現(xiàn)代生化分離技術(shù)SeparationMethodsinBiochemistry第3章沉淀技術(shù)第三章沉淀技術(shù)第3章沉淀技術(shù)第一節(jié)概述沉淀是溶液中的溶質(zhì)有液相變成固相析出的過程，表示一個新的凝結(jié)相的形成過程，或由于加入沉淀劑使某些離子成為難溶化合物而沉積的過程。沉淀VS結(jié)晶，本質(zhì)上同一種過程。同類分子或離子以有規(guī)則排列形式析出——結(jié)晶；以無規(guī)則的紊亂排列形式析出——沉淀。3.1.1沉淀的定義第3章沉淀技術(shù)3.1.2沉淀的類型：晶形沉淀：顆粒最大，其直徑大約在0.1~1μm之間。在沉淀內(nèi)部，離子按晶體結(jié)構(gòu)有規(guī)則地進(jìn)行排列，因而結(jié)構(gòu)緊密，整個沉淀所占的體積較小，極易沉降于容器底部。凝乳狀沉淀：顆粒大小介于上述二者之間，其直徑大約為0.02~1μm，因此其性質(zhì)也介于二者之間。無定型沉淀：顆粒最小，其直徑大約在0.02μm以下。沉淀內(nèi)部離子排列雜亂無章，并且包含有大量水分子，因而結(jié)構(gòu)疏松，體積龐大，難以沉降。第3章沉淀技術(shù)設(shè)備簡單，成本低，小批量生產(chǎn)。（豆腐，膠體凝聚）；有選擇性（不同的溶劑可以沉淀出不同的成分出來）；沉淀劑的選擇要考慮對生物活性的破壞作用和對人體的殘留毒害。3.1.3沉淀技術(shù)的應(yīng)用特點(diǎn)第3章沉淀技術(shù)第二節(jié)沉淀方法的分類鹽析有機(jī)溶劑沉淀等電點(diǎn)沉淀非離子多聚物沉淀其他沉析技術(shù)。第3章沉淀技術(shù)鹽析法—蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度受鹽濃度影響1、基本原理蛋白質(zhì)表面特性蛋白質(zhì)溶解：相似者相溶親水性和疏水性：有利因素：親水性，包括氫鍵、極性基團(tuán)、離子化側(cè)鏈、親水蛋白所占的%等。如白蛋白不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基團(tuán)、疏水蛋白所占的%等。如纖維蛋白原。第3章沉淀技術(shù)蛋白質(zhì)和酶均易溶于水，因?yàn)樵摲肿拥模瑿OOH、－NH2和－OH都是親水基團(tuán)，這些基團(tuán)與極性水分子相互作用形成水化層，包圍于蛋白質(zhì)分子周圍形成1nm~100nm顆粒的親水膠體，削弱了蛋白質(zhì)分子之間的作用力，蛋白質(zhì)分子表面極性基團(tuán)越多，水化層越厚，蛋白質(zhì)分子與溶劑分子之間的親和力越大，因而溶解度也越大。第3章沉淀技術(shù)鹽溶原理：大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象。蛋白質(zhì)分子吸附鹽類離子后，帶電表層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥（同性相斥）；而蛋白質(zhì)與水分子的相互作用卻加強(qiáng)，溶解性增大。第3章沉淀技術(shù)鹽析（破壞水化膜、中和電荷）1、繼續(xù)增大中性鹽離子強(qiáng)度時→大量的鹽奪取了自由水，將其轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水→蛋白質(zhì)膠體外層的水化膜因鹽的奪取而遭到破壞→蛋白質(zhì)膠體表面的疏水區(qū)域暴露出來，彼此相互聚集，沉淀；第3章沉淀技術(shù)2、加入高濃度中性鹽后，鹽離子與生物分子表面的帶相反電荷的離子基團(tuán)結(jié)合，中和了生物分子表面的電荷，降低了生物分子與水分子之間的相互作用，此時生物分子很容易相互聚集，在溶液中的溶解度降得很低，從而形成沉淀從溶液中析出。第3章沉淀技術(shù)2、鹽析公式及討論蛋白質(zhì)溶解度與溶液中離子強(qiáng)度關(guān)系：lgS=β-ksIS，蛋白質(zhì)溶解度（g/L）I=(1/2)∑cizi2β為常數(shù)，I=0時的lgSks為鹽析常數(shù)，與鹽性質(zhì)（離子價數(shù)、離子半徑等）、蛋白結(jié)構(gòu)有關(guān)，ks越大，鹽析效果越好（S越小，越易沉淀）第3章沉淀技術(shù)討論1、KsI項Ks與溶液的pH、溫度無關(guān)，僅取決于蛋白質(zhì)的性質(zhì)和鹽的種類。鹽濃度↑→離子強(qiáng)度I↑→S↓→析出。lgS=β-ksI第3章沉淀技術(shù)2、β值的特性及對鹽析的影響

表示不外加鹽時的理想溶解度S，肯定受到溫度、pH的影響；pH的影響：β在pI時最小（調(diào)節(jié)pH可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)凈電荷數(shù)變化）溫度的影響：高離子強(qiáng)度溶液中，溫度升高一般使β下降（溫度升高利于鹽的溶解，奪取更多的水分子，使蛋白質(zhì)溶解性更差）lgS=β-ksI第3章沉淀技術(shù)3、分段鹽析ks分段鹽析：固定蛋白質(zhì)的pH、T（β）,變動離子強(qiáng)度I達(dá)到沉淀的目的。β分段鹽析：在一定的離子強(qiáng)度下（I），改變?nèi)芤旱膒H、T，達(dá)到沉淀的目。ks分段鹽析用于蛋白質(zhì)粗品的分級沉淀。β分段鹽析用于蛋白質(zhì)進(jìn)一步的精細(xì)分離純化。lgS=β-ksI第3章沉淀技術(shù)3、鹽析操作要點(diǎn)3.1無機(jī)鹽的挑選原則高溶解度，能配置高離子強(qiáng)度的鹽溶液；溶解度受溫度的影響??；鹽溶液的密度不高，便于蛋白質(zhì)沉淀和離心分離；不易引起蛋白質(zhì)的變性；價格低廉；第3章沉淀技術(shù)通常采用中性鹽，最常用（NH4）2SO4，優(yōu)點(diǎn)：1、溶解度大：尤其是在低溫時仍有相當(dāng)高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，因而鹽析操作也要求在低溫下（0～4℃）進(jìn)行。硫銨在0℃時的溶解度70.6g/100mL，Na2SO4-4.9,

NaH2PO4-1.6

3.2鹽的選擇第3章沉淀技術(shù)2、不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有的酶或蛋白質(zhì)用2～3mol/L濃度的（NH4）2SO4保存可達(dá)數(shù)年之久。3、次常用Na2SO4。缺點(diǎn)：在30℃以下溶解度較低，主要用于熱穩(wěn)定蛋白。第3章沉淀技術(shù)3.3鹽析的操作與應(yīng)用3.3.1鹽析的操作方法鹽的處理硫酸銨使用時要求純度較高，生產(chǎn)時為降低成本，一般選用化學(xué)純的硫酸銨，在使用前應(yīng)進(jìn)行預(yù)處理，可通過化學(xué)法將重金屬除去（如通入H2S后過濾），再將硫酸銨重結(jié)晶備用。第3章沉淀技術(shù)加鹽的方法

固體硫酸銨加入法（需要量大時）。將其研成細(xì)粉，在攪拌下緩慢均勻少量多次地加入，接近計劃飽和度時，加鹽的速度更要慢一些，盡量避免局部硫酸銨濃度過大而造成不應(yīng)有的蛋白質(zhì)沉淀。

加入飽和硫酸銨溶液法（需要量小時）。第3章沉淀技術(shù)3.3.2鹽析的影響因素高濃度的蛋白質(zhì)用稍低的硫酸銨飽和度沉淀，若蛋白質(zhì)濃度過高，易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)的共沉淀作用。低濃度的蛋白質(zhì)，共沉淀作用小，但回收率降低。較適中的蛋白質(zhì)濃度是2.5％～3.0％，相當(dāng)于25mg/mL～30mg/mL。蛋白質(zhì)的濃度第3章沉淀技術(shù)

pH值對鹽析的影響在等電點(diǎn)處溶解度小，pH值常選在該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。第3章沉淀技術(shù)溫度的影響

對于蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物大分子，在高離子強(qiáng)度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強(qiáng)度溶液或純水中蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)還是隨濃度升高而增加的。一般情況下，可在室溫下進(jìn)行。但對于某些對溫度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力喪失。第3章沉淀技術(shù)3.3.3沉淀的再溶解1～2倍沉淀體積的下一步所用緩沖液溶解不溶時可能是變性蛋白質(zhì)或雜質(zhì)，離心除去。第3章沉淀技術(shù)3.3.4脫鹽透析超濾凝膠過濾層析over第3章沉淀技術(shù)有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑對于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一，常用丙酮、異丙酮、乙醇、甲醇等定義：向水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法，稱為有機(jī)溶劑沉淀法。第3章沉淀技術(shù)（1）靜電作用：降低水溶液的介電常數(shù)，向溶液中加入有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，帶電的蛋白質(zhì)溶質(zhì)分子之間庫侖引力增強(qiáng)，使其相互吸引而聚集，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。1、原理

第3章沉淀技術(shù)（2）脫水作用由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用。較靜電作用占更主要的地位。

第3章沉淀技術(shù)2、影響有機(jī)溶劑沉析的因素（一）溫度多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機(jī)溶劑中對溫度特別敏感，溫度稍高就會引起變性，且有機(jī)溶劑與水混合時產(chǎn)生放熱反應(yīng)，因此必須預(yù)冷，操作要在冰鹽浴中進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑時必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃。一般規(guī)律是溫度越低，得到的蛋白質(zhì)活性越高。

第3章沉淀技術(shù)（二）樣品濃度樣品較稀時，將增加有機(jī)溶劑投入量和損耗；樣品太濃會增加共沉作用。一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的初濃度以0.5～2%（5~20mg/mL）為好，多糖則以1～2％起始較合適。第3章沉淀技術(shù)（三）

pH值

選擇在樣品穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi)，通常是選在等電點(diǎn)附近，從而提高此沉淀法的分辨能力。第3章沉淀技術(shù)（四）離子強(qiáng)度

少量的中性鹽對蛋白質(zhì)變性有良好的保護(hù)作用，但鹽濃度過高會增加蛋白質(zhì)在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低濃度緩沖液中沉淀蛋白質(zhì)。鹽濃度太大或太小都有不利影響，通常鹽濃度以不超過5%為宜，使用乙醇的量也以不超過原蛋白質(zhì)水溶液的2倍體積為宜。第3章沉淀技術(shù)3、有機(jī)溶劑沉淀法的應(yīng)用（一）有機(jī)溶劑沉析的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：分辨能力比鹽析高,即一種生物分子或其他溶質(zhì)只在一個比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉析；沉析不用脫鹽，過濾比較容易。缺點(diǎn)：是某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進(jìn)行。

第3章沉淀技術(shù)（二）應(yīng)用有機(jī)溶劑沉析技術(shù)經(jīng)常用于蛋白質(zhì)、酶，多糖和核酸等生物大分子的沉析分離。使用時先要選擇合適的有機(jī)劑，然后注意調(diào)控樣品的濃度、溫度、pH和離子強(qiáng)度，使之達(dá)到最佳的分離效果。沉析所得的固體樣品，如果不是立即溶解進(jìn)行下一步的分離，則應(yīng)盡可能抽干沉析物，減少其中有機(jī)溶劑的含量，如若必要可以裝透析袋透析脫除有機(jī)溶劑，以免影響樣品的生物活性第3章沉淀技術(shù)實(shí)例第3章沉淀技術(shù)等電點(diǎn)沉淀法

1、原理調(diào)節(jié)兩性生化物質(zhì)溶液的pH值，以達(dá)到某一生化物質(zhì)的等電點(diǎn)，使其從溶液中沉淀析出而實(shí)現(xiàn)分離的技術(shù)稱為等電點(diǎn)沉析技術(shù)。等電點(diǎn)(pI)是兩性物質(zhì)在其質(zhì)點(diǎn)的凈電荷為零時介質(zhì)的pH值,溶質(zhì)凈電荷為零，分子間排斥電位降低，吸引力增大，能相互聚集起來，沉淀析出，此時溶質(zhì)的溶解度最低第3章沉淀技術(shù)特點(diǎn)等電點(diǎn)沉淀法操作十分簡單，試劑消耗少，給體系引入的外來物也少，是一種有效的蛋白質(zhì)初級分離方法，尤其對疏水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)。其主要優(yōu)點(diǎn)在于很多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都在偏酸性范圍內(nèi)，而無機(jī)酸通常價格低廉，因此可以省去除酸的步驟。第3章沉淀技術(shù)2、應(yīng)用在生化產(chǎn)品的分離純化過程中，常利用兩性物質(zhì)如氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽、酶、核酸等具有不同的等電點(diǎn)的特性來進(jìn)行產(chǎn)品的分離純化。由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨(dú)使用此法分辨率較低，因而此法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。第3章沉淀技術(shù)3、實(shí)例①從豬胰臟中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH3.0左右進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，除去共存的許多酸性蛋白質(zhì)(pI=3．O)。工業(yè)生產(chǎn)胰島素(pI＝5.3)時，先調(diào)pH至8.0除去堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)pH至3.0除去酸性蛋白質(zhì)(同時加入一定濃度的有機(jī)溶劑以提高沉淀效果)。②堿性磷酸酯酶的pI沉淀提?。喊l(fā)酵液調(diào)pH4.0后出現(xiàn)含堿性磷酸酯酶的沉淀物，離心收集沉淀物。用pH9.0的0.1mol/LTris-HCl緩沖液重新溶解，加入20～40%飽和度的硫酸銨分級，離心收集的沉淀Tris-HCl緩沖液再次沉淀，即得較純的堿性磷酸酯酶。第3章沉淀技術(shù)水溶性非離子型聚合物沉淀法定義許多水溶性非離子型聚合物，特別是PEG可用來進(jìn)行選擇性沉淀以純化蛋白質(zhì)。原理聚合物的作用認(rèn)為與有機(jī)溶劑相似，能降低水化度，使蛋白質(zhì)沉淀。此現(xiàn)象和兩水相的形成有聯(lián)系。使低分子量的蛋白質(zhì)沉淀，需加入大量PEG：而使高分子量的蛋白質(zhì)沉淀，加入的量較小。第3章沉淀技術(shù)常用的非離子型多聚物：不同分子量的聚乙二醇（PEG）和葡聚糖PEG：親水性強(qiáng)，溶干水和許多有機(jī)溶劑，對熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量（聚合程度）第3章沉淀技術(shù)PEG是一種特別有用的沉淀劑，因?yàn)闊o毒，不可燃性且對大多數(shù)蛋白質(zhì)有保護(hù)作用。PEG沉淀法能在室溫下進(jìn)行，得到的沉淀顆粒較大，收集容易。PEG的分子量需大于4000，最常用的是6000和20000。所用的PEG濃度通常為20％，濃度再高，會使粘度增大，造成沉淀的回收比較困難。PEG對后續(xù)分離步驟，影響較少，因此可以不必除去。但它的存在會干擾A280和Lowry法測定蛋白質(zhì)．第3章沉淀技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：室溫條件下操作；沉淀的顆粒往往比較大；不容易破壞蛋白質(zhì)活性。缺點(diǎn)：所得的沉淀中含有大量的PEG

第3章沉淀技術(shù)其他沉析技術(shù)一、成鹽沉淀法金屬離子沉淀法：蛋白質(zhì)在堿性溶液中帶負(fù)電荷，能與金屬離子形成金屬復(fù)合鹽沉淀。常用的金屬離子Zn2+、Ca2+、Pb2＋有機(jī)酸沉淀法：含氮有機(jī)酸如苦味酸和鞣酸等能夠與有機(jī)分子的堿性功能團(tuán)形成復(fù)合物而沉淀析出。無機(jī)酸沉淀法：磷鎢酸、磷鉬酸等能與陽離子形式的蛋白質(zhì)形成溶解度極低的復(fù)合鹽，從而使蛋白質(zhì)沉淀析出特點(diǎn)：常使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的沉淀，應(yīng)用時必須謹(jǐn)慎。第3章沉淀技術(shù)二、選擇性變性沉淀法選擇變性沉析法原理是利用蛋白質(zhì)、酶與核酸等生物大分子對某些物理或化學(xué)因素敏感性不同，而有選擇地使之變性沉析，以達(dá)到目的物與雜蛋白分離的技術(shù)，稱為選擇變性沉淀。1、選擇性熱變性2、選擇性酸堿變性3、選擇性變性劑第3章沉淀技術(shù)熱沉淀定義在較高溫度下，熱穩(wěn)定性差的蛋白質(zhì)將發(fā)生變性沉淀，利用這一現(xiàn)象，可根據(jù)蛋白質(zhì)間的熱穩(wěn)定性的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)的熱沉淀，分離純化熱穩(wěn)定性高的目標(biāo)產(chǎn)物。適用對象：熱穩(wěn)定性高的蛋白質(zhì)第3章沉淀技術(shù)實(shí)例酵母干粉中加