第3章同位素示蹤技術(shù)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)

齊孟文第3章同位素示蹤技術(shù)第3章同位素示蹤技術(shù)同位素示蹤

通過同位素標記核素或同位素標記化合物跟蹤研究相關(guān)物體運動過程及其規(guī)律的一種研究方法?！?.1同位素示蹤的基本依據(jù)和特點

第3章同位素示蹤技術(shù)

依據(jù)放射性同位素元素的同位素具有1)化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)同一的示蹤性2)物理性質(zhì)差異的可探測性穩(wěn)定性同位素元素的同位素具有1)化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)同一的示蹤性2)物理性質(zhì)差異的可探測性3)同位素的天然組成恒定第3章同位素示蹤技術(shù)第3章同位素示蹤技術(shù)在水文、地理及生物學(xué)中，相關(guān)周期表中的同位素要覽。點擊黃色標注的元素，即可鏈接到相應(yīng)網(wǎng)頁，可獲得關(guān)于其特性及應(yīng)用的簡要說明。LINK：USGS（U.S.GeologicalSurvey）第3章同位素示蹤技術(shù)第3章同位素示蹤技術(shù)特點放射性

1.測量靈敏度高活度檢測限Amin=1Bq,相應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)量檢測限10-12～10-17g

2.能與內(nèi)源物質(zhì)相區(qū)分，可在生理穩(wěn)恒條件進行代謝研究。

3.樣品制備及測定簡便。

4.結(jié)合顯影或顯像技術(shù)可進行定位定量或半定量測定。穩(wěn)定性

1.現(xiàn)代質(zhì)譜核素豐度測定的精度可達0.01%.

2.利用同位素稀釋原理可計算樣品中的物質(zhì)來自示蹤劑的比率。

3.樣品制備分析需大型設(shè)備。

4.無放射性，無衰變，無污染。有時是唯一的。第3章同位素示蹤技術(shù)

§3.2標記核素與標記化合物

3.2.1放射性同位素常用放射性核素

核素半衰期衰變方式β粒子(MeV)γ射線(MeV)3H12.3yβ-(100)0.018614C5730yβ-(100)0.15632P14.28dβ-(100)1.71135S87.4dβ-(100)0.16745Ca165dβ-(100)0.25859Fe44.6dβ-(100)0.274(45.8)0.467(52.7)1.566(0.3γ….第3章同位素示蹤技術(shù)3.2.1放射性同位素標記化合物化合物分子中某一元素的一個或數(shù)個普通核素原子被其放射性同位素核素原子所替代。1)標記方式均勻標記［U］

標記原子在相應(yīng)位置均勻分布，豐度相同，由生物合成產(chǎn)生。

不定位標記[G]

標記原子在相應(yīng)位置豐度不同，由同位素交換法產(chǎn)生。定位標記

標記原子在分子中有確定位置，由化學(xué)合成產(chǎn)生。第3章同位素示蹤技術(shù)2)制備有機合成

簡單標記化合物

復(fù)雜標記化物如：生物合成

飼喂標記前體→生物系統(tǒng)→生物大分子標記化合物。第3章同位素示蹤技術(shù)

生物合成示例第3章同位素示蹤技術(shù)同位素交換

RH+T2RT+HT

RH+T2ORT+THO

氚標可用所謂的氣爆法進行.把底物涂到石英瓶內(nèi),抽真空后,充入氚氣,通過高頻放電或紫外光照射使氚氣活化,促進交換.反應(yīng)結(jié)束,抽吸剩余氚氣,用易揮發(fā)溶劑轉(zhuǎn)移產(chǎn)物,最后除去溶劑.第3章同位素示蹤技術(shù)3)特點組成及總量不恒定放射性純度

所需放射性核素的活度占標記化合物制劑總放射性活度的百分數(shù)。放化純度

在制劑中，標記核素在特定標記化合物中的活度占該核素總活度的百分數(shù)。放化純度可用放射性薄層分析測定。第3章同位素示蹤技術(shù)放化純度說明示例

如碘-131的NaI制劑，除131I-，還可能有131I2，若放化[I-131]NaI的放化純度>95%，則表示以其他化學(xué)狀態(tài)存在的碘131<5%。第3章同位素示蹤技術(shù)輻射自分解

標記化合物的輻射對其自身所產(chǎn)生的離解作用。微量和低濃度

操作量為微居里(10-7-１０-14g)，因濃度低，單獨不易沉淀，并易吸附損失，在操作時常需加入同位素載體，以避免吸附或進行共沉淀。第3章同位素示蹤技術(shù)4)貯藏開瓶分裝,降低放射性溶液的濃度，降低比活度。低溫(2-4℃)及避光保存。第3章同位素示蹤技術(shù)3.2.2穩(wěn)定性同位素名詞核素的豐度

一種核素在其所屬元素的同位素原子中所占的原子百分數(shù)。核素的自然豐度核素在自然狀態(tài)下的豐度。核素的原子百分超核素的豐度較自然豐度超出的部分。第3章同位素示蹤技術(shù)常用核素

常用的穩(wěn)定性示蹤核素列表ElementHeavyisotopesLightisotopesH2D(0.0156%)1H(99.9844%)N15N(0.366%)14N(99.634%)C13C(1.108%)12C(98.892%)S36S(0.02%)

34S(4.22%)32S(95.02%)

33S(0.75%)O18O(0.204%)16O(99.759%)

17O(0.037%)第3章同位素示蹤技術(shù)標記化合物

通過富集標記元素的稀有同位素核素或貧化其普通同位素核素所形成的化合物，以及核素的自然豐度因環(huán)境而異有較大的同位素分餾變異，帶有原位標記“指紋”特點的化合物。第3章同位素示蹤技術(shù)第3章同位素示蹤技術(shù)第3章同位素示蹤技術(shù)第3章同位素示蹤技術(shù)§3.3試驗設(shè)計的一般原則和程序3.3.1放射性同位素示蹤示蹤劑的選擇考慮因素核素(射線種類、能量和半衰期)，標記方式。

例：有機磷農(nóng)藥馬拉硫磷殘留研究，14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ標記均可，降解中的去甲基作用(14Ｃ～CH3—)，酯鍵的水解作用(14Ｃ，３Ｈ～Ｃ2Ｈ5—)，硫代磷酸脂鍵的反應(yīng)，用32P或15Ｓ標記。第3章同位素示蹤技術(shù)示蹤劑量的估算引入量

標記化合物的用量，按一般實驗要求確定。放射性總活度或比活度，要求能被精確測量，而又不過強。

分無或有內(nèi)源物示蹤兩種情況討論。第3章同位素示蹤技術(shù)無內(nèi)源

此種情況下，示蹤劑在系統(tǒng)中未被稀釋,化合物的比活度不變，示蹤劑的比活度可由對樣品活度的要求直接估計得到。

式中,nmin～樣品的最小計數(shù)，最好為2000-4000cpm;

～儀器的計數(shù)效率；W～試樣重量；C～樣品中示蹤物的含量。

若實驗期間,放射性有明顯衰變,應(yīng)進行衰變校正。

第3章同位素示蹤技術(shù)舉例

無內(nèi)源物質(zhì)的示蹤試驗,如農(nóng)藥殘留試驗,試樣重1克,要求計數(shù)率達到2400cpm,已知儀器的探測效率為80%,若要求對樣品的檢測靈敏度為0.1ppm,問示蹤標記化合物的比活度至少為多少.第3章同位素示蹤技術(shù)有內(nèi)源

此種情況下，示蹤劑在系統(tǒng)中被稀釋。對示蹤劑比活度的估計，除要考慮儀器的探測效率和實驗期間放射性衰減外，必需考慮稀釋作用的影響。示蹤劑的比活度可由如下兩種方法之一估計。

估值法

式中，W，C為試樣重及物質(zhì)濃度或含量；Pdff為來自示蹤劑的比率。第3章同位素示蹤技術(shù)倒推法

以盆栽為例，設(shè)植株總重M2

，試樣重M1

最低計數(shù)率n(n≧4nb本底)?？紤]：不均勻分布因子P1

試樣的平均計數(shù)率：

儀器的探測效率

試樣的活度：總樣本量M2,

供試植株的總活度：第3章同位素示蹤技術(shù)驗期間的衰變引入時植株的活度：

A3＝Ａ2Ｐ2

，植株的吸收利用率應(yīng)引入的活度：

回代得到：第3章同位素示蹤技術(shù)舉例

有內(nèi)源物示蹤實驗示蹤劑引入量的估計。以32P標記肥料實驗為例，設(shè)實驗持續(xù)100d,測量樣品量取1g,植物平均含磷0.4%，其中來自肥料的比里率為Pdff(10%-50%),按25%估算，若樣品用固閃杯法測量，儀器的探測效率為80%，要求計數(shù)率為2000cpm,試估算32P標記肥料的比活度。第3章同位素示蹤技術(shù)示蹤劑的準備開瓶分裝對商業(yè)制劑進行必要稀釋和轉(zhuǎn)化的操作。工作程序

1.核查包裝說例磷—32標記磷酸氫鈉制劑

1)標記化合物名稱Na２Ｈ３２ＰＯ4

2)物理化學(xué)狀態(tài)溶液，無色透明

3)溶液體積5mci/ml4)比活度0.5mci/mmol5)放射性總活度2.5mci6)放射化學(xué)純度100%7)測定日期2000.3.128)包裝情況安培瓶盛裝，再置鋁罐內(nèi)。2.確定稀釋倍數(shù)濃度稀釋關(guān)系

S0V0=S1V1式中，S0、S1和V0、V1分別為稀釋前后制劑的放射性濃(μci/ml)，及體積。

比活度稀釋關(guān)系:a0m0=a1(m0+m1)式中，a0、a1分別為標記化合物稀釋前后的比活度，m0和m1為標記化合的質(zhì)量和所加穩(wěn)定性同位素載體的質(zhì)量。第3章同位素示蹤技術(shù)示蹤劑的準備3.開瓶分裝操作采用屏蔽和時間防護等措施，妥善處理廢物。4.使用前測定活度及放化純度，必要時應(yīng)純化。第3章同位素示蹤技術(shù)示蹤劑的引入植物體

根部水培、沙培、土培。

地上部涂抹法、注射法、點滴法。

動物體

注射法、涂布滲入法、吸入法。第3章同位素示蹤技術(shù)示蹤劑引入系統(tǒng)示例1．JimRasmussen,elat,2007.SoilBiology＆Biochemistry39,804-815.研究目的：套種體系碳、氮的轉(zhuǎn)移、沉積和淋溶動態(tài)。實驗布置：田間微區(qū)，插入PVC柱，內(nèi)徑30cm。示蹤劑：14C-尿素，15N-尿素。標記方法：葉緣吸收。植物葉片插入到盛有示蹤液的小管，小管由布拉膜密封，持續(xù)標記5天。14C-尿素標記用2ml管,盛1ml標記液，活度7.7×106dpm(3.5

Ci);15N-尿素用5ml管,盛2ml0.75%(w/v)豐度為99%的15N-尿素標記液。在整個生育期14C標記重復(fù)3次，15N標記重復(fù)5次。第3章同位素示蹤技術(shù)2.JessicaL.Butler,elat,2004.SoilBiology＆Biochemistry36,371-382.研究目的：新固定的光合作用產(chǎn)物在植物根際的分布與周轉(zhuǎn)。實驗布置：盆栽。示蹤劑：13CO2.標記方法：整株飼喂。盆栽植物移入氣密的透明有機玻璃光合室進行標記，光合室長×寬×高為40.5×40.5×58.5cm3,每次標記11個盆。13CO2在光合室直接發(fā)生,標記開始時監(jiān)測光合室CO2的濃度約為200ppm(v/v)，滴入1.5ml1.5M乳酸到盛有含22.4mgNaH13CO3(13C豐度為99%),此時光合室CO2的濃度大約升到約600ppm,待CO2的濃度降到200ppm，再在另一個含22.4mgNaH13CO3管中發(fā)生13CO2,此時CO2升至400ppm,待其再次降到200ppm，將標記盆移走，放入另一光合室內(nèi)一段時間，以便使呼出的13CO2被固定，使標記最大化。第3章同位素示蹤技術(shù)3.Florianwechern,elat,2007.SoilBiology＆Biochemistry39,2527-2537.研究目的：土壤根源性C和N的沉積及其歸宿。實驗：田間小區(qū)。示蹤劑：14C-蔗糖，15N-尿。標記方法：莖部飼喂。標記溶液1ml濃度2%(w/v),13C豐度為99%的蔗糖和濃度0.5%(w/v)，15N豐度為99%的尿素。引入方法,在距根部約3cm的莖處鉆0.5mm的洞，用燈芯與盛標記溶液的帶蓋試管相連，用硅膠密封連接處。

第3章同位素示蹤技術(shù)

示蹤研究舉例

14CO2植物光合生理研究

目的：

測量光合強度，同化物的運轉(zhuǎn)與分配，運轉(zhuǎn)機理，源與庫的關(guān)系及其調(diào)節(jié)，研究作物高產(chǎn)的光合生理。

1）14CO2標記

(14CO2+12CO2)的發(fā)生。

反應(yīng)方程

(HClO4,H3PO4)Ba14CO3+Na2CO3

(14CO2+12CO2)第3章同位素示蹤技術(shù)有關(guān)計量參量

光合作用二氧化碳的飽濃度為（0.12%-0.18%），一般向光合作用室引入0.1%～0.2%濃度,最高不0.5%,4CO2的放射性濃度(a)：整株標記，5

Ci/L；標記單個器官，幾百kBq/L；標記大型樹木，100

Ci/L。

設(shè)光合作用室的體積為V(L),二氧化碳的濃度為C(%),則,所需載體Na2CO3：第3章同位素示蹤技術(shù)Na2CO3+2HClO4CO2+2NaClO4+H2O10622.4XV

C所需Ba14CO3的活度A=V

a發(fā)生過程：在光合作用室內(nèi)直接發(fā)生，或預(yù)先在實驗室發(fā)生，標記時注射法引入。第3章同位素示蹤技術(shù)2）標記過程

光合室用聚氯乙?。蚧虿豢颍┓鈬┰圀w，扎緊，保證氣密，在袋上封扎進氣軟膠皮導(dǎo)管。用注射器定量吸取發(fā)生好的(14CO2+12CO2）注入光合室，爆光30min后，抽出殘氣，用NaOH吸收。第3章同位素示蹤技術(shù)第3章同位素示蹤技術(shù)3）測樣方法固樣1050C殺青,800C烘干，磨碎.取100mg，低本底計數(shù)或固閃杯法測量。液樣用堿濕消化或然燒法制樣后用液閃測量。第3章同位素示蹤技術(shù)4）結(jié)果分析14C分配率第3章同位素示蹤技術(shù)樣品的采集和制備采集

代表性

四分法縮減取樣。

防止交叉污染

按活度由低到高順序制備樣品。制備

把樣品轉(zhuǎn)化為適合測量與分析的形態(tài),由析對象和測量方式?jīng)Q定。第3章同位素示蹤技術(shù)

液閃樣品的制備均相樣品在閃爍液中形成溶液。測量方式非均相乳濁液、懸浮液。固體支持樣品吸附于濾膜再侵入閃爍液。均相樣品制備法1）溶劑提取法

侵漬法樣品→勻漿→振蕩提取→離心過濾濃縮。索氏抽提用索氏器回流提取。第3章同位素示蹤技術(shù)2）消化法酸消化:

0.2～0.6ml60%HClO450～100mg樣品0.2～0.4mlH2O2注意14C有可能形成14CO2

，該法淬滅較堿消化法的大。堿消化:常用無機堿或季胺堿：1ml2MNaOH+80～100mg樣品

2ml1～1.5M海胺甲醇液+400-450mg樣品

第3章同位素示蹤技術(shù)3)燃燒法

14CO2被堿性吸收液吸收樣品

T2O吸收液配方：甲苯480ml

乙氧基乙醇400ml

乙醇胺120ml對14ＣＯ2的回收率的96-98%PPO6gPOPOP0.2g第3章同位素示蹤技術(shù)3)燃燒法

甲苯800ml

乙氧基乙醇200mlPPO5g對3H水的回收率為96-98%POPOP0.2g乳化樣品：使樣品在閃爍體系中形成膠體或乳濁液。700ml甲苯+300mlTritonx100+PPO(5g)+POPOP(0.5g)

固體支持：樣品滴加或沉淀在濾膜(濾紙、玻璃纖維、醋酸纖維)，干燥后浸入閃爍液，相對測量。第3章同位素示蹤技術(shù)放射性測量數(shù)據(jù)的處理1.射性計數(shù)的統(tǒng)計漲落

由于核衰變受隨機過程支配，在測量條件及源強不變條件下，放射性測量計數(shù)不是定值，而是圍繞某一定值上下漲落的隨機變數(shù)，在計數(shù)N＞100時，其分布可用正態(tài)分布描述：第3章同位素示蹤技術(shù)實例樣品12345678910Ni(2min)1880,1887,1915,1851,1874,1853,1931,1866,1980,1893樣品11121314151617181920Ni(2min)1976,1876,1901,1979,1836,1832,1930,1917,1899,1890第3章同位素示蹤技術(shù)1.放射性計數(shù)的統(tǒng)計漲落式中,M和

分別是分布的數(shù)學(xué)期望值和標準差，對于放射性計數(shù)特別有

＝，即只有一個獨立的統(tǒng)計特征量。計數(shù)N出現(xiàn)在M±μ

區(qū)間的概率：第3章同位素示蹤技術(shù)2.統(tǒng)計誤差由一次測量結(jié)果或有限次測量的平均值作為計數(shù)期望值的估計所引起的誤差,一般用標準差σN表示：結(jié)果表示為：

標準誤差的統(tǒng)計意義:由正態(tài)分布知，任何一個計數(shù)落在M±σ區(qū)間的概率:P(｜N-M｜＜σ)＝68.3%反過來有:因此，標準誤差表示N±σN區(qū)間包含真平均值的概率為68.3%。第3章同位素示蹤技術(shù)3.函數(shù)統(tǒng)計誤差的運算函數(shù)Z＝f(x,y)的誤差傳遞公式第3章同位素示蹤技術(shù)3.函數(shù)統(tǒng)計誤差的運算1)計數(shù)率的誤差計算上列第一次測量的計數(shù)率及誤差。解:第3章同位素示蹤技術(shù)3.函數(shù)統(tǒng)計誤差的運算2)平均計數(shù)的誤差

3)平均計數(shù)率的誤差計算實例所列數(shù)據(jù)的平均計數(shù)率及誤差。解:第3章同位素示蹤技術(shù)3.函數(shù)統(tǒng)計誤差的運算3)平均計數(shù)率的誤差4)凈計數(shù)率的誤差，扣除本底的計率

第3章同位素示蹤技術(shù)3.3.2穩(wěn)定性15Ｎ同位素示蹤示蹤核素的豐度選擇以15Ｎ肥料利用率試驗為例:式中：W～施肥量或產(chǎn)量，N～含氮量(%)，a～原子百分超，R～肥料利用率，f、p～肥料或植物.樣品采集與制備采集：代表性和防止交叉污染。第3章同位素示蹤技術(shù)制備：將樣品中的氮轉(zhuǎn)變成N2

供質(zhì)譜或光譜分析15Ｎ豐度.1)凱氏—里屯伯格法凱氏消煮植物0.3-0.5g

(1-1.5mgN)+5-10mlH2SO4土壤1-2g

2小時清亮后，繼續(xù)

5小時第3章同位素示蹤技術(shù)蒸餾定氮

在堿性條件，將氨蒸出并被硼酸吸收，然后用H2SO4滴定測量全N。樣品全N含量

式中,V1

，V0—樣品和對照消耗酸的體積

，V2—消煮液的定容體積，V3用于蒸餾定氮的消煮液體積。第3章同位素示蹤技術(shù)過程

3ml10MNaOH/ml消煮液部分消煮液定容蒸餾2%H3BO4（+指示劑)吸收滴定酸化濃縮(2-3ml)密封保存里屯伯格轉(zhuǎn)化將銨轉(zhuǎn)化成N2，為防止大氣中N2的稀釋在高真空裝置進行。

2NH4+＋３NaBrO+2OH-N2