C基因工程的理論基礎1基因工程的基本概念B基因工程的基本形式A基本定義第十章基

因

工

程導論第十章基因工程導論A基本定義1基因工程的基本概念

基因工程是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)。因此，供體、受體、載體是基因工程的三大基本元件。第十章基因工程導論1基因工程的基本概念廣義的基因工程是指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設計與應用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達的設計與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；而下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。第十章基因工程導論基因工程(geneengineering)常和以下名稱混用:遺傳工程(geneticengineering);基因克隆(genecloning);分子克隆(molecularcloning);基因操作(genemanipulation);重組DNA技術(shù)(recombinationDNAtechnique)克隆(clone):作名詞時指含有某目的DNA片段的重組DNA分子或含有該重組分子的無性繁殖系.作動詞時是指基因的分離與重組過程。第十章基因工程導論基因工程的操作過程轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴增（轉(zhuǎn)、增）DNA的體外重組（切、接）第十章基因工程導論基因工程的操作過程切接轉(zhuǎn)增檢第十章基因工程導論B基因工程的基本形式1基因工程的基本概念第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表達經(jīng)典基因工程第二代基因工程蛋白編碼基因的定向誘變蛋白質(zhì)工程第三代基因工程代謝信息途徑的修飾重構(gòu)途徑工程

第四代基因工程基因組或染色體的轉(zhuǎn)移基因組工程第十章基因工程導論C重組DNA技術(shù)的理論基礎19世紀中孟德爾

豌豆雜交試驗

遺傳因子

經(jīng)典遺傳學20世紀初摩爾根

果蠅雜交實驗

基因

基因?qū)W1944年艾弗瑞

肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗

遺傳物質(zhì)DNA1973年伯格-杰克森-考恩-鮑耶

DNA分子體外拼接分子遺傳學1953年沃森-克瑞克

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)

分子生物學基因工程第十章基因工程導論2

基因工程的基本條件C用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細胞B用于基因克隆的載體A用于核酸操作的工具酶第十章基因工程導論A用于核酸操作的工具酶2

基因工程的基本條件限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶第十章基因工程導論限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵細菌的限制與修飾作用hsdR：編碼限制性核酸內(nèi)切酶hsdM：編碼限制性甲基化酶hsdS：編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出

HindII和HindIII

第十章基因工程導論限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的類型主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+識別序列TGAN8TGCT旋轉(zhuǎn)對稱序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位點距識別序列1kb處識別序列內(nèi)或附近距識別序列下游隨機性切割特異性切割24-26bp處第十章基因工程導論限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名種名株名HindIII

HindIIIHaemophilusinfluenzae

d嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶第十章基因工程導論限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點第十章基因工程導論EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHP第十章基因工程導論PstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP第十章基因工程導論PvuII等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’第十章基因工程導論DNA連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)修復雙鏈DNA上切口處的磷酸二酯鍵DNA連接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknick第十章基因工程導論DNA連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)修復與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上切口處的磷酸二酯鍵T4-DNA連接酶5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’第十章基因工程導論ds-DNA結(jié)構(gòu):切口,缺口,斷口缺口(gap)切口(nick)斷口(cut)3'HOP5'3'HOP5'第十章基因工程導論DNA連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)連接多個平頭雙鏈DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA連接酶第十章基因工程導論載體的功能及特征載體的功能運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞為外源基因提供復制能力或整合能力為外源基因的擴增或表達提供必要的條件第十章基因工程導論載體的功能及特征載體應具備的條件具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）

具有合適的篩選標記具有較高的外源DNA的載裝能力具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點第十章基因工程導論質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒是生物細胞內(nèi)固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子質(zhì)粒常見于原核細菌和真菌中絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1-300kb第十章基因工程導論質(zhì)粒質(zhì)粒的構(gòu)建天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎進行人工構(gòu)建。目前實驗室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：pSC101

8.8kb拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標記基因TcrColE16.5kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內(nèi)毒素標記基因E1RSF2124ColE1衍生質(zhì)粒氨芐青霉素抗性標記基因Apr第十章基因工程導論質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復制pBR322：氯霉素可擴增拷貝數(shù)50-100/cell用于基因克隆第十章基因工程導論質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18/19：拷貝數(shù)2000-3000/cell用于基因克隆和測序裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標記lacZ’第十章基因工程導論質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18/19：正選擇標記lacZ’的顯色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal第十章基因工程導論噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體的生物學特性：

生物結(jié)構(gòu)l噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體l噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成

l-DNA全長48502個核苷酸l-DNA上至少有61個基因第十章基因工程導論l噬菌體生物學特性：

生物結(jié)構(gòu)5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l-DNA第十章基因工程導論噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學特性：

感染周期體內(nèi)包裝100個左右的拷貝包裝范圍為原DNA的75-105%即36-51kbDA第十章基因工程導論噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長度，可以提高裝載量。其實野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體：插入型載體取代型載體第十章基因工程導論噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度插入型載體體外包裝插入位點體外包裝插入片段載體長度37kb插入片段大?。?-14kb（51–37）第十章基因工程導論噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度取代型載體體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長度10kb（51–26）載體長度26kb插入片段最大裝載長度25kb（36–26）第十章基因工程導論噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA重組分子的體外包裝：l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導入受體細胞用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時，當且僅當這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合后，包裝才能有效進行，任何一種蛋白包裝液被重組l-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設計的第十章基因工程導論考斯質(zhì)粒考斯質(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有1978年Collins和Hohn發(fā)明構(gòu)建pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNAcos序列和質(zhì)粒復制子的特殊類型的載體cossite-carryingplasmid1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段裝載范圍為31-45kb第十章基因工程導論考斯質(zhì)?？妓官|(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的特點：能像l-DNA那樣進行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細胞

裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質(zhì)粒那樣在受體細胞中自主復制重組操作簡便，篩選容易不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細胞第十章基因工程導論人造染色體載體

人類、動物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千kb的DNA片段，此時考斯質(zhì)粒的裝載量也遠遠不能滿足需要。將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復制并遺傳。目前常用的人造染色體載體包括：細菌人造染色體（BAC）酵母人造染色體（YAC）第十章基因工程導論人造染色體載體酵母人造染色體（YeastArtificialChromosomesYAC）YAC載體應含有下列元件：

酵母染色體的端粒序列

酵母人造染色體的構(gòu)建：pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色體的復制子

酵母染色體的中心粒序列

酵母系統(tǒng)的選擇標記大腸桿菌的復制子

大腸桿菌的選擇標記YAC載體的裝載量為350-400kb第十章基因工程導論人造染色體載體酵母人造染色體（YeastArtificialChromosomesYAC）酵母人造染色體的使用：pYAC4CENEcoRIURATELBamHITELoriAprTRPARSEcoRIEcoRIEcoRIBamHI連接轉(zhuǎn)化酵母菌重組酵母染色體第十章基因工程導論第十章基因工程導論C用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細胞3基因工程的基本條件各種基因工程受體的特性實驗室常用的基因工程受體受體細胞應具備的條件第十章基因工程導論受體細胞應具備的條件限制性缺陷型外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）重組整合缺陷型用于基因擴增或高效表達的受體細胞（recA-）具有較高的轉(zhuǎn)化效率具有與載體選擇標記互補的表型感染寄生缺陷型防止重組細菌擴散污染，生物武器除外

第十章基因工程導論實驗室常用的基因工程受體大腸桿菌用于接受質(zhì)粒：C600、W3110、HB101、JM83、 JM101（Aps、Tcs、Cms）

用于接受l-DNA：LE392、ED8654

酵母菌哺乳動物細胞CHO畢赤酵母啤酒酵母第十章基因工程導論3

基因工程的操作過程C轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）B重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴增（轉(zhuǎn)、增）ADNA的體外重組（切、接）第十章基因工程導論3

基因工程的操作過程切接轉(zhuǎn)增檢第十章基因工程導論ADNA的體外重組（切與接）3

基因工程的操作過程同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接不同粘性末端的連接粘性末端的更換人工粘性末端的連接重組率第十章基因工程導論同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG第十章基因工程導論B重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴增（轉(zhuǎn)與增）3

基因工程的操作過程轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化細胞的擴增第十章基因工程導論轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)Ca2+誘導的完整細菌細胞的轉(zhuǎn)化Ca2+誘導的完整細胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現(xiàn)空隙，細菌細胞此時的狀態(tài)叫做感受態(tài)

第十章基因工程導論轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)電穿孔轉(zhuǎn)化將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強大電場的作用下，細菌細胞壁和細胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進入細胞內(nèi)電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻毎诮Y(jié)構(gòu)的受體細胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大同樣的原理，電穿孔法也可用于質(zhì)粒消除實驗第十章基因工程導論C轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）3

基因工程的操作過程由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子轉(zhuǎn)化子重組子目的重組子第十章基因工程導論載體遺傳標記檢測抗藥性篩選法ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIApr抗藥性篩選法的基本原理：

pBR3224363bpori抗藥性篩選法可區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子將外源DNA片段插在EcoRI位點：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcr將外源DNA片段插在BamHI位點：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcs第十章基因工程導論載體遺傳標記檢測抗藥性篩選法抗藥性篩選法的基本操作：

先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Ap的平板再將Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至含有Ap和Tc的平板上

在Ap平板上生長、但在Ap和Tc平板上不長的轉(zhuǎn)化子即為

ApAp+Tc影印挑選重組子

第十章基因工程導論載體遺傳標記檢測顯色篩選法顯色篩選法的基本操作：

pUC18AprlacZ'oriAp+X-gal重組子（Apr+lacZ-）

將外源基因克隆在pUC18的lacZ’標記基因內(nèi)部，使之滅活，此時重組子呈Apr、lacZ-，淡黃色菌落；而非重組子則呈Apr、lacZ+，藍色菌落第十章基因工程導論第十章基因工程導論核酸分子雜交第十章基因工程導論Southern雜交－檢測DNA第十章基因工程導論Southern雜交－檢測DNA第十章基因工程導論A鳥槍法4

目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥槍法操作的改進鳥槍法克隆目的基因的局限性第十章基因工程導論鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略隨機克隆供體細胞的全基因組DNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細菌目的基因的克隆分離

第十章基因工程導論BcDNA法4

目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略cDNA法分離目的基因的基本程序cDNA法法克隆目的基因的局限性第十章基因工程導論cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略mDNAcDNA第一鏈的合成

5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’cDNA第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPs第十章基因工程導論cDNA第二鏈的合成

煮沸NaOH自身引導法：獲得的雙鏈cDNA5’端會有幾對堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’KlenowdNTPsS1第十章基因工程導論cDNA第二鏈的合成

DNApoldNTPsRNaesH置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會有幾對堿基缺失5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAp

5’5’S1AAAATTTOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’AAAAAAAAAAAAAA

5’5’TTTTTTTTTTTTTT

3’3’T4-DNAligase第十章基因工程導論cDNA第二鏈的合成

dCTPTdT引導合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5G

G

AAAAAOH

3’TTTTTp

5’3‘

HO5‘ppp’5G

G

AAAAACCCCCCCOH

3’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’5‘

pGGGGGGG3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’5‘

pGGGGGGGAAAAAOH

3’NaOH退火KlenowdNTPs第十章基因工程導論cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略雙鏈cDNA的克隆

雙鏈平頭的cDNA通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中：

平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收

平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收

第十章基因工程導論cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu)

細菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在細胞中含量少，對酶和堿極為敏感，分離純化困難僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因

第十章基因工程導論E