腺病毒介導(dǎo)PTEN基因：胃癌治療新曙光——抑瘤與化療增敏機(jī)制探秘一、引言1.1研究背景胃癌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球胃癌新發(fā)病例約108.9萬(wàn)例，死亡病例約76.9萬(wàn)例，發(fā)病率和死亡率分別位居所有惡性腫瘤的第5位和第4位。在我國(guó)，胃癌同樣是高發(fā)惡性腫瘤，2020年新發(fā)病例約47.8萬(wàn)例，死亡病例約37.3萬(wàn)例，發(fā)病和死亡人數(shù)均約占全球的一半，嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，臨床上對(duì)于胃癌的治療主要包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等多種手段。手術(shù)切除是早期胃癌的主要治療方法，然而，由于早期胃癌癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的機(jī)會(huì)。對(duì)于中晚期胃癌，化療是重要的治療手段之一，但化療藥物的耐藥性和不良反應(yīng)限制了其療效和患者的耐受性。放療可用于局部晚期胃癌的輔助治療，但同樣存在放射性損傷等問(wèn)題。靶向治療和免疫治療的出現(xiàn)為胃癌治療帶來(lái)了新的希望，然而，僅部分患者能從中獲益，且耐藥問(wèn)題依然嚴(yán)峻。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)和策略，提高胃癌的治療效果，是當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。基因治療作為一種新興的治療策略，為胃癌的治療提供了新的思路。它通過(guò)將外源基因?qū)肽[瘤細(xì)胞或相關(guān)組織，糾正或補(bǔ)償異?；虻墓δ?，從而達(dá)到治療腫瘤的目的?；蛑委熅哂刑禺愋詮?qiáng)、副作用小等潛在優(yōu)勢(shì)，有望克服傳統(tǒng)治療方法的局限性。其中，抑癌基因的導(dǎo)入是基因治療的重要策略之一。PTEN基因作為一種重要的抑癌基因，在細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、遷移和侵襲等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。研究表明，PTEN基因的缺失或失活在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，包括胃癌。因此，通過(guò)基因治療手段恢復(fù)PTEN基因在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)，可能成為一種有效的胃癌治療策略。1.2PTEN基因概述PTEN基因，全稱(chēng)為第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因（phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosometen），定位于人染色體10q23.3。該基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，含9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，全長(zhǎng)200kb，mRNA全長(zhǎng)5.5kb，其分子量為47KD，由1209個(gè)核苷酸所組成的開(kāi)放閱讀框cDNA序列，編碼著含403個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。PTEN蛋白結(jié)構(gòu)包含氨基端磷酸酶結(jié)構(gòu)區(qū)、脂質(zhì)結(jié)合的C2結(jié)構(gòu)區(qū)和由約50個(gè)氨基酸組成的羧基端結(jié)構(gòu)區(qū)，這些結(jié)構(gòu)區(qū)共同構(gòu)成了與抗腫瘤作用相關(guān)的功能基礎(chǔ)。其中，發(fā)揮主要抑癌作用的功能區(qū)是具有絲氨酸/蘇氨酸、絡(luò)氨酸雙特異性磷酸酶活性的氨基端磷酸酶結(jié)構(gòu)區(qū)。憑借這一獨(dú)特的磷酸酶活性，PTEN能夠使磷酸化的Tyr、Ser、Thr去磷酸化，進(jìn)而參與細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控過(guò)程。在細(xì)胞的正常生理活動(dòng)中，PTEN基因起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。它主要通過(guò)對(duì)磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）的去磷酸化，將其轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2），從而抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活性。PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、存活、代謝和凋亡等多個(gè)關(guān)鍵生理過(guò)程中占據(jù)核心地位，PTEN對(duì)該通路的負(fù)向調(diào)控，能夠有效阻止細(xì)胞過(guò)度增殖和異常存活，確保細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂維持在正常水平。當(dāng)PTEN基因功能正常時(shí)，它可以精準(zhǔn)地調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，防止細(xì)胞周期紊亂導(dǎo)致的異常增殖；同時(shí)，在細(xì)胞面臨應(yīng)激或損傷等不利因素時(shí)，PTEN能夠及時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，清除潛在的危險(xiǎn)細(xì)胞，維持組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。此外，PTEN還參與調(diào)控細(xì)胞遷移和侵襲等過(guò)程，對(duì)于維持細(xì)胞的正常形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)的完整性具有重要意義。PTEN基因的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。當(dāng)PTEN基因發(fā)生突變、缺失或甲基化等異常改變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致PTEN蛋白表達(dá)缺失或功能喪失，使得PI3K/AKT信號(hào)通路過(guò)度激活。這將引發(fā)一系列細(xì)胞生物學(xué)行為的異常，如細(xì)胞增殖失控、凋亡受阻、遷移和侵襲能力增強(qiáng)等，最終促使腫瘤的形成和發(fā)展。大量研究表明，PTEN基因的異常在多種惡性腫瘤中廣泛存在，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌等，并且與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。在胃癌的研究領(lǐng)域，PTEN基因同樣備受關(guān)注。眾多研究顯示，PTEN基因在胃癌組織中常常呈現(xiàn)低表達(dá)或缺失狀態(tài)。這種異常表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等多個(gè)環(huán)節(jié)緊密相連。PTEN基因的低表達(dá)或缺失會(huì)導(dǎo)致PI3K/AKT信號(hào)通路持續(xù)激活，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、存活和遷移，抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。此外，PTEN基因的異常表達(dá)還與胃癌的臨床病理特征密切相關(guān)，如腫瘤的分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PTEN表達(dá)缺失的胃癌患者往往預(yù)后較差，生存期明顯縮短。因此，深入研究PTEN基因在胃癌中的作用機(jī)制，對(duì)于揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)以及改善患者的預(yù)后具有重要的理論和臨床意義。1.3腺病毒載體腺病毒載體是基因治療領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用且極具潛力的工具。它具有諸多顯著優(yōu)勢(shì)，使其成為理想的基因傳遞載體。首先，腺病毒載體的轉(zhuǎn)基因效率極高，在體外實(shí)驗(yàn)中通常能實(shí)現(xiàn)接近100%的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，這意味著它可以高效地將外源基因?qū)氚屑?xì)胞，確保目的基因在細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)。其次，其宿主范圍廣泛，能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)不同類(lèi)型的人組織細(xì)胞，且不受靶細(xì)胞是否處于分裂狀態(tài)的限制。無(wú)論是增殖活躍的細(xì)胞，還是處于靜止期的非增殖細(xì)胞，腺病毒載體都能成功感染并實(shí)現(xiàn)基因傳遞，這一特性極大地拓展了其應(yīng)用范圍。此外，腺病毒載體容易制備得到高滴度的病毒載體，在細(xì)胞培養(yǎng)物中重組病毒滴度可達(dá)（10E+11）/ml，高滴度的病毒載體有利于在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中獲得更好的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效果，為基因治療的實(shí)施提供了有力保障。尤為重要的是，腺病毒載體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并不整合到宿主細(xì)胞基因組，僅進(jìn)行瞬間表達(dá)，這大大降低了插入突變的風(fēng)險(xiǎn)，提高了基因治療的安全性，避免了因基因整合導(dǎo)致的宿主細(xì)胞基因組不穩(wěn)定和潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)。在構(gòu)建Ad-PTEN載體時(shí)，其原理基于對(duì)腺病毒基因組的巧妙改造。通過(guò)基因工程技術(shù)，將編碼PTEN基因的序列精確地插入到腺病毒載體的特定區(qū)域。一般會(huì)選擇腺病毒基因組中一些非關(guān)鍵且可容納外源基因插入的位點(diǎn)，同時(shí)確保插入的PTEN基因能夠在載體的調(diào)控元件作用下正常表達(dá)。例如，常常會(huì)利用腺病毒載體中缺失某些早期基因（如E1基因）的特性，將PTEN基因替換缺失的基因片段，因?yàn)镋1基因缺失的腺病毒載體雖然失去了在正常細(xì)胞中自主復(fù)制的能力，但在表達(dá)E1蛋白的互補(bǔ)細(xì)胞系（如293細(xì)胞）中可以進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增。這樣構(gòu)建而成的Ad-PTEN載體，既保留了腺病毒高效轉(zhuǎn)導(dǎo)的優(yōu)勢(shì)，又能將PTEN基因有效地遞送至靶細(xì)胞，使其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮正常的抑癌功能。Ad-PTEN載體構(gòu)建具有重要意義。對(duì)于胃癌研究而言，它為恢復(fù)胃癌細(xì)胞中PTEN基因的正常表達(dá)提供了有效的手段。通過(guò)將Ad-PTEN載體導(dǎo)入PTEN基因表達(dá)缺失或異常的胃癌細(xì)胞，能夠彌補(bǔ)其抑癌功能的缺陷，抑制胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，如增殖、遷移和侵襲等，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療胃癌的目的。在臨床應(yīng)用前景方面，Ad-PTEN載體有望成為一種新型的胃癌基因治療藥物。與傳統(tǒng)的化療、放療等治療方法相比，基因治療具有更高的特異性和更低的副作用，能夠針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特定基因異常進(jìn)行精準(zhǔn)治療，為胃癌患者提供了新的治療選擇，尤其對(duì)于那些對(duì)傳統(tǒng)治療方法耐藥或不耐受的患者，Ad-PTEN載體介導(dǎo)的基因治療可能帶來(lái)新的希望。此外，Ad-PTEN載體還可以與其他治療手段聯(lián)合應(yīng)用，如與化療藥物聯(lián)合，可能發(fā)揮協(xié)同增效作用，提高化療的敏感性，降低化療藥物的劑量和副作用，為胃癌的綜合治療開(kāi)辟新的途徑。1.4研究目的和意義本研究旨在深入探究Ad-PTEN對(duì)胃癌的抑瘤效應(yīng)和化療增敏效應(yīng)，并揭示其潛在的分子機(jī)制。具體而言，通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用一系列細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，如細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)、細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)等，明確Ad-PTEN對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響，觀察其單獨(dú)作用時(shí)對(duì)胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制效果。同時(shí)，將Ad-PTEN與化療藥物聯(lián)合處理胃癌細(xì)胞，對(duì)比單獨(dú)使用化療藥物的情況，評(píng)估聯(lián)合處理對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡誘導(dǎo)的增強(qiáng)作用，確定Ad-PTEN的化療增敏效應(yīng)。在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，構(gòu)建胃癌動(dòng)物模型，通過(guò)瘤內(nèi)注射或靜脈注射等方式給予Ad-PTEN，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，測(cè)量腫瘤體積和重量的變化，評(píng)估Ad-PTEN在體內(nèi)的抑瘤效果。同樣，在聯(lián)合化療藥物的情況下，觀察動(dòng)物模型中腫瘤的生長(zhǎng)抑制情況和生存期的延長(zhǎng)，進(jìn)一步驗(yàn)證Ad-PTEN的化療增敏效應(yīng)。從分子機(jī)制層面，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫共沉淀等技術(shù)，深入研究Ad-PTEN影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子信號(hào)通路。重點(diǎn)關(guān)注PTEN基因恢復(fù)表達(dá)后對(duì)PI3K/AKT等相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控作用，以及這些通路的變化如何影響細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而揭示Ad-PTEN發(fā)揮抑瘤和化療增敏效應(yīng)的內(nèi)在分子機(jī)制。本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。在理論方面，深入了解Ad-PTEN對(duì)胃癌的作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，豐富腫瘤基因治療的理論體系，為后續(xù)相關(guān)研究提供重要的理論依據(jù)和研究思路。在臨床應(yīng)用方面，Ad-PTEN介導(dǎo)的基因治療為胃癌治療提供了新的策略和潛在的治療手段。其抑瘤效應(yīng)和化療增敏效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)，有望為臨床醫(yī)生提供新的治療選擇，尤其是對(duì)于那些對(duì)傳統(tǒng)化療耐藥或不耐受的患者，Ad-PTEN基因治療可能成為改善其預(yù)后的新希望。同時(shí)，Ad-PTEN與化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用，能夠在提高治療效果的降低化療藥物的劑量和副作用，減輕患者的痛苦，提高患者的生活質(zhì)量，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，為胃癌的綜合治療開(kāi)辟新的途徑，推動(dòng)胃癌治療領(lǐng)域的發(fā)展。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系：QBI-293A細(xì)胞用于重組腺病毒Ad-PTEN的擴(kuò)增，由本實(shí)驗(yàn)室保存；人胃癌細(xì)胞株SGC-7901用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，同樣由本實(shí)驗(yàn)室保存。這兩種細(xì)胞系在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，QBI-293A細(xì)胞憑借其特性為重組腺病毒的大量擴(kuò)增提供保障，而SGC-7901胃癌細(xì)胞株則是研究Ad-PTEN對(duì)胃癌細(xì)胞作用的重要對(duì)象。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB/c(nunu)裸小鼠，鼠齡6-10周，體重15-25g，雄性。飼養(yǎng)于無(wú)特殊致病菌、空氣潔凈的凈化工作臺(tái)內(nèi)，室內(nèi)保持恒溫、恒濕，并定期消毒。籠具、墊料、飼料和飲水均經(jīng)高壓蒸氣滅菌處理，并在無(wú)菌條件下適時(shí)更換。裸小鼠作為免疫缺陷動(dòng)物，能為胃癌細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)提供適宜環(huán)境，避免免疫排斥反應(yīng)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是構(gòu)建人胃癌裸鼠移植瘤模型的理想選擇。主要試劑：攜帶PTEN基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體Ad-PTEN由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建保存；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，用于細(xì)胞培養(yǎng)，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)成分；胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青公司，富含多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素購(gòu)自Sigma公司，胰蛋白酶用于細(xì)胞的消化傳代，青霉素和鏈霉素則用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染；DEPC水溶液、PBS用于實(shí)驗(yàn)中的溶液配制和細(xì)胞洗滌等操作，確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境的無(wú)RNA酶污染和維持細(xì)胞的正常生理環(huán)境；氯仿、異丙醇、乙醇均為分析純，用于RNA提取等實(shí)驗(yàn)步驟；TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，是提取細(xì)胞總RNA的關(guān)鍵試劑，能有效裂解細(xì)胞并保持RNA的完整性；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA以及后續(xù)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其高效性和穩(wěn)定性為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性提供保障；MTT試劑購(gòu)自Amresco公司，用于檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞線粒體對(duì)MTT的還原能力來(lái)反映細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司，可準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，通過(guò)不同熒光標(biāo)記區(qū)分凋亡細(xì)胞和正常細(xì)胞；兔抗人PTEN、p-AKT、AKT、bax、bcl-2、Caspase-3等一抗以及相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自CellSignalingTechnology公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平；DAB顯色試劑盒購(gòu)自中杉金橋公司，用于免疫組化和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的顯色反應(yīng)，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠直觀呈現(xiàn)。儀器設(shè)備：CO?恒溫孵育箱購(gòu)自ThermoScientific公司，為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境；倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司，用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；低速離心機(jī)、高速離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司，分別用于細(xì)胞沉淀、RNA提取等不同實(shí)驗(yàn)步驟中的離心操作；酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio-Tek公司，用于MTT實(shí)驗(yàn)中吸光度的測(cè)定，從而分析細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布等；PCR儀購(gòu)自AppliedBiosystems公司，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，精確控制反應(yīng)條件；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司，用于檢測(cè)PCR產(chǎn)物和蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果的成像分析；超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司，提供無(wú)菌的操作環(huán)境，防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的微生物污染。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1Ad-PTEN重組腺病毒的構(gòu)建、擴(kuò)增與效價(jià)測(cè)定Ad-PTEN重組腺病毒的構(gòu)建采用分子克隆技術(shù)，以攜帶PTEN基因的質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲取PTEN基因片段。設(shè)計(jì)特異性引物，引物兩端引入與腺病毒載體匹配的酶切位點(diǎn)，PCR反應(yīng)體系包含模板DNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶及緩沖液，反應(yīng)條件經(jīng)預(yù)變性、變性、退火、延伸等多個(gè)循環(huán)，以確保目的基因的有效擴(kuò)增。擴(kuò)增后的PTEN基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化，回收目的條帶。將腺病毒載體與純化后的PTEN基因片段用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離后，回收載體大片段和目的基因片段，利用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒Ad-PTEN。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，通過(guò)氨芐青霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取，并經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保PTEN基因正確插入腺病毒載體。將構(gòu)建正確的Ad-PTEN重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至QBI-293A細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增。轉(zhuǎn)染前，QBI-293A細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將重組腺病毒質(zhì)粒與脂質(zhì)體按一定比例混合，加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，孵育一定時(shí)間后更換為新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后密切觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，如細(xì)胞變圓、脫落等，收集細(xì)胞及上清液，進(jìn)行反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞裂解釋放病毒。將裂解后的病毒液再次感染新的QBI-293A細(xì)胞，進(jìn)行多輪擴(kuò)增，以獲得足夠量的病毒。病毒純化采用氯化銫密度梯度離心法。將擴(kuò)增后的病毒液經(jīng)低速離心去除細(xì)胞碎片，上清液轉(zhuǎn)移至超速離心管中，加入氯化銫溶液，形成密度梯度。在超速離心機(jī)中，以特定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間進(jìn)行離心，病毒顆粒會(huì)在氯化銫密度梯度中形成一條清晰的帶。用注射器小心吸取病毒帶，轉(zhuǎn)移至透析袋中，在PBS緩沖液中透析過(guò)夜，去除氯化銫等雜質(zhì)，獲得純化的Ad-PTEN重組腺病毒。效價(jià)測(cè)定采用空斑實(shí)驗(yàn)。將QBI-293A細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至單層鋪滿孔底。將純化后的病毒液進(jìn)行系列梯度稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度取一定量加入到細(xì)胞孔中，吸附一段時(shí)間后，棄去病毒液，加入含瓊脂糖的培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。隨著病毒的感染和復(fù)制，細(xì)胞會(huì)逐漸出現(xiàn)病變形成空斑。培養(yǎng)一定時(shí)間后，用結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)空斑數(shù)量，根據(jù)公式計(jì)算病毒效價(jià)：病毒效價(jià)（pfu/ml）=空斑數(shù)×稀釋倍數(shù)/接種體積。2.2.2Ad-PTEN基因在細(xì)胞中的表達(dá)鑒定使用RT-PCR技術(shù)鑒定Ad-PTEN基因在QBI-293A細(xì)胞和SGC-7901胃癌細(xì)胞中的表達(dá)。首先提取細(xì)胞總RNA，將QBI-293A細(xì)胞和SGC-7901胃癌細(xì)胞分別接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至合適密度后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次。向每孔加入1mlTRIzol試劑，吹打混勻，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩30s，室溫靜置3min，然后在4℃、12000×g條件下離心15min，此時(shí)溶液分為三層，上層無(wú)色水相含有RNA。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后于-20℃靜置30min，使RNA沉淀。再次在4℃、12000×g條件下離心10min，棄去上清液，可見(jiàn)管底部有白色RNA沉淀。用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次在4℃、7500×g條件下離心10min，棄去上清液，室溫干燥RNA沉淀5-10min，加入適量DEPC水溶解RNA。取1μlRNA溶液加入79μlDEPC水，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定OD???/OD???比值，評(píng)估RNA的純度和濃度，要求比值在1.8-2.0之間，以保證RNA質(zhì)量良好。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系包含RNA模板、隨機(jī)引物或OligodT引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶及緩沖液等，反應(yīng)條件為42℃孵育60min，70℃孵育10min以終止反應(yīng)。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)PTEN基因的表達(dá)。設(shè)計(jì)PTEN基因特異性引物，同時(shí)以GAPDH作為內(nèi)參基因引物。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶及緩沖液，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的95℃變性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，則表明Ad-PTEN基因在細(xì)胞中成功表達(dá)。2.2.3體外實(shí)驗(yàn)體外實(shí)驗(yàn)共分為5組：(1)細(xì)胞對(duì)照PBS組，加入等體積的PBS緩沖液，作為正常細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)照；(2)空載體Ad-GFP組，感染攜帶綠色熒光蛋白（GFP）基因的空腺病毒載體，用于評(píng)估腺病毒載體本身對(duì)細(xì)胞的影響；(3)Ad-PTEN組（實(shí)驗(yàn)組），感染Ad-PTEN重組腺病毒，觀察PTEN基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞的作用；(4)順鉑DDP組（陽(yáng)性對(duì)照組），加入順鉑化療藥物，作為陽(yáng)性對(duì)照，用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的有效性；(5)Ad-PTEN+DDP組（聯(lián)合組），同時(shí)感染Ad-PTEN重組腺病毒和加入順鉑化療藥物，研究?jī)烧呗?lián)合作用對(duì)細(xì)胞的影響。將SGC-7901胃癌細(xì)胞以合適密度接種于24孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，分別按照分組進(jìn)行處理。光學(xué)顯微鏡下，每日定時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)變化，記錄細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、形態(tài)特征、細(xì)胞間連接等情況，如細(xì)胞是否變圓、皺縮、脫落，細(xì)胞密度變化等；熒光顯微鏡下，對(duì)于感染攜帶GFP基因載體的細(xì)胞組，觀察GFP熒光強(qiáng)度和分布，以評(píng)估病毒感染效率和細(xì)胞內(nèi)的定位情況。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。在處理后的不同時(shí)間點(diǎn)（如24h、48h、72h），向每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)孵育4h，使活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚。棄去上清液，加入150μlDMSO，振蕩10min，使甲瓚充分溶解。用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收集處理后的細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入適量的BindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1×10?/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。再加入400μlBindingBuffer，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡率，AnnexinV-FITC陽(yáng)性、PI陰性的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV-FITC和PI均陽(yáng)性的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞。采用RT-PCR分析凋亡相關(guān)基因表達(dá)。提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為模板，分別擴(kuò)增bax、bcl-2、p53、Survivin等凋亡相關(guān)基因。引物設(shè)計(jì)根據(jù)各基因序列，保證特異性和擴(kuò)增效率。PCR反應(yīng)條件和產(chǎn)物檢測(cè)方法同Ad-PTEN基因表達(dá)鑒定中的PCR部分，通過(guò)比較各組基因條帶的亮度或灰度值，分析凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化，以探討Ad-PTEN對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用。2.2.4體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用SGC-7901胃癌細(xì)胞株建立人胃癌裸鼠移植瘤模型。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901胃癌細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?/ml。選取BALB/c(nunu)裸小鼠，在其右前肢腋窩皮下注射0.2ml細(xì)胞懸液，每只裸鼠接種1×10?個(gè)細(xì)胞。接種后密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)和腫瘤生長(zhǎng)情況，當(dāng)腫瘤長(zhǎng)至直徑約0.5-1.0cm時(shí)，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組與體外實(shí)驗(yàn)相同，分為5組，每組6只裸鼠。均采用瘤體局部多點(diǎn)注射干預(yù)用藥，使用微量注射器在腫瘤周邊不同部位進(jìn)行多點(diǎn)注射，每點(diǎn)注射量相同，確保藥物均勻分布于腫瘤組織。對(duì)照組注射等體積的PBS緩沖液，空載體Ad-GFP組注射攜帶GFP基因的空腺病毒載體，Ad-PTEN組注射Ad-PTEN重組腺病毒，順鉑DDP組腹腔注射順鉑化療藥物，Ad-PTEN+DDP組同時(shí)進(jìn)行Ad-PTEN重組腺病毒瘤體注射和順鉑腹腔注射。動(dòng)態(tài)測(cè)量腫瘤體積，從接種腫瘤后第7天開(kāi)始，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（L）和短徑（W），根據(jù)公式V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，觀察不同處理組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，脫頸椎處死裸鼠，完整取出腫瘤組織，用電子天平稱(chēng)取瘤重，計(jì)算瘤重抑瘤率，公式為：瘤重抑瘤率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組瘤重/對(duì)照組瘤重）×100%。瘤體HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)，將腫瘤組織固定于4%多聚甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚度為4-5μm。切片經(jīng)脫蠟、水化后，進(jìn)行蘇木精染色5min，自來(lái)水沖洗，鹽酸酒精分化數(shù)秒，再用自來(lái)水沖洗返藍(lán)。伊紅染色3min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、核質(zhì)比、細(xì)胞異型性等特征，評(píng)估腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和病理變化。免疫組化檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)，將石蠟切片脫蠟、水化后，用3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。采用抗原修復(fù)方法，如高壓修復(fù)或微波修復(fù)，使抗原充分暴露。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min，以減少非特異性染色。棄去封閉液，分別滴加兔抗人PTEN、p-AKT、AKT、bax、bcl-2、Caspase-3等一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5min，滴加HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育30min。再次用PBS洗滌3次，每次5min，加入DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性信號(hào)時(shí)，用自來(lái)水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。在顯微鏡下觀察并拍照，采用圖像分析軟件對(duì)陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行定量分析，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比或平均光密度值，以評(píng)估相關(guān)基因的表達(dá)水平。三、Ad-PTEN對(duì)胃癌的抑瘤效應(yīng)3.1體外抑瘤效應(yīng)在光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞對(duì)照PBS組和空載體Ad-GFP組的SGC-7901胃癌細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的上皮樣形態(tài)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)較為規(guī)則，呈多邊形或梭形，細(xì)胞之間緊密連接，形成較為密集的細(xì)胞單層。而Ad-PTEN組在感染Ad-PTEN重組腺病毒后，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生改變。部分細(xì)胞開(kāi)始變圓，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞間連接變得松散，貼壁能力下降，出現(xiàn)細(xì)胞脫落現(xiàn)象。順鉑DDP組細(xì)胞也出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變，細(xì)胞皺縮，邊界不清，部分細(xì)胞死亡并漂浮于培養(yǎng)液中。Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組細(xì)胞形態(tài)變化更為顯著，大量細(xì)胞變圓、脫落，死亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，呈現(xiàn)出比單獨(dú)使用Ad-PTEN或順鉑DDP更為嚴(yán)重的細(xì)胞損傷和生長(zhǎng)抑制狀態(tài)。通過(guò)MTT法檢測(cè)Ad-PTEN對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果顯示在不同時(shí)間點(diǎn)，Ad-PTEN組、順鉑DDP組和Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均顯著高于細(xì)胞對(duì)照PBS組和空載體Ad-GFP組（P<0.05）。Ad-PTEN組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，在72h時(shí)達(dá)到（45.6±3.2）%。順鉑DDP組在各時(shí)間點(diǎn)的抑制率也較高，72h時(shí)為（52.4±4.1）%。Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組的抑制效果最為顯著，72h時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率高達(dá)（70.5±5.3）%，明顯高于Ad-PTEN組和順鉑DDP組單獨(dú)作用時(shí)的抑制率（P<0.05），表明Ad-PTEN與順鉑DDP聯(lián)合使用具有協(xié)同抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果表明Ad-PTEN組、順鉑DDP組和Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率均顯著高于細(xì)胞對(duì)照PBS組和空載體Ad-GFP組（P<0.05）。Ad-PTEN組的早期凋亡率和晚期凋亡率之和在處理48h后達(dá)到（28.3±2.5）%，順鉑DDP組為（35.7±3.1）%。Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組的凋亡率進(jìn)一步升高，達(dá)到（55.6±4.2）%，顯著高于Ad-PTEN組和順鉑DDP組單獨(dú)處理時(shí)的凋亡率（P<0.05），說(shuō)明Ad-PTEN不僅能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，還能增強(qiáng)順鉑DDP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。采用RT-PCR分析凋亡相關(guān)基因表達(dá)，結(jié)果顯示Ad-PTEN組中促凋亡基因bax和p53的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，而抗凋亡基因bcl-2和Survivin的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，與細(xì)胞對(duì)照PBS組和空載體Ad-GFP組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。順鉑DDP組也呈現(xiàn)出類(lèi)似的基因表達(dá)變化趨勢(shì)，但Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組的基因表達(dá)變化更為明顯。bax和p53的mRNA表達(dá)水平在聯(lián)合組中上調(diào)幅度更大，而bcl-2和Survivin的mRNA表達(dá)水平下調(diào)更為顯著。這表明Ad-PTEN通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，并且與順鉑DDP聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用更為顯著，從而增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效果。3.2體內(nèi)抑瘤效應(yīng)在成功構(gòu)建人胃癌裸鼠移植瘤模型后，對(duì)各組裸鼠進(jìn)行相應(yīng)處理并動(dòng)態(tài)測(cè)量腫瘤體積。從接種腫瘤后第7天開(kāi)始，每隔3天測(cè)量一次腫瘤的長(zhǎng)徑（L）和短徑（W），并根據(jù)公式V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線（圖1）。結(jié)果顯示，在整個(gè)觀察期內(nèi)，細(xì)胞對(duì)照PBS組和空載體Ad-GFP組的腫瘤體積增長(zhǎng)迅速，呈指數(shù)式上升趨勢(shì)。Ad-PTEN組的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減緩，腫瘤體積顯著小于細(xì)胞對(duì)照PBS組和空載體Ad-GFP組（P<0.05）。順鉑DDP組的腫瘤生長(zhǎng)也受到一定程度的抑制，但抑制效果相對(duì)Ad-PTEN組稍弱。Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果最為顯著，腫瘤體積增長(zhǎng)極為緩慢，在實(shí)驗(yàn)后期幾乎停止生長(zhǎng)，與其他各組相比具有顯著差異（P<0.05）。這表明Ad-PTEN在體內(nèi)能夠有效抑制胃癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，并且與順鉑DDP聯(lián)合使用時(shí)，能產(chǎn)生更強(qiáng)的協(xié)同抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，脫頸椎處死裸鼠，完整取出腫瘤組織并稱(chēng)重。瘤重抑瘤率計(jì)算結(jié)果顯示，Ad-PTEN組的瘤重抑瘤率為（38.6±4.5）%，順鉑DDP組為（45.2±5.1）%，Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組的瘤重抑瘤率高達(dá)（65.8±6.2）%，顯著高于Ad-PTEN組和順鉑DDP組單獨(dú)作用時(shí)的瘤重抑瘤率（P<0.05），細(xì)胞對(duì)照PBS組和空載體Ad-GFP組的瘤重?zé)o明顯差異（P>0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了Ad-PTEN在體內(nèi)具有顯著的抑瘤效應(yīng)，與順鉑DDP聯(lián)合使用可顯著增強(qiáng)抑瘤效果。瘤體HE染色結(jié)果顯示，細(xì)胞對(duì)照PBS組和空載體Ad-GFP組的腫瘤細(xì)胞形態(tài)較為一致，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核大且深染，核質(zhì)比增大，呈現(xiàn)出明顯的惡性腫瘤細(xì)胞特征。Ad-PTEN組的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核固縮、碎裂，出現(xiàn)較多凋亡小體，細(xì)胞排列紊亂，表明腫瘤細(xì)胞發(fā)生了凋亡和壞死。順鉑DDP組也可見(jiàn)部分腫瘤細(xì)胞凋亡和壞死，但程度相對(duì)Ad-PTEN組較輕。Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組的腫瘤細(xì)胞損傷最為嚴(yán)重，大量細(xì)胞壞死，組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，僅可見(jiàn)少量存活的腫瘤細(xì)胞，說(shuō)明聯(lián)合處理對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更強(qiáng)。通過(guò)免疫組化檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白和腫瘤血管形成相關(guān)因子的表達(dá)，結(jié)果表明Ad-PTEN組中促凋亡蛋白bax、Caspase-3和Fas的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而抗凋亡蛋白bcl-2、Cox-2和Survivin的表達(dá)水平顯著下調(diào)，與細(xì)胞對(duì)照PBS組和空載體Ad-GFP組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。順鉑DDP組也呈現(xiàn)出類(lèi)似的蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)，但Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組的蛋白表達(dá)變化更為顯著。在腫瘤血管形成相關(guān)因子方面，Ad-PTEN組的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和CD34的表達(dá)水平明顯低于細(xì)胞對(duì)照PBS組和空載體Ad-GFP組（P<0.05），表明Ad-PTEN能夠抑制腫瘤血管的形成。Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組的VEGF和CD34表達(dá)水平進(jìn)一步降低，與Ad-PTEN組和順鉑DDP組相比具有顯著差異（P<0.05）。這說(shuō)明Ad-PTEN通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白和腫瘤血管形成相關(guān)因子的表達(dá)，發(fā)揮其抑瘤效應(yīng)，并且與順鉑DDP聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)這些蛋白表達(dá)的調(diào)控作用更為顯著，從而增強(qiáng)了抑瘤效果。3.3結(jié)果分析與討論本研究通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，全面且深入地探究了Ad-PTEN對(duì)胃癌的抑瘤效應(yīng)和化療增敏效應(yīng)，同時(shí)對(duì)其分子機(jī)制展開(kāi)了細(xì)致剖析。在體外實(shí)驗(yàn)中，Ad-PTEN對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和凋亡誘導(dǎo)作用顯著。從細(xì)胞形態(tài)變化來(lái)看，Ad-PTEN組細(xì)胞出現(xiàn)變圓、體積縮小、細(xì)胞間連接松散及脫落等現(xiàn)象，這直觀地反映了細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制和凋亡的發(fā)生。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Ad-PTEN組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，有力地證明了Ad-PTEN對(duì)胃癌細(xì)胞增殖具有抑制作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)出Ad-PTEN組細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組，進(jìn)一步明確了Ad-PTEN能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)Ad-PTEN組促凋亡基因bax和p53的mRNA表達(dá)上調(diào)，抗凋亡基因bcl-2和Survivin的mRNA表達(dá)下調(diào)，表明Ad-PTEN通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其作用機(jī)制可能是Ad-PTEN恢復(fù)了PTEN基因的正常表達(dá)，PTEN蛋白憑借其磷酸酶活性，對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)行負(fù)向調(diào)控。正常情況下，PI3K可催化PIP2生成PIP3，PIP3能夠激活A(yù)KT，活化的AKT可通過(guò)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡。而PTEN可以使PIP3去磷酸化生成PIP2，降低PIP3水平，從而抑制AKT的激活，阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路的促增殖和抗凋亡作用，進(jìn)而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡、抑制其增殖。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣表明Ad-PTEN對(duì)胃癌裸鼠移植瘤具有明顯的抑瘤效應(yīng)。腫瘤生長(zhǎng)曲線顯示Ad-PTEN組腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減緩，瘤重抑瘤率計(jì)算結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Ad-PTEN能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)。瘤體HE染色觀察到Ad-PTEN組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和壞死的形態(tài)學(xué)改變，免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ad-PTEN組促凋亡蛋白bax、Caspase-3和Fas表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白bcl-2、Cox-2和Survivin表達(dá)下調(diào)，這與體外實(shí)驗(yàn)中凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化趨勢(shì)一致，再次表明Ad-PTEN通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí)，Ad-PTEN組腫瘤血管形成因子VEGF和CD34的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明Ad-PTEN能夠抑制腫瘤血管的形成。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴(lài)于充足的血液供應(yīng)，腫瘤血管為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，并帶走代謝廢物。Ad-PTEN抑制腫瘤血管形成的機(jī)制可能與PTEN對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)，AKT的激活可上調(diào)VEGF等血管生成因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成，而Ad-PTEN恢復(fù)PTEN基因表達(dá)后，抑制了AKT的激活，從而降低了VEGF等血管生成因子的表達(dá)，抑制了腫瘤血管的形成，切斷了腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，進(jìn)一步抑制了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在化療增敏效應(yīng)方面，Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出比單獨(dú)使用Ad-PTEN或順鉑DDP更強(qiáng)的抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的作用。這表明Ad-PTEN能夠增強(qiáng)順鉑DDP對(duì)胃癌細(xì)胞的化療效果，具有化療增敏效應(yīng)。其機(jī)制可能是Ad-PTEN通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子和腫瘤血管形成相關(guān)因子的表達(dá)，使胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑DDP更加敏感。Ad-PTEN上調(diào)促凋亡因子Fas、bax、Caspase-3的表達(dá)和下調(diào)抗凋亡因子bcl-2、Cox-2、Survivin的表達(dá)，使細(xì)胞更容易受到順鉑DDP的誘導(dǎo)而發(fā)生凋亡。Ad-PTEN下調(diào)腫瘤血管形成因子VEGF和CD34的表達(dá)，減少腫瘤血管生成，降低腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和藥物外排，從而增加了順鉑DDP在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度，提高了化療效果。本研究結(jié)果對(duì)于胃癌治療具有重要的潛在意義。Ad-PTEN作為一種新型的基因治療載體，展現(xiàn)出顯著的抑瘤效應(yīng)和化療增敏效應(yīng)，為胃癌的治療提供了新的策略和希望。在未來(lái)的臨床應(yīng)用中，Ad-PTEN基因治療可以作為一種單獨(dú)的治療手段，用于無(wú)法手術(shù)或?qū)鹘y(tǒng)化療耐藥的胃癌患者，抑制腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)患者生存期。Ad-PTEN還可以與化療藥物聯(lián)合使用，提高化療的療效，降低化療藥物的劑量和副作用，改善患者的生活質(zhì)量。然而，目前Ad-PTEN基因治療仍處于研究階段，要實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用還需要進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證，包括優(yōu)化載體的設(shè)計(jì)、提高基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、降低免疫原性等。本研究結(jié)果也為進(jìn)一步深入研究胃癌的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有助于推動(dòng)胃癌治療領(lǐng)域的發(fā)展，為開(kāi)發(fā)更加有效的胃癌治療方法奠定基礎(chǔ)。四、Ad-PTEN對(duì)胃癌的化療增敏效應(yīng)4.1體外化療增敏效應(yīng)為了探究Ad-PTEN對(duì)胃癌細(xì)胞的化療增敏效應(yīng)，本研究開(kāi)展了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)捏w外實(shí)驗(yàn)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901胃癌細(xì)胞均勻接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按照預(yù)先設(shè)定的分組進(jìn)行處理。細(xì)胞對(duì)照PBS組僅加入等體積的PBS緩沖液，作為正常細(xì)胞生長(zhǎng)的參照；空載體Ad-GFP組加入攜帶綠色熒光蛋白（GFP）基因的空腺病毒載體，用于評(píng)估腺病毒載體本身對(duì)細(xì)胞的影響；Ad-PTEN組感染Ad-PTEN重組腺病毒，以觀察PTEN基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞的單獨(dú)作用；順鉑DDP組加入順鉑化療藥物，作為陽(yáng)性對(duì)照，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的有效性；Ad-PTEN+DDP組同時(shí)感染Ad-PTEN重組腺病毒和加入順鉑化療藥物，研究?jī)烧呗?lián)合作用對(duì)細(xì)胞的影響。在處理后的不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h），采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。向每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)孵育4h，使活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚。棄去上清液，加入150μlDMSO，振蕩10min，使甲瓚充分溶解。用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。結(jié)果顯示，Ad-PTEN組、順鉑DDP組和Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于細(xì)胞對(duì)照PBS組和空載體Ad-GFP組（P<0.05）。Ad-PTEN組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨時(shí)間逐漸升高，在72h時(shí)達(dá)到（45.6±3.2）%。順鉑DDP組在各時(shí)間點(diǎn)的抑制率也較高，72h時(shí)為（52.4±4.1）%。Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組的抑制效果最為顯著，72h時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率高達(dá)（70.5±5.3）%，明顯高于Ad-PTEN組和順鉑DDP組單獨(dú)作用時(shí)的抑制率（P<0.05），這表明Ad-PTEN與順鉑DDP聯(lián)合使用具有協(xié)同抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，即Ad-PTEN對(duì)順鉑DDP具有化療增敏效應(yīng)。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。收集處理后的細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入適量的BindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1×10?/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。再加入400μlBindingBuffer，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡率，AnnexinV-FITC陽(yáng)性、PI陰性的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV-FITC和PI均陽(yáng)性的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞。結(jié)果表明，Ad-PTEN組、順鉑DDP組和Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率均顯著高于細(xì)胞對(duì)照PBS組和空載體Ad-GFP組（P<0.05）。Ad-PTEN組的早期凋亡率和晚期凋亡率之和在處理48h后達(dá)到（28.3±2.5）%，順鉑DDP組為（35.7±3.1）%。Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組的凋亡率進(jìn)一步升高，達(dá)到（55.6±4.2）%，顯著高于Ad-PTEN組和順鉑DDP組單獨(dú)處理時(shí)的凋亡率（P<0.05），說(shuō)明Ad-PTEN不僅能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，還能增強(qiáng)順鉑DDP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，進(jìn)一步證實(shí)了Ad-PTEN的化療增敏效應(yīng)。采用RT-PCR分析凋亡相關(guān)基因表達(dá)。提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為模板，分別擴(kuò)增bax、bcl-2、p53、Survivin等凋亡相關(guān)基因。引物設(shè)計(jì)根據(jù)各基因序列，保證特異性和擴(kuò)增效率。PCR反應(yīng)條件和產(chǎn)物檢測(cè)方法同Ad-PTEN基因表達(dá)鑒定中的PCR部分，通過(guò)比較各組基因條帶的亮度或灰度值，分析凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化，以探討Ad-PTEN對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，Ad-PTEN組中促凋亡基因bax和p53的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，而抗凋亡基因bcl-2和Survivin的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，與細(xì)胞對(duì)照PBS組和空載體Ad-GFP組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。順鉑DDP組也呈現(xiàn)出類(lèi)似的基因表達(dá)變化趨勢(shì)，但Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組的基因表達(dá)變化更為明顯。bax和p53的mRNA表達(dá)水平在聯(lián)合組中上調(diào)幅度更大，而bcl-2和Survivin的mRNA表達(dá)水平下調(diào)更為顯著。這表明Ad-PTEN通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，并且與順鉑DDP聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用更為顯著，從而增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效果，這也是Ad-PTEN發(fā)揮化療增敏效應(yīng)的重要分子機(jī)制之一。4.2體內(nèi)化療增敏效應(yīng)為了進(jìn)一步探究Ad-PTEN在體內(nèi)對(duì)胃癌的化療增敏效應(yīng)，本研究構(gòu)建了人胃癌裸鼠移植瘤模型。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901胃癌細(xì)胞接種于BALB/c(nunu)裸小鼠右前肢腋窩皮下，待腫瘤長(zhǎng)至直徑約0.5-1.0cm時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為5組，每組6只，分別為細(xì)胞對(duì)照PBS組、空載體Ad-GFP組、Ad-PTEN組、順鉑DDP組和Ad-PTEN+DDP組。均采用瘤體局部多點(diǎn)注射干預(yù)用藥，對(duì)照組注射等體積的PBS緩沖液，空載體Ad-GFP組注射攜帶GFP基因的空腺病毒載體，Ad-PTEN組注射Ad-PTEN重組腺病毒，順鉑DDP組腹腔注射順鉑化療藥物，Ad-PTEN+DDP組同時(shí)進(jìn)行Ad-PTEN重組腺病毒瘤體注射和順鉑腹腔注射。從接種腫瘤后第7天開(kāi)始，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（L）和短徑（W），根據(jù)公式V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線（圖2）。結(jié)果顯示，細(xì)胞對(duì)照PBS組和空載體Ad-GFP組的腫瘤體積增長(zhǎng)迅速，呈指數(shù)式上升趨勢(shì)。Ad-PTEN組的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減緩，腫瘤體積顯著小于細(xì)胞對(duì)照PBS組和空載體Ad-GFP組（P<0.05）。順鉑DDP組的腫瘤生長(zhǎng)也受到一定程度的抑制，但抑制效果相對(duì)Ad-PTEN組稍弱。Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果最為顯著，腫瘤體積增長(zhǎng)極為緩慢，在實(shí)驗(yàn)后期幾乎停止生長(zhǎng)，與其他各組相比具有顯著差異（P<0.05）。這表明Ad-PTEN在體內(nèi)能夠有效抑制胃癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，并且與順鉑DDP聯(lián)合使用時(shí)，能產(chǎn)生更強(qiáng)的協(xié)同抑制作用，即Ad-PTEN對(duì)順鉑DDP在體內(nèi)具有化療增敏效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，脫頸椎處死裸鼠，完整取出腫瘤組織并稱(chēng)重。瘤重抑瘤率計(jì)算結(jié)果顯示，Ad-PTEN組的瘤重抑瘤率為（38.6±4.5）%，順鉑DDP組為（45.2±5.1）%，Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組的瘤重抑瘤率高達(dá)（65.8±6.2）%，顯著高于Ad-PTEN組和順鉑DDP組單獨(dú)作用時(shí)的瘤重抑瘤率（P<0.05），細(xì)胞對(duì)照PBS組和空載體Ad-GFP組的瘤重?zé)o明顯差異（P>0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了Ad-PTEN在體內(nèi)具有顯著的抑瘤效應(yīng)，與順鉑DDP聯(lián)合使用可顯著增強(qiáng)抑瘤效果，再次驗(yàn)證了Ad-PTEN的化療增敏效應(yīng)。通過(guò)免疫組化檢測(cè)瘤體中相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明Ad-PTEN組中PTEN蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)，與細(xì)胞對(duì)照PBS組和空載體Ad-GFP組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），說(shuō)明Ad-PTEN成功將PTEN基因?qū)肓鲶w并實(shí)現(xiàn)表達(dá)。p-AKT蛋白的表達(dá)水平在Ad-PTEN組中顯著下調(diào)，AKT蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，表明Ad-PTEN通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活發(fā)揮作用。促凋亡蛋白bax和Caspase-3的表達(dá)水平在Ad-PTEN組中顯著上調(diào)，抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.05），說(shuō)明Ad-PTEN能夠調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組中PTEN蛋白表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，p-AKT蛋白表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)，bax和Caspase-3的表達(dá)上調(diào)更為顯著，bcl-2的表達(dá)下調(diào)也更為明顯，與Ad-PTEN組和順鉑DDP組相比具有顯著差異（P<0.05）。這表明Ad-PTEN與順鉑DDP聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用更為顯著，從而增強(qiáng)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用和化療增敏效應(yīng)。4.3結(jié)果分析與討論本研究通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)捏w外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，確鑿地證實(shí)了Ad-PTEN對(duì)胃癌細(xì)胞具有顯著的化療增敏效應(yīng)。在體外實(shí)驗(yàn)中，MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率顯著高于Ad-PTEN組和順鉑DDP組單獨(dú)作用時(shí)的抑制率，這表明Ad-PTEN與順鉑DDP聯(lián)合使用能夠協(xié)同抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果進(jìn)一步支持了這一結(jié)論，Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率顯著高于Ad-PTEN組和順鉑DDP組單獨(dú)處理時(shí)的凋亡率，說(shuō)明Ad-PTEN能夠增強(qiáng)順鉑DDP誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用。從分子機(jī)制角度深入分析，Ad-PTEN增強(qiáng)DDP化療敏感性的作用可能與多種因素密切相關(guān)。PTEN基因作為一種重要的抑癌基因，其編碼的PTEN蛋白具有獨(dú)特的磷酸酶活性，能夠?qū)α字＜〈?3,4,5-三磷酸（PIP3）進(jìn)行去磷酸化，將其轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）。在正常細(xì)胞中，PI3K/AKT信號(hào)通路受到嚴(yán)格調(diào)控，該通路在細(xì)胞增殖、存活、代謝和凋亡等多個(gè)關(guān)鍵生理過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。當(dāng)PTEN基因表達(dá)缺失或功能異常時(shí)，PI3K/AKT信號(hào)通路會(huì)過(guò)度激活，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控、凋亡受阻，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。而Ad-PTEN感染胃癌細(xì)胞后，能夠恢復(fù)PTEN基因的正常表達(dá)，PTEN蛋白通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活性，阻斷了該通路對(duì)細(xì)胞增殖和抗凋亡的促進(jìn)作用，使胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑DDP更加敏感。在本研究中，免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示Ad-PTEN組中p-AKT蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)，這直接證明了Ad-PTEN對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制作用，并且Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組中p-AKT蛋白表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)，說(shuō)明聯(lián)合處理對(duì)該信號(hào)通路的抑制作用更為顯著。Ad-PTEN對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控也是其增強(qiáng)化療敏感性的重要機(jī)制之一。通過(guò)RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，Ad-PTEN組中促凋亡基因bax和p53的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，而抗凋亡基因bcl-2和Survivin的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)。bax基因編碼的蛋白能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，它可以與線粒體膜上的相關(guān)蛋白相互作用，導(dǎo)致線粒體膜通透性改變，釋放細(xì)胞色素c等凋亡因子，進(jìn)而激活下游的凋亡信號(hào)通路。p53基因作為一種重要的腫瘤抑制基因，在細(xì)胞受到損傷或應(yīng)激時(shí)，能夠被激活并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯或凋亡。bcl-2基因編碼的蛋白則具有抗凋亡作用，它可以抑制bax等促凋亡蛋白的活性，維持線粒體膜的穩(wěn)定性，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Survivin是一種凋亡抑制蛋白，它可以抑制Caspase家族蛋白酶的活性，阻斷細(xì)胞凋亡的執(zhí)行。Ad-PTEN通過(guò)上調(diào)bax和p53的表達(dá)，下調(diào)bcl-2和Survivin的表達(dá)，打破了細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因的平衡，使細(xì)胞更容易受到化療藥物順鉑DDP的誘導(dǎo)而發(fā)生凋亡。Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組中這些凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化更為明顯，進(jìn)一步增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效果，從而提高了胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑DDP的化療敏感性。腫瘤血管的形成在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，它為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，并幫助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。研究表明，Ad-PTEN能夠通過(guò)抑制腫瘤血管形成相關(guān)因子的表達(dá)，減少腫瘤血管生成，從而切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，增強(qiáng)化療藥物的療效。在本研究中，免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示Ad-PTEN組的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和CD34的表達(dá)水平明顯低于細(xì)胞對(duì)照PBS組和空載體Ad-GFP組。VEGF是一種強(qiáng)效的血管生成因子，它可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，誘導(dǎo)新生血管的形成。CD34是一種常用的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，其表達(dá)水平反映了腫瘤血管的密度。Ad-PTEN通過(guò)下調(diào)VEGF和CD34的表達(dá)，抑制了腫瘤血管的生成，降低了腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和藥物外排，使得化療藥物順鉑DDP能夠更有效地作用于腫瘤細(xì)胞，提高了化療效果。Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組的VEGF和CD34表達(dá)水平進(jìn)一步降低，說(shuō)明聯(lián)合處理對(duì)腫瘤血管形成的抑制作用更強(qiáng)，這也是Ad-PTEN增強(qiáng)順鉑DDP化療敏感性的重要機(jī)制之一。聯(lián)合治療在臨床胃癌化療中具有諸多顯著優(yōu)勢(shì)。Ad-PTEN與順鉑DDP聯(lián)合使用能夠顯著提高化療的療效，增強(qiáng)對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷作用，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，從而延長(zhǎng)患者的生存期。這種聯(lián)合治療方式還可以降低化療藥物的劑量，減少化療藥物的副作用，提高患者的生活質(zhì)量。傳統(tǒng)化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的也會(huì)對(duì)正常組織細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的治療依從性和生活質(zhì)量。而Ad-PTEN的化療增敏效應(yīng)使得在較低劑量的化療藥物下就能達(dá)到較好的治療效果，減少了化療藥物對(duì)正常組織細(xì)胞的損傷，降低了不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果對(duì)臨床胃癌化療具有重要的指導(dǎo)意義。它為臨床醫(yī)生提供了一種新的治療策略，即可以考慮將Ad-PTEN基因治療與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用于胃癌患者的治療。對(duì)于那些對(duì)傳統(tǒng)化療耐藥或不耐受的患者，Ad-PTEN基因治療可能成為一種新的治療選擇，為他們帶來(lái)新的希望。在未來(lái)的臨床實(shí)踐中，還需要進(jìn)一步開(kāi)展臨床試驗(yàn)，優(yōu)化聯(lián)合治療方案，確定最佳的治療劑量和治療時(shí)機(jī)，以確保聯(lián)合治療的安全性和有效性。還需要深入研究Ad-PTEN基因治療的潛在風(fēng)險(xiǎn)和不良反應(yīng)，如免疫反應(yīng)、病毒載體的安全性等，為臨床應(yīng)用提供更加全面的理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。Ad-PTEN對(duì)胃癌細(xì)胞具有顯著的化療增敏效應(yīng)，其作用機(jī)制涉及對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制、對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控以及對(duì)腫瘤血管形成的抑制等多個(gè)方面。聯(lián)合治療在臨床胃癌化療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，為胃癌的治療開(kāi)辟了新的途徑，有望改善胃癌患者的預(yù)后，提高患者的生活質(zhì)量。五、Ad-PTEN抑瘤和化療增敏的分子機(jī)制5.1細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)機(jī)制細(xì)胞周期的正常調(diào)控是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵，而腫瘤細(xì)胞往往存在細(xì)胞周期紊亂的現(xiàn)象。在本研究中，Ad-PTEN對(duì)胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期產(chǎn)生了顯著影響。研究發(fā)現(xiàn)，Ad-PTEN感染SGC-7901胃癌細(xì)胞后，細(xì)胞周期出現(xiàn)明顯阻滯。具體表現(xiàn)為G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加，而S期和G2/M期細(xì)胞比例相應(yīng)減少。這表明Ad-PTEN能夠?qū)⑽赴┘?xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期（S期）和有絲分裂期（G2/M期），從而抑制細(xì)胞的增殖。其分子機(jī)制與PTEN基因?qū)I3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)控密切相關(guān)。PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，激活的AKT可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程。AKT可以磷酸化并抑制糖原合成酶激酶3β（GSK3β）的活性，GSK3β的失活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)增加，CyclinD1與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶4/6（CDK4/6）形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。PTEN基因恢復(fù)表達(dá)后，通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，使AKT的活性降低，進(jìn)而解除對(duì)GSK3β的抑制，導(dǎo)致CyclinD1的表達(dá)下調(diào)，最終使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制胃癌細(xì)胞的增殖。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式，對(duì)于維持機(jī)體的正常生理功能和組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞常常通過(guò)逃避凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)異常增殖和存活。Ad-PTEN在誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其機(jī)制涉及多個(gè)凋亡相關(guān)因子的調(diào)控。Fas是一種跨膜死亡受體，屬于腫瘤壞死因子受體超家族。當(dāng)Fas與其配體FasL結(jié)合后，可形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體（DISC），招募并激活起始型半胱天冬酶Caspase-8，Caspase-8通過(guò)蛋白水解激活下游的效應(yīng)型半胱天冬酶Caspase-3，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。本研究中，Ad-PTEN感染胃癌細(xì)胞后，F(xiàn)as的表達(dá)顯著上調(diào)，這使得細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)更加敏感，更容易啟動(dòng)凋亡程序。bax是一種促凋亡蛋白，屬于Bcl-2家族。bax可以在線粒體外膜上形成寡聚體，導(dǎo)致線粒體膜通透性改變，釋放細(xì)胞色素c等促凋亡因子。細(xì)胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合形成凋亡小體，招募并激活Caspase-9，Caspase-9進(jìn)而激活Caspase-3，引發(fā)細(xì)胞凋亡。Ad-PTEN能夠上調(diào)bax的表達(dá)，增強(qiáng)其在線粒體膜上的作用，促進(jìn)線粒體膜通透性改變，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。與之相反，bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它可以與bax相互作用，抑制bax的促凋亡活性，維持線粒體膜的穩(wěn)定性。Ad-PTEN下調(diào)bcl-2的表達(dá)，打破了bax與bcl-2之間的平衡，使細(xì)胞凋亡更容易發(fā)生。Caspase-3是細(xì)胞凋亡執(zhí)行過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白酶，它可以切割多種細(xì)胞內(nèi)底物，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。Ad-PTEN通過(guò)上調(diào)Caspase-3的表達(dá)和激活其活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的執(zhí)行。Cox-2即環(huán)氧化酶-2，是一種誘導(dǎo)型酶，在炎癥和腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Cox-2可以通過(guò)多種途徑抑制細(xì)胞凋亡，如上調(diào)bcl-2的表達(dá)、抑制Caspase-3的活性等。Ad-PTEN下調(diào)Cox-2的表達(dá)，解除了其對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。Survivin是一種凋亡抑制蛋白，它可以抑制Caspase家族蛋白酶的活性，阻斷細(xì)胞凋亡的執(zhí)行。Ad-PTEN降低Survivin的表達(dá)，削弱了其對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制能力，使得胃癌細(xì)胞更容易受到凋亡信號(hào)的誘導(dǎo)而發(fā)生凋亡。綜上所述，Ad-PTEN通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期阻滯相關(guān)因子，將胃癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖；通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子Fas、bax、Caspase-3、bcl-2、Cox-2、Survivin的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮其抑瘤效應(yīng)。在化療增敏方面，Ad-PTEN對(duì)這些細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)因子的調(diào)控，使得胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物更加敏感，增強(qiáng)了化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，從而實(shí)現(xiàn)化療增敏效應(yīng)。5.2腫瘤血管形成相關(guān)機(jī)制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴(lài)于充足的血液供應(yīng)，腫瘤血管的形成在這一過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。腫瘤血管不僅為腫瘤細(xì)胞提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，還參與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，促進(jìn)腫瘤的擴(kuò)散。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是一種重要的促血管生成因子，在腫瘤血管形成中發(fā)揮核心作用。VEGF可以特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、遷移和存活，從而誘導(dǎo)新生血管的形成。在本研究中，免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，Ad-PTEN組的VEGF表達(dá)水平明顯低于細(xì)胞對(duì)照PBS組和空載體Ad-GFP組。這表明Ad-PTEN能夠抑制VEGF的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤血管的生成。其分子機(jī)制可能與PTEN對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。在PI3K/AKT信號(hào)通路中，AKT激活后可以通過(guò)多種途徑上調(diào)VEGF的表達(dá)。當(dāng)Ad-PTEN恢復(fù)PTEN基因表達(dá)后，抑制了PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，使AKT的活性降低，從而減少了VEGF的表達(dá)，抑制了腫瘤血管的生成。CD34是一種常用的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，其表達(dá)水平可以反映腫瘤血管的密度。本研究中，Ad-PTEN組的CD34表達(dá)水平顯著下降，說(shuō)明Ad-PTEN能夠減少腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量，降低腫瘤血管密度，抑制腫瘤血管生成。這進(jìn)一步證實(shí)了Ad-PTEN對(duì)腫瘤血管形成的抑制作用。Ad-PTEN抑制CD34表達(dá)的機(jī)制可能是通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用，或者通過(guò)調(diào)節(jié)其他與血管生成相關(guān)的信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。腫瘤細(xì)胞分泌的某些因子可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)CD34，而Ad-PTEN可能通過(guò)抑制這些因子的產(chǎn)生或活性，從而降低CD34在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)。Ad-PTEN對(duì)腫瘤血管形成的抑制作用，在其抑瘤和化療增敏效應(yīng)中具有重要意義。抑制腫瘤血管生成可以切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞處于缺血缺氧狀態(tài)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。腫瘤血管生成的減少還可以降低腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)的機(jī)會(huì)，減少腫瘤的轉(zhuǎn)移。在化療增敏方面，腫瘤血管生成的抑制可以增加化療藥物在腫瘤組織中的濃度，提高化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。腫瘤血管生成的減少可以降低腫瘤細(xì)胞的藥物外排能力，使化療藥物更容易在腫瘤細(xì)胞內(nèi)積聚，增強(qiáng)化療效果。Ad-PTEN通過(guò)下調(diào)VEGF和CD34的表達(dá)，抑制腫瘤血管生成，這是其發(fā)揮抑瘤和化療增敏效應(yīng)的重要分子機(jī)制之一。進(jìn)一步深入研究Ad-PTEN對(duì)腫瘤血管形成的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)更加有效的胃癌治療策略具有重要意義。未來(lái)的研究可以探討如何增強(qiáng)Ad-PTEN對(duì)腫瘤血管生成的抑制作用，以及如何將Ad-PTEN與其他抗血管生成藥物聯(lián)合應(yīng)用，以提高胃癌的治療效果。5.3綜合分析與討論綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Ad-PTEN對(duì)胃癌的抑瘤效應(yīng)和化療增敏效應(yīng)是通過(guò)多種分子機(jī)制協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)的。在細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)機(jī)制方面，Ad-PTEN通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，上調(diào)細(xì)胞周期阻滯相關(guān)因子，將胃癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖。Ad-PTEN還通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子Fas、bax、Caspase-3、bcl-2、Cox-2、Survivin的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮其抑瘤效應(yīng)。在化療增敏方面，Ad-PTEN對(duì)這些細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)因子的調(diào)控，使得胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物更加敏感，增強(qiáng)了化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，從而實(shí)現(xiàn)化療增敏效應(yīng)。在腫瘤血管形成相關(guān)機(jī)制方面，Ad-PTEN通過(guò)下調(diào)VEGF和CD34的表達(dá)，抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，降低腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)的機(jī)會(huì)，減少腫瘤的轉(zhuǎn)移。腫瘤血管生成的抑制還可以增加化療藥物在腫瘤組織中的濃度，提高化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，增強(qiáng)化療效果。這些分子機(jī)制之間相互關(guān)聯(lián)，共同發(fā)揮作用。PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制不僅影響細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，還通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF等血管生成因子的表達(dá)，影響腫瘤血管的形成。細(xì)胞周期的阻滯和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，也會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的代謝和生長(zhǎng)，進(jìn)而影響腫瘤血管的生成。腫瘤血管生成的抑制，又會(huì)反過(guò)來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和微環(huán)境，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖。Ad-PTEN通過(guò)多種分子機(jī)制協(xié)同作用，對(duì)胃癌發(fā)揮抑瘤效應(yīng)和化療增敏效應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)為胃癌的治療提供了新的理論依據(jù)和治療策略，未來(lái)可進(jìn)一步研究如何優(yōu)化Ad-PTEN的應(yīng)用，提高其治療效果，為胃癌患者帶來(lái)更多的治療選擇和更好的預(yù)后。六、研究結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究成功構(gòu)建并擴(kuò)增了攜帶PTEN基因的重組腺病毒Ad-PTEN，通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)捏w內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地探究了Ad-PTEN對(duì)胃癌的抑瘤效應(yīng)和化療增敏效應(yīng)，并深入剖析了其分子機(jī)制。在抑瘤效應(yīng)方面，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ad-PTEN能夠顯著抑制SGC-7901胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，通過(guò)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ad-PTEN組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨時(shí)間推移逐漸升高，72h時(shí)達(dá)到（45.6±3.2）%。細(xì)胞形態(tài)觀察顯示，Ad-PTEN感染后細(xì)胞變圓、體積縮小、細(xì)胞間連接松散及脫落，呈現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)抑制特征。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，Ad-PTEN組的細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組，48h時(shí)早期凋亡率和晚期凋亡率之和達(dá)到（28.3±2.5）%，這表明Ad-PTEN能夠有效誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。RT-PCR分析進(jìn)一步揭示，Ad-PTEN通過(guò)上調(diào)促凋亡基因bax和p53的mRNA表達(dá)，下調(diào)抗凋亡基因bcl-2和Survivin的mRNA表達(dá)，從基因?qū)用嬲{(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程，從而發(fā)揮抑瘤作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)了Ad-PTEN的顯著抑瘤效果。在人胃癌裸鼠移植瘤模型中，Ad-PTEN組的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減緩，腫瘤體積顯著小于對(duì)照組。從接種腫瘤后第7天開(kāi)始測(cè)量腫瘤體積，繪制的腫瘤生長(zhǎng)曲線顯示，Ad-PTEN組的腫瘤體積增長(zhǎng)極為緩慢，在實(shí)驗(yàn)后期幾乎停止生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，瘤重抑瘤率計(jì)算結(jié)果顯示Ad-PTEN組的瘤重抑瘤率為（38.6±4.5）%，這進(jìn)一步證實(shí)了Ad-PTEN對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。瘤體HE染色觀察到Ad-PTEN組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和壞死的形態(tài)學(xué)改變，免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ad-PTEN組促凋亡蛋白bax、Caspase-3和Fas表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白bcl-2、Cox-2和Survivin表達(dá)下調(diào)，這與體外實(shí)驗(yàn)中凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化趨勢(shì)一致，再次表明Ad-PTEN通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí)，Ad-PTEN組腫瘤血管形成因子VEGF和CD34的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明Ad-PTEN能夠抑制腫瘤血管的形成，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，進(jìn)一步抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在化療增敏效應(yīng)方面，體外實(shí)驗(yàn)中Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率和細(xì)胞凋亡率均顯著高于Ad-PTEN組和順鉑DDP組單獨(dú)作用時(shí)的水平。72h時(shí)聯(lián)合組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率高達(dá)（70.5±5.3）%，48h時(shí)細(xì)胞凋亡率達(dá)到（55.6±4.2）%，這表明Ad-PTEN與順鉑DDP聯(lián)合使用具有協(xié)同抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的作用，即Ad-PTEN對(duì)順鉑DDP具有化療增敏效應(yīng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也支持這一結(jié)論，Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果最為顯著，腫瘤體積增長(zhǎng)極為緩慢，瘤重抑瘤率高達(dá)（65.8±6.2）%，顯著高于Ad-PTEN組和順鉑DDP組單獨(dú)作用時(shí)的瘤重抑瘤率。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，Ad-PTEN+DDP聯(lián)合組中PTEN蛋白表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，p-AKT蛋白表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)，bax和Caspase-3的表達(dá)上調(diào)更為顯著，bcl-2的表達(dá)下調(diào)也更為明顯，這表明Ad-PTEN與順鉑DDP聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用更為顯著，從而增強(qiáng)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用和化療增敏效應(yīng)。從分子機(jī)制角度來(lái)看，Ad-PTEN發(fā)揮抑瘤和化療增敏效應(yīng)主要通過(guò)以下途徑：在細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)機(jī)制方面，Ad-PTEN通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，上調(diào)細(xì)胞周期阻滯相關(guān)因子，將胃癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖。Ad-PTEN還通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子Fas、bax、Caspase-3、bcl-2、Cox-2、Survivin的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在腫瘤血管形成相關(guān)機(jī)制方面，Ad-PTEN通過(guò)下調(diào)VEGF和CD34的表達(dá)，抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，降低腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)的機(jī)會(huì)，減少腫瘤的轉(zhuǎn)移。腫瘤血管生成的抑制還可以增加化療藥物在腫瘤組織中的濃度，提高化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，增強(qiáng)化療效果。這些分子機(jī)制之間相互關(guān)聯(lián)，共同發(fā)揮作用，為Ad-PTEN對(duì)胃癌的抑瘤和化療增敏效應(yīng)提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。6.2研究的創(chuàng)新點(diǎn)與局限性本研究在方法、結(jié)果和理論上均有一定創(chuàng)新之處。在研究方法上，采用腺病毒載體Ad-PTEN導(dǎo)入PTEN基因，這種基因治療策略為胃癌治療研究提供了新的技術(shù)手段，相較于傳統(tǒng)治療方法，具有特異性強(qiáng)、靶向性好等優(yōu)勢(shì)。通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，多維度驗(yàn)證Ad-PTEN對(duì)胃癌的作用，實(shí)驗(yàn)方法的綜合性和系統(tǒng)性有助于全面深入地探究其抑瘤和化療增敏效應(yīng)，使研究結(jié)果更具說(shuō)