序號(hào)：編碼：第九屆“挑戰(zhàn)杯”廣東大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽作品申報(bào)書作品名稱：H1N1亞型豬流感病毒血凝素(HA)基因的生物信息學(xué)分析和高效可溶表達(dá)學(xué)校全稱：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)申報(bào)者姓名（集體名稱）：謝易恒、李棟、蘇培穗、莫秋女、陳錦堅(jiān)類別：√自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文 □哲學(xué)社會(huì)科學(xué)類社會(huì)調(diào)查報(bào)告和學(xué)術(shù)論文□科技發(fā)明制作A類□科技發(fā)明制作B類報(bào)送方式：□省級(jí)報(bào)送作品□√高校直送作品

說明1.申報(bào)者應(yīng)在認(rèn)真閱讀此說明各項(xiàng)內(nèi)容后按要求詳細(xì)填寫。2．申報(bào)者在填寫申報(bào)作品情況時(shí)只需根據(jù)個(gè)人項(xiàng)目或集體項(xiàng)目填寫A1或A2表，根據(jù)作品類別（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文、哲學(xué)社會(huì)科學(xué)類社會(huì)調(diào)查報(bào)告和學(xué)術(shù)論文、科技發(fā)明制作）分別填寫B(tài)1、B2或B3表。所有申報(bào)者可根據(jù)情況填寫C表。3.表內(nèi)項(xiàng)目填寫時(shí)一律用鋼筆或打印，字跡要端正、清楚，此申報(bào)書可復(fù)制。4.序號(hào)、編碼由第九屆“挑戰(zhàn)杯”廣東大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽組委會(huì)填寫。5．學(xué)術(shù)論文、社會(huì)調(diào)查報(bào)告及所附的有關(guān)材料必須是中文（若是外文，請(qǐng)附中文本），請(qǐng)以4號(hào)楷體打印在A4紙上，附于申報(bào)書后，字?jǐn)?shù)在8000字左右（文章版面尺寸14.5×22cm）。6．作品申報(bào)書須按要求由各省或各校競賽組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)統(tǒng)一寄送。7.其他參賽事宜請(qǐng)向本校競賽組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)咨詢。A2申報(bào)者情況（集體項(xiàng)目）說明：1．必須由申報(bào)者本人按要求填寫；2．申報(bào)者代表必須是作者中學(xué)歷最高者，其余作者按學(xué)歷高低排列；3．本表中的學(xué)籍管理部門簽章視為申報(bào)者情況的確認(rèn)。申報(bào)者代表情況姓名謝易恒性別男出生年月1985．5學(xué)校華南農(nóng)業(yè)大學(xué)系別、專業(yè)、年級(jí)2004級(jí)動(dòng)物科學(xué)（生物工程方向）學(xué)歷本科學(xué)制4入學(xué)時(shí)間2004．9作品名稱H1N1亞型豬流感病毒血凝素(HA)基因的生物信息學(xué)分析和高效可溶表達(dá)畢業(yè)論文題目通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院郵政編碼510642辦公電話常住地通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)五山學(xué)生公寓5幢307郵政編碼510642住宅電話61307866其他作者情況姓名性別年齡學(xué)歷所在單位蘇培穗男22本科動(dòng)物科學(xué)學(xué)院2004級(jí)生物工程方向1班李棟男20本科動(dòng)物科學(xué)學(xué)院2004級(jí)生物工程方向1班莫秋女女21本科動(dòng)物科學(xué)學(xué)院2004級(jí)生物工程方向1班陳錦堅(jiān)男21本科動(dòng)物科學(xué)學(xué)院2004級(jí)生物工程方向1班資格認(rèn)定學(xué)校學(xué)籍管理部門意見以上作者是否為2006年7月1日前正式注冊在校的全日制非成人教育、非在職的高等學(xué)校中國籍?？粕?、本科生、碩士研究生或博士研究生。√是□否（部門簽章）年月日院系負(fù)責(zé)人或?qū)熞庖姳咀髌肥欠駷檎n外學(xué)術(shù)科技或社會(huì)實(shí)踐活動(dòng)成果√是□否負(fù)責(zé)人簽名：年月日

B1．申報(bào)作品情況（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文）說明：1．必須由申報(bào)者本人填寫；2．本部分中的科研管理部門簽章視為對(duì)申報(bào)者所填內(nèi)容的確認(rèn)；3．作品分類請(qǐng)按作品的學(xué)術(shù)方向或所涉及的主要學(xué)科領(lǐng)域填寫；4．碩士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全稱作品分類（D）A．機(jī)械與控制（包括機(jī)械、儀器儀表、自動(dòng)化控制、工程、交通、建筑等）B．信息技術(shù)（包括計(jì)算機(jī)、電信、通訊、電子等）C．?dāng)?shù)理（包括數(shù)學(xué)、物理、地球與空間科學(xué)等）D．生命科學(xué)（包括生物、農(nóng)學(xué)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、健康、衛(wèi)生、食品等）E．能源化工（包括能源、材料、石油、化學(xué)、化工、生態(tài)、環(huán)保等）作品撰寫的目的和基本思路對(duì)H1N1亞型豬流感病毒（SIV）血凝素基因(HA)的生物信息學(xué)進(jìn)行分析，并且高效可溶表達(dá)SIVHA抗原蛋白，為開發(fā)新型豬流感基因工程疫苗打下基礎(chǔ)，同時(shí)建立鑒別診斷H1N1豬流感病毒的ELISA方法，為豬流感的防控提供科學(xué)依據(jù)。作品的科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處本研究選用pBCX高效可溶表達(dá)載體（本研究室改造的載體，正在申請(qǐng)專利）高效表達(dá)H1N1SIV的HA蛋白。用msyB基因作為融合伴侶，使HA融合蛋白高效可溶表達(dá)，突破了傳統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)包涵體表達(dá)外源蛋白（多肽）的技術(shù)瓶頸。因此選用大腸桿菌msyB多肽基因是構(gòu)建高效可溶表達(dá)載體的最優(yōu)融合伴侶基因之一。近年來，融合蛋白被廣泛應(yīng)用于生物研究，因其具有雙方蛋白的活性，可被用于蛋白的表達(dá)、檢測、識(shí)別和純化。特別是在免疫治療和免疫分析以及尋求高效、新型重組藥物方面顯示了其特有的優(yōu)勢。應(yīng)用生物信息學(xué)的相關(guān)知識(shí)對(duì)SIVH1N1HA基因的氨基酸序列進(jìn)行疏水性、抗原性、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測、N－糖基化位點(diǎn)預(yù)測以及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測等，對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)一步了解和掌握。在了解SIV抗原基因HA的生物信息學(xué)基礎(chǔ)上，高效可溶表達(dá)HA蛋白，用純化的HA蛋白做成基因工程疫苗進(jìn)行動(dòng)物免疫研究；同時(shí)用純化的HA蛋白做包被抗原，建立鑒別診斷豬流感的ELISA方法。作品的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義從HA基因的生物信息學(xué)分析和高效可溶表達(dá)兩方面進(jìn)行研究，研究了將重組H1N1亞型SIVHA蛋白作為ELISA診斷抗原的可行性，為檢測H1N1亞型SIV抗體的間接ELISA方法的建立奠定了基礎(chǔ)，為防治豬流感和研制豬流感基因工程疫苗提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有一定的指導(dǎo)意義。學(xué)術(shù)論文文摘H1N1亞型豬流感病毒（SIV）的血凝素（hemagglutinin,HA)基因在流感病毒傳染的過程中與識(shí)別靶細(xì)胞表面受體在穿膜過程中起重要作用，刺激機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體可以抵抗病毒感染。我們采用RTPCR方法擴(kuò)增了H1N1亞型豬流感病毒廣東株的血凝素HA基因，測序后對(duì)HA基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。然后將HA基因克隆到高效可溶表達(dá)載體pBCX上，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBCXHA。將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)，SDSPAGE可檢測到分子量約為94.0ku的融合蛋白，通過薄層凝膠掃描分析表明表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的29.5％。經(jīng)蛋白可溶性分析看出，融合蛋白90％以上是以可溶形式表達(dá)的。Westernblot證實(shí)，可溶表達(dá)的融合蛋白與H1N1亞型豬流感病毒陽性血清具有良好的免疫反應(yīng)性。初步建立了檢測H1N1亞型SIV抗體的間接ELISA方法。作品在何時(shí)、何地、何種機(jī)構(gòu)舉行的會(huì)議上或報(bào)刊上發(fā)表及所獲獎(jiǎng)勵(lì)鑒定結(jié)果請(qǐng)?zhí)峁?duì)于理解、審查、評(píng)價(jià)所申報(bào)作品具有參考價(jià)值的現(xiàn)有技術(shù)及技術(shù)文獻(xiàn)的檢索目錄申報(bào)材料清單（申報(bào)論文一篇，相關(guān)資料名稱及數(shù)量）科研管理部門簽章年月日

C.當(dāng)前國內(nèi)外同類課題研究水平概述說明：1.申報(bào)者可根據(jù)作品類別和情況填寫；2.填寫此欄有助于評(píng)審。豬流感（swineinfluenza，SI）是由豬流感病毒(屬正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒，它屬于單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組大約為13.6kb，由大小不等的8個(gè)基因片段組成）引起的一種急性、熱性、高度接觸性的呼吸道傳染病，以突發(fā)、高熱、流淚、鼻液增多、咳嗽、呼吸困難、衰竭為主要特征。該病一年四季均可發(fā)生,不同日齡，性別和品種的豬均可感染，此外也能使人發(fā)病。早在1918年，豬流感就在美國大流行，此后每年都有發(fā)生，并很快蔓延到許多國家。自1930年shop首次從豬體中分離到豬流感病毒后，目前已證實(shí)豬流感已遍布世界各地。根據(jù)有關(guān)研究資料得知在豬體中廣泛流行的豬流感病毒，主要是古典H1N1、類禽H1N1和類人H3N2三種亞型。1979年類禽H1N1豬流感開始了席捲歐洲，在豬群中廣為傳播，之后逐漸蔓延到亞洲，我國也未能幸免。1998年以前H1N1豬流感在美國是主要流行。我國的情況更不容忽視，1979年郭元吉對(duì)我國不同地區(qū)的豬血清進(jìn)行豬流感檢測，H1的平均陽性率為3.8%；而1998年倪漢忠的血清學(xué)顯示，廣東省豬群中H1抗體陽性率為30.9%。張?zhí)K華等采用HI和ELISA的方法，于1999年到2002對(duì)上海市10區(qū)縣的30個(gè)豬場進(jìn)行了針對(duì)性的調(diào)查，結(jié)果表明：1999年抗體陽性率為31.6%，而2002年抗體陽性率上升為82.9%。由此說明H1N1流行有上升的趨勢。豬流感病毒具有感染人的潛力。據(jù)報(bào)道1976年，美國新澤西州的一名新兵感染豬源H1N1而死于肺炎。作為流感病毒的“混合器”，豬流感病毒在禽－豬－人的種間傳播中起到非常重要的作用。另外人類流感和豬流感爆發(fā)的平行性和相關(guān)性,賦予了豬流感非常重要的公共衛(wèi)生意義。目前研究報(bào)道的SIVHA蛋白的原核表達(dá)幾乎是不可溶的微量表達(dá)，很難用于基因工程疫苗制備和建立診斷方法；目前尚沒有建立完善的以HA抗原蛋白為包被抗原的鑒別診斷豬流感病毒的方法。本研究選用pBCX高效可溶表達(dá)載體（本研究室改造的載體，正在申請(qǐng)專利）高效表達(dá)H1N1SIV的HA蛋白。H1N1亞型豬流感病毒（SIV）的血凝素（hemagglutinin,HA)基因在流感病毒傳染的過程中與識(shí)別靶細(xì)胞表面受體在穿膜過程中起重要作用，刺激機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體可以抵抗病毒感染。我們采用RTPCR方法擴(kuò)增了H1N1亞型豬流感病毒廣東株的血凝素HA基因，測序后對(duì)HA基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。然后將HA基因克隆到高效可溶表達(dá)載體pBCX上，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBCXHA。用msyB基因作為融合伴侶，使HA融合蛋白高效可溶表達(dá)，突破了傳統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)包涵體表達(dá)外源蛋白（多肽）的技術(shù)瓶頸。因此選用大腸桿菌msyB多肽基因是構(gòu)建高效可溶表達(dá)載體的最優(yōu)融合伴侶基因之一。近年來，融合蛋白被廣泛應(yīng)用于生物研究，因其具有雙方蛋白的活性，可被用于蛋白的表達(dá)、檢測、識(shí)別和純化。特別是在免疫治療和免疫分析以及尋求高效、新型重組藥物方面顯示了其特有的優(yōu)勢。本研究通過薄層凝膠掃描分析表明表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的29.5％。經(jīng)蛋白可溶性分析看出，融合蛋白90％以上是以可溶形式表達(dá)的。Westernblot證實(shí)，可溶表達(dá)的融合蛋白與H1N1亞型豬流感病毒陽性血清具有良好的免疫反應(yīng)性。應(yīng)用生物信息學(xué)的相關(guān)知識(shí)對(duì)SIVH1N1HA基因的氨基酸序列進(jìn)行疏水性、抗原性、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測、N－糖基化位點(diǎn)預(yù)測以及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測等，對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)一步了解和掌握。在了解SIV抗原基因HA的生物信息學(xué)基礎(chǔ)上，高效可溶表達(dá)HA蛋白，用純化的HA蛋白做成基因工程疫苗進(jìn)行動(dòng)物免疫研究；同時(shí)用純化的HA蛋白做包被抗原，建立鑒別診斷豬流感的ELISA方法，為防治豬流感和研制豬流感基因工程疫苗提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有一定的指導(dǎo)意義。D.推薦者情況及對(duì)作品的說明說明：1．由推薦者本人填寫；2．推薦者必須具有高級(jí)專業(yè)技術(shù)職稱，并是與申報(bào)作品相同或相關(guān)領(lǐng)域的專家學(xué)者或?qū)I(yè)技術(shù)人員（教研組集體推薦亦可）；3．推薦者填寫此部分，即視為同意推薦；4．推薦者所在單位簽章僅被視為對(duì)推薦者身份的確認(rèn)。推薦者情況姓名畢英佐性別男年齡62職稱教授（博導(dǎo)）工作單位華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院通訊地址廣州天河五山483號(hào)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院郵政編碼510642單位電話02085280283住宅電薦者所在單位簽章（簽章）年月日請(qǐng)對(duì)申報(bào)者申報(bào)情況的真實(shí)性作出闡述本作品是由謝易恒同學(xué)為主的五位同學(xué)共同完成，時(shí)間從2006年5月到2006年12月。作品內(nèi)容真實(shí)，數(shù)據(jù)可靠，結(jié)論正確。請(qǐng)對(duì)作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評(píng)價(jià)本作品在了解SIV抗原蛋白（HA）的生物信息學(xué)基礎(chǔ)上，高效可溶表達(dá)了HA蛋白，用純化的HA蛋白做成基因工程疫苗進(jìn)行動(dòng)物免疫研究；同時(shí)用純化的HA蛋白做包被抗原，建立鑒別診斷豬流感的ELISA方法，為防治豬流感和研制豬流感基因工程疫苗提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有一定的指導(dǎo)意義。當(dāng)前豬流感免疫疫苗主要是滅活疫苗及弱毒疫苗，因此對(duì)亞單位疫苗及基因工程疫苗的研究就顯得有廣闊的前景，從而有望成為滅活疫苗的有效補(bǔ)充。本作品技術(shù)水平高，有推廣應(yīng)用前景。其它說明推薦者情況姓名曹永長性別男年齡41職稱教授/博導(dǎo)工作單位華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院通訊地址廣州天河五山483號(hào)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院郵編510642單位電話02085280283住宅電薦者所在單位簽章簽章日期年月日請(qǐng)對(duì)申報(bào)者申報(bào)情況的真實(shí)性作出闡述本作品是華南農(nóng)業(yè)大學(xué)本科課外科技創(chuàng)新論文，在動(dòng)物科學(xué)學(xué)院基因工程實(shí)驗(yàn)室完成，利用了本實(shí)驗(yàn)室成熟的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和已有研究材料，選題具有實(shí)踐指導(dǎo)意義。謝易恒等五位同學(xué)利用課余時(shí)間積極參與本研究室的科研工作，熟悉和掌握了各項(xiàng)基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)，特別是對(duì)基因的生物信息學(xué)分析，能熟練查找和應(yīng)用分析軟件，分析結(jié)果對(duì)基因表達(dá)和蛋白生物學(xué)活性的預(yù)測具有很好的參考價(jià)值。內(nèi)容真實(shí)，數(shù)據(jù)可靠，結(jié)論正確。請(qǐng)對(duì)作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評(píng)價(jià)本作品選題新穎且具有實(shí)踐指導(dǎo)意義，特別對(duì)現(xiàn)有豬流感的防治提供了很好的理論指導(dǎo)，為下一步的豬流感基因工程疫苗的制備和豬流感病毒的鑒別診斷打下了很好的基礎(chǔ)。本作品選用pBCX高效可溶表達(dá)載體（本研究室改造的載體，正在申請(qǐng)專利），可溶表達(dá)的融合蛋白與H1N1亞型豬流感病毒陽性血清具有很好的免疫反應(yīng)性。本研究成果對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有很好的理論和實(shí)踐指導(dǎo)作用，有推廣應(yīng)用前景。體現(xiàn)了五位同學(xué)具有一定的基因工程實(shí)驗(yàn)技能，能熟練應(yīng)用分子生物學(xué)軟件進(jìn)行基因和蛋白的生物信息學(xué)分析。其它說明學(xué)校組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)確認(rèn)并蓋章（團(tuán)委代章）年月日校主管領(lǐng)導(dǎo)或校主管部門確認(rèn)蓋章年月日各?。▍^(qū)、市）評(píng)審委員會(huì)初評(píng)意見評(píng)委簽名：年月日各省（區(qū)、市）組織協(xié)調(diào)委員會(huì)審定意見團(tuán)委科協(xié)教育廳學(xué)聯(lián)（簽章）（簽章）（簽章）（簽章）年月日

E．大賽組織委員會(huì)秘書處資格和形式審查意見組委會(huì)秘書處資格審查意見審查人（簽名）年月日組委會(huì)秘書處形式審查意見審查人（簽名）年月日組委會(huì)秘書處審查結(jié)果□合格□不合格負(fù)責(zé)人（簽名）年月日

F．參賽作品打印處H1N1亞型豬流感病毒血凝素(HA)基因的生物信息學(xué)分析和高效可溶表達(dá)謝易恒李棟莫秋女蘇培穗陳錦堅(jiān)指導(dǎo)老師：謝青梅老師作者單位：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣州，510642摘要：H1N1亞型豬流感病毒（SIV）的血凝素（hemagglutinin,HA)基因在流感病毒傳染的過程中與識(shí)別靶細(xì)胞表面受體在穿膜過程中起重要作用，刺激機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體可以抵抗病毒感染。我們采用RTPCR方法擴(kuò)增了H1N1亞型豬流感病毒廣東株的血凝素HA基因，測序后進(jìn)行基因生物信息學(xué)分析。然后將HA基因克隆到原核表達(dá)載體pBCX上，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBCXHA。將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)，SDSPAGE可檢測到分子量約為94.0ku的融合蛋白，通過薄層凝膠掃描分析表明表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的29.5％。經(jīng)蛋白可溶性分析看出，融合蛋白90％以上是以可溶形式表達(dá)的。Westernblot證實(shí)，可溶表達(dá)的融合蛋白與H1N1亞型豬流感病毒陽性血清具有良好的免疫反應(yīng)性。關(guān)鍵詞：H1N1亞型豬流感病毒HA基因生物信息學(xué)分析高效可溶表達(dá)免疫原性豬流感（swineinfluenza，SI）是由豬流感病毒(屬正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒，它屬于單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組大約為13.6kb，由大小不等的8個(gè)基因片段組成。）引起的一種急性，熱性，高度接觸性的呼吸道傳染病，以突發(fā)，高熱，流淚，鼻液增多，咳嗽，呼吸困難，衰竭為主要特征.該病一年四季均可發(fā)生,不同日齡，性別和品種的豬均可感染，此外也能使人發(fā)病。早在1918年，豬流感就在美國大流行，此后每年都有發(fā)生，并很快蔓延到許多國家。自1930年shop首次從豬體中分離到豬流感病毒后，目前已證實(shí)豬流感已遍布世界各地。根據(jù)有關(guān)研究資料得知在豬體中廣泛流行的豬流感病毒，主要是古典H1N1、類禽H1N1和類人H3N2三種亞型。1975年以前，H1N1豬流感病毒以地方流行性存在于歐美大陸，其他地方少有報(bào)道；70年代末，H1N1豬流感傳入了我國臺(tái)灣，香港和大陸等地，并在亞洲廣泛盛行。1979年類禽H1N1豬流感開始了席捲歐洲，在豬群中廣為傳播，之后逐漸蔓延到亞洲，我國也未能幸免。1998年以前H1N1豬流感在美國是主要流行。我國的情況更不容忽視，1979年郭元吉對(duì)我國不同地區(qū)的豬血清進(jìn)行豬流感檢測，H1的平均陽性率為3.8%；而1998年倪漢忠的血清學(xué)顯示，廣東省豬群中H1抗體陽性率為30.9%。張?zhí)K華等采用HI和ELISA的方法，于1999年到2002對(duì)上海市10區(qū)縣的30個(gè)豬場進(jìn)行了針對(duì)性的調(diào)查，結(jié)果表明：1999年抗體陽性率為31.6%，而2002年抗體陽性率上升為82.9%。由此說明H1N1流行有上升的趨勢.豬流感病毒具有感染人的潛力。據(jù)報(bào)道1976年，美國新澤西州的一名新兵感染豬源H1N1而死于肺炎。作為流感病毒的“混合器”，豬流感病毒在禽－豬－人的種間傳播中起到非常重要的作用。另外人類流感和豬流感爆發(fā)的平行性和相關(guān)性,賦予了豬流感非常重要的公共衛(wèi)生意義。生物信息學(xué)——是一門新興的交叉學(xué)科，是采用計(jì)算機(jī)技術(shù)和信息論方法究蛋白質(zhì)及核酸序列等各種生物信息的采集、存儲(chǔ)、傳遞、檢索、分析和解讀的科學(xué)，是現(xiàn)代生命科學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)、數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、物理學(xué)和化學(xué)等學(xué)科相互滲透而形成的交叉學(xué)科。具體的說，生物信息學(xué)是把基因組DNA序列信息分析作為源頭，破譯隱藏在DNA序列中的遺傳語言，特別是非編碼區(qū)的實(shí)質(zhì)；同時(shí)在發(fā)現(xiàn)了新基因信息之后進(jìn)行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模擬和預(yù)測。應(yīng)用生物信息學(xué)的相關(guān)方面對(duì)SIVH1N1HA基因的氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析、抗原性分析、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測、N－糖基化位點(diǎn)預(yù)測以及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測等，對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)一步了解和掌握。DNA重組技術(shù)又稱基因工程技術(shù)，為大量獲得蛋白質(zhì)/多肽（以下所稱“蛋白質(zhì)”和“多肽”通用）提供了技術(shù)支持。已有不少蛋白質(zhì)類藥物、疫苗、診斷試劑采用基因工程方法生產(chǎn)。要獲得大量的具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)是關(guān)鍵。在眾多的表達(dá)系統(tǒng)之中，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)，具有結(jié)構(gòu)簡單、易操作、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。但采用大腸桿菌高效表達(dá)外源蛋白質(zhì)時(shí)，外源蛋白質(zhì)經(jīng)常以不溶性的包涵體形式存在。包涵體要用變性劑溶解，再通過復(fù)性過程才能得到在緩沖液中溶解的蛋白質(zhì)。經(jīng)過復(fù)性處理的目標(biāo)蛋白質(zhì)不一定能完全恢復(fù)原來的生物學(xué)活性，有時(shí)甚至完全得不到有活性的蛋白質(zhì)。復(fù)性處理工藝也使目標(biāo)蛋白質(zhì)的制備成本上升。本研究選用pBCX高效可溶表達(dá)載體高效表達(dá)H1N1SIV的HA蛋白。用msyB基因作為融合伴侶，使HA融合蛋白高效可溶表達(dá)，突破了傳統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)包涵體表達(dá)外源蛋白（多肽）的技術(shù)瓶頸。msyB基因編碼蛋白是大腸桿菌本身的蛋白，是一種高可溶性多肽，本身在大腸桿菌中表達(dá)量很高，其作為載體蛋白具有穩(wěn)定性、可溶性和表達(dá)水平高的特性。當(dāng)被誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，msyB多肽作為載體可與同外源蛋白一道分泌到大腸桿菌的胞質(zhì)中表達(dá)，大大增加了外源蛋白的可溶性，且表達(dá)的外源蛋白能夠產(chǎn)生正確折疊。對(duì)那些在胞內(nèi)表達(dá)且表達(dá)產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌有毒性的外源基因來說，可以減弱其毒性，提高表達(dá)量，提高融合蛋白的穩(wěn)定性。因此選用大腸桿菌msyB多肽基因是構(gòu)建高效可溶表達(dá)載體的最優(yōu)融合伴侶基因之一。近年來，融合蛋白被廣泛應(yīng)用于生物研究，因其具有雙方蛋白的活性，可被用于蛋白的表達(dá)、檢測、識(shí)別和純化。特別是在免疫治療和免疫分析以及尋求高效、新型重組藥物方面顯示了其特有的優(yōu)勢。融合蛋白使昂貴的細(xì)胞因子在獸醫(yī)上的應(yīng)用成為可能，由融合蛋白構(gòu)建的“生物導(dǎo)彈”更是大大提高了藥物的效力，因此融合蛋白表達(dá)技術(shù)是一種極具發(fā)展前景的一門技術(shù)。本研究就是從以上方面展開的，即從HA基因的生物信息學(xué)分析和高效可溶表達(dá)兩方面進(jìn)行研究，研究了將重組H1N1亞型SIVHA蛋白作為ELISA診斷抗原的可行性，為檢測H1N1亞型SIV抗體的間接ELISA方法的建立奠定了基礎(chǔ)，為防治豬流感和研制豬流感基因工程疫苗提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有一定的指導(dǎo)意義。1、材料1.1病毒豬流感病毒毒株：A/swine/Guangdong/2/01(H1N1)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院基因工程實(shí)驗(yàn)室保存。1.2菌種基因工程宿主菌E.coliDH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存，基因型為supE44,△lacU169(ф80,lacZΔM15),hsdR17,recA1,endA1,gyrA96,thi1,relA1。表達(dá)菌E.coliBL21（DE3）由本實(shí)驗(yàn)室保存，基因型為hsdS,gal(λcⅠts857,indl,Sam7,nin5,LacUV5T7)。pGEMTEasy載體質(zhì)粒（圖1）系統(tǒng)為Promega公司產(chǎn)品;pBCX質(zhì)粒（圖2）本實(shí)驗(yàn)室保存。圖1質(zhì)粒pGEMTEasy的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.ASketchmapoftheplasmidpGEMTEasy圖2pBCX載體的結(jié)構(gòu)示意圖1.3常用培養(yǎng)基以及試劑LB液體培養(yǎng)基：Tryptone（OXOID公司）10g，YeastExtract（OXOID公司）5g，NaCl10g，加雙蒸水定容至1000mL，高壓滅菌20min后4℃保存。LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉至終濃度為1.5%（w/v），高壓滅菌后分裝入滅菌平皿內(nèi)，凝固后4℃LA固體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100μg/mL）：滅菌好的LB固體培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)，加入氨芐青霉素至終濃度為100μg/mL，分裝入滅菌平皿內(nèi)，凝固后4氨芐青霉素100mg/mL，0.22μm濾膜過濾除菌，20℃保存。無RNA酶的DEPC水：按1：1000的比例將DEPC加入三蒸水，室溫放置12h以上，然后高壓滅菌。50×TAE：Tris堿242g，Na2EDTA37.2g，冰醋酸57.1mL，加三蒸水定容至1000mL。使用液為1×溶液。AMV反轉(zhuǎn)錄酶（5U/μL）、HRPRNA酶抑制劑（40U/μL）、限制性內(nèi)切酶NdeI、EcoRI、小牛堿性磷酸酶（CIAP）、T4DNA連接酶及相應(yīng)緩沖液，ExTaqDNA聚合酶（5u/μL）均為TaKaRa產(chǎn)品。dNTPs（2.5mMeach）、DL2000DNAMarker、DL15000DNAMarker、DEPC、飽和酚購自上海生工生物工程公司；IPTG、Amp、溴化乙錠（EB）購自寶泰克生物科技；瓊脂糖購自基因；SephacrylS200聚丙烯酰胺凝膠購自Pharmacia公司；丙烯酰胺、N，N亞甲基雙丙烯酰胺、TEMED（N，N，N’,N’四甲基乙二胺）為TaKaRa產(chǎn)品；6xHisTag融合蛋白親和層析NiNTA凝膠購于德國Qiagen公司。DNA片段快速純化/回收試劑盒（E.Z.N.A.GelExtractionKit）為TaKaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒DNA抽提試劑盒（E.Z.N.A.?PlasmidMiniprepsKit）為Omega公司產(chǎn)品。1.4SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）緩沖液Tris甘氨酸電泳緩沖液（pH8.3）：25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸，0.1%SDS，室溫保存。5×SDSPAGE上樣緩沖液：60mmol/LTrisHCl，pH6.8，14.4mmol/LDTT，2%SDS，0.1%溴酚藍(lán)，25%甘油。考馬斯亮藍(lán)染色液：180mL甲醇，40mL冰醋酸，0.5g考馬斯亮藍(lán)R250，180mL雙蒸水。脫色液：100mL甲醇，100mL冰醋酸，800mL雙蒸水。分離膠緩沖液（pH8.8）：36.3gTris，48mL1mol/LHCl，加水至100mL。濃縮膠緩沖液（pH6.8）：6.0gTris，48mL1mol/LHCl，加水至100mL。1.5Westernblot試劑轉(zhuǎn)移緩沖液：25mMTris，192mmol/L甘氨酸，20%（v/v）甲醇，0.037%（v/v）SDS，用HCl調(diào)pH至8.3。TBS緩沖液：150mmol/LNaCl，10mmol/LTrisCl（pH7.5）。封閉液：5%脫脂奶粉，用TBS緩沖液配制，4℃保存?？贵w稀釋液：1%脫脂奶粉/TBS，用于稀釋抗體，4℃保存。顯色液：在9mlL0.01mol/LTrisCl（pH7.6）緩沖液中溶解6mg二氨基聯(lián)苯胺，加入1mL0.3%的氯化鈷，最后加入10μL30%的雙氧水，混勻后立即使用。1.6蛋白純化試劑Lysisbuffer(pH8.0)：50mmol/LNa2HPO4，300mmol/LNaCl，10mmol/L咪唑。Washbuffer(pH8.0)：50mmol/LNa2HPO4，300mmol/LNaCl，20mmol/L咪唑。1.7抗體豬禽流感H1N1標(biāo)準(zhǔn)陽性血清由廣東省獸醫(yī)防疫站惠贈(zèng)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗豬IgG(二抗)購自廣州博理生物技術(shù)公司。1.8主要儀器及設(shè)備PCRExpressGradientPCR儀（法國HYBAID公司）BIOID凝膠成像及分析系統(tǒng)（法國VILBERLOURMAT公司）JY9211超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（浙江寧波新芝科器研究所）EC57090蛋白質(zhì)電泳儀（美國TheromForma公司）冷凍高速離心機(jī)（德國SIGMA公司）超低溫冰箱（美國TheromForma公司）空氣搖床（美國TheromForma公司）WD9504型生化搖擺平臺(tái)（北京沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司）DYY6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）AIRTECH醫(yī)用超凈工作臺(tái)（上海沙瀘凈化設(shè)備廠）2、方法2.1引物設(shè)計(jì)與合成應(yīng)用DNAStar（4.0）軟件，參照GenBank中注冊的H1N1豬流感病毒血凝素基因（HA）序列，設(shè)計(jì)引物HAup1/HAdn1用于擴(kuò)增H1N1亞型豬流感的HA基因，引物理論跨幅分別為1701bp。引物由上海博亞生物工程公司合成。合成后的引物用三蒸水稀釋成25mmol/L溶液，-20℃HAup1：5'ttatgaaggcaatactagtgttc3'

HAdn1：5'tttcagatgcatattctgcactg3'2.2病毒RNA的提取按GibcoBRL公司TRIzolLSReagentRNA提取試劑盒的使用說明書進(jìn)行。在1.5mL微量離心管中加入250μL病毒尿囊液和750μLTRIzol，充分混勻，室溫放置10min；加入200uL氯仿，激烈搖動(dòng)15sec，室溫靜置5min后，4℃12,000r/m離心15min，取上清液于1.5mL微量離心管，加500μL異丙醇，充分混勻，室溫放置10min，4℃12,000r/m離心10min，棄去上清液，沉淀用70%乙醇洗滌1次，風(fēng)干，用10μL經(jīng)DEPC處理的無RNA酶的三蒸水溶解沉淀，直接用于RTPCR或80℃保存。2.32.3.1HA基因cDNA第一鏈的合成參照TaKaRa的AMV反轉(zhuǎn)錄酶的使用說明進(jìn)行，在20μL反應(yīng)體系中分別加入以下組分，混勻后，室溫放置10min，42℃保溫1h，冰浴2min，RT產(chǎn)物直接用于PCR擴(kuò)增，或20℃保存。RNA3μL5×buffer4μLdNTPs4μLRNA酶抑制劑0.5μLHAup11μLHAdn11μLAMV2μLDEPC水3.5μL2.3.2HA基因cDNA的PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為：10×buffer10μLdNTPs4μLHAup11μLHAdn11μLcDNA5μLExTaq1μLddH2O78μL將上述反應(yīng)物混勻，在PCRExpressGradientPCR儀上按下列反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：擴(kuò)增HA基因的程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性40sec、50℃退火50sec、72℃延伸2.5min，循環(huán)30次；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測。2.3.3PCR產(chǎn)物的凝膠回收與純化按TaKaRa公司凝膠純化試劑盒說明書進(jìn)行。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外透射儀上，用手術(shù)刀片切下含目的條帶的凝膠，以3倍體積的溶膠緩沖液，65℃水浴使之完全溶化，加入離子交換柱，12,000r/m離心1min，棄去濾液，用含酒精的洗脫液清洗2次，10,000r/m離心1min甩干殘液，將適量雙蒸水加入交換柱，于5060℃保溫?cái)?shù)分鐘，10,000r/m離心1min，收集濾液，用瓊脂糖電泳檢測回收效果?；厥盏腜CR產(chǎn)物在ExTaq作用下加尾，可直接用于連接。2.4THA重組質(zhì)粒的構(gòu)建2.4.1PCR產(chǎn)物與pGEMTEasy載體的連接連接反應(yīng)體系為（共10μL）：2×buffer5μL加尾的PCR產(chǎn)物3μLpGEMTEasy1μLT4DNA連接酶1μL混勻后稍離心后，于4℃條件下連接過夜。連接產(chǎn)物直接用于轉(zhuǎn)化。2.4.2DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備參照金東雁等（1996）的《分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法》，用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞。挑取DH5α單菌落接種于3mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜；取1mL培養(yǎng)好的菌液接種于含有100mLLB液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，220r/m于37℃振搖培養(yǎng)22.5h，待OD600值達(dá)到0.40.5時(shí)，立即將三角瓶取出置于冰浴中10min，4℃3000r/m離心10min，徹底棄去上清液，菌體用10mL用冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2重懸，冰浴15min，再于4℃3000r/m離心10min，傾去上清液，用2mL用冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2重懸菌體，4℃過夜，即可用于轉(zhuǎn)化。2.4.3連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞取上述制備的感受態(tài)細(xì)胞50μL，加入2.4.1中制備的連接產(chǎn)物5μL，混勻后冰浴30min，42℃熱休克90sec，迅速轉(zhuǎn)移到冰浴中冷卻2min，加入200μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，于37℃搖床中以160r/m振搖培養(yǎng)45min；取100μL菌液涂布于含Amp的LB平板中，37℃培養(yǎng)過夜。2.4.4轉(zhuǎn)化子的篩選、鑒定從上述過夜培養(yǎng)的平板中挑取單個(gè)菌落，接種于3mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜，分別用PCR和酶切反應(yīng)進(jìn)行鑒定。2.4.5轉(zhuǎn)化子的PCR篩選直接以菌液作為模板進(jìn)行PCR鑒定。反應(yīng)體系、PCR反應(yīng)程序同2.3.2。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。2.4.6HA基因的序列測定選擇經(jīng)PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒的菌液送交上海博亞生物技術(shù)進(jìn)行核苷酸序列測定。2.5用DNAstar軟件對(duì)HA基因進(jìn)行序列分析。2.6HA基因推導(dǎo)氨基酸序列的生物信息學(xué)分析將所測序列用DNAstar軟件包進(jìn)行同源性和抗原性分析，利用Bioedit7.0進(jìn)行疏水性分析，將序列提交到丹麥技術(shù)大學(xué)生物序列分析中心（CBS）網(wǎng)站http://genome.cbs.dtu.dk/servises/NetNGlyc/進(jìn)行跨膜區(qū)、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測和N糖基化位點(diǎn)預(yù)測，遞交到英國皇家科學(xué)技術(shù)醫(yī)藥學(xué)院結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究組的蛋白質(zhì)三維預(yù)測在線網(wǎng)站http://.sbg.bio.ic.ac.uk/servers/3dpssm/進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。2.7pBCX對(duì)H1N1亞型豬流感HA基因在大腸桿菌中高效可溶表達(dá)2.7.1根據(jù)測定的H1N1亞型豬流感HA基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，即HAup/HAdn，該片段理論跨度為1680bp，編碼560個(gè)氨基酸，在HAup5’端加上BamHI酶切位點(diǎn)（斜體）和保護(hù)堿基，在HAdn加上SalI酶切位點(diǎn)（斜體）和終止密碼。引物由上海博亞生物工程公司合成。合成后的引物用三蒸水稀釋成25mmol/L溶液，-20℃HAup：5'ATGGATCCGACACAATATGTATA3'

HAdn：5'ATGTCGACGATGCATATTCTGCACT3'2.7.2用HAup/HAdn引物對(duì)從THA重組質(zhì)粒上擴(kuò)增HA基因片段，100μLPCR反應(yīng)體系的組成為：10×buffer10μLdNTPs8μLTHA1μLHAup1μLHAdn1μLExTaq酶1μLddH2O78μLPCR擴(kuò)增反應(yīng)在MJ100型熱循環(huán)儀上進(jìn)行。擴(kuò)增條件為：循環(huán)1：94℃預(yù)變性3min，循環(huán)230：94℃40s、50℃50s、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL的溴化乙錠）電泳檢測，電泳條件為100V15min。用VilberLourmat凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。2.7.3按TaKaRa公司凝膠純化試劑盒說明書進(jìn)行，方法同.4將純化的HA基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用適量ddH2O溶解，在100μL反應(yīng)體系中加入下列反應(yīng)物，于37℃消化4h。10×Buffer10μLBamHI5μLSalI5μLPCR產(chǎn)物20μLddH2O60μL2.7.5酶切產(chǎn)物的凝膠回收將酶切的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳純化，電泳條件為80V、30min，在紫外燈下切下目的條帶，用DNA片段凝膠回收試劑盒回收HA基因片段。按TaKaRa公司凝膠純化試劑盒說明書進(jìn)行，同2.3.3。用1%瓊脂糖電泳檢測回收效果2.7.6質(zhì)粒載體pBCX的制備與消化在LA平板上劃線培養(yǎng)含有pBCX質(zhì)粒的E.coliDH5α，37℃溫箱中培養(yǎng)16h。挑取單菌落接種于3mLLA培養(yǎng)基中，37℃、200r/m振搖培養(yǎng)1620h。將3mL菌液分裝于2只1.5mL離心管中，4℃、3500r/m離心10min，沉淀細(xì)菌。按照E.Z.N.A.?PlasmidMiniprepsKit質(zhì)粒DNA抽提試劑盒說明書抽提質(zhì)粒，質(zhì)粒DNA溶解于50μLddH2O中。取2μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測質(zhì)粒的純度，用紫外吸收法測定質(zhì)粒DNA含量。在100μLpBCX質(zhì)粒的酶切反應(yīng)體系中加入下列反應(yīng)物，于37℃酶切消化4h。10×buffer10μLBamHI5μLSalI5μLCIAP1μLpBCX25μLddH2O54μL2.7.7質(zhì)粒酶切產(chǎn)物的回收按DNA片段凝膠回收試劑盒說明書從瓊脂糖電泳凝膠中回收酶切的pBCX質(zhì)粒載體，方法同2.3.3。2.7.8HA基因片段pBCX將經(jīng)酶切消化、凝膠純化后的HA基因片段與質(zhì)粒酶切產(chǎn)物按T4DNA連接試劑盒說明連接0.5h。在10μL的連接反應(yīng)體系中加入下列反應(yīng)物，連接產(chǎn)物直接用于轉(zhuǎn)化DH5α。10×連接緩沖液1μLHA基因片段3.5μLpBCX1.5μLT4DNA連接酶1μLddH2O3μL2.7.9連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α受體菌取2.7.8中的連接產(chǎn)物5μL加入到50μLE.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30min；42℃熱休克90sec，而后迅速轉(zhuǎn)移到冰浴2min；加入200μLLB液體培養(yǎng)基，于37℃以160r/m振搖培養(yǎng)45min。然后取200μL菌液涂布于LA固體瓊脂培養(yǎng)基，2.7.10挑取LA平皿上的抗性單菌落于3mLLA培養(yǎng)液中，37℃振搖培養(yǎng)10~12h，以菌液為模板，以特異性的HAup/HAdn引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定，反應(yīng)體系如下：10×PCRbuffer2μL菌液0.5μLdNTPs2μL（2.5mM）ExTaq酶0.1μL(5U/uL)HAup0.5μL（20uM）HAdn0.5μL（20uM）ddH2O補(bǔ)至20μLPCR擴(kuò)增執(zhí)行程序同2.7.2。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。將出現(xiàn)預(yù)期PCR擴(kuò)增條帶的轉(zhuǎn)化子，初步確定為插入了HA基因片段的陽性轉(zhuǎn)化子。2.7.11重組質(zhì)粒的選擇37℃培養(yǎng)過夜的陽性轉(zhuǎn)化子，用E.Z.N.A.?PlasmidMiniprepsKit抽提質(zhì)粒。將含有HA基因的重組質(zhì)粒命名為pBCXHA。對(duì)pBCXHA重組質(zhì)粒用BamHI和SalI進(jìn)行酶切鑒定。酶切反應(yīng)體系組成分別如下：10×buffer2μLBamHI1μLSalI1μLpBCXHA5μLddH2O11μL混勻離心后，37℃反應(yīng)4h，取5μL反應(yīng)液，用1%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mLEB）電泳對(duì)酶切反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測。對(duì)于重組質(zhì)粒酶切鑒定獲得預(yù)期條帶的轉(zhuǎn)化子，在LA瓊脂培養(yǎng)基上劃線，37℃培養(yǎng)細(xì)菌，挑取單菌落，接種于3mLLA液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜，取菌液進(jìn)行DNA序列測定。.12.1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞取質(zhì)粒pBCXHA1μL轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，BL21感受態(tài)細(xì)胞的制備過程同2.4.2，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞步驟同2.4.3，最后取菌液涂布含有100μg/mLAmp的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～16h。在LA轉(zhuǎn)化平板上挑取單個(gè)陽性菌落，據(jù)0中的方法直接用菌液為模板進(jìn)行PCR檢測。鑒定為陽性的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，將含有pBCXHA的細(xì)菌命名為將中PCR鑒定為陽性的轉(zhuǎn)化菌pBCXHABL21劃線培養(yǎng)；挑取單菌落接種于3mLLA液體培養(yǎng)基中，37℃，220r/m的空氣搖床中培養(yǎng)10h，取出菌液，置4℃冰箱過夜；按1%比例將上述菌液接種于3mLLA液體培養(yǎng)基，37℃，220r/m振搖培養(yǎng)；當(dāng)OD600為0.4～0.6時(shí)，加入終濃度為1mmol/LIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，取0～5h菌液，12,000rpm離心2min，去上清，細(xì)菌沉淀中加100μL1×SDS上樣緩沖液，80℃凍融三次，沸水中煮3～5min，12000r/m離心2min，取上清進(jìn)行SDSPAGE電泳。同時(shí)，設(shè)pBCX空質(zhì)粒按金東雁等（1996）介紹的方法制備SDS聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）。2.7.13按照《蛋白技術(shù)手冊》中的方法進(jìn)行（汪家政等，2000）。用的一抗是豬的H1N1亞型SIV陽性血清，二抗是HRP標(biāo)記的山羊抗豬IgG。3結(jié)果與分析3.1對(duì)H1N1亞型的SIVHA基因進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，研究發(fā)現(xiàn)在約1500bp出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶(圖3)，與預(yù)期的大小相符，初步表明用RTPCR方法成功擴(kuò)增了SIVHA基因。圖3H1N1亞型SIVHA基因的RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果M：DL2000DNAmarker(bp)，1、2、3、4為RTPCR擴(kuò)增出的目的條帶；HA基因的cDNA的克隆及鑒定SIVHAcDNA的RTPCR產(chǎn)物經(jīng)純化、加尾后，插入到pGEMTEasy載體的外源基因插入位點(diǎn)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coilDH5，以培養(yǎng)的菌液為模板進(jìn)行PCR鑒定。陽性菌液經(jīng)上海博亞生物工程公司測序，測序結(jié)果與GenBank中檢索的SIVHA基因同源性達(dá)95.3%以上，而氨基酸同源性為96.0%以上。圖4HA基因的cDNA的PCR鑒定M：DL2000DNAmarker(bp)，1、2、5、6、7為PCR鑒定陽性菌落；3、4、8為陰性菌落3.3重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定PCR擴(kuò)增的HA基因經(jīng)過酶切后連接同樣經(jīng)過酶切的pMXB，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。PCR鑒定（圖5）得到陽性克隆，抽提質(zhì)粒。重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物電泳后（圖6），得到一大一小兩個(gè)片段，其中小片段與目的基因片段大小一致，表明重組質(zhì)粒pMXBHA已構(gòu)建成功。圖5重組質(zhì)粒PCR鑒定M：DL2000DNAmarker(bp)，1、2、3、4為PCR鑒定陽性菌落圖6重組質(zhì)粒的酶切鑒定1DNAmarkerDL15000(bp)；2pMXBHA重組質(zhì)粒EcoRI/XhoI雙酶切鑒定3.3HA基因的序列測定對(duì)經(jīng)過PCR和酶切鑒定的重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，并推導(dǎo)出相應(yīng)的氨基酸序列，見表1。結(jié)果表明其基因序列全長為1701bp，共編碼567個(gè)氨基酸。tctatattaacaataaggagaaggaggtcctcgtgctatggggaattcaccatccacctSYINNKEKEVLVLWGIHHPPacagtgctgaccaacaaagtctctaccagaatgcagatgcctatgtttttgtggggtcaTSADQQSLYQNADAYVFVGStaaaatacaacaagaaattcaggccagaaatagcagcaagacccaaggtgagaggtcaaSKYNKKFRPEIAARPKVRGQacagggagaatgaactactactggacactagtagaacctggagatacaataacattcgaaTGRMNYYWTLVEPGDTITFEgcaactggaaatctagtggtaccaagatatgccttcgcaatgaaaagaggttctggatctATGNLVVPRYAFAMKRGSGSggtattatcatttcagatacaccagtccacgattgcaacacgacttgtcaaacacccaaaGIIISDTPVHDCNTTCQTPKggtgctataaacaccagccttccattccagaatatacatccagttacaattggagaatgtGAINTSLPFQNIHPVTIGECattcaatctagaggcctgtttggagctattgctggctttattgaagggggatggacaggaPKYVKSTNLRMATGLRNIPSatgatagatggatggtacggttatcaccatcaaaatgagcaaggatcaggatatgcagccMIDGWYGYHHQNEQGSGYAAgaccgaaagagcacacagaatgccattgacgggatcactaacaaagtaaattctgttattDRKSTQNAIDGITNKVNSVIGaaaagatgaacacacaattcacagcagtgggtaaagaattcaaccatctggaaaaaagaEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRatagagaatttaaacaaaaaagttgatgatggtcttctggatgtttggacttataatgccIENLNKKVDDGLLDVWTYNAgaactgttggttctattagaaaatgaaagaactttggattaccatgattcaaatgtgaagELLVLLENERTLDYHDSNVKaacctatatgagaaagtaagaagccagctaaaaaacaatgccaaggaaattggaaatggcNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGtgctttgaattttaccacaaatgtgatgacacgtgtatggagagcgtcagaaatggaactCFEFYHKCDDTCMESVRNGTtatgattatccaaaatactcagaagaagcaaaactaaacagagaggagatagatggggtaYDYPKYSEEAKLNREEIDGVaagctggaatcaacaaggatttaccaaattttggcgatctactcaactgtcgccagttcaKLESTRIYQILAIYSTVASSttggtactgttagtctccctgggggcaatcagtttctggatgtgctccaatgggtctttaLVLLVSLGAISFWMCSNGSLcagtgcagaatatgcatctgaQCRICI.表1HA基因的堿基序列和相應(yīng)的氨基酸序列TranslateDNASequenceDQ058215.seq(1,1701)WithStandardGeneticCodeMolecularWeight63476.88Daltons566AminoAcids58StronglyBasic(+)AminoAcids(K,R)59StronglyAcidic()AminoAcids(D,E)180HydrophobicAminoAcids(A,I,L,F,W,V)185PolarAminoAcids(N,C,Q,S,T,Y)3.4HA基因同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹分析3.4.1經(jīng)過測序可以知道SIVH1N1HA基因長是1701bp,共編碼547個(gè)氨基酸。用DNAstar軟件對(duì)A/swine/Guangdong/2/01(H1N1)、A/Swine/Wisconsin/163/97(H1N1)、A/Swine/Wisconsin/166/97(H1N1)、A/Swine/Wisconsin/235/97(H1N1)進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)其同源性高達(dá)95％以上，見表2。表2四種SIVH1N1HA基因的同源性分析四種SIVH1N1HA基因的同源性分析直觀圖3.4.2系統(tǒng)進(jìn)化樹分析根據(jù)http://./BLAST/Blast.cgi的分析結(jié)果，點(diǎn)擊\t"trv01164298365"Distancetreeofresults進(jìn)行A/swine/Guangdong/2/01(H1N1)和其參考毒株的進(jìn)化樹分析，如圖7←圖7HA基因的進(jìn)化樹分析3.5生物信息學(xué)分析3.5.1疏水性分析蛋白質(zhì)的親水部分位于分子表面，疏水部分位于分子內(nèi)部，根據(jù)殘基的組成和氨基酸序列可以了解蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)種不同肽段的極性，進(jìn)而估計(jì)不同肽段再分子內(nèi)外的定位。用Bioedit7.0軟件對(duì)SIVH1N1HA基因的氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析。圖8SIVH1N1HA氨基酸序列的疏水性預(yù)測Fig.HydrophobicitypredictionofdeducedAmidAcidsofSIVH1N1HA經(jīng)過預(yù)測該氨基酸序列主要有12段疏水區(qū)，分別位于420位，6095位，150165位，190198位，210218位，250290位，310320位，340360位，390405位，435450位，525550位。與疏水區(qū)相比，親水區(qū)占據(jù)了該肽鏈大部分區(qū)域?？乖苑治鰣D9SIVH1N1HA基因推導(dǎo)的氨基酸抗原型預(yù)測Fig.AntigencitypredictionofdeducedAmidAcidsofSIVH1N1HA用DNAstar對(duì)H1N1SIVHA基因進(jìn)行抗原性分析，發(fā)現(xiàn)抗原位點(diǎn)分布于整個(gè)氨基酸序列中。3.5.3抗原位點(diǎn)預(yù)測分析http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/antigenic.html結(jié)果分析，如下表3Max_score_posat"*"(1)Score1.254length24atresidues527>550*Sequence:IYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAI||527550(2)Score1.220length9atresidues4>12*Sequence:ILVFLLYTF||412(3)Score1.185length8atresidues440>447*Sequence:AELLVLLE||440447(4)Score1.181length7atresidues557>563*Sequence:NGSLQCR||557563(5)Score1.169length13atresidues189>201*Sequence:EVLVLWGIHHPPT||189201(6)Score1.168length11atresidues263>273*Sequence:GNLVVPRYAFA||263273(7)Score1.155length13atresidues38>50*Sequence:EKNVTVTHSVNLL||3850(8)Score1.151length10atresidues150>159*Sequence:TAACPYAGAN||150159(9)Score1.145length7atresidues18>24*Sequence:DTLCIGY||1824(10)Score1.145length17atresidues205>221*Sequence:QQSLYQNADAYVFVGSS||205221(11)Score1.141length22atresidues56>77*Sequence:GKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGW||5677(12)Score1.127length24atresidues304>327*Sequence:NTSLPFQNIHPVTIGECPKYVKST||304327(13)Score1.118length10atresidues81>90*Sequence:NPECELLFTA||8190(14)Score1.113length10atresidues163>172*Sequence:RNLIWLVKKE||163172(15)Score1.110length9atresidues120>128*Sequence:EQLSSVSSF||120128(16)Score1.102length10atresidues429>438*Sequence:DDGLLDVWTY||429438(17)Score1.092length10atresidues482>491*Sequence:FEFYHKCDDT||482491(18)Score1.089length8atresidues92>99*Sequence:SWSYIVET||9299(19)Score1.089length6atresidues105>110*Sequence:GTCYPG||105110(20)Score1.087length7atresidues248>254*Sequence:WTLVEPG||248254(21)Score1.086length15atresidues281>295*Sequence:GIIISDTPVHDCNTT||281295(22)Score1.066length10atresidues460>469*Sequence:KNLYEKVRSQ||460469(23)Score1.064length7atresidues175>181*Sequence:YPKLSKS||175181(24)Score1.053length8atresidues346>353*Sequence:LFGAIAGF||346353(25)Score1.040length8atresidues337>344*Sequence:NIPSIQSR||337344(26)Score1.033length6atresidues452>457*Sequence:LDYHDS||452457表3HA蛋白抗原位點(diǎn)預(yù)測3.5.=4\*Arabic4跨膜區(qū)預(yù)測分析序列提交到丹麥技術(shù)大學(xué)生物序列分析中心（CBS）網(wǎng)站http://genome.cbs.dtu.dk/servises/TMHMM/進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果，見圖9#SequenceLength:566#SequenceNumberofpredictedTMHs:1#SequenceExpnumberofAAsinTMHs:23.98627#SequenceExpnumber,first60AAs:0.53009#SequenceTotalprobofNin:0.02124Sequence TMHMM2.0 outside 1530Sequence TMHMM2.0 TMhelix 531553Sequence TMHMM2.0 inside 554566圖=10\*Arabic10SIVH1N1HA基因推導(dǎo)的氨基酸的跨膜區(qū)預(yù)測Fig.TransmembranehelicespredictionofdeducedAmidAcidsofSIVH1N1HA3.5.=5\*Arabic5磷酸化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果將研究的HA基因的氨基酸序列提交到丹麥技術(shù)大學(xué)生物序列分析中心(CBS)網(wǎng)站http://.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/，通過其NetPhos2.0在線分析軟件進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測。由圖11知道，當(dāng)取閾值為0.5的時(shí)候，在該序列中共有34個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)。圖11SIVH1N1HA基因推導(dǎo)的氨基酸的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig.PredictionofPhosphorylationsitesofdeducedAmidAcidsofSIVH1N1HA3.5.=6\*Arabic6N糖基化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果將研究的HA基因的氨基酸序列提交到丹麥技術(shù)大學(xué)生物序列分析中心(CBS)網(wǎng)站http://.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/，通過NetNGlyc1.0在線分析軟件進(jìn)行N糖基化位點(diǎn)（AsnXaaSer/Thr）預(yù)測，由圖11，在該序列中共有6個(gè)潛在的N－糖基化位點(diǎn)，當(dāng)取閾值為0.5的時(shí)候，第28位、40位、104位、304位、498位、557位的Asn殘基可能被糖基化。(Threshold=0.5)SeqNamePositionPotentialJuryNGlyc agreementresultSequence27NNST0.3901(8/9)Sequence28NSTD0.7996(9/9)+++Sequence40NVTV0.7476(9/9)++Sequence104NGTC0.5847(7/9)+Sequence293NTTC0.4820(5/9)Sequence304NTSL0.6616(9/9)++Sequence498NGTY0.5752(6/9)+Sequence557NGSL0.6833(9/9)++圖12SIVH1N1HA基因推導(dǎo)的氨基酸的N－糖基化位點(diǎn)預(yù)測Fig.PredictionofNGlycosylationpotentialsitesofdeducedAmidAcidsofSIVH1N1HA3.5.=7\*Arabic7二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是了解其高級(jí)結(jié)構(gòu)的前提，采用英國皇家科學(xué)技術(shù)醫(yī)藥學(xué)院蛋白質(zhì)三維預(yù)測在線網(wǎng)站http://.sbg.bio.ic.ac.uk/servers/3dpssm/對(duì)HA基因推導(dǎo)氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果見圖。結(jié)果表明，該氨基酸富含無規(guī)則卷曲（Coil）40.5%β折疊（Strand）27.9%α螺旋(Helix)31.6%。Statistics：Coil－229；Strand－158；Helix－179；Total－566圖13SIVH1N1HA基因推導(dǎo)的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.PredictionofsecondarystructureofthededucedproteinsofSIVH1N1HA3.6HA基因經(jīng)酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21(DE3)，在LA平板上挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)，同樣進(jìn)行PCR鑒定，獲得陽性的重組質(zhì)粒表達(dá)菌。取菌液接種到LA液體培養(yǎng)基中，待細(xì)菌濃度達(dá)到OD600為0.40.5時(shí)加入IPTG并使其終濃度達(dá)1mmol/L，用SDSPAGE檢測表達(dá)產(chǎn)物（如圖=15\*Arabic14）,與誘導(dǎo)前相比，在相對(duì)分子質(zhì)量約94.0Ku處出現(xiàn)明顯的誘導(dǎo)蛋白條帶，分子量大小與預(yù)期一致。用Ni－TNA樹脂過柱純化表達(dá)的融合蛋白，可以獲得高純度的目的蛋白（圖15）。圖14HA融合蛋白的不同小時(shí)誘導(dǎo)SDSPAGE分析M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1、2為未加IPTG的細(xì)菌裂解產(chǎn)物，37：分別為IPTG誘導(dǎo)0h、1h、3h、4h和5h的細(xì)菌裂解產(chǎn)物圖=15\*Arabic15HA融合蛋白的純化M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、3:elutionbuffer洗脫產(chǎn)物即純化的HA蛋白，2:表達(dá)的msyBHA總蛋白3.7表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析及免疫印跡（WesternBlot）檢測經(jīng)蛋白可溶性分析看出，融合蛋白90％以上是以可溶形式表達(dá)的，如圖=16\*Arabic16所示。經(jīng)SDSPAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移硝酸纖維素膜，用特異性的豬流感陽性血清對(duì)HA融合蛋白進(jìn)行免疫印跡分析（WesternBlot），如圖=17\*Arabic17所示。在硝酸纖維素膜上具有一條活性帶，大小與SDSPAGE表達(dá)的蛋白大小一致。證實(shí)了用載體pMBX表達(dá)的融合蛋白HA具有免疫活性。圖=16\*Arabic16