CHIP泛素化修飾降解：調(diào)控ZBP1水平及程序性細胞壞死的分子密碼一、引言1.1研究背景細胞死亡是生物體維持自身穩(wěn)態(tài)的重要生理過程，對個體發(fā)育、組織修復(fù)以及疾病防御等方面起著關(guān)鍵作用。程序性細胞死亡作為細胞死亡的一種重要形式，在細胞凋亡被發(fā)現(xiàn)后，逐漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。細胞凋亡以其典型的形態(tài)學(xué)特征和復(fù)雜的分子調(diào)控機制，被廣泛認為是一種高度有序、受基因精確調(diào)控的細胞死亡方式。然而，隨著研究的不斷深入，科學(xué)家們逐漸認識到，細胞死亡的形式并非只有凋亡一種，程序性細胞壞死的發(fā)現(xiàn)，進一步豐富了人們對細胞死亡調(diào)控機制的理解。程序性細胞壞死，又稱為壞死性凋亡（necroptosis），是一種不依賴于半胱天冬酶（caspase）的程序性細胞死亡方式。它的發(fā)現(xiàn)打破了傳統(tǒng)觀念中壞死是一種被動、無序的細胞死亡過程的認知。程序性細胞壞死在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)出與經(jīng)典壞死相似的特征，如細胞腫脹、細胞膜破裂以及細胞內(nèi)容物釋放等，但在分子機制層面，它卻是由特定的信號通路所介導(dǎo)，受到一系列基因和蛋白的精細調(diào)控。研究表明，程序性細胞壞死在機體的免疫防御、發(fā)育過程以及多種疾病的發(fā)生發(fā)展中都扮演著不可或缺的角色。在病毒感染過程中，宿主細胞可以通過激活程序性細胞壞死來限制病毒的復(fù)制和傳播，從而保護機體免受病毒侵害；在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，程序性細胞壞死的異常激活或抑制可能影響腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移以及對化療藥物的敏感性。因此，深入探究程序性細胞壞死的分子機制，對于理解細胞命運的調(diào)控、疾病的發(fā)病機制以及開發(fā)新型治療策略具有重要意義。ZBP1（Z-DNAbindingprotein1）作為程序性細胞壞死信號通路中的關(guān)鍵分子，近年來受到了廣泛關(guān)注。ZBP1最初被發(fā)現(xiàn)是一種能夠特異性識別Z型核酸（Z-DNA和Z-RNA）的胞質(zhì)核酸免疫傳感器。當(dāng)細胞受到病原體感染、氧化應(yīng)激或其他外界刺激時，細胞內(nèi)會產(chǎn)生異常的Z型核酸，這些Z型核酸可以被ZBP1識別并結(jié)合。ZBP1通過其特殊的結(jié)構(gòu)域與Z型核酸相互作用，從而激活下游的程序性細胞壞死信號通路。具體來說，ZBP1含有兩個關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域，即Zα結(jié)構(gòu)域和RHIM（RIPhomotypicinteractionmotif）結(jié)構(gòu)域。Zα結(jié)構(gòu)域負責(zé)與Z型核酸結(jié)合，而RHIM結(jié)構(gòu)域則可以與受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）和受體相互作用蛋白激酶3（RIPK3）等蛋白相互作用，形成壞死小體（necrosome），進而激活程序性細胞壞死。ZBP1在多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用。在抗病毒免疫中，ZBP1能夠感知病毒感染后產(chǎn)生的Z型核酸，迅速啟動程序性細胞壞死，清除被病毒感染的細胞，有效阻止病毒的擴散；在腫瘤微環(huán)境中，ZBP1的表達水平和活性變化可能影響腫瘤細胞的存活和增殖，以及腫瘤的免疫逃逸能力。然而，目前對于ZBP1在程序性細胞壞死中的調(diào)控機制，尤其是其在細胞內(nèi)的水平調(diào)控機制，仍存在許多未知之處，亟待深入研究。泛素化修飾作為一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，在細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解、定位、活性調(diào)節(jié)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。泛素化修飾是一個復(fù)雜的酶促級聯(lián)反應(yīng)過程，涉及泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）和泛素連接酶（E3）。在這個過程中，E1首先在ATP的作用下激活泛素分子，然后將激活的泛素轉(zhuǎn)移至E2上；E3則負責(zé)識別特定的底物蛋白，并將E2上的泛素分子連接到底物蛋白的賴氨酸殘基上，形成多聚泛素鏈。帶有多聚泛素鏈的底物蛋白隨后被26S蛋白酶體識別并降解，從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)水平的調(diào)控。CHIP（C-terminusofHsp70-interactingprotein）作為一種具有E3泛素連接酶活性的分子伴侶，近年來在蛋白質(zhì)質(zhì)量控制和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等領(lǐng)域備受關(guān)注。CHIP含有三個重要的結(jié)構(gòu)域，分別是N端的四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域（TPR）、中間的U-box結(jié)構(gòu)域和C端的RING指結(jié)構(gòu)域。TPR結(jié)構(gòu)域可以與熱休克蛋白（Hsp70、Hsp90等）相互作用，協(xié)助CHIP識別并結(jié)合底物蛋白；U-box結(jié)構(gòu)域則具有E3酶活性，能夠與E2酶結(jié)合，催化泛素分子連接到底物蛋白上；C端的RING指結(jié)構(gòu)域進一步增強了CHIP的泛素連接酶活性。已有研究表明，CHIP參與了多種細胞生理過程的調(diào)控，通過介導(dǎo)底物蛋白的泛素化降解，維持細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。在神經(jīng)退行性疾病中，CHIP可以通過泛素化降解異常聚集的蛋白質(zhì)，減少蛋白質(zhì)聚集體對神經(jīng)元的毒性作用，從而保護神經(jīng)元的功能；在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，CHIP對一些癌基因和抑癌基因的泛素化調(diào)控，可能影響腫瘤細胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。然而，CHIP是否參與ZBP1水平的調(diào)控，以及這種調(diào)控在程序性細胞壞死中的作用和機制，目前尚未見報道。綜上所述，程序性細胞壞死作為一種重要的程序性細胞死亡方式，在機體的生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。ZBP1作為程序性細胞壞死信號通路中的關(guān)鍵分子，其水平和活性的調(diào)控對于程序性細胞壞死的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。泛素化修飾作為細胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)調(diào)控機制，在蛋白質(zhì)質(zhì)量控制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著核心作用。CHIP作為一種具有獨特結(jié)構(gòu)和功能的E3泛素連接酶，可能參與ZBP1水平的調(diào)控，進而影響程序性細胞壞死的進程。因此，深入研究CHIP泛素化修飾降解對ZBP1水平及程序性細胞壞死的調(diào)控機制，不僅有助于揭示程序性細胞壞死的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還可能為相關(guān)疾病的治療提供新的靶點和策略。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究CHIP泛素化修飾降解對ZBP1水平及程序性細胞壞死的調(diào)控機制，填補該領(lǐng)域在分子調(diào)控機制方面的空白，為相關(guān)疾病的治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。在細胞程序性死亡的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中，程序性細胞壞死作為一種重要的形式，與多種生理和病理過程密切相關(guān)。ZBP1作為程序性細胞壞死信號通路中的關(guān)鍵分子，其水平的精準調(diào)控對維持細胞正常生理功能至關(guān)重要。然而，目前關(guān)于ZBP1水平調(diào)控機制的研究仍存在諸多未知。泛素化修飾作為細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解和功能調(diào)控的重要方式，在維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和正常生理功能方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CHIP作為一種具有E3泛素連接酶活性的分子，其在蛋白質(zhì)質(zhì)量控制和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用已逐漸被揭示，但CHIP是否參與ZBP1水平的調(diào)控以及這種調(diào)控如何影響程序性細胞壞死的進程，尚未得到明確解答。因此，本研究聚焦于CHIP對ZBP1的泛素化修飾降解作用，旨在從分子層面解析其調(diào)控程序性細胞壞死的具體機制，為深入理解細胞死亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新的視角和理論支持。從理論意義來看，本研究有助于進一步完善程序性細胞壞死的分子調(diào)控理論。通過揭示CHIP泛素化修飾降解對ZBP1水平的調(diào)控機制，能夠深入了解程序性細胞壞死信號通路的精細調(diào)控過程，填補該領(lǐng)域在分子機制研究方面的空白，豐富和拓展細胞死亡調(diào)控的理論體系。這不僅有助于我們從分子層面更深入地理解細胞命運的決定機制，還能為后續(xù)研究細胞內(nèi)其他信號通路與程序性細胞壞死之間的相互作用奠定基礎(chǔ)，推動生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)毎劳稣{(diào)控機制的認識向更深層次發(fā)展。從實際應(yīng)用價值來看，本研究成果可能為多種疾病的治療提供新的靶點和策略。在腫瘤治療方面，程序性細胞壞死的異常激活或抑制與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過調(diào)控CHIP對ZBP1的泛素化修飾，有可能調(diào)節(jié)腫瘤細胞的程序性細胞壞死，從而為腫瘤的治療提供新的思路。例如，對于某些對傳統(tǒng)化療藥物耐藥的腫瘤細胞，通過激活CHIP介導(dǎo)的ZBP1泛素化降解，可能重新誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生程序性細胞壞死，增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，提高治療效果。在神經(jīng)退行性疾病中，異常的細胞死亡往往是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和疾病進展的重要因素。如果能夠明確CHIP-ZBP1-程序性細胞壞死軸在神經(jīng)退行性疾病中的作用機制，就有可能通過調(diào)節(jié)這一通路來減少神經(jīng)元的死亡，為神經(jīng)退行性疾病的治療提供新的靶點和干預(yù)策略。此外，在病毒感染性疾病中，程序性細胞壞死在宿主抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。深入研究CHIP對ZBP1的調(diào)控機制，有助于開發(fā)新的抗病毒治療方法，通過調(diào)節(jié)程序性細胞壞死來增強宿主的抗病毒能力，控制病毒感染的發(fā)展。綜上所述，本研究對CHIP泛素化修飾降解調(diào)控ZBP1水平及程序性細胞壞死的機制進行深入研究，無論是在理論上完善細胞死亡調(diào)控的分子機制，還是在實際應(yīng)用中為相關(guān)疾病的治療提供新的靶點和策略，都具有重要的意義和價值。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運用多種實驗方法和技術(shù)手段，從細胞、分子等多個層面深入探究CHIP泛素化修飾降解對ZBP1水平及程序性細胞壞死的調(diào)控機制。1.3.1實驗方法細胞培養(yǎng)與處理：選用人胚腎293T細胞、小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）等細胞系，在含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。根據(jù)實驗需求，對細胞進行不同的處理，如轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、感染病毒、給予藥物刺激等，以模擬不同的生理和病理狀態(tài)。免疫共沉淀（Co-IP）：用于驗證CHIP與ZBP1之間是否存在相互作用。具體操作如下，收集細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌兩次后，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，在冰上裂解30分鐘，期間不斷輕柔混勻。然后于4℃、12000g離心15分鐘，取上清。向上清中加入適量的CHIP抗體或ZBP1抗體，4℃孵育過夜，使抗體與相應(yīng)蛋白充分結(jié)合。隨后加入ProteinA/G瓊脂糖珠，繼續(xù)在4℃孵育2-4小時，以捕獲抗原-抗體復(fù)合物。用預(yù)冷的洗滌緩沖液（如含0.1%Tween-20的PBS）洗滌瓊脂糖珠-抗原-抗體復(fù)合物3-5次，每次5分鐘，以去除非特異性結(jié)合的蛋白。最后加入適量的2×SDS上樣緩沖液，煮沸10分鐘使蛋白變性，進行SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡（WesternBlot）檢測。蛋白質(zhì)印跡（WesternBlot）：用于檢測細胞內(nèi)CHIP、ZBP1及程序性細胞壞死相關(guān)蛋白（如RIPK1、RIPK3、MLKL等）的表達水平和磷酸化狀態(tài)。收集細胞后，按照上述免疫共沉淀的方法提取細胞總蛋白，并進行蛋白定量。將定量后的蛋白樣品與2×SDS上樣緩沖液混合，煮沸變性后進行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉或BSA封閉液室溫封閉1-2小時，以防止非特異性結(jié)合。隨后加入一抗（如抗CHIP抗體、抗ZBP1抗體、抗RIPK1抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-5次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。再加入相應(yīng)的二抗（如HRP標記的羊抗兔IgG、HRP標記的羊抗鼠IgG等），室溫孵育1-2小時。最后用TBST緩沖液充分洗滌PVDF膜后，加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑），在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光顯影，分析蛋白條帶的灰度值，以半定量分析蛋白的表達水平。細胞轉(zhuǎn)染：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法或電穿孔法將質(zhì)粒（如過表達CHIP的質(zhì)粒、敲低CHIP的siRNA、過表達ZBP1的質(zhì)粒、突變型ZBP1的質(zhì)粒等）轉(zhuǎn)染至細胞中，以改變細胞內(nèi)CHIP或ZBP1的表達水平。具體操作根據(jù)不同的轉(zhuǎn)染試劑和細胞系進行優(yōu)化。例如，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑時，將適量的質(zhì)粒與脂質(zhì)體按照一定比例混合，室溫孵育15-20分鐘，形成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物，然后將復(fù)合物加入到細胞培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)細胞，使質(zhì)粒進入細胞并表達相應(yīng)的蛋白。泛素化實驗：用于檢測ZBP1是否被CHIP泛素化修飾以及泛素化修飾的位點。構(gòu)建帶有泛素標簽（如HA-ubiquitin）的質(zhì)粒，并與CHIP和ZBP1的相關(guān)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染48小時后，收集細胞，用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白。然后進行免疫共沉淀實驗，使用ZBP1抗體沉淀ZBP1蛋白，隨后用抗HA抗體進行蛋白質(zhì)印跡檢測，觀察是否有泛素化的ZBP1條帶出現(xiàn)。若要確定泛素化修飾的位點，可構(gòu)建ZBP1的一系列突變體質(zhì)粒，分別與CHIP和HA-ubiquitin質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞，通過上述方法檢測突變體ZBP1的泛素化情況，從而確定泛素化修飾的具體賴氨酸殘基位點。程序性細胞壞死檢測：采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法、碘化丙啶（PI）染色法和AnnexinV-FITC/PI雙染法等方法檢測細胞程序性壞死的發(fā)生情況。LDH釋放法是通過檢測細胞培養(yǎng)上清中LDH的活性來反映細胞膜的損傷程度，從而間接判斷細胞程序性壞死的發(fā)生。具體操作是收集細胞培養(yǎng)上清，按照LDH檢測試劑盒的說明書進行操作，在酶標儀上測定490nm處的吸光度值，計算LDH釋放率。PI染色法是利用PI能夠穿透壞死細胞破損的細胞膜，與細胞核中的DNA結(jié)合發(fā)出紅色熒光的原理，通過流式細胞儀檢測PI陽性細胞的比例來確定程序性壞死細胞的數(shù)量。AnnexinV-FITC/PI雙染法則是結(jié)合了AnnexinV能夠特異性結(jié)合凋亡早期細胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸，以及PI能夠標記壞死細胞的特點，通過流式細胞儀區(qū)分凋亡細胞、壞死細胞和正常細胞，從而更準確地檢測程序性細胞壞死的發(fā)生。1.3.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：首先，通過免疫共沉淀和蛋白質(zhì)印跡實驗，驗證CHIP與ZBP1在細胞內(nèi)是否存在相互作用，并初步探究這種相互作用對ZBP1蛋白水平的影響。然后，利用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，分別過表達和敲低CHIP，檢測ZBP1蛋白水平的變化，進一步明確CHIP對ZBP1水平的調(diào)控作用。接著，進行泛素化實驗，確定CHIP是否介導(dǎo)ZBP1的泛素化修飾以及泛素化修飾的位點。之后，通過給予細胞程序性細胞壞死誘導(dǎo)劑（如TNF-α、SMACmimetic、z-VAD-fmk聯(lián)合處理），觀察在不同CHIP和ZBP1表達水平下，細胞程序性壞死的發(fā)生情況，采用上述程序性細胞壞死檢測方法進行檢測和分析。同時，構(gòu)建ZBP1的突變體質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染至細胞中，模擬ZBP1無法被CHIP泛素化修飾的情況，再次檢測細胞程序性壞死的發(fā)生，以深入探究CHIP泛素化修飾降解ZBP1對程序性細胞壞死的調(diào)控機制。最后，綜合以上實驗結(jié)果，總結(jié)CHIP泛素化修飾降解調(diào)控ZBP1水平及程序性細胞壞死的分子機制，為相關(guān)疾病的治療提供理論依據(jù)和潛在靶點。[此處插入技術(shù)路線圖1-1，技術(shù)路線圖應(yīng)清晰展示各實驗步驟之間的邏輯關(guān)系和先后順序，包括細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、免疫共沉淀、蛋白質(zhì)印跡、泛素化實驗、程序性細胞壞死檢測等關(guān)鍵實驗環(huán)節(jié)，以及各實驗所對應(yīng)的預(yù)期結(jié)果和數(shù)據(jù)分析方法。]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1程序性細胞壞死概述2.1.1程序性細胞壞死的概念與特征程序性細胞壞死是一種由基因調(diào)控的、不依賴于半胱天冬酶（caspase）的細胞死亡方式，它打破了傳統(tǒng)觀念中壞死是一種被動、無序過程的認知。與細胞凋亡相比，程序性細胞壞死具有獨特的形態(tài)學(xué)和生化特征。在形態(tài)學(xué)上，細胞凋亡表現(xiàn)為細胞皺縮、染色質(zhì)凝集、細胞膜內(nèi)陷形成凋亡小體等，這些凋亡小體最終被吞噬細胞清除，不會引發(fā)炎癥反應(yīng)。而程序性細胞壞死時，細胞則會出現(xiàn)明顯的腫脹，細胞膜完整性喪失并發(fā)生破裂，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物釋放到細胞外間質(zhì)中，引發(fā)周圍組織的炎癥反應(yīng)。從生化特征來看，細胞凋亡主要由caspase家族蛋白酶介導(dǎo)，通過一系列級聯(lián)反應(yīng)切割細胞內(nèi)的重要蛋白底物，從而執(zhí)行凋亡程序。例如，caspase-3可以切割多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP），使其失去活性，影響DNA修復(fù)，最終導(dǎo)致細胞凋亡。程序性細胞壞死則不依賴于caspase，而是由特定的蛋白激酶如受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）、受體相互作用蛋白激酶3（RIPK3）和混合譜系激酶樣結(jié)構(gòu)域蛋白（MLKL）等介導(dǎo)其信號通路。RIPK1和RIPK3可以通過其RHIM結(jié)構(gòu)域相互作用，形成壞死小體，激活下游的MLKL，進而引發(fā)程序性細胞壞死。與其他細胞死亡方式相比，程序性細胞壞死也有其獨特之處。例如，與細胞自噬性死亡不同，細胞自噬是細胞通過形成自噬體，包裹細胞內(nèi)的受損細胞器或蛋白質(zhì)等，然后與溶酶體融合進行降解，以維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和提供營養(yǎng)物質(zhì)，而程序性細胞壞死主要是導(dǎo)致細胞的死亡和炎癥反應(yīng)。與焦亡相比，焦亡是一種由炎性小體激活caspase-1等炎性caspase，導(dǎo)致細胞腫脹破裂并釋放炎癥因子的細胞死亡方式，雖然兩者都有細胞腫脹和炎癥反應(yīng)的特征，但焦亡主要由caspase介導(dǎo)，而程序性細胞壞死不依賴于caspase。這些差異表明，程序性細胞壞死作為一種獨特的細胞死亡方式，在細胞命運調(diào)控和機體生理病理過程中發(fā)揮著不可替代的作用，其獨特的特征也為研究其分子機制和生物學(xué)功能提供了重要線索。2.1.2程序性細胞壞死的信號通路程序性細胞壞死的信號通路主要由RIPK1、RIPK3、MLKL等關(guān)鍵蛋白介導(dǎo)，它們之間相互作用，形成了一個復(fù)雜而精細的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)細胞受到腫瘤壞死因子α（TNF-α）、細菌內(nèi)毒素、雙鏈RNA等刺激時，死亡受體（如TNFR1）被激活，招募銜接蛋白TRADD（TNFR1-associateddeathdomainprotein）和TRAF2（TNFreceptor-associatedfactor2）。TRADD與RIPK1結(jié)合，使RIPK1發(fā)生磷酸化并激活，激活的RIPK1進一步招募RIPK3。RIPK1和RIPK3通過其RHIM結(jié)構(gòu)域相互作用，形成壞死小體。壞死小體的形成是程序性細胞壞死信號通路中的關(guān)鍵步驟，它將信號進一步傳遞給下游的MLKL。在壞死小體中，RIPK3通過磷酸化作用激活MLKL。MLKL被激活后，其構(gòu)象發(fā)生改變，從單體狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣丫垠w狀態(tài)。寡聚化的MLKL轉(zhuǎn)位到細胞膜上，插入細胞膜并形成孔道，導(dǎo)致細胞膜的通透性增加，細胞內(nèi)容物泄露，最終引發(fā)細胞程序性壞死。研究表明，MLKL的磷酸化位點和寡聚化狀態(tài)對其功能至關(guān)重要，通過基因突變或化學(xué)抑制劑阻斷MLKL的磷酸化或寡聚化，可以有效抑制程序性細胞壞死的發(fā)生。除了上述經(jīng)典的信號通路外，程序性細胞壞死還存在一些其他的調(diào)控機制和相關(guān)信號分子。例如，ZBP1作為一種細胞內(nèi)的模式識別受體，能被病毒或宿主來源的Z型核酸活化?；罨腪BP1也可以通過其RHIM結(jié)構(gòu)域與RIPK1和RIPK3相互作用，激活程序性細胞壞死信號通路。在某些病毒感染的情況下，病毒產(chǎn)生的Z型核酸可以被ZBP1識別，從而啟動程序性細胞壞死，以限制病毒的復(fù)制和傳播。一些小分子物質(zhì)如Nec-1（necrostatin-1）等可以特異性地抑制RIPK1的激酶活性，從而阻斷程序性細胞壞死的發(fā)生。這些調(diào)控機制和相關(guān)信號分子的發(fā)現(xiàn)，進一步豐富了我們對程序性細胞壞死信號通路的認識，也為開發(fā)針對程序性細胞壞死相關(guān)疾病的治療藥物提供了更多的靶點和思路。2.2ZBP1蛋白及其功能2.2.1ZBP1的結(jié)構(gòu)與功能ZBP1，即Z-DNA結(jié)合蛋白1，又被稱為DAI（DNA-dependentactivatorofIFN-regulatoryfactors），是細胞內(nèi)一種重要的模式識別受體，在免疫防御、細胞死亡調(diào)控等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。ZBP1蛋白含有多個結(jié)構(gòu)域，其中Zαβ結(jié)構(gòu)域和RHIM結(jié)構(gòu)域是其發(fā)揮功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。Zαβ結(jié)構(gòu)域是ZBP1特異性識別Z型核酸（Z-DNA和Z-RNA）的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Z型核酸是一種特殊的核酸構(gòu)象，與傳統(tǒng)的B型核酸在空間結(jié)構(gòu)上存在明顯差異。在正常生理狀態(tài)下，細胞內(nèi)的核酸主要以B型構(gòu)象存在，但在病毒感染、細胞應(yīng)激等情況下，細胞內(nèi)會產(chǎn)生Z型核酸。ZBP1的Zαβ結(jié)構(gòu)域能夠通過其獨特的氨基酸序列和空間構(gòu)象，與Z型核酸緊密結(jié)合，從而啟動后續(xù)的免疫應(yīng)答和細胞死亡信號傳導(dǎo)。研究表明，Zαβ結(jié)構(gòu)域中的關(guān)鍵氨基酸殘基突變會導(dǎo)致ZBP1對Z型核酸的結(jié)合能力喪失，進而影響其功能的發(fā)揮。例如，通過定點突變技術(shù)將Zαβ結(jié)構(gòu)域中的某些氨基酸殘基替換后，ZBP1無法再識別Z型核酸，細胞對病毒感染的防御能力也明顯下降。RHIM結(jié)構(gòu)域則在ZBP1介導(dǎo)的細胞死亡信號傳導(dǎo)中起著核心作用。RHIM結(jié)構(gòu)域是一段富含精氨酸和組氨酸的保守序列，它能夠與其他含有RHIM結(jié)構(gòu)域的蛋白相互作用，形成蛋白復(fù)合物，從而傳遞細胞死亡信號。在程序性細胞壞死信號通路中，ZBP1的RHIM結(jié)構(gòu)域可以與RIPK1和RIPK3的RHIM結(jié)構(gòu)域相互作用。當(dāng)ZBP1識別Z型核酸被激活后，其RHIM結(jié)構(gòu)域與RIPK1和RIPK3結(jié)合，促使RIPK1和RIPK3發(fā)生磷酸化并激活，進而形成壞死小體，激活下游的MLKL，最終引發(fā)程序性細胞壞死。這種通過RHIM結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的蛋白-蛋白相互作用是程序性細胞壞死信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對于清除病原體感染的細胞、維持機體免疫平衡具有重要意義。2.2.2ZBP1與程序性細胞壞死的關(guān)聯(lián)ZBP1在程序性細胞壞死的啟動和調(diào)控過程中扮演著不可或缺的角色，其主要通過與RIPK1、RIPK3等關(guān)鍵蛋白相互作用，激活程序性細胞壞死信號通路。當(dāng)細胞受到病毒感染或其他應(yīng)激刺激時，細胞內(nèi)產(chǎn)生的Z型核酸被ZBP1識別并結(jié)合，ZBP1發(fā)生構(gòu)象變化從而被激活。激活后的ZBP1通過其RHIM結(jié)構(gòu)域與RIPK1和RIPK3結(jié)合，招募它們形成復(fù)合物。在這個復(fù)合物中，RIPK1和RIPK3的激酶活性被激活，RIPK3進一步磷酸化MLKL。MLKL被磷酸化后發(fā)生寡聚化，從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細胞膜上，插入細胞膜形成孔道，導(dǎo)致細胞膜的通透性增加，細胞內(nèi)容物泄露，最終引發(fā)程序性細胞壞死。研究表明，在敲除ZBP1基因的細胞中，即使給予程序性細胞壞死誘導(dǎo)劑刺激，細胞也難以發(fā)生程序性細胞壞死，這充分證明了ZBP1在程序性細胞壞死啟動中的關(guān)鍵作用。在某些病毒感染的情況下，病毒的核酸會在細胞內(nèi)形成Z型構(gòu)象，被ZBP1識別。例如，單純皰疹病毒（HSV）感染細胞后，其病毒DNA會在細胞內(nèi)形成Z-DNA，ZBP1通過Zαβ結(jié)構(gòu)域識別Z-DNA后被激活，進而通過RHIM結(jié)構(gòu)域與RIPK1和RIPK3相互作用，激活程序性細胞壞死信號通路，使被感染的細胞發(fā)生程序性細胞壞死，從而限制病毒的復(fù)制和傳播。ZBP1還可以與其他信號分子相互作用，對程序性細胞壞死進行精細調(diào)控。ZBP1可以與TRIF（TIRdomain-containingadapter-inducingIFN-β）相互作用，在Toll樣受體（TLR）信號通路中，協(xié)同調(diào)節(jié)程序性細胞壞死的發(fā)生。這種復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)使得ZBP1在程序性細胞壞死中能夠根據(jù)不同的細胞微環(huán)境和刺激信號，精確地調(diào)控細胞死亡的進程，維持細胞和機體的穩(wěn)態(tài)。2.3泛素化修飾與降解系統(tǒng)2.3.1泛素化修飾的過程與機制泛素化修飾是一種高度保守且復(fù)雜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程，在細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制、代謝調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)以及細胞周期調(diào)控等眾多生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。這一過程主要涉及三種關(guān)鍵的酶，即泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3，它們依次協(xié)同作用，完成對底物蛋白的泛素化修飾。泛素激活酶E1是泛素化修飾的起始關(guān)鍵酶。在ATP的參與下，E1首先與泛素分子結(jié)合，形成E1-泛素復(fù)合物，這一過程消耗ATP并使泛素分子的羧基末端與E1的半胱氨酸殘基之間形成高能硫酯鍵，從而激活泛素分子。這個激活步驟是泛素化修飾的起始點，為后續(xù)的反應(yīng)提供了活化的泛素分子。以人類細胞中的UBA1（E1的一種亞型）為例，它通過其特定的結(jié)構(gòu)域與泛素分子相互作用，在ATP水解提供能量的情況下，完成對泛素分子的激活。研究表明，UBA1基因的突變可能導(dǎo)致其對泛素分子的激活能力下降，進而影響細胞內(nèi)的泛素化修飾過程，引發(fā)一系列細胞功能異常。激活后的泛素分子從E1轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶E2上。E2酶含有一個保守的半胱氨酸殘基，泛素分子通過與這個半胱氨酸殘基形成硫酯鍵，與E2緊密結(jié)合。E2在泛素化修飾過程中起著中間傳遞的關(guān)鍵作用，它不僅接收來自E1的活化泛素，還與后續(xù)的E3酶相互作用，共同完成泛素分子向底物蛋白的轉(zhuǎn)移。人類細胞中存在多種E2酶，如UBE2D1、UBE2E1等，它們具有不同的底物特異性和功能特性。UBE2D1在某些信號通路中，能夠特異性地與特定的E3酶結(jié)合，介導(dǎo)底物蛋白的泛素化修飾，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化。不同的E2酶在細胞內(nèi)的表達水平和活性也受到嚴格調(diào)控，以適應(yīng)細胞不同生理狀態(tài)下對泛素化修飾的需求。泛素連接酶E3是泛素化修飾過程中的關(guān)鍵決定因素，它決定了底物蛋白的特異性識別和泛素化修飾的位點。E3酶通過其特定的結(jié)構(gòu)域與底物蛋白相互作用，同時與攜帶泛素分子的E2酶結(jié)合，催化泛素分子從E2轉(zhuǎn)移到底物蛋白的賴氨酸殘基上。根據(jù)結(jié)構(gòu)和作用機制的不同，E3酶主要分為兩大類：RING（ReallyInterestingNewGene）型和HECT（HomologoustoE6-associatedProteinC-Terminus）型。RING型E3酶通過其RING結(jié)構(gòu)域與E2酶和底物蛋白相互作用，促進泛素分子的轉(zhuǎn)移，但自身并不直接參與泛素-底物鍵的形成；而HECT型E3酶則首先與泛素分子形成硫酯鍵，然后將泛素分子直接轉(zhuǎn)移到底物蛋白上。例如，MDM2是一種典型的RING型E3酶，它能夠特異性地識別腫瘤抑制因子p53，并介導(dǎo)p53的泛素化降解，從而調(diào)節(jié)細胞的生長和凋亡。當(dāng)細胞受到DNA損傷等應(yīng)激刺激時，MDM2與p53的相互作用受到調(diào)控，p53的泛素化降解減少，p53蛋白水平升高，進而激活一系列下游基因的表達，引發(fā)細胞周期阻滯或凋亡，以維持細胞基因組的穩(wěn)定性。在泛素化修飾過程中，單個泛素分子連接到底物蛋白上稱為單泛素化修飾，而多個泛素分子依次連接形成多聚泛素鏈則稱為多泛素化修飾。多聚泛素鏈可以通過不同的賴氨酸殘基連接方式形成，如K48連接、K63連接等，不同連接方式的多聚泛素鏈賦予底物蛋白不同的命運。K48連接的多聚泛素鏈通常作為信號，引導(dǎo)底物蛋白被26S蛋白酶體識別并降解，從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)水平的調(diào)控。在細胞周期調(diào)控中，周期蛋白（Cyclin）的降解就是通過K48連接的多聚泛素化修飾介導(dǎo)的。當(dāng)細胞周期進入特定階段時，相應(yīng)的E3酶識別并結(jié)合Cyclin，催化其發(fā)生K48連接的多聚泛素化修飾，被修飾后的Cyclin被26S蛋白酶體識別并降解，從而確保細胞周期的正常進行。K63連接的多聚泛素鏈則更多地參與細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)、DNA損傷修復(fù)等過程，而不是直接介導(dǎo)蛋白質(zhì)的降解。在DNA損傷修復(fù)過程中，一些參與修復(fù)的蛋白會被K63連接的多聚泛素化修飾，這種修飾能夠招募其他修復(fù)相關(guān)蛋白，形成修復(fù)復(fù)合物，促進DNA損傷的修復(fù)。泛素化修飾是一個高度有序且精細調(diào)控的過程，E1、E2和E3酶之間的協(xié)同作用以及多聚泛素鏈的不同連接方式，賦予了細胞對蛋白質(zhì)進行多樣化修飾和調(diào)控的能力，從而維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和正常生理功能。2.3.2CHIP在泛素化降解中的作用CHIP作為一種獨特的E3泛素連接酶，在泛素化降解過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其結(jié)構(gòu)和功能特性決定了它能夠特異性地識別底物蛋白并促進其泛素化和降解，從而在細胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及多種生理病理過程中扮演重要角色。CHIP的結(jié)構(gòu)包含多個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域賦予了CHIP獨特的功能。CHIP的N端含有四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域（TPR），TPR結(jié)構(gòu)域由多個四肽重復(fù)單元組成，能夠與熱休克蛋白（Hsp70、Hsp90等）相互作用。這種相互作用使得CHIP能夠借助熱休克蛋白的分子伴侶功能，接近并識別那些需要被降解的錯誤折疊或受損的蛋白質(zhì)底物。在細胞受到高溫、氧化應(yīng)激等環(huán)境脅迫時，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)容易發(fā)生錯誤折疊，此時Hsp70等熱休克蛋白會結(jié)合到錯誤折疊的蛋白質(zhì)上，幫助其恢復(fù)正確構(gòu)象。CHIP通過TPR結(jié)構(gòu)域與Hsp70結(jié)合，形成CHIP-Hsp70-底物蛋白復(fù)合物，從而實現(xiàn)對底物蛋白的特異性識別。研究表明，當(dāng)TPR結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變時，CHIP與Hsp70的結(jié)合能力顯著下降，導(dǎo)致其對底物蛋白的識別和降解效率降低，進而影響細胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制體系的正常運行。CHIP的中間區(qū)域是U-box結(jié)構(gòu)域，這是CHIP發(fā)揮E3泛素連接酶活性的核心結(jié)構(gòu)域。U-box結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)和功能上與RING指結(jié)構(gòu)域相似，能夠與泛素結(jié)合酶E2相互作用。當(dāng)CHIP識別到底物蛋白后，U-box結(jié)構(gòu)域與攜帶泛素分子的E2酶結(jié)合，催化泛素分子從E2轉(zhuǎn)移到底物蛋白的賴氨酸殘基上，啟動底物蛋白的泛素化修飾過程。體外實驗證實，將U-box結(jié)構(gòu)域突變或缺失后，CHIP喪失了E3泛素連接酶活性，無法介導(dǎo)底物蛋白的泛素化，這充分說明了U-box結(jié)構(gòu)域在CHIP泛素化功能中的關(guān)鍵作用。CHIP的C端含有RING指結(jié)構(gòu)域，雖然其具體功能尚未完全明確，但研究表明它可能進一步增強CHIP的泛素連接酶活性，或者在底物蛋白的識別和多聚泛素鏈的形成過程中發(fā)揮一定作用。有研究推測，RING指結(jié)構(gòu)域可能與U-box結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，優(yōu)化CHIP對E2酶和底物蛋白的結(jié)合能力，從而提高泛素化修飾的效率。然而，關(guān)于RING指結(jié)構(gòu)域的詳細功能和作用機制，仍需要進一步深入研究。在泛素化降解過程中，CHIP能夠特異性地識別多種底物蛋白，并介導(dǎo)它們的泛素化和降解。許多錯誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)是CHIP的重要底物。在神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病和帕金森病中，異常聚集的蛋白質(zhì)（如β-淀粉樣蛋白、α-突觸核蛋白等）會對神經(jīng)元造成損傷。CHIP可以通過與這些錯誤折疊和聚集的蛋白質(zhì)結(jié)合，介導(dǎo)它們的泛素化修飾，然后被26S蛋白酶體識別并降解，從而減少蛋白質(zhì)聚集體對神經(jīng)元的毒性作用，保護神經(jīng)元的正常功能。一些參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白也受到CHIP的泛素化調(diào)控。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，某些癌基因或抑癌基因的表達和活性異常會影響腫瘤細胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。CHIP可以通過泛素化降解這些異常表達的信號蛋白，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號通路，維持細胞的正常生理狀態(tài)。例如，CHIP可以介導(dǎo)某些促癌蛋白（如c-Myc等）的泛素化降解，抑制腫瘤細胞的增殖；同時，它也可以促進某些抑癌蛋白（如p53等）的穩(wěn)定性，增強細胞對腫瘤發(fā)生的抑制能力。CHIP作為一種具有獨特結(jié)構(gòu)和功能的E3泛素連接酶，通過其TPR、U-box和RING指結(jié)構(gòu)域，特異性地識別底物蛋白，與E2酶協(xié)同作用，促進底物蛋白的泛素化修飾，并最終通過26S蛋白酶體降解，在細胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。三、CHIP泛素化修飾降解對ZBP1水平的調(diào)控機制3.1CHIP與ZBP1的相互作用驗證3.1.1免疫共沉淀實驗為了驗證CHIP與ZBP1在細胞內(nèi)是否存在直接相互作用，我們采用免疫共沉淀實驗進行探究。選用人胚腎293T細胞作為實驗對象，該細胞具有易于培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用研究。將細胞接種于6孔板中，待細胞密度達到70%-80%時，進行轉(zhuǎn)染操作。首先，構(gòu)建過表達CHIP和ZBP1的質(zhì)粒。通過基因克隆技術(shù)，從cDNA文庫中擴增出CHIP和ZBP1的編碼基因，分別將其插入到帶有FLAG標簽和HA標簽的真核表達載體中，構(gòu)建出pFLAG-CHIP和pHA-ZBP1質(zhì)粒。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將pFLAG-CHIP和pHA-ZBP1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細胞中，設(shè)置單獨轉(zhuǎn)染pFLAG-CHIP或pHA-ZBP1質(zhì)粒的細胞作為對照組。轉(zhuǎn)染48小時后，收集細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌兩次，以去除細胞表面的雜質(zhì)和培養(yǎng)基。加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，在冰上裂解30分鐘，期間不斷輕柔混勻，使細胞充分裂解，釋放出細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。然后于4℃、12000g離心15分鐘，取上清，得到細胞總蛋白裂解液。向上清中加入適量的抗FLAG抗體（針對CHIP蛋白的FLAG標簽），4℃孵育過夜，使抗體與CHIP蛋白充分結(jié)合。隨后加入ProteinA/G瓊脂糖珠，繼續(xù)在4℃孵育2-4小時，ProteinA/G瓊脂糖珠能夠特異性地結(jié)合抗體，從而捕獲抗原-抗體復(fù)合物，即CHIP與ZBP1的復(fù)合物（如果兩者存在相互作用）。用預(yù)冷的洗滌緩沖液（如含0.1%Tween-20的PBS）洗滌瓊脂糖珠-抗原-抗體復(fù)合物3-5次，每次5分鐘，以去除非特異性結(jié)合的蛋白。最后加入適量的2×SDS上樣緩沖液，煮沸10分鐘使蛋白變性，進行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉或BSA封閉液室溫封閉1-2小時，以防止非特異性結(jié)合。隨后加入抗HA抗體（針對ZBP1蛋白的HA標簽）作為一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-5次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。再加入相應(yīng)的HRP標記的羊抗鼠IgG二抗，室溫孵育1-2小時。最后用TBST緩沖液充分洗滌PVDF膜后，加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑），在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光顯影。如果在共轉(zhuǎn)染pFLAG-CHIP和pHA-ZBP1質(zhì)粒的細胞樣品中，能夠檢測到與ZBP1相對應(yīng)的條帶，而在單獨轉(zhuǎn)染pFLAG-CHIP或pHA-ZBP1質(zhì)粒的對照組中未檢測到該條帶，或者條帶強度明顯較弱，這就表明CHIP與ZBP1在細胞內(nèi)存在相互作用，并且這種相互作用可以通過免疫共沉淀的方法被檢測到。通過免疫共沉淀實驗，我們能夠初步驗證CHIP與ZBP1在細胞內(nèi)是否存在直接相互作用，為后續(xù)研究兩者的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。3.1.2體內(nèi)外結(jié)合實驗為了進一步確定CHIP與ZBP1的結(jié)合親和力和結(jié)合位點，我們利用GSTpull-down等實驗進行深入探究。GSTpull-down實驗是一種在體外研究蛋白質(zhì)相互作用的常用方法，它利用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）與谷胱甘肽（GSH）的特異性結(jié)合特性，將融合有GST標簽的蛋白固定在GSH-瓊脂糖珠上，當(dāng)與融合蛋白有相互作用的蛋白通過層析柱或與此固相復(fù)合物混合時，就可被吸附而分離，從而驗證蛋白質(zhì)之間的相互作用。首先，構(gòu)建GST-CHIP融合表達質(zhì)粒。通過基因工程技術(shù)，將CHIP的編碼基因克隆到含有GST標簽的表達載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中。挑取單菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日，按1:100的比例轉(zhuǎn)接至新鮮的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至菌體OD600值達到0.6-0.8。加入IPTG至終濃度為0.5mM，16℃誘導(dǎo)表達GST-CHIP融合蛋白16小時。誘導(dǎo)結(jié)束后，4℃、5000rpm離心10分鐘收集菌體。用預(yù)冷的PBS重懸菌體，加入蛋白酶抑制劑，進行超聲破碎，使細胞裂解。4℃、12000rpm離心30分鐘，取上清，得到含有GST-CHIP融合蛋白的裂解液。將GSH-瓊脂糖珠用PBS洗滌3次，每次3000rpm離心5分鐘，去除雜質(zhì)。將洗滌后的GSH-瓊脂糖珠與含有GST-CHIP融合蛋白的裂解液在4℃孵育2-4小時，使GST-CHIP融合蛋白與GSH-瓊脂糖珠充分結(jié)合。用PBS洗滌結(jié)合有GST-CHIP融合蛋白的GSH-瓊脂糖珠3-5次，每次3000rpm離心5分鐘，去除未結(jié)合的蛋白。另一方面，從細胞中提取天然的ZBP1蛋白。選用小鼠胚胎成纖維細胞（MEF），按照上述免疫共沉淀實驗中的細胞裂解方法，提取細胞總蛋白。將提取的細胞總蛋白與結(jié)合有GST-CHIP融合蛋白的GSH-瓊脂糖珠在4℃孵育過夜，使ZBP1蛋白與GST-CHIP融合蛋白充分相互作用。用PBS洗滌復(fù)合物3-5次，每次3000rpm離心5分鐘，去除未結(jié)合的ZBP1蛋白。最后加入適量的2×SDS上樣緩沖液，煮沸10分鐘使蛋白變性，進行SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡檢測。在蛋白質(zhì)印跡檢測中，使用抗ZBP1抗體作為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG作為二抗，通過化學(xué)發(fā)光法檢測是否存在ZBP1蛋白條帶。如果在與GST-CHIP融合蛋白孵育的樣品中檢測到ZBP1蛋白條帶，而在僅與GSH-瓊脂糖珠孵育的對照組中未檢測到該條帶，表明CHIP與ZBP1在體外存在相互作用。為了進一步確定CHIP與ZBP1的結(jié)合位點，構(gòu)建一系列CHIP或ZBP1的突變體質(zhì)粒。例如，針對CHIP的TPR結(jié)構(gòu)域、U-box結(jié)構(gòu)域和RING指結(jié)構(gòu)域分別設(shè)計突變體，通過定點突變技術(shù)改變關(guān)鍵氨基酸殘基，構(gòu)建出相應(yīng)的突變體質(zhì)粒。同樣地，對ZBP1的Zαβ結(jié)構(gòu)域和RHIM結(jié)構(gòu)域進行定點突變，構(gòu)建突變體質(zhì)粒。將這些突變體質(zhì)粒分別表達并純化出相應(yīng)的突變體蛋白，重復(fù)上述GSTpull-down實驗。通過比較野生型和突變體蛋白之間的結(jié)合情況，分析條帶的強度變化，從而確定CHIP與ZBP1相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域和結(jié)合位點。如果某個突變體蛋白與ZBP1的結(jié)合能力明顯下降或消失，說明該突變體所涉及的結(jié)構(gòu)域或氨基酸殘基在CHIP與ZBP1的相互作用中起著關(guān)鍵作用。通過GSTpull-down等體內(nèi)外結(jié)合實驗，我們能夠更深入地了解CHIP與ZBP1的結(jié)合特性，為揭示它們之間的相互作用機制提供重要線索。3.2CHIP介導(dǎo)ZBP1泛素化修飾的位點與方式3.2.1泛素化位點鑒定為了確定ZBP1被CHIP泛素化修飾的具體氨基酸位點，我們采用了質(zhì)譜分析技術(shù)。首先，構(gòu)建過表達CHIP、ZBP1以及HA-ubiquitin的質(zhì)粒。將這些質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細胞中，使細胞內(nèi)同時表達CHIP、ZBP1和HA-泛素。轉(zhuǎn)染48小時后，收集細胞，用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白。接著進行免疫共沉淀實驗，使用ZBP1抗體沉淀ZBP1蛋白及其結(jié)合的泛素化蛋白。將免疫共沉淀得到的蛋白復(fù)合物進行SDS-PAGE電泳，然后將凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用考馬斯亮藍染色或銀染法對PVDF膜上的蛋白條帶進行染色，切下與泛素化ZBP1相對應(yīng)的條帶。將切下的蛋白條帶進行膠內(nèi)酶解，使用胰蛋白酶等酶將蛋白消化成小分子肽段。酶解后的肽段通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS）進行分析。在質(zhì)譜分析過程中，肽段離子化后在電場和磁場的作用下，按照質(zhì)荷比（m/z）的不同進行分離和檢測。通過質(zhì)譜儀檢測到的肽段的質(zhì)荷比信息，結(jié)合數(shù)據(jù)庫搜索，我們可以推斷出肽段的氨基酸序列。由于泛素化修飾會導(dǎo)致被修飾氨基酸殘基的質(zhì)量增加，在質(zhì)譜圖中會出現(xiàn)特定的質(zhì)荷比位移。通過分析質(zhì)譜圖中肽段的質(zhì)荷比變化，與理論上泛素化修飾后肽段的質(zhì)荷比進行比對，從而確定ZBP1上被泛素化修飾的賴氨酸殘基位點。如果某個肽段在質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了比未修飾肽段質(zhì)量增加了114.04293Da（單個泛素分子的質(zhì)量減去一個水分子的質(zhì)量）的峰，且該肽段包含賴氨酸殘基，那么這個賴氨酸殘基很可能就是被泛素化修飾的位點。為了進一步驗證質(zhì)譜分析的結(jié)果，我們構(gòu)建ZBP1的點突變體質(zhì)粒，將質(zhì)譜預(yù)測的泛素化位點賴氨酸殘基突變?yōu)榫彼釟埢?。將突變體質(zhì)粒與CHIP和HA-ubiquitin質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞，再次進行免疫共沉淀和蛋白質(zhì)印跡實驗。如果突變后的ZBP1不再發(fā)生泛素化修飾，或者泛素化修飾水平顯著降低，就可以證實該位點確實是CHIP介導(dǎo)ZBP1泛素化修飾的位點。通過質(zhì)譜分析和點突變驗證實驗，我們能夠準確地鑒定出ZBP1被CHIP泛素化修飾的具體氨基酸位點，為深入理解CHIP對ZBP1的泛素化調(diào)控機制提供關(guān)鍵信息。3.2.2泛素化方式研究為了探究CHIP對ZBP1進行泛素化修飾的方式是單泛素化還是多泛素化，以及這種修飾方式對ZBP1命運的影響，我們設(shè)計了一系列實驗。首先，構(gòu)建過表達CHIP、ZBP1以及HA-ubiquitin的質(zhì)粒。將這些質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細胞中，使細胞內(nèi)同時表達CHIP、ZBP1和HA-泛素。轉(zhuǎn)染48小時后，收集細胞，用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白。進行免疫共沉淀實驗，使用ZBP1抗體沉淀ZBP1蛋白及其結(jié)合的泛素化蛋白。將免疫共沉淀得到的蛋白復(fù)合物進行SDS-PAGE電泳，然后用抗HA抗體進行蛋白質(zhì)印跡檢測，觀察泛素化ZBP1條帶的遷移情況。在SDS-PAGE電泳中，單泛素化修飾的ZBP1由于只連接了一個泛素分子，其分子量增加相對較小，在凝膠上的遷移位置相對較快；而多泛素化修飾的ZBP1由于連接了多個泛素分子，分子量顯著增加，在凝膠上的遷移位置相對較慢，會出現(xiàn)多條遷移率不同的條帶，呈現(xiàn)出階梯狀分布。如果在蛋白質(zhì)印跡結(jié)果中，只出現(xiàn)一條遷移較快的條帶，且該條帶對應(yīng)的分子量增加與單泛素化修飾相符，說明CHIP對ZBP1主要進行單泛素化修飾；如果出現(xiàn)多條遷移率不同的條帶，呈現(xiàn)出階梯狀分布，且條帶對應(yīng)的分子量增加與多泛素化修飾相符，說明CHIP對ZBP1進行多泛素化修飾。為了進一步明確泛素化修飾方式對ZBP1命運的影響，我們分別構(gòu)建了只表達單泛素化ZBP1和多泛素化ZBP1的突變體質(zhì)粒。通過定點突變技術(shù)，在ZBP1的特定賴氨酸殘基位點引入突變，使得ZBP1只能發(fā)生單泛素化修飾或多泛素化修飾。將這些突變體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至細胞中，觀察ZBP1的細胞定位、穩(wěn)定性以及對程序性細胞壞死信號通路的激活能力。如果單泛素化修飾的ZBP1主要定位于細胞質(zhì)中，且其蛋白穩(wěn)定性較高，對程序性細胞壞死信號通路的激活能力較弱；而多泛素化修飾的ZBP1更容易被26S蛋白酶體識別并降解，蛋白穩(wěn)定性較低，同時能夠更有效地激活程序性細胞壞死信號通路，說明不同的泛素化修飾方式對ZBP1的命運有著顯著影響。通過以上實驗，我們能夠深入了解CHIP對ZBP1的泛素化修飾方式及其對ZBP1命運的影響，為揭示CHIP泛素化修飾降解調(diào)控ZBP1水平及程序性細胞壞死的機制提供重要依據(jù)。3.3CHIP調(diào)控ZBP1降解的分子機制3.3.1蛋白酶體途徑參與ZBP1降解在確定CHIP介導(dǎo)ZBP1泛素化修飾后，進一步探究其降解機制發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體途徑在ZBP1降解過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。蛋白酶體是細胞內(nèi)負責(zé)降解蛋白質(zhì)的重要復(fù)合物，它能夠識別并降解被泛素化修飾的蛋白質(zhì)。當(dāng)ZBP1被CHIP泛素化修飾后，會形成帶有多聚泛素鏈的ZBP1蛋白復(fù)合物。這種多聚泛素鏈作為一種信號，能夠被26S蛋白酶體的19S調(diào)節(jié)顆粒所識別。19S調(diào)節(jié)顆粒具有多種功能，它不僅能夠識別泛素化的蛋白質(zhì)，還含有多個ATP酶活性位點，能夠利用ATP水解提供的能量，促進底物蛋白的去折疊，并將其轉(zhuǎn)運至20S核心顆粒中進行降解。在ZBP1降解過程中，19S調(diào)節(jié)顆粒首先通過其表面的泛素受體蛋白與ZBP1上的多聚泛素鏈結(jié)合。這些泛素受體蛋白具有特定的結(jié)構(gòu)域，能夠特異性地識別不同連接方式和長度的多聚泛素鏈。一旦結(jié)合，19S調(diào)節(jié)顆粒利用ATP水解產(chǎn)生的能量，驅(qū)動底物蛋白ZBP1發(fā)生去折疊，使其能夠通過20S核心顆粒狹窄的通道進入內(nèi)部。20S核心顆粒由多個亞基組成，形成一個桶狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部含有多個蛋白酶活性位點。進入20S核心顆粒的ZBP1蛋白在這些蛋白酶活性位點的作用下，被逐步降解為小分子肽段。這些小分子肽段最終被釋放到細胞內(nèi)，進一步被其他肽酶水解為氨基酸，參與細胞內(nèi)的代謝過程。研究表明，使用蛋白酶體抑制劑（如MG132）處理細胞后，能夠顯著抑制ZBP1的降解。在過表達CHIP和ZBP1的細胞中，加入MG132后，ZBP1蛋白水平明顯升高，且泛素化修飾的ZBP1也大量積累。這充分證明了蛋白酶體途徑在CHIP介導(dǎo)的ZBP1降解過程中起著不可或缺的作用，CHIP通過泛素化修飾ZBP1，使其能夠被蛋白酶體識別并降解，從而實現(xiàn)對ZBP1水平的調(diào)控。3.3.2影響ZBP1降解的其他因素除了CHIP介導(dǎo)的泛素化修飾和蛋白酶體途徑外，細胞內(nèi)環(huán)境、其他蛋白或分子也可能對ZBP1的降解過程產(chǎn)生重要影響。細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)是影響ZBP1降解的一個重要因素。細胞內(nèi)存在著復(fù)雜的氧化還原平衡體系，當(dāng)細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，細胞內(nèi)的活性氧（ROS）水平升高。研究發(fā)現(xiàn)，ROS可以通過氧化修飾ZBP1或CHIP蛋白，影響它們之間的相互作用以及ZBP1的泛素化修飾和降解。在氧化應(yīng)激條件下，ZBP1的某些氨基酸殘基可能被氧化，導(dǎo)致其構(gòu)象發(fā)生改變，影響CHIP對其識別和泛素化修飾。ROS還可能影響蛋白酶體的活性，進而影響ZBP1的降解效率。通過使用抗氧化劑（如N-乙酰半胱氨酸，NAC）處理細胞，可以降低細胞內(nèi)ROS水平，觀察到ZBP1的降解過程得到恢復(fù)，這表明氧化還原狀態(tài)對ZBP1降解具有調(diào)節(jié)作用。細胞內(nèi)的一些分子伴侶蛋白也可能參與ZBP1降解的調(diào)節(jié)。熱休克蛋白（Hsp）家族成員在細胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制中發(fā)揮著重要作用。Hsp70和Hsp90等分子伴侶可以與未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，幫助它們正確折疊或引導(dǎo)它們進入降解途徑。在ZBP1降解過程中，Hsp70和Hsp90可能與ZBP1和CHIP相互作用，影響ZBP1的泛素化修飾和降解。研究發(fā)現(xiàn)，Hsp70可以與ZBP1結(jié)合，穩(wěn)定ZBP1的構(gòu)象，在一定程度上抑制CHIP對ZBP1的泛素化修飾。而Hsp90則可能通過與CHIP相互作用，調(diào)節(jié)CHIP的活性，從而影響ZBP1的降解。當(dāng)細胞受到熱激等應(yīng)激刺激時，Hsp70和Hsp90的表達水平會發(fā)生變化，這種變化可能進一步影響ZBP1的降解過程。一些細胞內(nèi)的信號通路也可能對ZBP1的降解產(chǎn)生影響。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在細胞的生長、增殖、分化和應(yīng)激反應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，MAPK信號通路的激活可以影響CHIP和ZBP1的表達和活性。在某些細胞刺激條件下，MAPK信號通路被激活，導(dǎo)致CHIP的磷酸化水平發(fā)生改變，進而影響其E3泛素連接酶活性。這種變化可能影響CHIP對ZBP1的泛素化修飾和降解。PI3K-Akt信號通路也與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和降解密切相關(guān)。激活PI3K-Akt信號通路可以通過調(diào)節(jié)一些蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)，影響它們與其他蛋白的相互作用，從而影響ZBP1的降解。這些細胞內(nèi)環(huán)境因素、分子伴侶蛋白以及信號通路等對ZBP1降解的調(diào)節(jié)作用，進一步說明了ZBP1降解過程的復(fù)雜性和精細調(diào)控機制。四、ZBP1水平變化對程序性細胞壞死的影響4.1ZBP1過表達對程序性細胞壞死的誘導(dǎo)作用4.1.1細胞模型構(gòu)建與處理為深入探究ZBP1過表達對程序性細胞壞死的誘導(dǎo)作用，我們精心構(gòu)建了ZBP1過表達的細胞模型。選用小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）作為實驗細胞，因其來源廣泛、易于培養(yǎng)且對程序性細胞壞死信號通路較為敏感，能夠為研究提供良好的細胞基礎(chǔ)。通過基因克隆技術(shù)，從cDNA文庫中獲取ZBP1的編碼基因，將其插入到帶有FLAG標簽的真核表達載體pCMV-FLAG中，成功構(gòu)建出pCMV-FLAG-ZBP1過表達質(zhì)粒。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000將pCMV-FLAG-ZBP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MEF細胞中。在轉(zhuǎn)染前，將MEF細胞接種于6孔板中，每孔接種密度為2×10?個細胞，置于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度達到70%-80%時進行轉(zhuǎn)染操作。按照Lipofectamine3000試劑說明書，將適量的pCMV-FLAG-ZBP1質(zhì)粒與Lipofectamine3000試劑在Opti-MEM培養(yǎng)基中混合，室溫孵育15-20分鐘，形成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物。然后將復(fù)合物加入到含有MEF細胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，以確保質(zhì)粒充分表達。設(shè)置轉(zhuǎn)染空載體pCMV-FLAG的細胞作為對照組，以排除載體本身對實驗結(jié)果的影響。為誘導(dǎo)程序性細胞壞死，采用TNF-α（腫瘤壞死因子α）、SMACmimetic（一種凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1激活劑）和z-VAD-fmk（一種泛半胱天冬酶抑制劑）聯(lián)合處理細胞。在轉(zhuǎn)染48小時后，將細胞培養(yǎng)基更換為含有10ng/mLTNF-α、1μMSMACmimetic和50μMz-VAD-fmk的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6小時。TNF-α能夠激活死亡受體TNFR1，啟動程序性細胞壞死信號通路；SMACmimetic可以增強TNF-α誘導(dǎo)的壞死信號；z-VAD-fmk則通過抑制caspase的活性，阻斷細胞凋亡途徑，促使細胞走向程序性細胞壞死。通過這種聯(lián)合處理方式，能夠有效地誘導(dǎo)細胞發(fā)生程序性細胞壞死，以便后續(xù)研究ZBP1過表達對其的影響。4.1.2壞死相關(guān)指標檢測為準確評估ZBP1過表達對程序性細胞壞死的誘導(dǎo)作用，我們對細胞壞死率、RIPK3和MLKL磷酸化水平等壞死相關(guān)指標進行了全面檢測。采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測細胞壞死率。LDH是一種存在于細胞內(nèi)的酶，當(dāng)細胞膜受損時，LDH會釋放到細胞外培養(yǎng)基中。收集細胞培養(yǎng)上清，按照LDH檢測試劑盒說明書進行操作。將培養(yǎng)上清與LDH檢測試劑在96孔板中混合，室溫孵育30分鐘，然后在酶標儀上測定490nm處的吸光度值。同時，設(shè)置標準品孔，繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算細胞培養(yǎng)上清中LDH的釋放量，進而計算細胞壞死率。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體的對照組相比，ZBP1過表達組細胞培養(yǎng)上清中LDH釋放量顯著增加，細胞壞死率明顯升高，表明ZBP1過表達能夠促進細胞發(fā)生程序性細胞壞死。通過蛋白質(zhì)印跡（WesternBlot）檢測RIPK3和MLKL的磷酸化水平。收集處理后的細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌兩次，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，在冰上裂解30分鐘，期間不斷輕柔混勻。然后于4℃、12000g離心15分鐘，取上清，進行蛋白定量。將定量后的蛋白樣品與2×SDS上樣緩沖液混合，煮沸變性后進行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1-2小時。隨后加入抗p-RIPK3（磷酸化RIPK3）抗體、抗RIPK3抗體、抗p-MLKL（磷酸化MLKL）抗體和抗MLKL抗體作為一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-5次，每次10分鐘。再加入相應(yīng)的HRP標記的二抗，室溫孵育1-2小時。最后用TBST緩沖液充分洗滌PVDF膜后，加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑），在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光顯影。分析蛋白條帶的灰度值，以半定量分析RIPK3和MLKL的磷酸化水平。結(jié)果表明，ZBP1過表達組中p-RIPK3和p-MLKL的蛋白條帶灰度值明顯高于對照組，即RIPK3和MLKL的磷酸化水平顯著升高。這說明ZBP1過表達能夠激活程序性細胞壞死信號通路中的關(guān)鍵蛋白RIPK3和MLKL，促使它們發(fā)生磷酸化，進而誘導(dǎo)程序性細胞壞死的發(fā)生。通過對細胞壞死率、RIPK3和MLKL磷酸化水平等壞死相關(guān)指標的檢測，有力地證明了ZBP1過表達對程序性細胞壞死具有顯著的誘導(dǎo)作用。4.2ZBP1低表達或敲除對程序性細胞壞死的抑制作用4.2.1基因編輯技術(shù)應(yīng)用為了深入探究ZBP1低表達或敲除對程序性細胞壞死的抑制作用，我們運用先進的CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了相應(yīng)的細胞系。CRISPR-Cas9系統(tǒng)是一種源自細菌和古細菌的適應(yīng)性免疫防御機制，其核心組件包括Cas9核酸內(nèi)切酶和引導(dǎo)RNA（gRNA）。gRNA能夠通過堿基互補配對原則特異性地識別目標基因序列，并引導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶在特定位置切割DNA雙鏈，使DNA雙鏈斷裂（DSBs）。細胞自身的DNA修復(fù)機制在修復(fù)DSBs時，可能會引入堿基的插入或缺失，從而導(dǎo)致基因移碼突變，實現(xiàn)基因敲除的目的；也可以在提供外源修復(fù)模板的情況下，實現(xiàn)基因的定點插入或替換。在構(gòu)建ZBP1低表達或敲除細胞系時，首先借助生物信息學(xué)工具，對ZBP1基因序列進行全面分析，精準選擇合適的靶點。靶點通常設(shè)計在ZBP1基因的關(guān)鍵功能區(qū)域，如編碼Zαβ結(jié)構(gòu)域或RHIM結(jié)構(gòu)域的外顯子上，以確?；蚓庉嫼竽軌蛴行茐腪BP1蛋白的正常功能。針對選定的靶點，設(shè)計并合成相應(yīng)的gRNA序列，將其克隆到特定的表達載體中，構(gòu)建出gRNA表達質(zhì)粒。與此同時，獲取表達Cas9核酸內(nèi)切酶的質(zhì)粒。將gRNA表達質(zhì)粒和Cas9表達質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法或電穿孔法等高效的轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入到小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）中。在轉(zhuǎn)染過程中，對轉(zhuǎn)染條件進行優(yōu)化，如調(diào)整質(zhì)粒的用量、轉(zhuǎn)染試劑的比例以及轉(zhuǎn)染時間等，以提高轉(zhuǎn)染效率，確保足夠數(shù)量的細胞攝取質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染完成后，利用嘌呤霉素等抗生素對細胞進行篩選。在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中通常攜帶抗生素抗性基因，只有成功攝取并表達質(zhì)粒的細胞才能在含有抗生素的培養(yǎng)基中存活。經(jīng)過一段時間的篩選，獲得穩(wěn)定表達Cas9和gRNA的細胞克隆。為了鑒定這些細胞克隆中ZBP1基因的編輯情況，采用聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增ZBP1基因的編輯區(qū)域，然后對PCR產(chǎn)物進行測序分析。通過與野生型ZBP1基因序列進行比對，確定基因編輯的類型和效率。篩選出ZBP1基因成功敲除或低表達的細胞克隆，進一步擴大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定的ZBP1低表達或敲除細胞系。為了確保細胞系的穩(wěn)定性和可靠性，對其進行多次傳代培養(yǎng)，并定期檢測ZBP1基因的表達水平和編輯狀態(tài)。通過以上嚴謹?shù)膶嶒灢襟E和技術(shù)手段，成功構(gòu)建了ZBP1低表達或敲除細胞系，為后續(xù)研究ZBP1在程序性細胞壞死中的作用提供了關(guān)鍵的實驗材料。4.2.2細胞對壞死刺激的反應(yīng)變化當(dāng)ZBP1低表達或敲除后，細胞在面對程序性細胞壞死刺激時，展現(xiàn)出顯著的抵抗能力變化和相關(guān)信號通路的改變。以TNF-α、SMACmimetic和z-VAD-fmk聯(lián)合刺激作為程序性細胞壞死的誘導(dǎo)條件，在野生型MEF細胞中，這種聯(lián)合刺激能夠有效地激活程序性細胞壞死信號通路，導(dǎo)致細胞發(fā)生程序性細胞壞死。而在ZBP1低表達或敲除的MEF細胞中，細胞對這種刺激的反應(yīng)明顯減弱。通過乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測細胞壞死率，結(jié)果顯示ZBP1低表達或敲除組細胞培養(yǎng)上清中的LDH釋放量顯著低于野生型對照組，表明細胞壞死率明顯降低，即ZBP1低表達或敲除增強了細胞對程序性細胞壞死的抵抗能力。在信號通路層面，程序性細胞壞死信號通路中的關(guān)鍵蛋白RIPK3和MLKL的磷酸化水平也發(fā)生了顯著變化。蛋白質(zhì)印跡（WesternBlot）檢測結(jié)果表明，在野生型細胞受到程序性細胞壞死刺激后，RIPK3和MLKL迅速發(fā)生磷酸化，激活下游的壞死信號。而在ZBP1低表達或敲除的細胞中，即使給予相同的刺激，RIPK3和MLKL的磷酸化水平也明顯低于野生型細胞。這說明ZBP1低表達或敲除抑制了程序性細胞壞死信號通路的激活，使得RIPK3和MLKL難以被磷酸化，從而無法有效地啟動程序性細胞壞死。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ZBP1低表達或敲除還影響了壞死小體的形成。壞死小體是程序性細胞壞死信號傳導(dǎo)中的關(guān)鍵復(fù)合物，由RIPK1、RIPK3等蛋白相互作用形成。在ZBP1正常表達的細胞中，受到刺激后能夠迅速形成壞死小體，而在ZBP1低表達或敲除的細胞中，壞死小體的形成受到明顯抑制，這進一步證實了ZBP1在程序性細胞壞死信號通路中的關(guān)鍵作用。ZBP1低表達或敲除對細胞在程序性細胞壞死刺激下的抵抗能力和信號通路產(chǎn)生了顯著影響，為深入理解程序性細胞壞死的調(diào)控機制提供了重要線索。4.3ZBP1介導(dǎo)程序性細胞壞死的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制4.3.1RHIM結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵作用ZBP1的RHIM結(jié)構(gòu)域在程序性細胞壞死信號通路中起著至關(guān)重要的作用，它主要通過與RIPK1、RIPK3等蛋白的RHIM結(jié)構(gòu)域相互作用，激活程序性細胞壞死信號通路。RHIM結(jié)構(gòu)域是一段高度保守的氨基酸序列，存在于ZBP1、RIPK1和RIPK3等多種與程序性細胞壞死相關(guān)的蛋白中。在正常生理狀態(tài)下，ZBP1處于未激活狀態(tài)，其RHIM結(jié)構(gòu)域與其他結(jié)構(gòu)域相互作用，維持著ZBP1的穩(wěn)定構(gòu)象。當(dāng)細胞受到病毒感染、氧化應(yīng)激等刺激時，細胞內(nèi)產(chǎn)生的Z型核酸被ZBP1的Zαβ結(jié)構(gòu)域識別并結(jié)合，ZBP1發(fā)生構(gòu)象變化從而被激活。激活后的ZBP1，其RHIM結(jié)構(gòu)域暴露，能夠與RIPK1和RIPK3的RHIM結(jié)構(gòu)域相互作用。這種相互作用是通過RHIM結(jié)構(gòu)域之間的氫鍵、疏水作用等非共價鍵實現(xiàn)的。研究表明，當(dāng)ZBP1的RHIM結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變，導(dǎo)致其與RIPK1和RIPK3的RHIM結(jié)構(gòu)域結(jié)合能力喪失時，程序性細胞壞死信號通路無法正常激活，細胞對程序性細胞壞死刺激的敏感性顯著降低。在ZBP1基因敲除的細胞中，重新表達野生型ZBP1能夠恢復(fù)細胞對程序性細胞壞死刺激的響應(yīng)，而表達RHIM結(jié)構(gòu)域突變的ZBP1則無法恢復(fù)。ZBP1與RIPK1、RIPK3通過RHIM結(jié)構(gòu)域相互作用，形成了壞死小體，這是程序性細胞壞死信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵復(fù)合物。在壞死小體中，RIPK1和RIPK3的激酶活性被激活，它們可以通過自身磷酸化以及相互磷酸化來增強激酶活性。激活的RIPK3進一步磷酸化下游的MLKL，從而啟動程序性細胞壞死。這種通過RHIM結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的蛋白-蛋白相互作用和信號傳導(dǎo)，使得ZBP1能夠在程序性細胞壞死信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵的啟動和調(diào)控作用。在病毒感染過程中，病毒產(chǎn)生的Z型核酸被ZBP1識別，ZBP1通過RHIM結(jié)構(gòu)域與RIPK1和RIPK3結(jié)合，激活壞死小體的形成，促使被病毒感染的細胞發(fā)生程序性細胞壞死，從而限制病毒的復(fù)制和傳播。ZBP1的RHIM結(jié)構(gòu)域在程序性細胞壞死信號通路中是不可或缺的關(guān)鍵元件，它通過與RIPK1、RIPK3等蛋白的相互作用，實現(xiàn)了信號的傳遞和放大，最終導(dǎo)致程序性細胞壞死的發(fā)生。4.3.2下游信號分子的激活與調(diào)控RIPK3激活后對MLKL的磷酸化以及MLKL寡聚化并轉(zhuǎn)位到細胞膜上引發(fā)細胞壞死的過程，是程序性細胞壞死信號通路中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，受到多種因素的精細調(diào)控。當(dāng)ZBP1通過RHIM結(jié)構(gòu)域與RIPK1和RIPK3相互作用，激活RIPK3后，RIPK3的激酶活性被充分激活。RIPK3能夠特異性地識別并結(jié)合MLKL，在ATP的參與下，將磷酸基團轉(zhuǎn)移到MLKL的特定絲氨酸殘基上，主要是Ser345位點。這種磷酸化修飾改變了MLKL的構(gòu)象，使其從單體狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣丫垠w狀態(tài)。研究表明，MLKL的磷酸化是其激活和發(fā)揮功能的關(guān)鍵步驟，通過基因突變或使用激酶抑制劑阻斷RIPK3對MLKL的磷酸化，能夠有效抑制程序性細胞壞死的發(fā)生。在體外實驗中，使用RIPK3抑制劑處理細胞后，MLKL的磷酸化水平顯著降低，細胞對程序性細胞壞死刺激的敏感性也明顯下降。寡聚化的MLKL具有更高的活性，它能夠轉(zhuǎn)位到細胞膜上，插入細胞膜并形成孔道，導(dǎo)致細胞膜的通透性增加，細胞內(nèi)容物泄露，最終引發(fā)細胞壞死。MLKL轉(zhuǎn)位到細胞膜的過程涉及多種分子機制。MLKL的四螺旋束結(jié)構(gòu)域（4HB）在轉(zhuǎn)位過程中起著關(guān)鍵作用，它能夠與細胞膜上的磷脂酰肌醇等脂質(zhì)分子相互作用，促進MLKL與細胞膜的結(jié)合。一些輔助蛋白也可能參與了MLKL的轉(zhuǎn)位過程。研究發(fā)現(xiàn)，一些膜結(jié)合蛋白如Tmem16F等可以與MLKL相互作用，協(xié)助MLKL在細胞膜上的定位和孔道形成。在Tmem16F基因敲除的細胞中，MLKL轉(zhuǎn)位到細胞膜的效率降低，程序性細胞壞死的發(fā)生也受到抑制。MLKL形成的孔道大小和結(jié)構(gòu)對細胞膜的損傷程度和細胞壞死的進程有著重要影響。通過冷凍電鏡等技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，MLKL寡聚體在細胞膜上形成的孔道具有特定的結(jié)構(gòu)和尺寸，能夠允許小分子物質(zhì)和離子通過，導(dǎo)致細胞內(nèi)離子平衡失調(diào)，最終引發(fā)細胞壞死。在這一過程中，還存在一些反饋調(diào)節(jié)機制來精細調(diào)控程序性細胞壞死的進程。細胞內(nèi)的一些蛋白磷酸酶可以對磷酸化的MLKL進行去磷酸化，從而抑制MLKL的活性，終止程序性細胞壞死信號通路。研究表明，蛋白磷酸酶PP2A可以與MLKL相互作用，去除其磷酸基團，降低MLKL的寡聚化水平和細胞膜轉(zhuǎn)位能力，抑制程序性細胞壞死的發(fā)生。一些細胞內(nèi)的信號通路也可以通過調(diào)節(jié)RIPK3和MLKL的表達和活性，對程序性細胞壞死進行調(diào)控。NF-κB信號通路在受到刺激時，可以激活相關(guān)基因的表達，其中一些基因產(chǎn)物能夠抑制RIPK3的活性，從而抑制程序性細胞壞死。在TNF-α刺激細胞時，NF-κB信號通路被激活，其下游的一些抑制蛋白如cIAP1和cIAP2等表達上調(diào)，這些抑制蛋白可以與RIPK1結(jié)合，抑制RIPK1對RIPK3的激活，進而抑制程序性細胞壞死。這些反饋調(diào)節(jié)機制使得程序性細胞壞死信號通路能夠根據(jù)細胞內(nèi)環(huán)境和外界刺激的變化，精確地調(diào)控細胞死亡的進程，維持細胞和機體的穩(wěn)