1發(fā)布2015-02-27發(fā)布2015-03-01實(shí)施發(fā)布 II 2 2 2 3 4 6 本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。孫潔、陶虹、廖立珊、唐金明、陳書琨、葉奕優(yōu)、1非洲豬瘟病毒抗體檢測阻斷酶聯(lián)免疫吸附法GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和SN/T2123出入境動物檢疫實(shí)驗(yàn)樣品蛋白抗體，就會與包被抗原發(fā)生反應(yīng)，從而阻斷下一步酶標(biāo)抗非洲豬瘟病毒p54蛋白單克隆最終的顯色反應(yīng)就越淺，因此可通過酶標(biāo)儀讀數(shù)來判定待檢血清樣品中抗體的含量。ASF：非洲豬瘟。ASFV：非洲豬瘟病毒。2a)主要菌株與質(zhì)粒:pET-52b(+)3C/LIC-p54重組表達(dá)質(zhì)粒（含ASFVp54目的基因，片段大小為552bp）；感受態(tài)細(xì)胞BL21(b)主要試劑:LB培養(yǎng)基；PCR反應(yīng)母液；瓊脂糖凝膠；IPTG；氨芐青霉素；細(xì)菌細(xì)胞蛋白裂解液；液體石蠟；胎牛血清；IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)液；ELISA包被液；封閉液；稀釋液；顯色液；終止液。具體配制方法見附錄A。非洲豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陰性血清微量移液器（10μL、100μL、1000μ3采用引物對（上游引物序列為5’-ATGGATTCTGAATTTTTTCA-3’，下游引物序列為增出552bp的特異性條帶，具體核苷酸序列可參考7.3ASFVp54蛋白抗原的表達(dá)、將含pET-52b(+)3C/LIC-p54重組表達(dá)質(zhì)粒載體的BL21(DE3)宿主細(xì)胞，在含100mg/L氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落，接種于2mL含100mg/L氨芐青霉7.3.2.1將7.3.1中收集的菌液在4℃300沉淀，4℃3000r/min離心15min，去上清。用細(xì)菌細(xì)胞蛋白裂解液重懸菌體，冰7.3.3.1性狀真空凍干保存的非洲豬瘟病毒p54重組蛋7.3.3.2濃度測定復(fù)溶后蛋白質(zhì)濃度應(yīng)不低7.3.3.3純度測定采用SDS對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果只在28ku大小處結(jié)果應(yīng)在28ku大小處出現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)條帶。采用非洲豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽性血清對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫7.3.3.5貯藏與有效期置2～8℃貯藏，有效期為4藏中心（CCTCC武漢）保藏（細(xì)胞株保藏號：C2014212由深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研采用商業(yè)辣根過氧化物酶標(biāo)記試劑盒對單克隆抗體進(jìn)行酶標(biāo)記，分裝冷凍8.3.2.2濃度測定蛋白含量應(yīng)不低于1.0mg/m8.3.2.3效價(jià)測定用7中制備的p54蛋白抗原（2.5μg/mL包被ELISA板進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，HRP標(biāo)記抗體1：1000稀釋，OD9.1.1非洲豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽性血清來源9.1.2非洲豬瘟陽性血清的檢驗(yàn)及貯藏9.1.2.3效價(jià)檢驗(yàn)用ASF國際參考ELISA試劑盒試驗(yàn)，PI值大于80%。59.2.1非洲豬瘟陰性對照血清來源采自3月齡健康豬血清，經(jīng)ASF國際參考ELISA試劑盒試驗(yàn)，檢測為陰9.2.2非洲豬瘟陰性血清的檢驗(yàn)及貯藏9.2.2.2無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》第三部附9.2.2.3效價(jià)檢驗(yàn)國際參考試劑盒試驗(yàn)檢測PI值小于40。9.3待檢血清樣品的準(zhǔn)備樣品保存等操作可按《出入境動物檢疫實(shí)驗(yàn)樣品采集、運(yùn)輸和保存9.4阻斷ELISA試驗(yàn)操作9.4.1包被9.4.2洗板9.4.3封閉每孔加封閉液100μL，37℃反應(yīng)1h。9.4.4洗板9.4.5加樣板，每份樣品做兩孔，每孔50μL；37℃反應(yīng)1h。9.4.6洗板），69.4.9洗板9.4.10加底物液每孔加50μL底物液，37℃作用10min。9.4.11加終止液9.4.12結(jié)果讀取當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清PI值≥80%，而標(biāo)準(zhǔn)陰性血清OD值≥1.0時(shí)，試驗(yàn)成立。則待檢樣品可按下表判定，可疑樣品需重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果仍為可疑則7A.30.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液（P磷酸二氫鈉磷酸氫二鈉A.4包被液：0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液A.5洗滌液（0.01mol/LpH7.4PBS0.05%Tween-20，PBST）8KH2PO4Tween-200.A.7底物液A.7.3工作底物液配制：臨用前配制。9水1atggattctgaattttttcaaccggt61gtcaccccaccaagcttcttctcca121ttagtcattattatcatc181gccgctattgaggaggaagatatacagt241gaagtcactccacaaccaggtacctctaaaccggctgga301aaaccagtcacgggcagaccggcaacaaacagaccag