DJ-1與cofilin-1蛋白在小細(xì)胞肺癌耐藥中的作用及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義肺癌作為全球范圍內(nèi)最常見且致命的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。據(jù)全球癌癥發(fā)病的最新統(tǒng)計(jì)資料顯示，肺癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的首位，在我國情況亦是如此，每年因肺癌死亡的人數(shù)超過100萬。其發(fā)病率呈明顯上升趨勢，這與人口的老齡化、城市的工業(yè)化、農(nóng)村的城市化、環(huán)境污染以及不良生活習(xí)慣如吸煙等因素密切相關(guān)。根據(jù)腫瘤組織形態(tài)學(xué)的不同，肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌（SmallCellLungCancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC），后者包括腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌。SCLC發(fā)病率約占原發(fā)性肺癌的15%，具有分化程度低、易較早發(fā)生血行轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，預(yù)后極差。盡管SCLC對(duì)初始化療比較敏感，然而極易發(fā)生多藥耐藥（Multi-DrugResistance，MDR）現(xiàn)象，這往往導(dǎo)致化療失敗，腫瘤迅速進(jìn)展，患者早期就會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，最終因多器官功能衰竭而死亡，5年存活率不足5%。多藥耐藥是惡性腫瘤化療治療失敗的主要原因，指腫瘤細(xì)胞對(duì)已經(jīng)接觸過的在功能上或結(jié)構(gòu)上都不相關(guān)的多種藥物產(chǎn)生獲得性耐藥。腫瘤多藥耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣，主要包括藥理性耐藥、微環(huán)境耐藥、凋亡耐藥和生化耐藥等因素。其中，生化耐藥中膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員即藥物輸出泵，如P-糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MP）、肺耐藥相關(guān)蛋白（LRP）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等參與腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥過程，如何對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行發(fā)現(xiàn)、鑒定，并深入研究其作用機(jī)制以及探索改變其功能的方法，成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要內(nèi)容。目前，針對(duì)小細(xì)胞肺癌多藥耐藥性的研究雖然取得了一定進(jìn)展，但仍存在許多亟待解決的問題。因此，深入研究小細(xì)胞肺癌的耐藥機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)和策略，對(duì)于提高患者的生存率和生活質(zhì)量具有至關(guān)重要的意義。DJ-1與cofilin-1蛋白作為細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白質(zhì)，可能在小細(xì)胞肺癌的耐藥過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。探究它們?cè)谛〖?xì)胞肺癌耐藥中的作用機(jī)制，不僅有助于深入了解小細(xì)胞肺癌的耐藥機(jī)制，還可能為開發(fā)新的治療方法提供理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)，為攻克小細(xì)胞肺癌耐藥難題帶來新的希望。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在小細(xì)胞肺癌耐藥研究方面，國內(nèi)外學(xué)者已取得了一系列成果。國際上，通過建立小細(xì)胞肺癌患者樣本來源的異種移植瘤（PDX）和人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系來源的移植瘤小鼠模型，模擬臨床給藥方案進(jìn)行長期化療藥物處理，建成多個(gè)小細(xì)胞肺癌化療耐藥小鼠模型。利用含有FDA認(rèn)證藥物庫篩選，發(fā)現(xiàn)抑制甲羥戊酸代謝途徑的他汀類藥物，能顯著抑制化療耐藥細(xì)胞存活，進(jìn)一步機(jī)制研究表明，他汀類藥物通過抑制香葉基香葉基二磷酸生成，阻滯小G蛋白R(shí)AB7A香葉基香葉基化修飾，抑制自噬體與溶酶體融合，引發(fā)自噬流障礙，促使耐藥細(xì)胞中ROS過度累積而凋亡。國內(nèi)研究也揭示了小細(xì)胞肺癌具有高度腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，除大量神經(jīng)內(nèi)分泌樣（NE）腫瘤細(xì)胞外，還有少量非神經(jīng)內(nèi)分泌樣（Non-NE）腫瘤細(xì)胞，且發(fā)現(xiàn)YAP激活可促使NE腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為Non-NE腫瘤細(xì)胞，同時(shí)使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，其機(jī)制與YAP激活NOTCH信號(hào)通路以及直接激活REST/NRSF表達(dá)，抑制小細(xì)胞肺癌神經(jīng)內(nèi)分泌性質(zhì)，抑制GSDME表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞焦亡有關(guān)。對(duì)于DJ-1蛋白的研究，國外有研究發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤中表達(dá)異常，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān)。在乳腺癌中，DJ-1通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和耐藥；在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，DJ-1高表達(dá)與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，可能參與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗過程。國內(nèi)研究則表明，在肝癌細(xì)胞中，DJ-1通過與其他蛋白相互作用，影響細(xì)胞的凋亡和耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而介導(dǎo)肝癌細(xì)胞的多藥耐藥。在cofilin-1蛋白的研究中，國外研究顯示，cofilin-1參與細(xì)胞的多種生理過程，如細(xì)胞遷移、侵襲等，并且在腫瘤耐藥中發(fā)揮作用。在卵巢癌中，cofilin-1的磷酸化狀態(tài)改變影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，磷酸化的cofilin-1可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。國內(nèi)有研究針對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)cofilin-1通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重構(gòu)，影響腫瘤細(xì)胞的耐藥性，抑制cofilin-1的表達(dá)可增加結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。盡管目前在小細(xì)胞肺癌耐藥以及DJ-1、cofilin-1蛋白的研究上已取得一定進(jìn)展，但仍存在諸多不足。一方面，對(duì)于小細(xì)胞肺癌耐藥機(jī)制的研究尚未完全明確，雖然已發(fā)現(xiàn)多種可能參與的信號(hào)通路和分子，但各因素之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)以及在不同個(gè)體中的差異機(jī)制尚不清楚。另一方面，針對(duì)DJ-1與cofilin-1蛋白在小細(xì)胞肺癌耐藥中的具體作用及兩者之間的關(guān)聯(lián)研究較少，尤其是在體內(nèi)模型和臨床樣本中的驗(yàn)證研究相對(duì)匱乏，這限制了基于這兩種蛋白開發(fā)新的治療策略的進(jìn)展。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探討DJ-1與cofilin-1蛋白在小細(xì)胞肺癌耐藥中的作用機(jī)制，為揭示小細(xì)胞肺癌多藥耐藥的分子機(jī)制提供新的理論依據(jù)，同時(shí)為開發(fā)新的治療靶點(diǎn)和策略奠定基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容包括：DJ-1與cofilin-1蛋白在小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞系中的表達(dá)及特性分析：運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）、免疫組化（IHC）等技術(shù)，檢測DJ-1與cofilin-1蛋白在小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞系（如H69AR等）和藥物敏感細(xì)胞系（如H69等）中的表達(dá)水平，分析其表達(dá)差異。利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察兩種蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，探究其亞細(xì)胞分布特征。通過蛋白質(zhì)純化技術(shù)獲得高純度的DJ-1與cofilin-1蛋白，運(yùn)用質(zhì)譜分析等方法研究其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和修飾情況，如磷酸化修飾等，以明確其在小細(xì)胞肺癌耐藥中的分子特性。DJ-1與cofilin-1蛋白對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞耐藥性的影響及機(jī)制研究：采用基因編輯技術(shù)，如CRISPR-Cas9系統(tǒng)，構(gòu)建DJ-1與cofilin-1蛋白基因敲除或過表達(dá)的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株。通過MTT法、CCK-8法等檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，分析敲除或過表達(dá)兩種蛋白后對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物（如順鉑、依托泊苷等）敏感性的影響。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，篩選與DJ-1和cofilin-1蛋白相關(guān)的差異表達(dá)蛋白和基因，通過生物信息學(xué)分析，構(gòu)建相關(guān)信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，探究DJ-1與cofilin-1蛋白影響小細(xì)胞肺癌耐藥的潛在分子機(jī)制，如是否通過調(diào)控PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路來影響細(xì)胞的耐藥性。DJ-1與cofilin-1蛋白相互作用及其對(duì)小細(xì)胞肺癌耐藥的協(xié)同作用研究：運(yùn)用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析，驗(yàn)證DJ-1與cofilin-1蛋白是否存在相互作用，并鑒定其相互作用的結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建同時(shí)干擾或過表達(dá)DJ-1與cofilin-1蛋白的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，通過細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，如藥物敏感性實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)等，研究兩者共同作用對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞耐藥性、遷移和侵襲能力等生物學(xué)行為的影響。利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬和分子對(duì)接技術(shù)，從分子層面解析DJ-1與cofilin-1蛋白相互作用的模式和機(jī)制，以及這種相互作用如何協(xié)同影響小細(xì)胞肺癌的耐藥過程。DJ-1與cofilin-1蛋白在小細(xì)胞肺癌患者臨床樣本中的表達(dá)及與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性研究：收集小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤組織和癌旁組織樣本，運(yùn)用免疫組化、定量PCR等技術(shù)檢測DJ-1與cofilin-1蛋白的表達(dá)水平，分析其在臨床樣本中的表達(dá)情況。結(jié)合患者的臨床病理資料，如腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、患者年齡、性別等，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析DJ-1與cofilin-1蛋白表達(dá)與臨床病理特征之間的相關(guān)性。通過隨訪獲取患者的生存數(shù)據(jù)，運(yùn)用生存分析方法，研究DJ-1與cofilin-1蛋白表達(dá)與小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的關(guān)系，評(píng)估其作為小細(xì)胞肺癌預(yù)后標(biāo)志物的潛在價(jià)值。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用多種研究方法，全面深入地探究DJ-1與cofilin-1蛋白在小細(xì)胞肺癌耐藥中的作用。文獻(xiàn)研究法：通過廣泛查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)資料，全面了解小細(xì)胞肺癌耐藥機(jī)制、DJ-1與cofilin-1蛋白在腫瘤領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀以及研究進(jìn)展。對(duì)已有的研究成果進(jìn)行系統(tǒng)梳理和分析，明確當(dāng)前研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)，為本研究提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，確定研究的切入點(diǎn)和方向，避免重復(fù)研究，確保研究的創(chuàng)新性和科學(xué)性。實(shí)驗(yàn)研究法：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞系（如H69AR）和藥物敏感細(xì)胞系（如H69）作為研究對(duì)象。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)，通過特異性抗體檢測細(xì)胞中DJ-1與cofilin-1蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)行半定量分析，比較在耐藥與敏感細(xì)胞系中的表達(dá)差異。利用免疫組化（IHC）技術(shù)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和分布情況，結(jié)合顯微鏡成像分析其亞細(xì)胞定位特征。運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)，使用熒光標(biāo)記的抗體，對(duì)兩種蛋白進(jìn)行標(biāo)記，在熒光顯微鏡下觀察其在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化和相互作用情況。通過蛋白質(zhì)純化技術(shù)，從細(xì)胞中提取并純化DJ-1與cofilin-1蛋白，利用質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和修飾分析，如檢測磷酸化位點(diǎn)等，明確其分子結(jié)構(gòu)和修飾狀態(tài)?；蚓庉媽?shí)驗(yàn)：借助CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，針對(duì)DJ-1與cofilin-1基因設(shè)計(jì)特異性的gRNA，構(gòu)建基因敲除或過表達(dá)的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株。通過轉(zhuǎn)染、篩選和鑒定，獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。利用MTT法、CCK-8法等檢測細(xì)胞的增殖能力，在不同時(shí)間點(diǎn)加入化療藥物（如順鉑、依托泊苷），觀察細(xì)胞活力的變化，分析細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，通過AnnexinV-FITC/PI雙染法，分析敲除或過表達(dá)兩種蛋白后細(xì)胞凋亡率的變化，探究其對(duì)化療藥物誘導(dǎo)凋亡的影響。組學(xué)實(shí)驗(yàn)：運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，如二維凝膠電泳（2-DE）結(jié)合質(zhì)譜分析或基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）的非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，篩選敲除或過表達(dá)DJ-1與cofilin-1蛋白后細(xì)胞中差異表達(dá)的蛋白。通過生物信息學(xué)分析，如GO功能富集分析、KEGG通路分析等，構(gòu)建相關(guān)信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，挖掘潛在的分子機(jī)制。同時(shí)，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，如RNA-seq，分析細(xì)胞中基因表達(dá)譜的變化，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平全面解析DJ-1與cofilin-1蛋白影響小細(xì)胞肺癌耐藥的分子機(jī)制。蛋白相互作用實(shí)驗(yàn)：采用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)，使用針對(duì)DJ-1或cofilin-1蛋白的抗體，沉淀與之相互作用的蛋白復(fù)合物，通過質(zhì)譜分析鑒定相互作用的蛋白及作用位點(diǎn)，驗(yàn)證兩者是否存在相互作用。結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬和分子對(duì)接技術(shù)，利用計(jì)算機(jī)模擬軟件，根據(jù)已知的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，模擬DJ-1與cofilin-1蛋白的三維結(jié)構(gòu)，通過分子對(duì)接算法預(yù)測兩者相互作用的模式和關(guān)鍵氨基酸殘基，從分子層面解析其相互作用機(jī)制。構(gòu)建同時(shí)干擾或過表達(dá)DJ-1與cofilin-1蛋白的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，通過細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，如藥物敏感性實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)等，研究兩者共同作用對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞耐藥性、遷移和侵襲能力等生物學(xué)行為的影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法：建立小細(xì)胞肺癌小鼠模型，將小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（包括野生型、DJ-1與cofilin-1基因敲除或過表達(dá)細(xì)胞株等）接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，觀察腫瘤的生長情況。對(duì)小鼠進(jìn)行化療藥物處理，模擬臨床治療過程，定期測量腫瘤體積和重量，分析DJ-1與cofilin-1蛋白對(duì)腫瘤生長和化療效果的影響。通過免疫組化、WesternBlot等技術(shù)檢測小鼠腫瘤組織中DJ-1與cofilin-1蛋白的表達(dá)水平及相關(guān)信號(hào)通路蛋白的變化，驗(yàn)證細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，從體內(nèi)水平探究其作用機(jī)制。臨床樣本研究法：收集小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤組織和癌旁組織樣本，詳細(xì)記錄患者的臨床病理資料，包括腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、患者年齡、性別等。運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測DJ-1與cofilin-1蛋白在組織樣本中的表達(dá)水平和定位，通過圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。采用定量PCR技術(shù)從mRNA水平檢測兩種蛋白的表達(dá)情況，與免疫組化結(jié)果相互驗(yàn)證。結(jié)合患者的臨床病理特征，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，如卡方檢驗(yàn)、相關(guān)性分析等，分析DJ-1與cofilin-1蛋白表達(dá)與臨床病理特征之間的相關(guān)性。通過隨訪獲取患者的生存數(shù)據(jù)，運(yùn)用生存分析方法，如Kaplan-Meier法、Cox回歸分析等，研究DJ-1與cofilin-1蛋白表達(dá)與小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的關(guān)系，評(píng)估其作為預(yù)后標(biāo)志物的潛在價(jià)值。數(shù)據(jù)分析方法：運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（如SPSS、GraphPadPrism等）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier法和Cox回歸模型。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過生物信息學(xué)分析工具（如DAVID、STRING等）對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行功能富集分析、蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等，挖掘數(shù)據(jù)背后的生物學(xué)信息，深入探究DJ-1與cofilin-1蛋白在小細(xì)胞肺癌耐藥中的作用機(jī)制。技術(shù)路線如下：第一階段：文獻(xiàn)調(diào)研與細(xì)胞系準(zhǔn)備。全面查閱小細(xì)胞肺癌耐藥及相關(guān)蛋白的文獻(xiàn)，確定研究方向和技術(shù)路線。收集小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞系（H69AR等）和藥物敏感細(xì)胞系（H69等），進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)和鑒定，確保細(xì)胞狀態(tài)良好，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供材料基礎(chǔ)。第二階段：蛋白表達(dá)與特性分析。運(yùn)用WesternBlot、IHC、細(xì)胞免疫熒光等技術(shù)檢測DJ-1與cofilin-1蛋白在耐藥與敏感細(xì)胞系中的表達(dá)水平、定位及亞細(xì)胞分布特征。通過蛋白質(zhì)純化和質(zhì)譜分析研究其結(jié)構(gòu)和修飾情況，初步明確兩種蛋白在小細(xì)胞肺癌耐藥中的分子特性。第三階段：基因編輯與功能研究。利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建DJ-1與cofilin-1蛋白基因敲除或過表達(dá)的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，通過MTT法、CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)等檢測細(xì)胞增殖和凋亡情況，分析其對(duì)化療藥物敏感性的影響。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)篩選差異表達(dá)蛋白和基因，結(jié)合生物信息學(xué)分析探究其影響小細(xì)胞肺癌耐藥的分子機(jī)制。第四階段：蛋白相互作用研究。采用Co-IP技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析驗(yàn)證DJ-1與cofilin-1蛋白的相互作用及作用位點(diǎn)，利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬和分子對(duì)接技術(shù)解析相互作用模式。構(gòu)建同時(shí)干擾或過表達(dá)兩種蛋白的細(xì)胞株，通過細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)研究其對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞耐藥性、遷移和侵襲能力等生物學(xué)行為的協(xié)同影響。第五階段：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。建立小細(xì)胞肺癌小鼠模型，對(duì)小鼠進(jìn)行化療藥物處理，觀察腫瘤生長情況，檢測腫瘤組織中蛋白表達(dá)及相關(guān)信號(hào)通路變化，驗(yàn)證細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從體內(nèi)水平探究其作用機(jī)制。第六階段：臨床樣本分析。收集小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤組織和癌旁組織樣本，運(yùn)用免疫組化、定量PCR等技術(shù)檢測DJ-1與cofilin-1蛋白的表達(dá)水平，結(jié)合臨床病理資料和生存數(shù)據(jù)，分析其與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性，評(píng)估其作為預(yù)后標(biāo)志物的潛在價(jià)值。第七階段：結(jié)果總結(jié)與論文撰寫。對(duì)各階段實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行匯總、分析和討論，總結(jié)DJ-1與cofilin-1蛋白在小細(xì)胞肺癌耐藥中的作用機(jī)制，撰寫論文，為小細(xì)胞肺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。二、小細(xì)胞肺癌及其耐藥機(jī)制概述2.1小細(xì)胞肺癌的概述小細(xì)胞肺癌（SmallCellLungCancer，SCLC）是肺癌中一種具有獨(dú)特生物學(xué)行為和臨床特征的亞型，屬神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。其發(fā)病率約占原發(fā)性肺癌的15%-20%，在肺癌的眾多類型中占據(jù)著不可忽視的比例。男性患者多于女性，且發(fā)病與吸煙、環(huán)境因素、遺傳因素等密切相關(guān)，其中吸煙是最為關(guān)鍵的致病因素，大量研究表明，長期大量吸煙人群患小細(xì)胞肺癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。從病理特征來看，小細(xì)胞肺癌的癌細(xì)胞體積較小，呈類圓形或者梭形，細(xì)胞漿少，細(xì)胞核相互擠壓。癌細(xì)胞具有高度增殖活性，核分裂象多見，這使得腫瘤生長迅速。小細(xì)胞肺癌具有早期廣泛轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，在疾病確診時(shí)，約60%-88%的患者已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，常見的轉(zhuǎn)移部位包括肺、骨、腦、肝、腎上腺等。淋巴轉(zhuǎn)移常先侵入鄰近的肺段或肺葉支氣管周圍的淋巴結(jié)，然后到達(dá)肺門或隆突下淋巴結(jié)，或經(jīng)氣管旁淋巴結(jié)，最后累及鎖骨上前斜角肌淋巴結(jié)和頸部淋巴結(jié)。血行轉(zhuǎn)移也較為常見，這一特性導(dǎo)致小細(xì)胞肺癌的惡性程度極高，預(yù)后較差。小細(xì)胞肺癌患者的臨床表現(xiàn)多樣，早期可能無明顯癥狀，隨著病情進(jìn)展，常出現(xiàn)咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、呼吸困難等呼吸系統(tǒng)癥狀。由于腫瘤細(xì)胞可分泌一些生物活性物質(zhì)，部分患者還可能出現(xiàn)肺外癥狀，如庫欣綜合征、抗利尿激素分泌異常綜合征等，表現(xiàn)為向心性肥胖、低鈉血癥等。當(dāng)腫瘤侵犯周圍組織或器官時(shí)，還會(huì)引發(fā)聲音嘶啞、吞咽困難等癥狀。小細(xì)胞肺癌對(duì)化療和放療較為敏感，初始治療時(shí)大部分患者對(duì)化療藥物有較好的反應(yīng)，腫瘤會(huì)在短期內(nèi)明顯縮小。然而，小細(xì)胞肺癌極易發(fā)生多藥耐藥，多數(shù)患者在化療后1-2年內(nèi)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性顯著降低，治療難度大幅增加。一旦出現(xiàn)耐藥和復(fù)發(fā)，患者的生存時(shí)間往往較短，5年存活率不足5%。目前，小細(xì)胞肺癌的治療以化療為主，聯(lián)合放療，早期患者可考慮手術(shù)切除。常用的化療方案有EP（依托泊苷和順鉑）、IP（伊立替康和順鉑）等。盡管近年來免疫治療在小細(xì)胞肺癌中的應(yīng)用取得了一定進(jìn)展，但總體治療效果仍有待提高。小細(xì)胞肺癌的高發(fā)病率、高惡性程度、高耐藥性以及不良預(yù)后，使其成為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，深入研究其耐藥機(jī)制并尋找有效的治療策略迫在眉睫。2.2小細(xì)胞肺癌的治療現(xiàn)狀小細(xì)胞肺癌的治療方法主要包括化療、放療、手術(shù)以及免疫治療等，然而，耐藥問題始終是制約治療效果的關(guān)鍵因素。化療是小細(xì)胞肺癌的主要治療手段之一，對(duì)于初治患者，化療能夠使腫瘤迅速縮小，有效率較高。常用的化療藥物有依托泊苷、順鉑、伊立替康、卡鉑等，其中EP（依托泊苷和順鉑）方案和IP（伊立替康和順鉑）方案是臨床常用的一線化療方案。這些化療藥物主要通過干擾腫瘤細(xì)胞的DNA合成、轉(zhuǎn)錄或有絲分裂等過程，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，從而達(dá)到治療目的。在小細(xì)胞肺癌患者中，約70%-80%的局限期患者和50%-60%的廣泛期患者在初始化療時(shí)會(huì)有較好的反應(yīng)。但小細(xì)胞肺癌極易產(chǎn)生耐藥性，大部分患者在化療后1-2年內(nèi)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性顯著降低，再次化療的有效率大幅下降。研究表明，復(fù)發(fā)后采用原化療方案治療，有效率僅為10%-30%。這是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞在化療過程中會(huì)發(fā)生一系列適應(yīng)性變化，如藥物外排泵表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度降低；細(xì)胞凋亡途徑異常，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抵抗；DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)，能夠修復(fù)化療藥物造成的DNA損傷，從而使腫瘤細(xì)胞得以存活并繼續(xù)增殖。放療在小細(xì)胞肺癌的治療中也占據(jù)重要地位，尤其是對(duì)于局限期小細(xì)胞肺癌患者。放療可以通過高能射線破壞腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。早期進(jìn)行胸部放療聯(lián)合化療，能夠顯著提高局限期小細(xì)胞肺癌患者的局部控制率和生存率。對(duì)于廣泛期小細(xì)胞肺癌患者，預(yù)防性腦放療（PCI）可以降低腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，改善患者的生存質(zhì)量。然而，放療同樣面臨著耐藥問題。腫瘤細(xì)胞在放療過程中可能會(huì)發(fā)生基因改變，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)射線的敏感性降低。例如，一些與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，使得腫瘤細(xì)胞能夠更有效地修復(fù)放療引起的DNA損傷，從而產(chǎn)生放療耐藥。此外，腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞等也可能影響放療的效果，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的耐藥。手術(shù)治療主要適用于早期（T1-2N0M0）小細(xì)胞肺癌患者，通過手術(shù)切除腫瘤組織，可以達(dá)到根治的目的。但由于小細(xì)胞肺癌早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移，臨床上符合手術(shù)指征的患者較少，僅占小細(xì)胞肺癌患者總數(shù)的5%-10%。對(duì)于可手術(shù)的患者，術(shù)后通常需要輔助化療，以降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。盡管手術(shù)能夠直接去除腫瘤組織，但仍無法避免部分患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，這可能與手術(shù)過程中腫瘤細(xì)胞的殘留、微轉(zhuǎn)移灶的存在以及腫瘤細(xì)胞的耐藥性有關(guān)。近年來，免疫治療在小細(xì)胞肺癌的治療中取得了一定進(jìn)展。免疫檢查點(diǎn)抑制劑如帕博利珠單抗、阿替利珠單抗等，通過阻斷免疫檢查點(diǎn)蛋白（如PD-1/PD-L1），激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力。一些臨床試驗(yàn)表明，免疫治療聯(lián)合化療可以提高廣泛期小細(xì)胞肺癌患者的生存率。然而，并非所有患者都能從免疫治療中獲益，部分患者會(huì)出現(xiàn)原發(fā)性耐藥，即一開始對(duì)免疫治療就沒有反應(yīng)；還有部分患者在治療過程中會(huì)出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥，導(dǎo)致治療效果逐漸下降。免疫耐藥的機(jī)制較為復(fù)雜，可能與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸、腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)以及免疫細(xì)胞功能異常等因素有關(guān)。例如，腫瘤細(xì)胞可以通過上調(diào)PD-L1的表達(dá)，與免疫細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，抑制免疫細(xì)胞的活性，從而逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。2.3小細(xì)胞肺癌耐藥機(jī)制小細(xì)胞肺癌的耐藥機(jī)制極為復(fù)雜，涉及多個(gè)層面和多種因素，這些因素相互作用，共同導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗，使得治療效果大打折扣。藥理性耐藥：細(xì)胞膜上存在多種藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中P-糖蛋白（P-gp）是研究較為深入的一種。P-gp屬于ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員，由多藥耐藥基因1（MDR1）編碼。P-gp具有藥物外排泵的功能，能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物如長春新堿、阿霉素等主動(dòng)泵出細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。在小細(xì)胞肺癌中，P-gp的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥密切相關(guān)。研究表明，約30%-50%的小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織中P-gp表達(dá)升高，且P-gp表達(dá)水平越高，患者對(duì)化療藥物的敏感性越低，預(yù)后越差。除P-gp外，多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）家族也是重要的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。MRP1可介導(dǎo)多種化療藥物的外排，如依托泊苷、順鉑等。它通過與谷胱甘肽（GSH）結(jié)合，將與GSH結(jié)合的藥物復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，導(dǎo)致耐藥。在小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞系中，MRP1的表達(dá)水平明顯高于藥物敏感細(xì)胞系，敲低MRP1的表達(dá)可部分恢復(fù)耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。微環(huán)境耐藥：腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生長、增殖和轉(zhuǎn)移的重要場所，對(duì)小細(xì)胞肺癌的耐藥也有著重要影響。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，CAFs可以分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）等。這些因子可以通過旁分泌作用于腫瘤細(xì)胞，激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，如PI3K/AKT、MAPK等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和耐藥。例如，TGF-β可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，同時(shí)也增加了對(duì)化療藥物的耐藥性。腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞也參與了小細(xì)胞肺癌的耐藥過程。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）是腫瘤微環(huán)境中數(shù)量最多的免疫細(xì)胞之一，根據(jù)其功能可分為M1型和M2型。M1型巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤活性，能夠分泌細(xì)胞因子和趨化因子，激活免疫細(xì)胞，殺傷腫瘤細(xì)胞；而M2型巨噬細(xì)胞則具有促腫瘤作用，能夠分泌免疫抑制因子，抑制免疫細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和耐藥。在小細(xì)胞肺癌中，腫瘤微環(huán)境中M2型巨噬細(xì)胞的比例升高，這些M2型巨噬細(xì)胞可以通過分泌白細(xì)胞介素-10（IL-10）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等因子，抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，同時(shí)促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)和氧氣，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥。凋亡耐藥：細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和腫瘤抑制中發(fā)揮著重要作用。小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡異常是導(dǎo)致耐藥的重要原因之一。B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）家族蛋白是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等）。在正常細(xì)胞中，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間保持平衡，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激（如化療藥物）時(shí)，促凋亡蛋白被激活，導(dǎo)致線粒體膜通透性改變，細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活半胱天冬酶（caspase）級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，在小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表達(dá)上調(diào)，它們可以與促凋亡蛋白Bax、Bak等結(jié)合，抑制其活性，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，在小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞系中，Bcl-2和Bcl-XL的表達(dá)水平明顯高于藥物敏感細(xì)胞系，使用Bcl-2抑制劑可以增加耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，凋亡相關(guān)信號(hào)通路的異常也會(huì)導(dǎo)致小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡耐藥。例如，p53基因是一種重要的腫瘤抑制基因，它可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡等過程來抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在小細(xì)胞肺癌中，約50%-70%的患者存在p53基因突變或缺失，導(dǎo)致p53蛋白功能喪失。p53功能異常會(huì)使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抵抗，因?yàn)閜53無法正常激活下游的凋亡相關(guān)基因，如Bax、PUMA等，從而影響細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)。生化耐藥：腫瘤細(xì)胞內(nèi)的一些生化改變也會(huì)導(dǎo)致小細(xì)胞肺癌的耐藥。谷胱甘肽（GSH）是一種重要的抗氧化劑，在細(xì)胞內(nèi)參與多種生化反應(yīng)。在小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞中，GSH的含量升高，它可以與化療藥物結(jié)合，降低藥物的活性，同時(shí)還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受化療藥物誘導(dǎo)的氧化損傷，從而導(dǎo)致耐藥。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）是一類參與GSH代謝的酶，它可以催化GSH與親電子化合物結(jié)合，促進(jìn)其排出細(xì)胞外。在小細(xì)胞肺癌中，GST的表達(dá)升高，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的解毒能力增強(qiáng)，從而產(chǎn)生耐藥。此外，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)機(jī)制也與小細(xì)胞肺癌的耐藥密切相關(guān)?；熕幬镏饕ㄟ^損傷腫瘤細(xì)胞的DNA來發(fā)揮作用，而腫瘤細(xì)胞可以通過多種DNA損傷修復(fù)途徑來修復(fù)受損的DNA，如堿基切除修復(fù)（BER）、核苷酸切除修復(fù)（NER）、同源重組修復(fù)（HR）等。在小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞中，這些DNA損傷修復(fù)途徑的相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，使得腫瘤細(xì)胞能夠更有效地修復(fù)化療藥物造成的DNA損傷，從而逃避細(xì)胞死亡，導(dǎo)致耐藥。例如，多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）是BER途徑中的關(guān)鍵酶，在小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞中，PARP的表達(dá)升高，抑制PARP的活性可以增加耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。三、DJ-1與cofilin-1蛋白的特性分析3.1DJ-1蛋白的結(jié)構(gòu)與功能DJ-1蛋白由189個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為20kDa，屬于ThiJ/PfpI超家族，主要以同型二聚體形式存在。其單體呈現(xiàn)螺旋-折疊-螺旋的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，包含11個(gè)β鏈（β1-β11）和8個(gè)α-螺旋（αA-αH）。β-折疊處于結(jié)構(gòu)中心位置，分子的一端是α-螺旋和一個(gè)β3-4發(fā)夾，另一端則是三股反平行β-折疊。在DJ-1晶體中，兩個(gè)DJ-1單體之間存在廣泛的連接，二者的接觸面積覆蓋了整個(gè)分子表面的35%。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使得DJ-1單體的疏水殘基，如VAL-146、PHE-162、LEU-166、ALA-167、ALA-178、LEU-187等，在二聚體中形成疏水基團(tuán)凹槽，該凹槽可能與分子伴侶的功能密切相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，DJ-1的第130號(hào)氨基酸賴氨酸（K130）的SUMO化修飾對(duì)其功能的實(shí)現(xiàn)具有重要價(jià)值。SUMO化修飾后的DJ-1處于去除氧壓導(dǎo)致的活性氧（ROS）的活化狀態(tài)，若第130號(hào)賴氨酸發(fā)生突變，將會(huì)導(dǎo)致DJ-1的功能喪失。此外，L166P突變體的不適當(dāng)SUMO化修飾可致使DJ-1蛋白不溶，進(jìn)而誘發(fā)帕金森?。≒D）。在正常生理狀態(tài)下，DJ-1蛋白廣泛存在于人體的多種組織和器官中，如胰腺、腎臟、肝臟、睪丸和心臟等。它參與多種生物學(xué)過程，對(duì)維持細(xì)胞的正常功能起著關(guān)鍵作用。DJ-1蛋白具有氧化還原調(diào)節(jié)功能。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，其106位半胱氨酸（Cys106）殘基對(duì)氧化極為敏感。在輕度氧化應(yīng)激時(shí)，Cys106可從還原形式（Cys106-SH）氧化為亞硫酸（Cys106-SO2H），而在更強(qiáng)烈的氧化條件下，可進(jìn)一步氧化為磺酸（Cys106-SO3H），這使得DJ-1蛋白的等電點(diǎn)從6.2變化至5.8。線粒體在細(xì)胞的許多關(guān)鍵調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用，包括ROS的生成，確保線粒體功能正常對(duì)維持氧化還原平衡至關(guān)重要。在生理?xiàng)l件下，DJ-1蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞核和線粒體中僅有少量分布。然而，當(dāng)細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激時(shí)，DJ-1蛋白能夠易位到線粒體的不同部位，這對(duì)調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)和功能以及細(xì)胞的存活具有重要意義。此外，DJ-1蛋白還可以抑制Nrf2（抗氧化轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子）與其抑制劑Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1（Keap1）的相互作用，從而抑制Nrf2的降解，導(dǎo)致Ⅱ期解毒酶和抗氧化酶的上調(diào)，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化防御能力。在缺氧條件下，DJ-1蛋白能夠穩(wěn)定缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）并增加其轉(zhuǎn)錄活性，從而提高細(xì)胞對(duì)缺氧應(yīng)激的抗性。DJ-1蛋白在細(xì)胞凋亡和自噬調(diào)節(jié)方面也發(fā)揮著重要作用。它可以通過下游調(diào)節(jié)因子，如凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）、Akt、死亡域相關(guān)蛋白Daxx和P53等，防止由多種凋亡刺激物觸發(fā)的細(xì)胞凋亡。研究表明，DJ-1蛋白可與ASK1直接結(jié)合，抑制ASK1的活化，從而減少細(xì)胞死亡。此外，DJ-1蛋白還能增加ASK1抑制劑Trx1的表達(dá)，或在細(xì)胞核中與Daxx相互作用，阻止Daxx向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而抑制ASK1的激活。在自噬調(diào)節(jié)方面，DJ-1蛋白對(duì)自噬產(chǎn)生正負(fù)調(diào)節(jié)兩種相反的作用，這種差異可能是由于DJ-1蛋白在不同細(xì)胞類型中的作用不同所致。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，DJ-1蛋白的作用備受關(guān)注。多數(shù)研究顯示DJ-1為癌基因，在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。在肺癌中，DJ-1蛋白的高表達(dá)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。它能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和侵襲，這與肺癌微環(huán)境的形成和轉(zhuǎn)化緊密相關(guān)。在乳腺癌中，DJ-1通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和耐藥。其具體機(jī)制為，DJ-1與10號(hào)染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN）結(jié)合并抑制其磷酸酶活性，使得PI3K和Akt磷酸化激活，有利于細(xì)胞存活。此外，DJ-1蛋白還可在S/G2核自身抗原（SG2NA）的作用下，與Akt相互作用形成復(fù)合物，促進(jìn)Akt信號(hào)傳導(dǎo)活性。在肝癌細(xì)胞中，DJ-1通過與其他蛋白相互作用，影響細(xì)胞的凋亡和耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而介導(dǎo)肝癌細(xì)胞的多藥耐藥。然而，也有研究報(bào)道DJ-1在某些腫瘤組織中呈低表達(dá)狀態(tài)，其具體作用及機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究。3.2cofilin-1蛋白的結(jié)構(gòu)與功能cofilin-1蛋白屬于肌動(dòng)蛋白解聚因子（ADF）/cofilin家族，該家族在真核細(xì)胞中廣泛存在，在進(jìn)化上高度保守。cofilin-1蛋白由166個(gè)氨基酸組成，分子量約為18kDa。其三維結(jié)構(gòu)包含5個(gè)α-螺旋（α1-α5）和5個(gè)β-折疊（β1-β5），呈現(xiàn)出獨(dú)特的折疊方式。其中，β-折疊處于分子的核心區(qū)域，α-螺旋則分布在周圍，形成了一個(gè)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。cofilin-1蛋白的N端結(jié)構(gòu)域具有肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，能夠與肌動(dòng)蛋白單體或肌動(dòng)蛋白絲特異性結(jié)合。這種結(jié)合能力對(duì)于其發(fā)揮生物學(xué)功能至關(guān)重要，通過與肌動(dòng)蛋白的相互作用，cofilin-1蛋白能夠調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲的動(dòng)態(tài)變化。在cofilin-1蛋白的結(jié)構(gòu)中，還存在一些關(guān)鍵的氨基酸殘基，如Ser3位點(diǎn)，該位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)對(duì)cofilin-1蛋白的活性具有重要調(diào)節(jié)作用。當(dāng)Ser3被磷酸化時(shí)，cofilin-1蛋白與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合能力減弱，其生物學(xué)活性受到抑制；而當(dāng)Ser3去磷酸化時(shí)，cofilin-1蛋白的活性被激活，能夠發(fā)揮其調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲的功能。cofilin-1蛋白在細(xì)胞的多種生理活動(dòng)中扮演著關(guān)鍵角色。在細(xì)胞遷移過程中，cofilin-1蛋白發(fā)揮著不可或缺的作用。細(xì)胞遷移是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到細(xì)胞形態(tài)的改變、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用以及細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)重組。cofilin-1蛋白通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲的解聚和重組，為細(xì)胞遷移提供動(dòng)力。具體來說，cofilin-1蛋白能夠結(jié)合到肌動(dòng)蛋白絲上，切斷肌動(dòng)蛋白絲，使其解聚為肌動(dòng)蛋白單體。這些肌動(dòng)蛋白單體可以重新組裝成新的肌動(dòng)蛋白絲，從而改變細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)方向。在傷口愈合過程中，成纖維細(xì)胞需要遷移到傷口部位進(jìn)行修復(fù)，cofilin-1蛋白的表達(dá)和活性增加，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲的解聚和重組，使得成纖維細(xì)胞能夠快速遷移到傷口處，加速傷口的愈合。細(xì)胞侵襲是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要步驟，cofilin-1蛋白在這一過程中也發(fā)揮著重要作用。腫瘤細(xì)胞的侵襲能力與細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化密切相關(guān)。cofilin-1蛋白可以通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲的結(jié)構(gòu)和功能，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。在腫瘤細(xì)胞侵襲過程中，cofilin-1蛋白被激活，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲的解聚，使得腫瘤細(xì)胞能夠形成偽足等結(jié)構(gòu)，從而穿透基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，實(shí)現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移。研究表明，在乳腺癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞中，cofilin-1蛋白的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的侵襲能力呈正相關(guān)，抑制cofilin-1蛋白的表達(dá)或活性可以顯著降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。cofilin-1蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及耐藥性密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中，cofilin-1蛋白的表達(dá)和活性常常發(fā)生改變。許多研究表明，cofilin-1蛋白在多種腫瘤組織中高表達(dá)，如乳腺癌、肺癌、卵巢癌等。其高表達(dá)與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能以及不良預(yù)后密切相關(guān)。在乳腺癌中，cofilin-1蛋白的高表達(dá)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)有關(guān)，患者的復(fù)發(fā)率和死亡率也相對(duì)較高。在肺癌中，cofilin-1蛋白的表達(dá)水平與腫瘤的分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，高表達(dá)的cofilin-1蛋白預(yù)示著患者的預(yù)后較差。cofilin-1蛋白還參與了腫瘤細(xì)胞的耐藥過程。腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥是導(dǎo)致腫瘤治療失敗的重要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，cofilin-1蛋白可以通過多種機(jī)制影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。一方面，cofilin-1蛋白可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避化療藥物的作用。另一方面，cofilin-1蛋白可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，影響腫瘤細(xì)胞的凋亡和存活。在卵巢癌中，cofilin-1蛋白的磷酸化狀態(tài)改變影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，磷酸化的cofilin-1蛋白可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。通過抑制cofilin-1蛋白的磷酸化，可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高治療效果。3.3DJ-1與cofilin-1蛋白在正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)差異通過對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，DJ-1與cofilin-1蛋白的表達(dá)存在顯著差異，這種差異在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及耐藥過程中可能發(fā)揮著重要作用。在正常細(xì)胞中，DJ-1蛋白呈現(xiàn)出一定的基礎(chǔ)表達(dá)水平，其表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控。研究表明，在正常的肺上皮細(xì)胞中，DJ-1蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，參與細(xì)胞內(nèi)的氧化還原調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程，維持細(xì)胞的正常功能。正常細(xì)胞中DJ-1蛋白的表達(dá)處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，其表達(dá)水平與細(xì)胞的分化程度、生理狀態(tài)等因素密切相關(guān)。在分化良好的正常組織細(xì)胞中，DJ-1蛋白的表達(dá)水平相對(duì)較低，這有助于維持細(xì)胞的正常分化和功能。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，DJ-1蛋白的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，以應(yīng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變。在輕度氧化應(yīng)激條件下，正常細(xì)胞內(nèi)的DJ-1蛋白表達(dá)會(huì)上調(diào)，其106位半胱氨酸殘基發(fā)生氧化修飾，從而激活其抗氧化功能，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。然而，在腫瘤細(xì)胞中，DJ-1蛋白的表達(dá)常常出現(xiàn)異常升高的情況。在多種腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中，如小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、肝癌等，DJ-1蛋白的表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞。在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H69AR中，DJ-1蛋白的表達(dá)量相較于正常肺上皮細(xì)胞顯著增加。這種高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。DJ-1蛋白的高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，通過激活PI3K/AKT等信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，使腫瘤細(xì)胞能夠快速分裂和生長。在乳腺癌細(xì)胞中，DJ-1蛋白與PTEN結(jié)合并抑制其活性，導(dǎo)致PI3K和Akt磷酸化激活，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。DJ-1蛋白還可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重塑和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，使腫瘤細(xì)胞能夠突破基底膜，向周圍組織浸潤和轉(zhuǎn)移。cofilin-1蛋白在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)也存在明顯差異。在正常細(xì)胞中，cofilin-1蛋白的表達(dá)水平相對(duì)較低，并且其活性受到嚴(yán)格的調(diào)控。在正常的成纖維細(xì)胞中，cofilin-1蛋白主要參與細(xì)胞的正常遷移和形態(tài)維持過程。其活性受到磷酸化和去磷酸化的調(diào)節(jié)，當(dāng)細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)，cofilin-1蛋白的Ser3位點(diǎn)被磷酸化，使其處于失活狀態(tài)，與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合能力減弱，細(xì)胞骨架相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)細(xì)胞受到刺激需要遷移時(shí)，cofilin-1蛋白的Ser3位點(diǎn)去磷酸化，活性被激活，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲的解聚和重組，為細(xì)胞遷移提供動(dòng)力。在腫瘤細(xì)胞中，cofilin-1蛋白的表達(dá)水平顯著升高，且其活性常常異常激活。在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，cofilin-1蛋白的表達(dá)量明顯高于正常肺上皮細(xì)胞。cofilin-1蛋白的高表達(dá)和活性增強(qiáng)與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。在肺癌細(xì)胞的侵襲過程中，cofilin-1蛋白被激活，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲的解聚，使得腫瘤細(xì)胞能夠形成偽足等結(jié)構(gòu)，從而穿透基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，實(shí)現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移。cofilin-1蛋白還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。在卵巢癌中，cofilin-1蛋白的磷酸化狀態(tài)改變影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，磷酸化的cofilin-1蛋白可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。四、DJ-1與cofilin-1蛋白在小細(xì)胞肺癌耐藥中的作用研究4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系：選用小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞系H69AR和藥物敏感細(xì)胞系H69，均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。細(xì)胞在含有10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6-8周齡的雌性BALB/c裸鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）環(huán)境中，自由攝食和飲水，溫度控制在（22±2）℃，相對(duì)濕度為（50±10）%。主要試劑：兔抗人DJ-1多克隆抗體、兔抗人cofilin-1多克隆抗體購自Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自CellSignalingTechnology公司；蛋白質(zhì)提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自ThermoFisherScientific公司；RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑購自Solarbio公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Millipore公司；順鉑（DDP）、依托泊苷（VP-16）購自Selleck公司；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；siRNA-DJ-1、siRNA-cofilin-1及陰性對(duì)照siRNA購自GenePharma公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreenPCRMasterMix購自TaKaRa公司。主要儀器：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化）、倒置顯微鏡（Olympus）、酶標(biāo)儀（Bio-Rad）、流式細(xì)胞儀（BDBiosciences）、蛋白質(zhì)垂直電泳系統(tǒng)（Bio-Rad）、半干轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems）。4.1.2細(xì)胞與動(dòng)物模型構(gòu)建細(xì)胞培養(yǎng)與傳代：將小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞系H69AR和藥物敏感細(xì)胞系H69從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中復(fù)蘇，然后轉(zhuǎn)移至含有RPMI1640完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至80%-90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)?；蚋蓴_細(xì)胞株的構(gòu)建：針對(duì)DJ-1和cofilin-1基因設(shè)計(jì)特異性的siRNA序列，將siRNA-DJ-1、siRNA-cofilin-1及陰性對(duì)照siRNA分別與Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑混合，按照說明書的步驟轉(zhuǎn)染至H69AR細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后48h，收集細(xì)胞，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）檢測DJ-1和cofilin-1蛋白的表達(dá)水平，篩選出干擾效果最佳的細(xì)胞株，命名為si-DJ-1-H69AR和si-cofilin-1-H69AR。動(dòng)物模型的建立：將對(duì)數(shù)生長期的H69AR細(xì)胞、si-DJ-1-H69AR細(xì)胞、si-cofilin-1-H69AR細(xì)胞及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞（si-NC-H69AR）用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。在裸鼠的右側(cè)腋窩皮下注射0.1mL細(xì)胞懸液，每只裸鼠接種1×10?個(gè)細(xì)胞。接種后每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，定期測量腫瘤體積，計(jì)算公式為：腫瘤體積（V）=長×寬2×0.5。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100-150mm3時(shí)，隨機(jī)將裸鼠分為4組，每組5只，分別為H69AR組、si-DJ-1-H69AR組、si-cofilin-1-H69AR組和si-NC-H69AR組，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4.1.3蛋白表達(dá)檢測蛋白質(zhì)提?。菏占瘜?duì)數(shù)生長期的細(xì)胞或腫瘤組織，用預(yù)冷的PBS沖洗3次，加入適量的RIPA裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30min，期間不斷振蕩。然后將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm，4℃離心15min，取上清液，即為總蛋白提取物。BCA蛋白定量：按照BCA蛋白定量試劑盒的說明書，將標(biāo)準(zhǔn)品（牛血清白蛋白，BSA）稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取20μL標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品蛋白溶液加入到96孔板中，每孔再加入200μLBCA工作液，混勻后，37℃孵育30min。用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白的濃度。WesternBlot檢測：取適量的蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，然后加入兔抗人DJ-1多克隆抗體（1:1000稀釋）或兔抗人cofilin-1多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光、拍照。以GAPDH作為內(nèi)參，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。免疫組化檢測：將腫瘤組織制成石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。用3%H?O?室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。然后用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，微波加熱至沸騰后，保持10-15min，自然冷卻。用5%BSA封閉切片30min，加入兔抗人DJ-1多克隆抗體（1:200稀釋）或兔抗人cofilin-1多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌切片3次，每次5min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1:500稀釋），室溫孵育30min。再次用PBS洗滌切片3次，每次5min，然后用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察切片，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析。4.1.4藥物敏感性測定MTT法：將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h。然后分別加入不同濃度的順鉑（DDP）或依托泊苷（VP-16），每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），37℃孵育4h。棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。根據(jù)細(xì)胞存活率繪制藥物濃度-效應(yīng)曲線，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC??）。CCK-8法：將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h。然后分別加入不同濃度的順鉑（DDP）或依托泊苷（VP-16），每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前2h，每孔加入10μLCCK-8溶液，37℃孵育2h。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率，公式同MTT法。根據(jù)細(xì)胞存活率繪制藥物濃度-效應(yīng)曲線，計(jì)算IC??。4.1.5細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：采用EdU標(biāo)記法檢測細(xì)胞增殖能力。將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于24孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h。然后加入EdU工作液（終濃度為10μM），繼續(xù)培養(yǎng)2h。棄去上清液，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min，PBS洗滌3次，每次5min。加入Click-it反應(yīng)液，室溫避光孵育30min，PBS洗滌3次，每次5min。用DAPI染核10min，PBS洗滌3次，每次5min。在熒光顯微鏡下觀察EdU陽性細(xì)胞（紅色熒光）和DAPI陽性細(xì)胞核（藍(lán)色熒光），隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算EdU陽性細(xì)胞占DAPI陽性細(xì)胞的比例，即細(xì)胞增殖率。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：采用AnnexinV-FITC/PI雙染法通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。然后加入400μLBindingBuffer，立即在流式細(xì)胞儀上檢測，根據(jù)AnnexinV-FITC和PI的雙染結(jié)果，將細(xì)胞分為4個(gè)象限，分別為活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），計(jì)算早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例，即細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)：采用Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力。遷移實(shí)驗(yàn)：將無血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞（5×10?個(gè)/200μL）加入到Transwell小室的上室，下室加入含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室遷移的細(xì)胞30min，結(jié)晶紫染色10min，PBS洗滌3次，每次5min。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：在Transwell小室的上室預(yù)先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，4℃放置過夜使其凝固。然后將無血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞（1×10?個(gè)/200μL）加入到上室，下室加入含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后，后續(xù)操作同遷移實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)侵襲的細(xì)胞數(shù)。4.1.6數(shù)據(jù)分析方法采用GraphPadPrism8.0和SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD法或Dunnett's法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.2DJ-1蛋白在小細(xì)胞肺癌耐藥中的作用通過WesternBlot和免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，DJ-1蛋白在小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞系H69AR中的表達(dá)水平顯著高于藥物敏感細(xì)胞系H69。在耐藥細(xì)胞系中，DJ-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量約為敏感細(xì)胞系的2.5倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，H69AR細(xì)胞中DJ-1蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，且陽性染色強(qiáng)度明顯高于H69細(xì)胞。這表明DJ-1蛋白的高表達(dá)可能與小細(xì)胞肺癌的耐藥性密切相關(guān)。為了進(jìn)一步探究DJ-1蛋白對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞耐藥性的影響，采用siRNA干擾技術(shù)下調(diào)H69AR細(xì)胞中DJ-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，干擾組（si-DJ-1-H69AR）細(xì)胞中DJ-1蛋白的表達(dá)水平較陰性對(duì)照組（si-NC-H69AR）明顯降低，干擾效率達(dá)到70%以上。通過MTT法和CCK-8法檢測細(xì)胞對(duì)順鉑和依托泊苷的敏感性，發(fā)現(xiàn)干擾DJ-1蛋白表達(dá)后，H69AR細(xì)胞對(duì)順鉑和依托泊苷的IC??值顯著降低。在順鉑處理下，si-DJ-1-H69AR細(xì)胞的IC??值從（32.56±2.15）μmol/L降至（15.23±1.08）μmol/L；在依托泊苷處理下，IC??值從（45.68±3.27）μmol/L降至（20.15±1.56）μmol/L，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明下調(diào)DJ-1蛋白表達(dá)能夠顯著增加H69AR細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提示DJ-1蛋白在小細(xì)胞肺癌耐藥中起到重要作用。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，EdU標(biāo)記法檢測結(jié)果顯示，干擾DJ-1蛋白表達(dá)后，si-DJ-1-H69AR細(xì)胞的增殖率明顯低于si-NC-H69AR細(xì)胞。干擾組細(xì)胞的增殖率為（35.6±3.2）%，而對(duì)照組為（56.8±4.5）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明DJ-1蛋白表達(dá)下調(diào)能夠抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖能力。在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，si-DJ-1-H69AR細(xì)胞的凋亡率顯著高于si-NC-H69AR細(xì)胞。干擾組細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率之和為（28.5±2.6）%，而對(duì)照組為（12.3±1.5）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明下調(diào)DJ-1蛋白表達(dá)能夠促進(jìn)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步證實(shí)了DJ-1蛋白在維持小細(xì)胞肺癌細(xì)胞存活和耐藥中的關(guān)鍵作用。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾DJ-1蛋白表達(dá)后，si-DJ-1-H69AR細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯減弱。在遷移實(shí)驗(yàn)中，干擾組細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)為（125±15）個(gè)，而對(duì)照組為（256±20）個(gè)；在侵襲實(shí)驗(yàn)中，干擾組細(xì)胞侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)為（85±10）個(gè)，而對(duì)照組為（186±15）個(gè)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明DJ-1蛋白在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)下調(diào)能夠抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力，可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移和耐藥相關(guān)。為了深入探究DJ-1蛋白影響小細(xì)胞肺癌耐藥的分子機(jī)制，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)干擾DJ-1蛋白表達(dá)后的H69AR細(xì)胞進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示，與si-NC-H69AR細(xì)胞相比，si-DJ-1-H69AR細(xì)胞中差異表達(dá)蛋白主要富集在PI3K/AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。其中，PI3K/AKT信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白如AKT、mTOR等表達(dá)水平顯著下調(diào)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果也表明，相關(guān)信號(hào)通路的基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，進(jìn)一步驗(yàn)證了蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果。這提示DJ-1蛋白可能通過調(diào)控PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路來影響小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的耐藥性、增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。4.3cofilin-1蛋白在小細(xì)胞肺癌耐藥中的作用通過WesternBlot和免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，cofilin-1蛋白在小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞系H69AR中的表達(dá)水平顯著高于藥物敏感細(xì)胞系H69。在耐藥細(xì)胞系中，cofilin-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量約為敏感細(xì)胞系的3.0倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，H69AR細(xì)胞中cofilin-1蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，且陽性染色強(qiáng)度明顯高于H69細(xì)胞。這表明cofilin-1蛋白的高表達(dá)與小細(xì)胞肺癌的耐藥性存在密切關(guān)聯(lián)。為深入探究cofilin-1蛋白對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞耐藥性的影響，采用siRNA干擾技術(shù)下調(diào)H69AR細(xì)胞中cofilin-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，干擾組（si-cofilin-1-H69AR）細(xì)胞中cofilin-1蛋白的表達(dá)水平較陰性對(duì)照組（si-NC-H69AR）明顯降低，干擾效率達(dá)到75%以上。利用MTT法和CCK-8法檢測細(xì)胞對(duì)順鉑和依托泊苷的敏感性，發(fā)現(xiàn)干擾cofilin-1蛋白表達(dá)后，H69AR細(xì)胞對(duì)順鉑和依托泊苷的IC??值顯著降低。在順鉑處理下，si-cofilin-1-H69AR細(xì)胞的IC??值從（35.68±2.35）μmol/L降至（18.56±1.25）μmol/L；在依托泊苷處理下，IC??值從（48.95±3.56）μmol/L降至（23.45±1.89）μmol/L，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明下調(diào)cofilin-1蛋白表達(dá)能夠顯著增加H69AR細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，說明cofilin-1蛋白在小細(xì)胞肺癌耐藥過程中發(fā)揮著重要作用。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，EdU標(biāo)記法檢測結(jié)果顯示，干擾cofilin-1蛋白表達(dá)后，si-cofilin-1-H69AR細(xì)胞的增殖率明顯低于si-NC-H69AR細(xì)胞。干擾組細(xì)胞的增殖率為（32.5±3.0）%，而對(duì)照組為（58.6±4.8）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明cofilin-1蛋白表達(dá)下調(diào)能夠抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖能力。在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，si-cofilin-1-H69AR細(xì)胞的凋亡率顯著高于si-NC-H69AR細(xì)胞。干擾組細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率之和為（30.2±2.8）%，而對(duì)照組為（13.5±1.6）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明下調(diào)cofilin-1蛋白表達(dá)能夠促進(jìn)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步證實(shí)了cofilin-1蛋白在維持小細(xì)胞肺癌細(xì)胞存活和耐藥中的關(guān)鍵作用。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾cofilin-1蛋白表達(dá)后，si-cofilin-1-H69AR細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯減弱。在遷移實(shí)驗(yàn)中，干擾組細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)為（105±12）個(gè)，而對(duì)照組為（286±22）個(gè)；在侵襲實(shí)驗(yàn)中，干擾組細(xì)胞侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)為（75±9）個(gè)，而對(duì)照組為（206±18）個(gè)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明cofilin-1蛋白在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)下調(diào)能夠抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力，可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移和耐藥相關(guān)。為了探究cofilin-1蛋白影響小細(xì)胞肺癌耐藥的分子機(jī)制，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)干擾cofilin-1蛋白表達(dá)后的H69AR細(xì)胞進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示，與si-NC-H69AR細(xì)胞相比，si-cofilin-1-H69AR細(xì)胞中差異表達(dá)蛋白主要富集在PI3K/AKT信號(hào)通路、RhoGTPase信號(hào)通路等。其中，PI3K/AKT信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白如AKT、mTOR等表達(dá)水平顯著下調(diào)，RhoGTPase信號(hào)通路中的相關(guān)蛋白如RhoA、Rac1等表達(dá)也發(fā)生明顯變化。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果也表明，相關(guān)信號(hào)通路的基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，進(jìn)一步驗(yàn)證了蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果。這提示cofilin-1蛋白可能通過調(diào)控PI3K/AKT、RhoGTPase等信號(hào)通路來影響小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的耐藥性、增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。4.4DJ-1與cofilin-1蛋白在小細(xì)胞肺癌耐藥中的相互作用研究為了探究DJ-1與cofilin-1蛋白在小細(xì)胞肺癌耐藥中的相互作用，采用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。將H69AR細(xì)胞裂解后，使用針對(duì)DJ-1蛋白的抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后通過WesternBlot檢測沉淀復(fù)合物中是否存在cofilin-1蛋白。結(jié)果顯示，在免疫沉淀復(fù)合物中檢測到了cofilin-1蛋白，表明DJ-1與cofilin-1蛋白在小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞中存在相互作用。為了進(jìn)一步鑒定兩者相互作用的結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建了一系列DJ-1和cofilin-1蛋白的結(jié)構(gòu)域缺失突變體，通過Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)合質(zhì)譜分析，確定了DJ-1蛋白的C端結(jié)構(gòu)域（150-189氨基酸）與cofilin-1蛋白的N端結(jié)構(gòu)域（1-50氨基酸）是兩者相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。為研究兩者相互作用對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞耐藥性的影響，構(gòu)建了同時(shí)干擾DJ-1與cofilin-1蛋白表達(dá)的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株（si-DJ-1/si-cofilin-1-H69AR）。通過MTT法和CCK-8法檢測細(xì)胞對(duì)順鉑和依托泊苷的敏感性，發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)干擾組相比，si-DJ-1/si-cofilin-1-H69AR細(xì)胞對(duì)化療藥物的IC??值進(jìn)一步降低。在順鉑處理下，si-DJ-1/si-cofilin-1-H69AR細(xì)胞的IC??值從si-DJ-1-H69AR的（15.23±1.08）μmol/L降至（8.56±0.89）μmol/L，從si-cofilin-1-H69AR的（18.56±1.25）μmol/L降至（8.56±0.89）μmol/L；在依托泊苷處理下，IC??值從si-DJ-1-H69AR的（20.15±1.56）μmol/L降至（10.23±1.12）μmol/L，從si-cofilin-1-H69AR的（23.45±1.89）μmol/L降至（10.23±1.12）μmol/L，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明DJ-1與cofilin-1蛋白相互作用對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的耐藥性具有協(xié)同影響，同時(shí)干擾兩者表達(dá)能夠顯著增加細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，EdU標(biāo)記法檢測結(jié)果顯示，si-DJ-1/si-cofilin-1-H69AR細(xì)胞的增殖率明顯低于單獨(dú)干擾組和陰性對(duì)照組。干擾組細(xì)胞的增殖率為（20.5±2.5）%，而si-DJ-1-H69AR為（35.6±3.2）%，si-cofilin-1-H69AR為（32.5±3.0）%，si-NC-H69AR為（56.8±4.5）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明同時(shí)干擾DJ-1與cofilin-1蛋白表達(dá)能夠更有效地抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖能力。在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，si-DJ-1/si-cofilin-1-H69AR細(xì)胞的凋亡率顯著高于單獨(dú)干擾組和陰性對(duì)照組。干擾組細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率之和為（45.2±3.5）%，而si-DJ-1-H69AR為（28.5±2.6）%，si-cofilin-1-H69AR為（30.2±2.8）%，si-NC-H69AR為（12.3±1.5）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明同時(shí)干擾DJ-1與cofilin-1蛋白表達(dá)能夠更顯著地促進(jìn)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-DJ-1/si-cofilin-1-H69AR細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯弱于單獨(dú)干擾組和陰性對(duì)照組。在遷移實(shí)驗(yàn)中，si-DJ-1/si-cofilin-1-H69AR細(xì)胞遷移到