2GB/TXXXX—XXXX廢水中頭孢菌素類抗生素的測定液相色譜-串聯(lián)質譜法警告：使用本文件的人員應有正規(guī)實驗室工作實踐經(jīng)驗。本文件并未指出所有可能的安全問題。使用者有責任采取適當?shù)陌踩徒】荡胧?，并保證符合國家有關法規(guī)規(guī)定的條件。本文件規(guī)定了廢水中頭孢匹羅、頭孢喹肟、頭孢洛寧、頭孢乙腈、頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢克肟、頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢噻呋、頭孢噻吩，13種頭孢菌素類抗生素的測定方法液相色譜-串聯(lián)質譜法。本文件適用于生活污水、養(yǎng)殖廢水和醫(yī)療廢水中13種頭孢類抗生素的測定。當取樣量為500mL，定容體積為1mL，進樣體積為2μl時，13種頭孢菌素類抗生素的方法檢出限為0.03ng/L～1.0ng/L，測定下限為1.0ng/L～3.0ng/L。參見附錄A。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682—2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法HJ493水質采樣樣品的保存和管理技術規(guī)定HJ494水質采樣技術指導3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4原理樣品過濾后，經(jīng)固相萃取柱富集和凈化，用液相色譜-串聯(lián)質譜測定，基質校準外標法定量。5一般規(guī)定本文件所用試劑和水，在沒有注明其他要求時，均指分析純試劑和GB/T6682—2008表1中的一級水。6試劑與材料6.1甲醇（CH3OH）：色譜純。3GB/TXXXX—XXXX6.2甲酸（HCOOH）：色譜純。6.3鹽酸：分析純。6.4乙腈（CH3CN）：色譜純。6.50.1%甲酸溶液：準確移取0.5mL甲酸于預先加入適量水的500mL容量瓶中，用水稀釋定容至標線，混勻。6.6鹽酸溶液：取適量鹽酸用水調節(jié)至pH≈3。6.730%乙腈溶液：取300mL乙腈與700mL水混勻。6.8頭孢菌素類標準物質：頭孢匹羅、頭孢喹肟、頭孢洛寧、頭孢乙腈、頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢克肟、頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢噻呋、頭孢噻吩，純度均≥92.0%（詳見附錄A）；也可使用市售有證標準物質。6.9標準儲備溶液（500μg/mL）：稱取適量標準品（精確至0.01mg）（6.8），分別置于10mL容量瓶中，用30％乙腈溶液溶解并定容。于-18℃以下保存，有效期為3個月。如所用標準品為相應的鹽或含結晶水，應折算成有效成分。6.10混合標準中間溶液（10μg/mL分別準確移取標準儲備溶液各10mL，于10mL容量瓶中，用30％乙腈溶液定容。于-18℃以下保存，有效期為1個月。6.11混合標準系列工作溶液：準確移取適量混合標準中間溶液，用空白基質稀釋定容配成混合標準系列工作溶液，濃度分別為5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。6.12固相萃取柱：填料為二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物（HLB）或同等柱效的萃取柱，規(guī)格為6mL/500mg。6.13有機濾膜：0.22μm聚醚砜和聚四氟乙烯或其他等效材質濾膜。6.14玻璃纖維濾膜：0.45μm玻璃纖維濾膜或其他材質等效濾膜。7儀器設備7.1液相色譜-串聯(lián)質譜儀：配有電噴霧離子源（ESI），具備梯度洗脫和多反應監(jiān)測功能。7.2固相萃取裝置：流速可調節(jié)。7.3氮吹濃縮儀。7.4旋渦混勻器：轉動頻次0rpm~3000rpm。7.5采樣瓶：1000mL磨口或帶聚四氟乙烯內(nèi)襯墊瓶蓋的棕色玻璃瓶。7.6微量注射器或移液器：10μL、50μL、100μL、500μL、1mL。8試樣制備與保存4GB/TXXXX—XXXX8.1試樣的制備稱樣量和制備試驗溶液的方法按相關產(chǎn)品標準中的規(guī)定進行。8.2試樣的保存水樣的采集按照HJ494和HJ493的相關規(guī)定。9試驗步驟9.1提取量取500mL樣品，并充分混勻，用0.45μm的玻璃纖維膜對樣品進行過濾，收集水樣。9.2凈化將固相萃取柱，固定在固相萃取裝置上，依次用6mL甲醇、6mL水及6mL鹽酸溶液活化。將預處理過的樣品以4mL/min的流速通過小柱。上樣完畢后，用5mL水淋洗小柱。然后用氮氣吹掃或固相萃取裝置的真空泵干燥小柱25min，去除小柱中的殘留水分。再用5mL乙腈（6.1.4）洗脫小柱，收集洗脫液。洗脫液經(jīng)濃縮裝置濃縮至近干，用0.1%甲酸溶液定容至1.0mL，渦旋混勻，過0.22μm濾膜后置于棕色進樣瓶中，待測。9.3基質匹配標準曲線的制備精密量取混合標準工作液適量，用經(jīng)提取凈化后的空白樣品溶液稀釋配制濃度為5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L的系列基質校準工作溶液，0.22μm濾膜供液相色譜串聯(lián)質譜測定，以定量離子對峰面積為縱坐標、標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求回歸方程和相關系數(shù)。9.4測定9.4.1液相色譜參考條件a)色譜柱：填料粒徑為1.8μm，柱長50mm，內(nèi)徑2.1mm的C18反相液相色譜柱或其他性能相近的色譜柱；b)流速：0.2mL/min；c)柱溫：30℃;d)進樣體積：2μL；e)流動相：A相為0.1%甲酸水，B相位為甲醇，梯度洗脫程序見表1。表1梯度洗脫程序555GB/TXXXX—XXXX559.4.2質譜參考條件a)離子源：電噴霧離子源（ESI）；b)掃描模式：正離子模式；c)監(jiān)測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；d)噴霧電壓：3.0kV；e)離子源溫度：150℃;f)離子源溫度:150℃;g)脫溶劑氣溫度:500℃;h)錐孔氣流速:50L/h；i)脫溶劑氣流速:1000L/h；j)二級碰撞氣:氬氣多反應監(jiān)測（MRM)、離子對、碰撞能量參見附錄B。9.5測定方法9.5.1定性分析按照液相色譜-質譜/質譜條件測定試樣和基質混合標準工作溶液，如果檢測的質量色譜峰保留時間與標準物質保留時間相差不超過士2.5%，定性離子對的相對豐度(是用相對于最強離子豐度的強度百分比表示)與濃度相當基質標準工作溶液的相對豐度一致，相對豐度允許偏差不超過表2規(guī)定的范圍，則可判斷試樣中存在對應的被測物。表2定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差>50>20~50>10~20±25±30±509.5.2定量分析根據(jù)試樣中頭孢類藥物的含量情況，選取響應值相近的基質標準工作液一起進行色譜分析。基質標準工作液和待測液中頭孢類藥物的響應值應在儀器線性響應范圍內(nèi)。在上述色譜條件下頭孢類藥物的多反應監(jiān)測(MRM)色譜圖參見附錄C。9.6空白實驗取空白試樣，除不加抗生素外，采用完全相同的步驟進行平行操作。9.7試驗數(shù)據(jù)處理6GB/TXXXX—XXXX采用基質匹配標準曲線定量，試樣中13種頭孢類藥物的含量由液相色譜-質譜/質譜儀的數(shù)據(jù)處理軟件或按公式(1)計算，計算結果需扣除空白值。式中：ρi——樣品中目標化合物x的質量濃度的數(shù)值，單位為微克每升(μg/L）；ρix——由標準曲線得到的試樣中目標化合物x的質量濃度的數(shù)值，單位為納克每升（ng/mL）；V1——試樣定容體積的數(shù)值，單位為毫升（mLV0——取樣體積的數(shù)值，單位為升（L）。測定結果小數(shù)點后位數(shù)的保留與方法檢出限一致，最多保留三位有效數(shù)字。10準確度本方法在5.0ng/L～50.0ng/L添加濃度水平上的回收率為60%～120%。11精密度本方法批內(nèi)相對標準偏差≤15%，批間相對標準偏差≤20%。7GB/TXXXX—XXXX（資料性附錄）13種頭孢菌素類抗生素信息見表A.1。表A.113種頭孢菌素類抗生素信息1234567898GB/TXXXX—XXXX（資料性附錄）13種頭孢菌素類抗生素的多離子反應監(jiān)測條件見表B.1。表B.113種頭孢菌素類抗生素的多離子反應監(jiān)測條件1514.8/1202528.8/133.93458.8/3374356.8/2805347.9/15886455.8/39687349.8/1768441.8/363.9889453.8/285454.8/3238645.8/143523.8/124.8413.8/336.8為定量離子對9GB/TXXXX—XXXX(資料性附錄)頭孢類藥物標準物質多反應監(jiān)測(MRM)色譜圖見圖C.1。圖C.1頭孢類藥物標準物質多反應監(jiān)測(MRM)色譜圖1.頭孢匹羅（3.18min）、2.頭孢喹肟（3.52