不尋常結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)第四次課C分子生物學(xué)第四次課反向重復(fù)序列間間隔較短或無間隔反向重復(fù)序列間間隔較長(zhǎng)分子生物學(xué)第四次課

*較短的回文序列可能是作為一種信號(hào)

如：限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)一些調(diào)控蛋白的識(shí)別位點(diǎn)

例如限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ的識(shí)別位點(diǎn)

5‘－－GAATTC－－3’3‘－－CTTAAG－－5’分子生物學(xué)第四次課六、轉(zhuǎn)座基因組是相對(duì)穩(wěn)定的，基因組中的序列通常處于恒定的位置。因此，我們可以通過構(gòu)建遺傳圖譜(geneticmap)來鑒定已知基因的基因座。在分子水平上，每個(gè)個(gè)體基因組之間的差異主要由重組引起，但轉(zhuǎn)座元件（transposableelement）或轉(zhuǎn)座子（transposons）的存在也可以造成基因組的改變。分子生物學(xué)第四次課1.轉(zhuǎn)座子的概念及發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子(transposon或transposableelement)是基因組內(nèi)相對(duì)獨(dú)立的、可移動(dòng)序列，它們不必借用噬菌體或質(zhì)粒的形式就可以從基因組的一個(gè)部位直接轉(zhuǎn)移到另一個(gè)部位，這個(gè)過程稱為轉(zhuǎn)座（transposition）轉(zhuǎn)座子每次移動(dòng)時(shí)攜帶著轉(zhuǎn)座必需的基因一起在基因組內(nèi)躍遷，所以轉(zhuǎn)座子又稱跳躍基因（jumpinggene）分子生物學(xué)第四次課轉(zhuǎn)座元件首先是由BarbaraMcClintock于40年代在玉米的遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的，她稱之為控制元件（controllingelement），因?yàn)樗粌H能夠在基因組內(nèi)轉(zhuǎn)移，而且還能夠改變基因的活性并引起功能的改變?，F(xiàn)在認(rèn)為轉(zhuǎn)座子存在于地球上所有的生物。分子生物學(xué)第四次課分子生物學(xué)第四次課2特點(diǎn)：

?轉(zhuǎn)座子是基因組的正常組成成分，不以獨(dú)立的形式存在（如噬菌體或質(zhì)粒DNA）。

?不必借助同源序列就可移動(dòng)的DNA片段，即轉(zhuǎn)座作用與供體和受體之間的序列無關(guān)。

?原核生物和真核生物均有轉(zhuǎn)座子。

?轉(zhuǎn)座序列可沿染色體移動(dòng)，甚至在不同染色體間跳躍。?轉(zhuǎn)座以很低的頻率發(fā)生，而且轉(zhuǎn)座子的插入是隨機(jī)的，分子生物學(xué)第四次課3種類與特征（1）兩種類型：

A

簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子（simpletransposon）或（插入序列insertionsequenceIS）

B

復(fù)合轉(zhuǎn)座子（compositetransposon）

（2）特征：

a）兩端有20～40bp的反向重復(fù)序列(IR)b）具有編碼轉(zhuǎn)座酶（transposase）的基因

c）復(fù)合轉(zhuǎn)座子除轉(zhuǎn)座酶基因外還有1—數(shù)個(gè)基因。

d）轉(zhuǎn)座酶催化轉(zhuǎn)座子插入新位點(diǎn)。分子生物學(xué)第四次課A

插入序列?最簡(jiǎn)單，是細(xì)菌染色體、質(zhì)粒和某些噬菌體的正常組分，是一個(gè)自主的單位，每種IS均編碼自身轉(zhuǎn)座所需的蛋白質(zhì)。?

命名：IS＋編號(hào)（鑒定類型）長(zhǎng)度700～2000bp分子生物學(xué)第四次課每種IS元件具有不同序列，但有共同的組織形式插入序列IS1的結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)第四次課分子生物學(xué)第四次課B

復(fù)合轉(zhuǎn)座子?

表示法：通常以Tn和后面加上數(shù)碼表示，如Tn903。?

結(jié)構(gòu):a.除有轉(zhuǎn)座酶基因外還有其它表型基因，如：抗藥基因，使宿主具表性效應(yīng)。

b.兩側(cè)有重復(fù)序列。

c.有的轉(zhuǎn)座子的重復(fù)順序就是IS。?

功能：和IS一樣可以從一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)座到另一個(gè)位點(diǎn)。分子生物學(xué)第四次課Tn1681大腸桿菌熱穩(wěn)定毒素I基因552bpIRIRIRIR復(fù)合轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)示意圖IS1IS1分子生物學(xué)第四次課a)TnAfamily

l

具有IR、轉(zhuǎn)座酶基因、調(diào)節(jié)基因（解離酶）、抗抗生素基因

2.5kb20kb

Tn3IRTnpATnpRAmpRIR38bp38bp

轉(zhuǎn)座酶

regulatorβ-內(nèi)酰胺酶

?

兩種類型分子生物學(xué)第四次課b）兩端重復(fù)序列為IS的復(fù)合轉(zhuǎn)座子

e.g.IS插入到功能基因兩端，可能形成復(fù)合轉(zhuǎn)座因子

其兩翼往往是兩個(gè)相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某個(gè)功能基因兩端時(shí)就可能產(chǎn)生復(fù)合轉(zhuǎn)座子。一旦形成復(fù)合轉(zhuǎn)座子，IS序列就不能再單獨(dú)移動(dòng)，因?yàn)樗鼈兊墓δ鼙恍揎椓?，只能作為?fù)合體移動(dòng)。分子生物學(xué)第四次課ISISISISLISR臂中心區(qū)臂transposition分子生物學(xué)第四次課?

當(dāng)兩個(gè)IS組件相同時(shí)，其中任一個(gè)都可行使轉(zhuǎn)座功能?

不同時(shí)，主要依靠一個(gè)?

兩側(cè)的IS既可以是IR，又可以是DR狀態(tài)（IR多）分子生物學(xué)第四次課4.轉(zhuǎn)座發(fā)生的機(jī)制轉(zhuǎn)座子插入到一個(gè)新的部位的通常步驟是：在靶DNA上制造一個(gè)交錯(cuò)的切口，然后轉(zhuǎn)座子與突出的單鏈末端相連接，并填充切口。交錯(cuò)末端的產(chǎn)生和填充解釋了在插入部位產(chǎn)生靶DNA正向重復(fù)的原因。鏈的切口之間的交錯(cuò)決定了正向重復(fù)的長(zhǎng)度。分子生物學(xué)第四次課分子生物學(xué)第四次課1）復(fù)制型轉(zhuǎn)座模式（replicativetransposition）

轉(zhuǎn)座子作為可移動(dòng)的元件被復(fù)制，一個(gè)拷貝保留在供體原來的部位不變；另一個(gè)拷貝則插入到受體的位點(diǎn)上，結(jié)果供體和受體都有一個(gè)轉(zhuǎn)座子的拷貝。

需兩種酶：

轉(zhuǎn)座酶(transposase)：作用于靶位點(diǎn)和原來轉(zhuǎn)座子兩端。

解離酶(resolvase)：作用于復(fù)制后的拷貝。分子生物學(xué)第四次課復(fù)制型轉(zhuǎn)座復(fù)制型轉(zhuǎn)座分子生物學(xué)第四次課3）非復(fù)制型轉(zhuǎn)座（nonreplicativetransposition)

轉(zhuǎn)座子從供體一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到受體新位點(diǎn)處，供體

位點(diǎn)留下缺口，受到損傷（嚴(yán)重時(shí)致死）或宿主修復(fù)系

統(tǒng)識(shí)別修復(fù)。

只需轉(zhuǎn)座酶分子生物學(xué)第四次課轉(zhuǎn)座元件作為一個(gè)物理實(shí)體直接由一個(gè)部位轉(zhuǎn)移到另一個(gè)部位。分子生物學(xué)第四次課分子生物學(xué)第四次課除了引起在新部位序列插入的簡(jiǎn)單分子間轉(zhuǎn)座之外，轉(zhuǎn)座子還能促進(jìn)其他類型的DNA重排。任何一對(duì)正向重復(fù)序列之間的重組會(huì)導(dǎo)致它們的序列的缺失；而一對(duì)反向重復(fù)序列之間的交互重組可能使重復(fù)序列之間的序列被倒位，而重復(fù)序列本身被保留。分子生物學(xué)第四次課分子生物學(xué)第四次課分子生物學(xué)第四次課

玉米中的控制因子包括：自主型因子，具有自主剪接和轉(zhuǎn)座的功能非自主性因子，單獨(dú)存在時(shí)很穩(wěn)定，只當(dāng)基因組中存在與非自主性因子同家族的自主性因子時(shí)才具備轉(zhuǎn)座功能。同一家族的自主性因子能為非自主性因子提供轉(zhuǎn)座酶。分子生物學(xué)第四次課玉米中轉(zhuǎn)座子的特點(diǎn)玉米轉(zhuǎn)座子具有典型的IS特征，轉(zhuǎn)座子兩翼有兩個(gè)倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列，在靶DNA插入位點(diǎn)有兩個(gè)短的正向重復(fù)序列。在Ac-Ds體系中：

Ac轉(zhuǎn)座子的兩翼有11bp的倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列，在靶DNA位點(diǎn)復(fù)制形成8bp正向重復(fù)

Ds是Ac轉(zhuǎn)座子的缺失體，但兩端轉(zhuǎn)座序列特征完整，如果細(xì)胞內(nèi)有相應(yīng)的轉(zhuǎn)座酶活性Ds就能恢復(fù)轉(zhuǎn)座性能分子生物學(xué)第四次課玉米轉(zhuǎn)