基因工程的相關(guān)熱點(diǎn)

隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，曾經(jīng)遙不可及的PCR技術(shù)逐步走進(jìn)了高中實(shí)驗(yàn)室。PCR技術(shù)應(yīng)

用廣泛，如實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)、重疊延伸PCR、大引物PCR、反向PCR、巢式PCR等,

高考試題中有關(guān)PCR的問(wèn)題越來(lái)越多，設(shè)問(wèn)考查深度也明顯提升。各種PCR技術(shù)不是孤立的，

它們均已常規(guī)PCR為基礎(chǔ)，為實(shí)現(xiàn)特定目的而進(jìn)行了一定改進(jìn)，但也有各自的局限性，因此在

必要時(shí)可同時(shí)使用幾種擴(kuò)增技術(shù)，如多重巢式PCR、反向?qū)崟r(shí)熒光定量PCR等。

在高考備考中，要關(guān)注不同擴(kuò)增技術(shù)的本質(zhì)差異，同時(shí)總結(jié)此類試題的解題步驟；一是尋

找題圖有效信息，確定所考PCR類型；二是迅速再憶所考PCR的獨(dú)特性，猜測(cè)出題人可能得

意圖；二是根據(jù)設(shè)問(wèn)對(duì)前述猜測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證，并領(lǐng)悟出題人挖掘的新考點(diǎn)，進(jìn)而對(duì)知識(shí)框架進(jìn)行

士親

7TS口0

命題點(diǎn)：PCR技術(shù)與病毒檢測(cè)、基因定點(diǎn)突變與基因改造、基因編輯技術(shù)、同尾酶等。

一、PCR技術(shù)及其應(yīng)用

1、PCR技術(shù)與病毒檢測(cè)一一實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）

新型冠狀病毒感染的常規(guī)檢測(cè)方法是通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定。先從樣本中提取RNA,RNA

中可能有新冠病毒的RNA,同時(shí)也存在很多采樣患者的組織和存在于采樣部位的微生物的RNAO

通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶將樣本的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在PCR反應(yīng)體系中，包含一對(duì)

特異性引物以及一個(gè)Taqman探針，該探針為一段特異性寡核昔酸序列，兩端分別標(biāo)記了報(bào)告

熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；若反應(yīng)體

系存在靶序列，PCR反應(yīng)時(shí)探針與模板結(jié)合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針降

解，報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出熒光。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子產(chǎn)生。熒光

定量PCR儀能夠監(jiān)測(cè)出熒光到達(dá)預(yù)先設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)（Ct值）與病毒核酸濃度有關(guān)，病毒核

酸濃度越高，Ct值越?。ㄈ鐖D）。

平臺(tái)期｛廠

65

線性增長(zhǎng)期，/

Ct值［/熒光閾值

指數(shù)增長(zhǎng)期［VI

010203040

循環(huán)數(shù)

乙

接

（1）RT（reversetranscription）-PCR即反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，是將RNA的反轉(zhuǎn)錄和cDNA的

聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。

RNA^I

R

N

A

翟逆轉(zhuǎn)錄酶

錄

RNA^

DN嬋鏈

cDN嬋鏈

D

N

A

擴(kuò)DN鎮(zhèn)合酶

增

DN憚鏈

DNA?鏈

（2）優(yōu)點(diǎn)：早期診斷、靈敏度和特異性高，判斷是否感染新冠病毒的直接接證據(jù)。

2、重疊延伸PCR技術(shù)

重疊延伸PCR技術(shù)是一項(xiàng)重要的基因定點(diǎn)突變技術(shù),其主要設(shè)計(jì)思路是用具有互補(bǔ)配對(duì)片

段的引物（圖中的引物2和3,突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn)），分別進(jìn)行PCR,獲

得有重疊鏈的兩種DNA片段，再在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸獲得想要的目的基因。

水蛭素是一種蛋白質(zhì)，可用于預(yù)防和治療血栓。某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭素基

因中的特定位點(diǎn)引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺（密碼子為AAC、AAU）替換為賴氨

酸（密碼子為AAA、AAG）,從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理見圖。

擬突變位點(diǎn)

5---------A-------3'

3'---------------T--------5'

引物引物

第2/4

…」/3：—5'

一3資53,

I5Z3A—3'

階3一T-------------5'3'匕5，

Z而53,

段1

15弓

I使用引物1和2引物3|使用引物3和4

\進(jìn)行

、PCR\進(jìn)行PCR

Z5'一個(gè)--------3'

53A

第3'1-------------5'

二混合、變性后，雜交

階,

5'人

段3'^——5'

首先使用DNA聚合酶延伸，

然后使用引物1和4進(jìn)行PCR

5'人3'

3'人5'

突變后的基因

困段回接

(1)PCR擴(kuò)增過(guò)程

高溫變性：溫度超過(guò)90℃,雙鏈DNA解聚為單鏈

低溫復(fù)性：溫度下降到50°C左右，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合

中溫延伸：溫度上升到72°C左右，溶液中的4種脫氧核甘酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下,

根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈

3、大引物PCR技術(shù)

大引物PCR需要用到三條引物進(jìn)行兩輪PCR,這三條引物分別是突變上游引物、常規(guī)上游

引物和常規(guī)下游引物。該技術(shù)的流程如圖所示。第一輪PCR利用突變上游引物和常規(guī)下游引物

進(jìn)行擴(kuò)增，得到不完整的含有突變位點(diǎn)的DNA片段；第二輪PCR利用第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物中的一條

DNA鏈作為下游大引物，它與常規(guī)上游引物一起擴(kuò)增得到完整的含有突變位點(diǎn)的DNA片段。

常規(guī)下游引物

擬突變位點(diǎn)3'?---------5'

5,-------X--------------------------3'

y-------X--------------------------5'

突變上游引物

進(jìn)行PCR

5，_/\y

產(chǎn)物作為下一輪PCR的大引物V5'

下游大引物

3,5,

S'3,

3,5'

S'A3'

進(jìn)行PCR

常規(guī)上游引物

/\

5,3,

/\

3'5'

國(guó)用國(guó)國(guó)

(1)引物設(shè)計(jì)需要遵循以下原則：

①引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp,常用的是18-27bp,但不應(yīng)大于38,過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度

大于74℃,不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。

②引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高的序列，尤其是3'端相似性較高的序列，否則容易

導(dǎo)致錯(cuò)配。

③引物3,端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。末位堿基為A的錯(cuò)配效率明

顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3'端使用堿基A。

④引物序列的GC含量一般為40-60%,過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。

⑤引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件最佳。

⑥AG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)

當(dāng)選用3'端AG值較低(絕對(duì)值不超過(guò)9),而5'端和中間AG值相對(duì)較高的弓|物。

⑦引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過(guò)高（超過(guò)4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降

低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。

⑧對(duì)引物的修飾一般是在5'端增加酶切位點(diǎn)。

4、反向PCR測(cè)定未知DNA區(qū)域

當(dāng)DNA的某些序列已知，而需要擴(kuò)增已知序列兩

已知序列

端的未知序列時(shí)，可采用反向PCR技術(shù)。原理：用限

位點(diǎn)一切位點(diǎn)

制性內(nèi)切核酸酶切割該DNA,隨后使用DNA連接酶將限制性內(nèi)切酹酹解

R

獲得的酶切產(chǎn)物環(huán)化，這樣就獲得了已知序列兩側(cè)攜

帶有未知序列的環(huán)狀DNA分子。以該已知序列為模板

設(shè)計(jì)一對(duì)相反方向的特異性引物，該引物對(duì)已知序列

變性并加入根據(jù)已

反向，但對(duì)未知序列卻是相向的，從而得以擴(kuò)增出未知序列合成的引物

知序列。

PCR擴(kuò)堵

LR

已知序列已?知序列

反向PCR的原理示意圖

（1）PCR技術(shù)由變性一退火一延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增

形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物

與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板一引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶

序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)

制鏈

二、同尾酶

同尾酶中，識(shí)別序列不同的限制酶，雖然識(shí)別的堿基序列不同，但是切開的黏性末

端的堿基卻能夠正好相互配對(duì)，在DNA連接酶的作用下能形成重組DNA分子，如：限制

酶BamHI識(shí)別的堿基序列為一GIGATCC—,限制酶BglII識(shí)別的堿基序列為一AIGATCT

—,限制酶Mb。：［識(shí)別的堿基序列為一IGATC一,限制酶BamHI切開的DNA兩條鏈的黏

性末端中沒(méi)有被配對(duì)的堿基是GATC-,限制酶BglII和限制酶MboI切開的黏性末端未

配對(duì)的堿基也都是GATC—,因此也可以通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的形式重組。

國(guó)隕國(guó)回

(1)定義：來(lái)源不同，識(shí)別的堿基序列也不相同，但能切割產(chǎn)生相同末端的限制酶叫同

尾酶。

(2)同尾酶識(shí)別的靶序列不相同，但能切割產(chǎn)生相同的黏性末端，因此也可以通過(guò)堿基

互補(bǔ)配對(duì)的形式重組。

三、啟動(dòng)子的類型

1、組成型啟動(dòng)子：在生物體的所有組織中都有活性的啟動(dòng)子。其調(diào)控不受外界條件的影響，

所啟動(dòng)基因的表達(dá)具有持續(xù)性，但不表現(xiàn)時(shí)空特異性。例如，在雙子葉植物中最常用的組成型

啟動(dòng)子是花椰菜花病毒啟動(dòng)子、T7噬菌體啟動(dòng)子。

2、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：能被誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，只有在誘導(dǎo)劑存在

的條件下才能表達(dá)目的產(chǎn)物。這種方法有助于避免菌體生長(zhǎng)前期高表達(dá)對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，又

可減少菌體蛋白酶對(duì)產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達(dá)。常見的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有Lac

乳糖操縱子以及在此基礎(chǔ)上衍生出的多種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

3、組織熱異性啟動(dòng)子：只有在特定的器官或組織中才能啟動(dòng)基因的表達(dá)，如神經(jīng)細(xì)胞等組織

特異性啟動(dòng)子。

國(guó)E3圖陶

(D啟動(dòng)子的作用：

①RNA聚合酶識(shí)別結(jié)合的位點(diǎn)，從而影響基因的表達(dá)

②通過(guò)改變啟動(dòng)子的序列，可以控制基因的表達(dá)模式，從而改變基因的功能

③啟動(dòng)子可用來(lái)改變基因組中某一特定基因的表達(dá)量

④啟動(dòng)子可以用來(lái)控制基因組中某一特定基因的表達(dá)量

熱點(diǎn)集訓(xùn)

1、臨床上常采用RT-PCR技術(shù)，對(duì)受測(cè)者咽拭子取樣后進(jìn)行新型冠狀病毒核酸檢測(cè)。RT-PCR

是指以病毒的RNA為模板合成cDNA,并對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的過(guò)程。為定量測(cè)定樣品中病毒

的核酸，常采用實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)原理如下圖所示。在PCR反應(yīng)體系中每加入一

對(duì)引物的同時(shí)，加入一個(gè)與某條模板鏈互補(bǔ)的熒光探針，當(dāng)TaqDNA聚合酶催化子鏈延伸至探

針處，會(huì)水解探針，使熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一次，就有一個(gè)熒光信號(hào)生成。

CT值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是（）

警1—

木恃病毒

RNAcDNA

A.引物、熒光探針均具有特異性，通過(guò)氫鍵與cDNA中的目的基因特異性結(jié)合

B.熒光探針的水解發(fā)生在PCR過(guò)程中的延伸階段

C.樣本中初始病毒核酸量越多，CT值就越大

D.TaqDNA聚合酶催化DNA的合成方向是從子鏈的5，端向3,端延伸

【答案】C

【詳解】A、引物、熒光探針由特定序列構(gòu)成具有特異性，它們都可以與cDNA中的目的基因通

過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)特異性結(jié)合，結(jié)合處形成氫鍵，A正確；

B、“當(dāng)TaqDNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處，會(huì)水解探針”，所以熒光探針的水解發(fā)生在

PCR過(guò)程中的延伸階段，B正確；

C、樣本中初始病毒核酸量越多，達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)就越少，CT值就越小，C錯(cuò)誤；

D、TaqDNA聚合酶催化DNA的合成時(shí)，子鏈的延伸方向是從5,端向3'端，D正確。

2、人類Y基因啟動(dòng)子上游的調(diào)控序列中含有BCLUA蛋白結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)結(jié)合BCLUA蛋

白后，Y基因的表達(dá)被抑制。通過(guò)改變?cè)摻Y(jié)合位點(diǎn)的序列，解除對(duì)Y基因表達(dá)的抑制，可對(duì)某

種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療?？蒲腥藛T擴(kuò)增了Y基因上游不同長(zhǎng)度的片段，將這些片段分別

插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測(cè)，以確定BCLUA蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置。相關(guān)信息如

圖所示。

注：

;調(diào)控序列縷動(dòng)子色因F1~F7,R引物

P：雌激素誘導(dǎo)下發(fā)揮

作用的啟動(dòng)子

：F1F2止°】F7MMi：J”終止子

載體的終上子熒光蛋白基因

部分結(jié)構(gòu)二滅”棄口上口PBCZ〃H基因

、K/Xhol:CTCGAG

?I一EcoRI:&4TTC

NhelEcoRIMiniEcoRI.WoI終止子Sall：CTCGAC

Nhel：GZTAGC

（1）為將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá)，需在引物末端添加限制酶識(shí)別

序列。據(jù)圖可知，在笆?F,末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是—，在R末端添加的序列所

對(duì)應(yīng)的限制酶是。本實(shí)驗(yàn)中，從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過(guò)程共需要一種酶。

（2）將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCLUA基因的受體細(xì)胞，成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)i?F$與R擴(kuò)增產(chǎn)物

的載體表達(dá)熒光蛋白，受體細(xì)胞有熒光，含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無(wú)熒光。含F(xiàn)7與R

擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無(wú)熒光的原因是—o

（3）向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，含E?F,與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光，而含

Fs?Fe與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光。若Y基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對(duì)應(yīng)的位置

不含有BCLUA蛋白的結(jié)合位點(diǎn)序列，據(jù)此結(jié)果可推測(cè)，BCLUA蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于,理

由是_。

【答案】SallEcoRI6F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的啟動(dòng)子，熒光蛋白基

因不表達(dá)引物F4與F5在調(diào)控序列上所對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段上根據(jù)有無(wú)熒光情

況判斷，F(xiàn)1?F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均有結(jié)合位點(diǎn)，因此結(jié)合位點(diǎn)位于F4所對(duì)應(yīng)調(diào)控序列的下

游（右側(cè)）；F5?F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均無(wú)結(jié)合位點(diǎn)，可知結(jié)合位點(diǎn)位于F5所對(duì)應(yīng)調(diào)控序列

的上游（左側(cè)），所以結(jié)合位點(diǎn)位于引物F4與F5在調(diào)控序列上所對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段上

【分析】1、據(jù)題意可知，科研人員擴(kuò)增了Y基因上游不同長(zhǎng)度的片段，據(jù)圖中注釋可知，F(xiàn)1~F7

以及R位置均為引物，故擴(kuò)增的序列分別是引物F1和引物R之間的序列，弓|物F2和弓|物R之

間的序列，引物F3和引物R之間的序列，引物F4和引物R之間的序列，引物F5和引物R之

間的序列，引物F6和引物R之間的序列，引物F7和引物R之間的序列；

2、據(jù)圖中對(duì)限制酶的注釋可知，限制酶肱I識(shí)別并切割后的黏性末端與限制酶比I識(shí)

別并切割后的黏性末端相同，限制酶肪。I識(shí)別并切割后的黏性末端與限制酶Sa/I識(shí)別

并切割后的黏性末端相同。

【詳解】（1）據(jù)題意可知，需要將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入并指導(dǎo)熒光蛋白基因的表達(dá)，則含

有啟動(dòng)子的擴(kuò)增后的產(chǎn)物讀取方向與熒光蛋白基因的讀取方向一致，故擴(kuò)增后的產(chǎn)物中的R端

與熒光蛋白基因中限制酶物〃I識(shí)別序列端結(jié)合，才能保證擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入并指導(dǎo)熒

光蛋白基因的表達(dá)。要做到定向插入，需要引物末端兩端添加限制酶的識(shí)別序列，且被限制酶

識(shí)別并切割后，兩端的黏性末端不能相同。而擴(kuò)增后的產(chǎn)物中可能含有物〃I和后。I的

識(shí)別位點(diǎn)，故在引物末端添加限制酶的識(shí)別序列不能被限制酶物〃I和后。I所識(shí)別，故

應(yīng)該選用添加限制酶比?！↖和限制酶Sa/I識(shí)別序列，據(jù)圖中對(duì)限制酶的注釋可知，限制

酶肱加I識(shí)別并切割后的黏性末端與限制酶反。火I識(shí)別并切割后的黏性末端相同，故R

末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是a。7?I,在F1?F7末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是

SalI；熒光蛋白基因中含有限制酶&I的識(shí)別位點(diǎn)，故對(duì)載體使用限制酶物〃I和

XhoI切割。綜上所述，對(duì)載體使用限制酶物〃I和后。I切割，對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物用限制

酶&I和限制酶Sa/I識(shí)別序列,然后在DNA連接酶的催化作用下，連接形成重組載體；

產(chǎn)物擴(kuò)增中需要使用Tag酶催化，合成更多的產(chǎn)物，故從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過(guò)程

共需要6種酶，分別是Tag酶、限制酶比I、限制酶Sa/I、限制酶肱/〃I、限制酶

XhoI、DNA連接酶；

（2）受體細(xì)胞中已經(jīng)除去BCL11A基因，故擴(kuò)增產(chǎn)物中的BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)，不會(huì)抑制

熒光蛋白基因的表達(dá)；基因的表達(dá)需要RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合，才能完成熒光蛋白基因的轉(zhuǎn)

錄過(guò)程；含F(xiàn)1?F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的載體表達(dá)熒光蛋白，受體細(xì)胞有熒光，含F(xiàn)7與R擴(kuò)增

產(chǎn)物的受體細(xì)胞無(wú)熒光，則可能是F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的啟動(dòng)子，熒光蛋白基因不表達(dá)；

（3）向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，此時(shí)重組載體上的20/"基因表達(dá)，產(chǎn)生BCL11A蛋白，

BCL11A蛋白與BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后，導(dǎo)致熒光蛋白基因被抑制；含F(xiàn)1?F4與R擴(kuò)

增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光，則說(shuō)明BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后在引物F4與引物R之間

的序列上；含F(xiàn)5?F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光，則說(shuō)明BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)結(jié)

合后在引物F5的上游序列，故據(jù)此結(jié)果可推測(cè)，BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于引物F4與F5在

調(diào)控序列上所對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段上。

【點(diǎn)睛】對(duì)基因工程中PCR技術(shù)的掌握，對(duì)基因工程的第二步，基因表達(dá)載體的構(gòu)建的過(guò)程的

分析，雙酶切法的應(yīng)用，限制酶的作用和切割特點(diǎn)，是解決本題的關(guān)鍵。

3、反向PCR流程如圖所示，該技術(shù)可利用一段已知DNA序列設(shè)計(jì)合理的引物，擴(kuò)增已知序列

兩端的未知序列。圖中已知序列一條鏈的堿基排列順序?yàn)椤?'-AACTATGCGCTCATGA-……

-GCAATGCGTAGCCTCT-3'”。下列敘述錯(cuò)誤的是（）

A.I酶切：用一種限制酶切割DNA,以使兩端未知序列形成相同的黏性末端

B.H連接：使用DNA連接酶催化相鄰核昔酸之間形成磷酸二酯鍵

C.設(shè)計(jì)的兩種引物分別是“5'-AACTATGCGCTCATGA-3'”和"5'-AGAGGCTACGCATTGO3'

D.對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。該DNA單鏈序列可能為

“5'-AATTCCAGT-...-CTGAATT-3'”

【答案】C

【詳解】A、根據(jù)圖示可以看出經(jīng)過(guò)I酶切過(guò)程后，由于用一種限制酶切割DNA,從而使兩端

未知序列形成相同的黏性末端，A正確；

B、II過(guò)程是將DNA片段連接起來(lái)，該過(guò)程中使用DNA連接酶催化相鄰核甘酸之間形成磷酸二

酯鍵，B正確；

C、設(shè)計(jì)的兩種引物需要與已知序列發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，而后向兩側(cè)延伸合成未知序列，因此

合成的引物分別是“5'TCATGAGCGCATAGTT-3'”和"5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'"，C錯(cuò)誤；

D、對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列，由于F序列是未知序列，根據(jù)C項(xiàng)中

的引物序列做出判斷，該DNA單鏈序列可能為"5'-AATTCCAGT-……-CTGAATT-3'”，D正確。

4、某研究小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將綠色熒光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一

端，如圖甲所示。實(shí)驗(yàn)得到能正常表達(dá)兩種蛋白質(zhì)的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得

Gata3-GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設(shè)計(jì)了引物1和引

物2用于PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖乙所示。

編碼區(qū)非編碼區(qū)

插入前

大片段

GFP

編碼區(qū)I非編碼區(qū)

小片段

_：--------------5'

弓麗I麗2”

下列敘述正確的是（）

A.Gata3基因的啟動(dòng)子無(wú)法控制GFP基因的表達(dá)

B.翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白

C.2號(hào)條帶的小鼠是野生型，4號(hào)條帶的小鼠是Gata3-GFP基因純合子

D.若用引物1和引物3進(jìn)行PCR,能更好地區(qū)分雜合子和純合子

【答案】B

【詳解】A、分析圖中可知，啟動(dòng)子在左側(cè)，GFP基因整合Gata3基因的右側(cè)，啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)

錄后，可以使GEP基因轉(zhuǎn)錄，Gata3基因的啟動(dòng)子能控制GFP基因的表達(dá)，A錯(cuò)誤；

B、因啟動(dòng)子在左側(cè)，轉(zhuǎn)錄的方向向右，合成的mRNA從左向右為5，一3，，剛好是翻譯的方

向，所以翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正確；

C、整合GFP基因后，核酸片段變長(zhǎng)，2號(hào)個(gè)體只有大片段，所以是Gata3-GFP基因純合子，4

號(hào)個(gè)體只有小片段，是野生型，C錯(cuò)誤；

D、用引物1和引物3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的片段大小差異較小，無(wú)法較好的區(qū)分片段，D

錯(cuò)誤。

5、不對(duì)稱PCR技術(shù)是利用不等量的一對(duì)引物來(lái)產(chǎn)5'3'

甲II

生大量單鏈DNA(ssDNA)的方法，如圖所示。不1,1—限制性引物

對(duì)稱PCR中加入的一對(duì)引物中含量較少的被稱為甲I"”“'

限制性引物，含量較多的被稱為非限制性引物，3，5-

非限制性引物

兩者的比例通常為1/50-1/100.PCR反應(yīng)的最初

若干次循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA

(dsDNA),在限制性引物消耗完后，就會(huì)產(chǎn)生大量的ssDNA.下列相關(guān)說(shuō)法正確的是()

A.兩種引物與模板鏈結(jié)合時(shí)，需將溫度控制在72℃左右

B.PCR擴(kuò)增時(shí)，在DNA解旋酶的作用下雙鏈DNA解聚為單鏈

C.通過(guò)不對(duì)稱PCR技術(shù)最后大量獲得的ssDNA的堿基序列與圖中甲鏈的相同

D.PCR擴(kuò)增時(shí)，子鏈分別沿限制性引物的5,端、非限制性引物的3,端延伸

【答案】C

【詳解】A、兩種引物與模板鏈結(jié)合即復(fù)性過(guò)程，該過(guò)程中溫度下降到50℃左右，兩種引物通

過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合，A錯(cuò)誤；

B、PCR擴(kuò)增時(shí)，當(dāng)加熱至90℃以上時(shí)，DNA解聚為單鏈，不需要加入DNA解旋酶，B錯(cuò)誤;

CD、PCR擴(kuò)增時(shí)，需要引物與DNA單鏈結(jié)合，在耐高溫DNA聚合酶作用下，將4種脫氧核甘酸

添加至引物的3'端，完成DNA單鏈的延伸，限制性引物數(shù)量少，會(huì)先耗盡，而非限制性引物

數(shù)量多，其與乙鏈結(jié)合，最后大量獲得的ssDNA的堿基序列與圖中甲鏈的相同，C正確，D錯(cuò)

誤。

6、重疊延伸PCR技術(shù)是采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)

增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸，獲得想要的目的基因。某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭

素基因的特定位點(diǎn)引入特定突變，以實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)突變，原理見圖。下列說(shuō)法正確的是()

A.過(guò)程②的擴(kuò)增緩沖溶液中一般要添加Mg2+

B.若引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、引物4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次DNA分子

的復(fù)制后，一共會(huì)產(chǎn)生4種DNA分子

C.經(jīng)過(guò)過(guò)程④獲得的雜交DNA有2種，都可以經(jīng)過(guò)過(guò)程⑤獲得目的基因

D.過(guò)程⑤使用耐高溫的DNA聚合酶延伸，需要引物

【答案】A

【詳解】A、過(guò)程②為PCR反應(yīng)，需要在一定的添加Mg2+的緩沖液中才能進(jìn)行，A正確；

B、兩個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中各自形成兩種DNA分子，但由于引物1和引物4形成兩個(gè)與原DNA相同的

DNA分子，所以含有引物1和4的DNA屬于同一種DNA,故總共形成3種DNA分子，B錯(cuò)誤；

C、過(guò)程④獲得的雜交DNA有2種，一種3,端為單鏈，一種5,端為單鏈，5/端為單鏈的雜

交DNA為所需DNA,C錯(cuò)誤；

D、過(guò)程⑤是延伸過(guò)程，該過(guò)程使用耐高溫的DNA聚合酶進(jìn)行催化，不需要引物，D錯(cuò)誤。

7、通過(guò)引物設(shè)計(jì)運(yùn)用PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)目的基因的定點(diǎn)突變?nèi)鐖D為誘與'物

基因工程中獲取突變基因的過(guò)程，其中引物1序列中含有一個(gè)堿基T第一輪PCR].

不能與目的基因片段配對(duì)，但不影響引物與模板鏈的整體配對(duì)，反=:.

PCR產(chǎn)物用作大引物

應(yīng)體系中引物1和引物2的5'端分別設(shè)計(jì)增加限制性內(nèi)切酶a和限-——

制性內(nèi)切酶b的識(shí)別位點(diǎn)。有關(guān)敘述不正確的是（）蜜-H

A.兩種引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識(shí)別位點(diǎn)有利于目的基因的定向插入

B.一個(gè)DNA分子在第2輪PCR后，得到的四個(gè)DNA分子各不相同

C.第2輪PCR,引物1與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長(zhǎng)的突變基因

D.在第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對(duì)且兩條鏈等長(zhǎng)的DNA占1/4

【答案】C

【詳解】A、引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識(shí)別位點(diǎn)，可以配合載體的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，幫助目的基

因定向定點(diǎn)插入運(yùn)載體，避免發(fā)生自身環(huán)化，A正確；

B、第一、二輪循環(huán)合成的子鏈長(zhǎng)度均不同，根據(jù)半保留復(fù)制特點(diǎn)可知，前兩輪循環(huán)產(chǎn)生的四

個(gè)DNA分子的兩條鏈均不等長(zhǎng),一個(gè)DNA分子在第2輪PCR后，得到的四個(gè)DNA分子各不相同，

B正確；

C、在第3輪PCR中，物質(zhì)②是引物2以引物1拓展得到的DNA鏈為模板進(jìn)行復(fù)制得到的，故

引物1能與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長(zhǎng)的突變基因，C錯(cuò)誤；

D、在第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對(duì)且兩條鏈等長(zhǎng)的DNA有2個(gè)，總DNA分子共8個(gè)，所

以比例為1/4,D正確。

8、新冠病毒包膜表面的S蛋白能識(shí)別人體細(xì)胞膜表面的ACE2受體并導(dǎo)致病毒入侵人體細(xì)胞。

制備重組亞單位新冠疫苗的線路是：提取新冠病毒RNA一通過(guò)RT-PCR（反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒?/p>

應(yīng)）技術(shù)擴(kuò)增篩選RBD蛋白（S蛋白中真正與ACE2結(jié)合的關(guān)鍵部分）基因（圖1）一構(gòu)建基因

表達(dá)載體（圖2）一導(dǎo)入CHO細(xì)胞并培養(yǎng)一提取并純化RBD蛋白一制成疫苗。圖3為利用電泳

技術(shù)對(duì)PCR的產(chǎn)物進(jìn)行純度鑒定，1號(hào)泳道為標(biāo)準(zhǔn)（Marker）,2號(hào)泳道為陽(yáng)性對(duì)照組，3號(hào)

泳道為實(shí)驗(yàn)組。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（）

SmaI

引物1工引物2引物2引物4

=3▼==2'

tIIHIIIIIIIIIIIIIIHL

引肅輸6弓痂t菊8”123

BaniHI、\r-'HindTO.

RBD蛋白基因

圖1RBD蛋白基因結(jié)構(gòu)與引物位置示意圖

圖3電泳鑒定

A.利用RT-PCR技術(shù)獲取RBD蛋白基因時(shí)，需加入逆轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶

B.利用PCR擴(kuò)增含有限制酶切點(diǎn)的RBD蛋白基因時(shí)，應(yīng)選擇的引物為引物4、引物5

C.2號(hào)泳道是以（提純的）RBD蛋白基因片段為材料所做的陽(yáng)性對(duì)照組

D.為提高目的基因和運(yùn)載體的正確連接效率，應(yīng)選擇限制酶EcoRI切割

【答案】D

【詳解】A、RT-PCR技術(shù)是將RNA的反轉(zhuǎn)錄和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù),

利用RT酶PCR技術(shù)，獲取S蛋白基因時(shí)，需加入逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶，A正確；

B、引物與模板鏈的3'端堿基互補(bǔ)配對(duì)，故引物1、引物2、引物7和引物8不合適，擴(kuò)增得

到的RBD蛋白基因也應(yīng)該含有限制酶的酶切位點(diǎn)，故引物3和引物6不合適，故選引物4和引

物5,B正確；

C、PCR的產(chǎn)物可通過(guò)電泳鑒定，設(shè)置如下：1號(hào)泳道為標(biāo)準(zhǔn)（Marker）,2號(hào)泳道是以RBD蛋

白基因片段為材料做的陽(yáng)性對(duì)照組，3號(hào)泳道為實(shí)驗(yàn)組，C正確；

D、質(zhì)粒上沒(méi)有SmaI酶切位點(diǎn)，且若使用EcoRI酶切，易造成目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化，故

應(yīng)該選擇BamHI和HindllLD錯(cuò)誤。

9、（不定項(xiàng)）稻米胚乳直鏈淀粉含量高會(huì)導(dǎo)致食用品質(zhì)差。研究發(fā)現(xiàn)，水稻蠟質(zhì)基因（Wx）

編碼直鏈淀粉合成酶。若Wx基因中第226位堿基是正常的G,該位點(diǎn)所在的內(nèi)含子能被正常

剪接，胚乳中直鏈淀粉含最高，基因型記做GG；若該位點(diǎn)突變成T,則不能被正常剪接，胚乳

中直鏈淀粉的合成水平會(huì)降低，基因型記做TT。為檢測(cè)Wx基因該位點(diǎn)堿基是G或T,研究人

員以待測(cè)水稻葉片總DNA為材料，以Wx基因片段設(shè)計(jì)引物，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)AccI酶切后電

泳。如圖所示，已知引物1為5,-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3,,AccI酶的識(shí)別位點(diǎn)為5，

-GTATAC-3Z,兩引物之間無(wú)另外的AccI酶的識(shí)別位點(diǎn)。下列敘述不正確的是（）

GCTTCACTTCTCTGCTTGTGTTCAACTCTCGTTAAATCAT

高直睫淀粉含量（GG）和中等直捱淀粉含量（TT）水稻品種中蠟質(zhì)基因部分DNA順序

A.該實(shí)驗(yàn)中需設(shè)計(jì)的引物2為5'—TTCAACTCTCGTTAAATCAT-3'

B.若電泳結(jié)果只能觀察到530bp的DNA條帶，則表明該水稻品種為TT型

C.GT雜合型水稻品種酶切電泳結(jié)果為3條條帶

D.組成上述兩種淀粉合成酶的氨基酸的種類不同，數(shù)目相同

【答案】ABD

【詳解】A、分析題圖可知，引物的延伸方向?yàn)?'-3',故圖示所給引物1設(shè)計(jì)區(qū)堿基序列所

在的DNA鏈為非模板鏈，故引物1的堿基序列與非模板鏈的堿基序列相同，而引物2要以引物

2設(shè)計(jì)區(qū)堿基序列所在的DNA鏈為模板，故引物2的堿基序列應(yīng)與所給序列堿基互補(bǔ)配對(duì)，該

實(shí)驗(yàn)中需設(shè)計(jì)的引物2為5'—ATGATTTAACGAGAGTTGAA—3',A錯(cuò)誤；

B、若酶切產(chǎn)物只能觀察到450bp的DNA條帶，則表明第226位堿基是正常的G,該位點(diǎn)所在

的內(nèi)含子能被正常剪接，GAI該水稻品種為GG型，B錯(cuò)誤；

C、若Wx基因中第226位堿基是正常的G,該位點(diǎn)所在的內(nèi)含子能被正常剪接，胚乳中直鏈淀

粉含最高，基因型記做GG；若該位點(diǎn)突變成T,則不能被正常剪接，胚乳中直鏈淀粉的合成水

平會(huì)降低，基因型記做TT,故GT雜合型水稻品種的G能被酶切成兩段，而T不能被酶切，故

酶切電泳結(jié)果為3條條帶，C正確；

D、組成上述兩種淀粉合成酶的氨基酸的數(shù)目不同，D錯(cuò)誤。

10、In-Fusion技術(shù)是一項(xiàng)新型的無(wú)縫克隆技術(shù)。該技術(shù)關(guān)鍵是要在目的基因兩端構(gòu)建與線性

化質(zhì)粒末端相同的DNA序列（即同源序列，通常為15-20bp）,然后用In-Fusion酶處理即可

實(shí)現(xiàn)無(wú)縫連接。它的操作步驟大致為：①利用PCR技術(shù)將質(zhì)粒線性化；②PCR擴(kuò)增出兩端含線

性化質(zhì)粒同源序列的目的基因；③目的基因與線性化質(zhì)粒同源區(qū)域在In-Fusion酶作用下形成

重組質(zhì)粒；④將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞。回答下列問(wèn)題。

引啰匚宜物2

引物A目,的基因

5'—3'/

3'—5'

c引物B

①②PCR

[iiiiiWil

同源序列1同源序列2

llllllHIIII

\UilLKIn-Fusion酶.

同源序列

互換重組

受體細(xì)胞

⑴過(guò)程①需要用到的酶是o過(guò)程③中，同源序列1與同源序列2中的堿基序列不同,

這樣設(shè)計(jì)的好處是。

⑵為保證擴(kuò)增出兩端含線性化質(zhì)粒同源序列的目的基因，引物A或引物B要依據(jù)序列

進(jìn)行設(shè)計(jì)。

⑶若目的基因是氨葦青霉素抗性基因，以大腸桿菌作為受體細(xì)胞。為檢測(cè)已轉(zhuǎn)化大腸桿菌的

抗性效果，在含有氨葦青霉素和不含氨葦青霉素的培養(yǎng)基上分別接種等量的已轉(zhuǎn)化大腸桿菌并

培養(yǎng)相同時(shí)間，然后采用法進(jìn)行計(jì)數(shù)，若結(jié)果較真實(shí)值偏小，原因是。

（4）與傳統(tǒng)構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法相比，In-Fusion技術(shù)的優(yōu)勢(shì)有。（至少答出兩點(diǎn)）

【答案】（1）耐高溫的DNA聚合酶（或TaqDNA聚合酶）防止目的基因反向連接，防

止線性化質(zhì)粒或目的基因自身環(huán)化（2）目的基因與質(zhì)粒

（3）稀釋涂布平板當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，在平板上觀察到的是一個(gè)菌落

⑷不受限制酶酶切位點(diǎn)的限制；可以把目的基因插入任何位點(diǎn)；避免限制酶切割對(duì)質(zhì)粒功能

區(qū)的破壞

【詳解】（1）過(guò)程①是利用兩種引物進(jìn)行的質(zhì)粒線性化過(guò)程，該過(guò)程屬于PCR技術(shù)的應(yīng)用，

故需要TaqDNA聚合酶；過(guò)程③是基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程，該過(guò)程中，同源序列1、2中的堿

基排序不同，這樣設(shè)計(jì)的好處是防止目的基因反向連接，防止線性化質(zhì)粒或目的基因的自身環(huán)

化，以保證目的基因能夠正確連接并表達(dá)。

（2）目的基因經(jīng)引物A或引物B擴(kuò)增后需要與目的基因和線性化質(zhì)粒連接，故為保證擴(kuò)增出

所需的目的基因，引物A或引物B要依據(jù)目的基因和質(zhì)粒序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。

（3）能對(duì)微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法有用顯微鏡計(jì)數(shù)法和稀釋涂布平板法（用于活菌計(jì)數(shù)）；由

于在用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)時(shí)，當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí),在平板上觀察到的是一個(gè)菌落,

故導(dǎo)致結(jié)果較真實(shí)值偏小。

（4）由題意可知，好吧對(duì)比傳統(tǒng)構(gòu)建重組質(zhì)粒，In-Fusion技術(shù)的優(yōu)勢(shì)有不受限制酶酶切位

點(diǎn)的限制；可以把目的基因插入任何位點(diǎn)；避免限制酶切割對(duì)質(zhì)粒功能區(qū)的破壞等。

11、金屬硫蛋白（MT）是一類廣泛存在于動(dòng)物肝臟細(xì)胞中的金屬結(jié)合蛋白，具有吸附重金屬的

作用?？蒲腥藛T將MT基因?qū)氪竽c桿菌構(gòu)建工程菌，利用這一工程菌吸附工業(yè)廢水中的重金

屬?；卮鹣铝袉?wèn)題：

⑴為獲取目的基因，從中提取mRNA,通過(guò)法獲得MTcDNA。MTcDNA的堿基

序列與細(xì)胞中MT基因的堿基序列（填“相同”或“不同”）。

⑵為了提高工程菌MT蛋白的產(chǎn)量，將基因與外源表達(dá)增強(qiáng)元件連接（圖甲表示引物對(duì)應(yīng)

的位置）。

甲②

---------1表達(dá)增強(qiáng)元碼_|MT基因|-------

（注：①、②③、④表示引物）②④

利用PCR檢測(cè)連接是否成功，可選擇的引物組合是（填字母），該P(yáng)CR反應(yīng)體系中需

加入酶。

A.①+③B.①+④C.③+②D.③+④

⑶將改造后的目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的片段末端為平末端，而載體E只有能產(chǎn)生黏性

末端的酶切位點(diǎn)。為了能夠?qū)T基因與載體E相連，可以在上述引物的（填“5,”

或“3,”）端添加能產(chǎn)生黏性末端的限制酶識(shí)別序列；也可以借助中間載體P將MT基因接入

載體E。（圖乙表示載體P和載體E的酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的酶切序列）

—CTCGAG——GATATC——CTGCAG——CCCGGG——GGTACC—

—GAGCTC——CTATAG——GACGTC——GGGCCC——CCATGG—

加t

ttTtTT

EcoRVPstISmaIKpnI

后者具體操作步驟如下:

①選用酶將載體p切開，再用DNA連接酶將MT基因與載體P相連,構(gòu)成重組載體P'。

②載體P'不具有表達(dá)MT基因的和。選用酶組合對(duì)載體P'和載體

E進(jìn)行酶切，將切下的MT基因和載體E用DNA連接酶進(jìn)行連接。為了提高獲得重組質(zhì)粒的效

率，除了考慮適宜的外界條件、目的基因的濃度外，還需考慮（寫出兩點(diǎn)）。

（4）將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到用處理的大腸桿菌中完成轉(zhuǎn)化；利用含有的培養(yǎng)基篩

選出MT工程菌。

⑸通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MT基因已經(jīng)成功導(dǎo)入大腸桿菌，但該菌不能吸附工業(yè)廢水中的重金屬，可能

的原因是：o

【答案】（1）動(dòng)物肝臟細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄/反轉(zhuǎn)錄不同

（2）BTaqDNA聚合酶/耐高溫的DNA聚合酶

（3）5,EcoRV啟動(dòng)子終止子X(jué)hol和PstI質(zhì)粒的濃度、質(zhì)粒的

純度、DNA連接酶的濃度DNA連接酶活性

（4）CaCl2卡那霉素

⑸轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的基因不表達(dá)/表達(dá)量少/表達(dá)不及預(yù)期

【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸?kù)中獲取、利用

PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載

體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體

細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定。

【詳解】（1）分析題意，金屬硫蛋白（MT）是一類廣泛存在于動(dòng)物肝臟細(xì)胞中的金屬結(jié)合蛋

白，為獲取目的基因，可從動(dòng)物肝臟細(xì)胞中提取mRNA,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄）法獲得MTcDNA；

MTcDNA是經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到的，該過(guò)程中由于成熟的mRNA已經(jīng)經(jīng)過(guò)剪切等過(guò)程，不含內(nèi)含子等

非編碼序列，故MTcDNA的堿基序列與細(xì)胞中MT基因的堿基序列不同。

（2）PCR擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)選擇一對(duì)引物，引物需要與模板的3'端結(jié)合，本操作中將MT基因與外

源表達(dá)增強(qiáng)元件連接，利用PCR檢測(cè)連接是否成功，需要擴(kuò)增表達(dá)增強(qiáng)元件和目的基因，結(jié)合

題圖可知，可選擇的引物組合是①+④，故選B；由于PCR過(guò)程中所需溫度較高，故PCR反應(yīng)

體系中需加入TaqDNA聚合酶/耐高溫的DNA聚合酶。

（3）PCR擴(kuò)增時(shí)與引物的3'端結(jié)合，’為了能夠?qū)T基因與載體E相連，可以在上述引物

的5,端添加能產(chǎn)生黏性末端的限制酶識(shí)別序列。

①PCR所用的DNA聚合酶擴(kuò)增出的M基因的末端為平末端，則可用EcoRV酶將載體P切開，形

成平末端，由于T4DNA連接酶可以連接平末端，所以用T4DNA連接酶將M基因與載體P相連,

構(gòu)成重組載體P'。

②由于載體P'不具有表達(dá)M基因的啟動(dòng)子和終止子，所以選用Xhol和PstI酶組合對(duì)載體P'

和載體E進(jìn)行酶切，將切下的M基因和載體E用DNA連接酶進(jìn)行連接，得到含有啟動(dòng)子和終止

子的表達(dá)載體;為了提高獲得重組質(zhì)粒的效率，除了考慮適宜的外界條件、目的基因的濃度外，

還需考慮質(zhì)粒的濃度、質(zhì)粒的純度、DNA連接酶的濃度DNA連接酶活性等。

（4）將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是鈣離子處理法，故可將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到用CaCk處理

的大腸桿菌中完成轉(zhuǎn)化；結(jié)合圖示可知，重組質(zhì)粒含有的標(biāo)記基因是卡那霉素，故利用含有卡

那霉素的培養(yǎng)基篩選出MT工程菌。

（5）由于轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的MT基因不表達(dá)/表達(dá)量少/表達(dá)不及預(yù)期，故通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MT基

因已經(jīng)成功導(dǎo)入大腸桿菌，但該菌不能吸附工業(yè)廢水中的重金屬。

12、人絨毛膜促性腺激素（HCG）是女性懷孕后胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，由a鏈和

B鏈（hCGB）結(jié)合而成。近年研究顯示，hCGB也可表達(dá)于結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞，與腫

瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系。研發(fā)抗hCGB疫苗已成為近年來(lái)腫瘤生物治療新的熱點(diǎn)，

下圖1為其制備的基本方案。

hCGB基因

登錄基因

（）

數(shù)據(jù)庫(kù)，630bp

查詢hCG。?|A|||||||||||||||||||||F1重組酶、

基因序列

'~DN~A^L接酶需環(huán)化移導(dǎo)大入腸桿菌提取口、鑒a定重工組質(zhì)粒

AOX1啟動(dòng)子甲序列（320bp）

''小窗3回導(dǎo)入IV

分離、提純檢測(cè)

.______線性質(zhì)粒制備成抗hCG3疫苗—發(fā)酵罐一-酵母菌

H）----A--（組氨酸

氨節(jié)青霉素抗性基因組氨酸合成酶基因缺陷型）

（注1:甲序列指導(dǎo)合成的信號(hào)肽能引導(dǎo)后續(xù)合成的肽鏈進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔

注2:AOX1為甲醇氧化酶基因的啟動(dòng)子，只能在以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中正常表達(dá)）

圖1

（1）構(gòu)建基因表達(dá)載體。圖中獲取h