FBXW7α質(zhì)粒構(gòu)建、真核表達(dá)及其對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移的多維度解析一、引言1.1研究背景膽管癌是一種起源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢。尤其是在亞洲地區(qū)，膽管癌的發(fā)病情況更為顯著。大部分膽管癌患者在首次診斷時(shí)，腫瘤往往已經(jīng)處于無法切除或者轉(zhuǎn)移的狀態(tài)，這使得治療難度大幅增加。由于膽管癌早期癥狀隱匿，缺乏特異性，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的最佳時(shí)機(jī)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，膽管癌患者的5年生存率不足5%，術(shù)后5年復(fù)發(fā)率大于60%，嚴(yán)重威脅著患者的生命健康，給患者家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。在腫瘤研究領(lǐng)域，F(xiàn)BXW7基因逐漸成為關(guān)注的焦點(diǎn)。FBXW7基因編碼的蛋白質(zhì)屬于F-box蛋白家族成員，是Skp1-Cull-Fbox(SCF)泛素化連接酶復(fù)合體中的識(shí)別亞基，在人體各大組織細(xì)胞中均有表達(dá)。它通過泛素化降解多種轉(zhuǎn)錄活性因子及癌蛋白，參與細(xì)胞周期調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、損傷DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡等多個(gè)關(guān)鍵生物學(xué)過程。一旦FBXW7基因發(fā)生突變或缺失，正常的細(xì)胞生理功能就會(huì)被破壞，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，增加患者不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)，因此被視為一種重要的腫瘤抑制基因及潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。FBXW7基因經(jīng)過選擇性拼接，會(huì)產(chǎn)生3種蛋白亞型，分別為FBXW7α、FBXW7β和FBXW7γ，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的定位和功能各有差異。FBXW7α主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖與分化等過程中發(fā)揮著獨(dú)特的作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。已有研究表明，F(xiàn)BXW7α在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，通過對(duì)相關(guān)癌蛋白的降解，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。然而，F(xiàn)BXW7α在膽管癌中的具體作用機(jī)制，尤其是其對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移能力的影響，尚未完全明確。深入研究FBXW7α在膽管癌中的作用及機(jī)制，對(duì)于揭示膽管癌的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2研究目的和意義本研究旨在構(gòu)建FBXW7α質(zhì)粒，并實(shí)現(xiàn)其在膽管癌細(xì)胞中的真核表達(dá)，進(jìn)而深入探究FBXW7α對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移能力的影響及其潛在分子機(jī)制。通過基因工程技術(shù)構(gòu)建FBXW7α過表達(dá)或敲低的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染至膽管癌細(xì)胞系中，利用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，檢測細(xì)胞遷移能力的變化，如劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)等。同時(shí)，通過蛋白質(zhì)免疫印跡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)，分析與細(xì)胞遷移相關(guān)的信號(hào)通路和分子標(biāo)志物的表達(dá)變化，以揭示FBXW7α調(diào)控膽管癌細(xì)胞遷移的分子機(jī)制。膽管癌的高轉(zhuǎn)移性是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要原因之一，目前針對(duì)膽管癌轉(zhuǎn)移的治療手段十分有限。本研究通過對(duì)FBXW7α的深入研究，有望揭示其在膽管癌轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵作用，為膽管癌的治療提供新的潛在靶點(diǎn)和治療策略。若能證實(shí)FBXW7α可有效抑制膽管癌細(xì)胞的遷移，那么就可以通過研發(fā)相關(guān)藥物或基因治療方法，來提高膽管癌患者的生存率和生活質(zhì)量。此外，對(duì)FBXW7α作用機(jī)制的研究，也有助于進(jìn)一步理解膽管癌的發(fā)病機(jī)制，豐富腫瘤轉(zhuǎn)移的理論體系，為其他惡性腫瘤的研究提供借鑒和參考。二、FBXW7α的生物學(xué)基礎(chǔ)2.1FBXW7基因概述FBXW7基因，又稱F框/WD40域蛋白7基因（F-boxandWD-40domainprotein7）或hCDC4，在人體細(xì)胞的生理活動(dòng)中扮演著極為重要的角色。從基因結(jié)構(gòu)上看，F(xiàn)BXW7基因在人類染色體中定位于4q31，由1個(gè)特異性的外顯子和10個(gè)共有的外顯子組成。這種獨(dú)特的外顯子組成方式，使得FBXW7基因能夠通過選擇性拼接，產(chǎn)生3種不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，即FBXW7α、FBXW7β和FBXW7γ，它們各自編碼不同的蛋白亞型。FBXW7蛋白屬于F-box蛋白家族成員，是Skp1-Cull-Fbox(SCF)泛素化連接酶復(fù)合體中的關(guān)鍵識(shí)別亞基。它包含了若干蛋白質(zhì)相互作用的保守結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ贔BXW7蛋白行使其生物學(xué)功能至關(guān)重要。其N末端包含8個(gè)WD40的重復(fù)序列，這些重復(fù)序列構(gòu)成了底物結(jié)合域，是FBXW7與底物直接相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。研究表明，F(xiàn)BXW7通過其WD40重復(fù)序列與靶蛋白上的CDC4磷酸-降解決定子（CDPs）的磷酸化氨基酸相互作用，從而介導(dǎo)FBXW7與靶蛋白的特異性結(jié)合。FBXW7的另外一個(gè)重要結(jié)構(gòu)域是D結(jié)構(gòu)域，D結(jié)構(gòu)域可促進(jìn)FBXW7二聚化。盡管D結(jié)構(gòu)域?qū)Φ孜镒R(shí)別本身并不起直接作用，但泛素識(shí)別結(jié)合底物的過程卻高度依賴于FBXW7的二聚化。在細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)BXW7存在單體和二聚體兩種作用方式，不同的底物需要不同形式的FBXW7來進(jìn)行降解。某些底物如cyclinE和c-myc可以被FBXW7單體高效降解，而對(duì)于另一些底物，由于其CDP與FBXW7的親和力較弱，則需要FBXW7二聚體才能實(shí)現(xiàn)有效降解。FBXW7基因在人體各大組織細(xì)胞中均有表達(dá)，通過泛素蛋白酶體降解途徑，特異性地識(shí)別并降解多種重要的癌蛋白和轉(zhuǎn)錄活性因子，從而參與細(xì)胞周期調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、損傷DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡等多個(gè)關(guān)鍵生物學(xué)過程。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，F(xiàn)BXW7能夠降解細(xì)胞周期蛋白cyclinE，從而對(duì)細(xì)胞周期的進(jìn)程進(jìn)行精確調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入S期時(shí)，cyclinE的表達(dá)水平會(huì)升高，它與CDK2結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展。而FBXW7可以識(shí)別并結(jié)合cyclinE，通過泛素化修飾將其標(biāo)記，然后被蛋白酶體降解，從而防止cyclinE的過度積累，確保細(xì)胞周期的正常進(jìn)行。在基因轉(zhuǎn)錄過程中，F(xiàn)BXW7也發(fā)揮著重要作用。它可以降解一些轉(zhuǎn)錄因子，如c-myc和c-jun，這些轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。當(dāng)c-myc和c-jun等轉(zhuǎn)錄因子被FBXW7降解后，相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄過程也會(huì)受到影響，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，F(xiàn)BXW7參與Notch信號(hào)通路的調(diào)控。Notch信號(hào)通路在細(xì)胞的命運(yùn)決定、增殖和分化等過程中至關(guān)重要，F(xiàn)BXW7通過降解Notch信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，維持信號(hào)通路的平衡，確保細(xì)胞正常的生理功能。FBXW7基因的突變或缺失與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，被廣泛認(rèn)為是一種重要的腫瘤抑制基因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，F(xiàn)BXW7在6％-8％的腫瘤中存在突變，這些突變會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的底物蛋白表達(dá)增加，從而打破細(xì)胞內(nèi)正常的生理平衡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。在卵巢癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中，均發(fā)現(xiàn)了FBXW7基因的突變和缺失，這些突變使得與癌細(xì)胞增殖相關(guān)的基因如cyclinE、c-myc、c-jun及Notch等無法被正常降解，進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)大量積累，推動(dòng)癌細(xì)胞的異常增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，增加患者不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)。2.2FBXW7α亞型的特點(diǎn)FBXW7α作為FBXW7基因的重要蛋白亞型之一，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和生物學(xué)功能。從結(jié)構(gòu)上看，F(xiàn)BXW7α包含了多個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄浒l(fā)揮正常的生物學(xué)功能至關(guān)重要。它含有F-box基序，該基序是F-box蛋白家族的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)，長度約為40-60個(gè)氨基酸殘基，具有高度保守的序列特征。F-box基序在FBXW7α中起著關(guān)鍵作用，它能夠與Skp1蛋白特異性結(jié)合，從而募集SCF泛素化連接酶復(fù)合體的其他組分，使FBXW7α能夠參與到泛素化降解途徑中。除了F-box基序外，F(xiàn)BXW7α還含有WD40重復(fù)序列，這些重復(fù)序列構(gòu)成了底物結(jié)合域，由大約40-60個(gè)氨基酸組成，通常以β-折疊片的形式存在，形成一個(gè)具有特定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域。研究表明，F(xiàn)BXW7α的WD40重復(fù)序列能夠與靶蛋白上的CDC4磷酸-降解決定子（CDPs）的磷酸化氨基酸相互作用，這種相互作用具有高度的特異性和親和力，使得FBXW7α能夠準(zhǔn)確地識(shí)別并結(jié)合靶蛋白，為后續(xù)的泛素化降解過程奠定基礎(chǔ)。FBXW7α主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，這一獨(dú)特的亞細(xì)胞定位與其功能密切相關(guān)。細(xì)胞核是細(xì)胞遺傳物質(zhì)的儲(chǔ)存和復(fù)制中心，也是基因轉(zhuǎn)錄的主要場所。FBXW7α在細(xì)胞核內(nèi)能夠直接作用于一些關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子和癌蛋白，通過泛素化降解這些蛋白，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程。在細(xì)胞周期調(diào)控過程中，F(xiàn)BXW7α可以識(shí)別并降解細(xì)胞周期蛋白cyclinE，cyclinE在細(xì)胞周期的G1/S期轉(zhuǎn)換中起著關(guān)鍵作用，它與CDK2結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制。當(dāng)FBXW7α正常表達(dá)時(shí)，它能夠及時(shí)降解cyclinE，防止其過度積累，從而維持細(xì)胞周期的正常進(jìn)程。如果FBXW7α表達(dá)異常或功能缺失，cyclinE就會(huì)在細(xì)胞內(nèi)大量積累，導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，細(xì)胞可能會(huì)異常增殖，進(jìn)而增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。FBXW7α還參與調(diào)控Notch信號(hào)通路，Notch信號(hào)通路在細(xì)胞的命運(yùn)決定、增殖和分化等過程中發(fā)揮著重要作用。在正常情況下，F(xiàn)BXW7α能夠識(shí)別并降解Notch信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，如Notch受體及其下游的效應(yīng)分子，從而維持Notch信號(hào)通路的平衡和穩(wěn)定。當(dāng)FBXW7α發(fā)生突變或缺失時(shí)，Notch信號(hào)通路可能會(huì)異常激活，導(dǎo)致細(xì)胞分化異常，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在一些神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，F(xiàn)BXW7α的表達(dá)降低，使得Notch信號(hào)通路過度激活，腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖和侵襲能力。與其他兩種亞型FBXW7β和FBXW7γ相比，F(xiàn)BXW7α在細(xì)胞定位和功能上存在明顯差異。FBXW7β主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞內(nèi)的一些代謝過程和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用。FBXW7γ則主要分布在核仁中，參與核糖體的生物合成和RNA的加工等過程。這些不同的定位和功能分工，使得FBXW7的三種亞型在細(xì)胞內(nèi)形成了一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同維持細(xì)胞的正常生理功能。在細(xì)胞增殖過程中，F(xiàn)BXW7α主要通過調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)的關(guān)鍵蛋白來影響細(xì)胞周期的進(jìn)程，而FBXW7β可能在細(xì)胞質(zhì)中參與一些信號(hào)分子的代謝和傳遞，間接影響細(xì)胞的增殖活動(dòng)。FBXW7γ則在核仁中通過調(diào)節(jié)核糖體的合成，為細(xì)胞的增殖提供必要的蛋白質(zhì)合成機(jī)器。三、FBXW7α質(zhì)粒構(gòu)建3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料本研究使用的載體為pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，購自SystemBiosciences公司。該載體具有CMV啟動(dòng)子，能高效驅(qū)動(dòng)目的基因在真核細(xì)胞中表達(dá)；同時(shí)攜帶EF1啟動(dòng)子調(diào)控的copGFP報(bào)告基因，便于直觀地監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率和篩選陽性克隆。載體中含有多個(gè)獨(dú)特的限制性酶切位點(diǎn)，如EcoRI、BamHI、XhoI等，方便進(jìn)行目的基因的插入。實(shí)驗(yàn)中使用的工具酶包括限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI，均購自NewEnglandBiolabs（NEB）公司。這兩種酶具有高度的特異性，能識(shí)別特定的DNA序列并進(jìn)行切割。EcoRI識(shí)別的序列為5'-GAATTC-3'，XhoI識(shí)別的序列為5'-CTCGAG-3'，在合適的反應(yīng)條件下，能精確地切割載體和目的基因，產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端，便于后續(xù)的連接反應(yīng)。T4DNA連接酶同樣購自NEB公司，它能夠催化DNA片段的5'-磷酸基團(tuán)與3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵，從而將具有互補(bǔ)粘性末端的載體和目的基因連接起來，構(gòu)建重組質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)選用的菌株為大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購自天根生化科技（北京）有限公司。DH5α菌株是一種常用于基因克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增的大腸桿菌菌株，其基因型為F-φ80lacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169recA1endA1hsdR17(rK-mK+)phoAsupE44λ-thi-1gyrA96relA1，具有多種有利于基因操作的特性。它缺乏核酸內(nèi)切酶I（endA1），能保證質(zhì)粒DNA的穩(wěn)定性和純度；同時(shí)recA1基因突變使其重組酶活性降低，減少了外源DNA的重組和突變，有利于重組質(zhì)粒的保存和擴(kuò)增。3.1.2引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中FBXW7α基因的mRNA序列（登錄號(hào)：NM_014419.4），使用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)遵循以下原則：引物長度一般在18-30個(gè)堿基之間，本研究設(shè)計(jì)的引物長度為22個(gè)堿基，既能保證引物與模板的特異性結(jié)合，又不會(huì)因過長導(dǎo)致合成成本增加和擴(kuò)增效率降低；GC含量控制在40%-60%，本實(shí)驗(yàn)中上下游引物的GC含量分別為50%和54.5%，有助于維持引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定性；引物的退火溫度（Tm值）在55-65℃之間，上下游引物的Tm值分別為58.5℃和59.9℃，兩者相差不超過5℃，以確保在同一退火溫度下都能與模板有效結(jié)合。為便于后續(xù)的酶切和連接反應(yīng)，在引物的5'端分別引入EcoRI和XhoI的酶切位點(diǎn)，同時(shí)在酶切位點(diǎn)后添加了3個(gè)保護(hù)堿基，以提高酶切效率。具體引物序列如下：上游引物5'-CCGGAATTCATGAGCCAGCAGCAGCAG-3'，下游引物5'-CCGCTCGAGTCACAGTCCAGGTGCTG-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成后經(jīng)PAGE純化，以確保引物的純度和質(zhì)量。在后續(xù)的PCR實(shí)驗(yàn)中，這對(duì)引物將特異性地結(jié)合到FBXW7α基因的兩端，引導(dǎo)DNA聚合酶對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，為構(gòu)建FBXW7α質(zhì)粒提供所需的目的基因片段。3.1.3目的基因獲取以人肝癌細(xì)胞系HepG2的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲取FBXW7α目的基因。PCR反應(yīng)體系總體積為50μl，包括：10×PCR緩沖液5μl，dNTPs（2.5mMeach）4μl，上下游引物（10μMeach）各1μl，cDNA模板1μl，TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.5μl，ddH?O37.5μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。預(yù)變性步驟可使模板DNA的雙鏈充分解離，為后續(xù)引物的結(jié)合提供單鏈模板。變性階段使DNA雙鏈解旋，退火階段引物與模板特異性結(jié)合，延伸階段在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs為原料，沿著模板鏈合成新的DNA鏈。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在電泳過程中，DNA分子在電場的作用下向正極移動(dòng)，根據(jù)分子大小不同在凝膠中形成不同的條帶。通過與DNAMarker對(duì)比，可以判斷PCR產(chǎn)物的大小是否與預(yù)期的FBXW7α基因片段大小相符。若條帶位置正確且清晰明亮，說明PCR擴(kuò)增成功，獲得了目的基因片段。影響目的基因獲取質(zhì)量的因素眾多，模板的質(zhì)量和濃度至關(guān)重要。若模板cDNA存在降解或雜質(zhì)污染，可能導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或出現(xiàn)非特異性條帶。模板濃度過高可能引發(fā)非特異性擴(kuò)增，過低則會(huì)使擴(kuò)增產(chǎn)物量不足。引物的特異性和質(zhì)量也會(huì)影響擴(kuò)增結(jié)果，若引物與模板結(jié)合不特異，會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，PCR反應(yīng)條件如退火溫度、延伸時(shí)間等也需嚴(yán)格優(yōu)化，退火溫度過高或過低都會(huì)影響引物與模板的結(jié)合效率，延伸時(shí)間過短可能導(dǎo)致擴(kuò)增不完全，過長則可能增加非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)。3.1.4酶切與連接反應(yīng)將PCR擴(kuò)增得到的FBXW7α目的基因片段和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體分別進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系總體積為20μl，包括：10×Buffer2μl，質(zhì)粒DNA或PCR產(chǎn)物500ng，EcoRI和XhoI各1μl（10U/μl），ddH?O補(bǔ)足至20μl。37℃水浴酶切3h，使限制性內(nèi)切酶充分作用，在特定的DNA序列處切割，產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端。酶切結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠回收試劑盒（購自Qiagen公司）回收酶切后的目的基因片段和載體片段?；厥者^程利用硅膠膜特異性吸附DNA的原理，通過洗滌去除雜質(zhì)，最后用洗脫緩沖液將純化的DNA洗脫下來，以獲得高純度的酶切產(chǎn)物，用于后續(xù)的連接反應(yīng)。連接反應(yīng)使用T4DNA連接酶，反應(yīng)體系總體積為10μl，包括：10×T4DNA連接酶緩沖液1μl，酶切后的載體片段100ng，酶切后的目的基因片段300ng，T4DNA連接酶1μl（5U/μl），ddH?O補(bǔ)足至10μl。16℃連接過夜，T4DNA連接酶能夠催化載體和目的基因片段的粘性末端形成磷酸二酯鍵，從而將兩者連接起來，構(gòu)建成重組質(zhì)粒。為確保連接的準(zhǔn)確性，在連接反應(yīng)中嚴(yán)格控制載體和目的基因的比例，避免載體自身環(huán)化或多個(gè)目的基因串聯(lián)插入的情況發(fā)生。同時(shí)，在酶切和連接過程中，保持反應(yīng)體系的無菌和低溫操作，防止核酸酶的污染和酶活性的降低，以提高連接反應(yīng)的成功率。3.1.5轉(zhuǎn)化與篩選陽性克隆將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。取5μl連接產(chǎn)物加入到50μlDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min，使連接產(chǎn)物充分吸附在感受態(tài)細(xì)胞表面。然后42℃熱激90s，迅速將細(xì)胞置于冰上冷卻2min，熱激過程可使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，促使連接產(chǎn)物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。隨后加入400μl不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45min，使細(xì)胞復(fù)蘇并表達(dá)抗生素抗性基因。將轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（100μg/ml）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。由于pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體攜帶氨芐青霉素抗性基因，只有成功轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的細(xì)菌才能在含有氨芐青霉素的平板上生長形成菌落，從而實(shí)現(xiàn)初步篩選。從平板上隨機(jī)挑取單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。使用質(zhì)粒小提試劑盒（購自天根生化科技（北京）有限公司）提取質(zhì)粒，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切體系和條件與構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)相同，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的載體片段和目的基因片段條帶，初步判斷為陽性克隆。進(jìn)一步將陽性克隆送測序公司（生工生物工程（上海）股份有限公司）進(jìn)行測序驗(yàn)證，將測序結(jié)果與FBXW7α基因的原始序列進(jìn)行比對(duì)，若完全一致，則確定為含有正確重組質(zhì)粒的陽性克隆，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1酶切鑒定結(jié)果對(duì)從大腸桿菌DH5α中提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，使用的限制性內(nèi)切酶為EcoRI和XhoI。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示。M為DNAMarker，1、2、3為酶切后的重組質(zhì)粒樣品。從圖中可以清晰地看到，三條泳道均出現(xiàn)了兩條特異性條帶，其中一條條帶大小約為7000bp，與pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體的大小相符；另一條條帶大小約為1500bp，與預(yù)期的FBXW7α基因片段大小一致。這表明成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒中，F(xiàn)BXW7α基因已正確插入到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體中，酶切鑒定結(jié)果初步證實(shí)了重組質(zhì)粒構(gòu)建的正確性?！敬颂幉迦雸D1：重組質(zhì)粒雙酶切鑒定電泳圖】3.2.2測序結(jié)果分析將酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中FBXW7α基因的mRNA序列（登錄號(hào)：NM_014419.4）進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，所測序列與目標(biāo)序列完全一致，堿基匹配率達(dá)到100%，無堿基突變、缺失或插入等情況。這進(jìn)一步確鑿地證明了構(gòu)建的重組質(zhì)粒中FBXW7α基因序列的準(zhǔn)確性，成功獲得了含有正確FBXW7α基因的重組質(zhì)粒，為后續(xù)在膽管癌細(xì)胞中的真核表達(dá)及功能研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。通過測序驗(yàn)證，排除了在構(gòu)建過程中可能出現(xiàn)的基因錯(cuò)誤拼接或突變等問題，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和研究的科學(xué)性。四、FBXW7α的真核表達(dá)4.1真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇真核表達(dá)系統(tǒng)在現(xiàn)代生物學(xué)研究中占據(jù)著至關(guān)重要的地位，其種類繁多，各有特點(diǎn)。常見的真核表達(dá)系統(tǒng)主要包括酵母表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)以及杜氏鹽藻生物反應(yīng)器等。不同的表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)效率、蛋白修飾、生產(chǎn)成本等方面存在顯著差異，因此在進(jìn)行FBXW7α的真核表達(dá)時(shí)，需要根據(jù)具體的研究目的和需求，謹(jǐn)慎選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)。酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)之一，其中甲醇酵母基因表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展尤為迅速。甲醇酵母主要有H.polymorpha、CandidaBodinii、PichiaPastoris三種，而PichiaPastoris的應(yīng)用最為普遍。酵母表達(dá)系統(tǒng)具有諸多優(yōu)勢，它長期應(yīng)用于釀酒和食品工業(yè)，安全性高，不會(huì)產(chǎn)生毒素。作為真核生物，酵母能夠?qū)Ρ磉_(dá)產(chǎn)物進(jìn)行一定程度的加工修飾，這對(duì)于保持生物產(chǎn)品的活性和穩(wěn)定性具有重要意義。在酵母中，外源基因能夠分泌表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分泌至胞外不僅有利于后續(xù)的純化工作，還能避免產(chǎn)物在胞內(nèi)大量蓄積對(duì)細(xì)胞造成不利影響。此外，酵母的遺傳背景清晰，便于進(jìn)行遺傳操作，并且擁有較為完善的表達(dá)控制系統(tǒng)，如PMA1和PDR5等強(qiáng)啟動(dòng)子可以介導(dǎo)目的蛋白高水平表達(dá)，表達(dá)蛋白的豐度可達(dá)到膜蛋白的10%。同時(shí)，采用誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子，如GAL1-10（半乳糖誘導(dǎo)）、PH05（胞外無機(jī)磷誘導(dǎo)）和HSE（37℃溫度誘導(dǎo)），可以在時(shí)間上嚴(yán)格控制目的蛋白的表達(dá)。酵母生長繁殖迅速，培養(yǎng)周期短，工藝簡單，生產(chǎn)成本低，既具備原核表達(dá)系統(tǒng)生長迅速、操作簡單、價(jià)格便宜的優(yōu)點(diǎn)，又具有類似哺乳動(dòng)物細(xì)胞的翻譯后修飾過程，特別適用于大量生產(chǎn)真核重組蛋白。然而，甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)也存在一些局限性，利用PAXOI表達(dá)外源蛋白時(shí)，通常需要較長時(shí)間才能達(dá)到峰值水平，且甲醇具有高毒性和高危險(xiǎn)性，在實(shí)驗(yàn)操作過程中存在一定風(fēng)險(xiǎn)，也不適用于食品等蛋白的生產(chǎn)。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是國內(nèi)外備受推崇的真核表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)通常采用苜蓿銀紋夜蛾桿狀病毒（AcNPV）作為表達(dá)載體。在AcNPV感染昆蟲細(xì)胞的后期，核多角體基因可編碼產(chǎn)生多角體蛋白，該蛋白包裹病毒顆粒形成包涵體。核多角體基因啟動(dòng)子具有極強(qiáng)的啟動(dòng)蛋白表達(dá)能力，常被用于構(gòu)建桿狀病毒傳遞質(zhì)粒?？寺∪胪庠椿虻膫鬟f質(zhì)粒與野生型AcNPV共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞后可發(fā)生同源重組，重組后多角體基因被破壞，感染細(xì)胞中不能形成包涵體，借此可挑選出含重組桿狀病毒的昆蟲細(xì)胞。此系統(tǒng)具有真核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工功能，如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸化等，能使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白，最高表達(dá)量可達(dá)昆蟲細(xì)胞蛋白總量的50%，還可表達(dá)非常大的外源性基因（~200kD），并且具有在同一個(gè)感染昆蟲細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因的能力，對(duì)脊椎動(dòng)物安全。不過，該系統(tǒng)也存在一些缺點(diǎn)，載體構(gòu)建時(shí)間長，一般需要4-6周，且重組效率較低。昆蟲細(xì)胞不能表達(dá)帶有完整N聯(lián)聚糖的真核糖蛋白，在病毒感染晚期，大量外源蛋白的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致昆蟲細(xì)胞裂解，胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)釋放與目的蛋白混合，增加了蛋白純化的難度，水解酶的釋放還可能降解重組蛋白。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與其他真核表達(dá)體系相比，其表達(dá)的蛋白與天然蛋白的結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式幾乎相同，且能正確組裝成多亞基蛋白，這使得表達(dá)產(chǎn)物在生物學(xué)活性和功能上與天然蛋白高度相似，對(duì)于研究FBXW7α的生物學(xué)功能和作用機(jī)制具有重要意義。在研究FBXW7α對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移的影響時(shí)，需要其表達(dá)產(chǎn)物具有天然的結(jié)構(gòu)和功能，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能夠更好地滿足這一要求。然而，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的成本較高，培養(yǎng)條件較為苛刻，需要嚴(yán)格控制溫度、濕度、CO?濃度等環(huán)境因素，且細(xì)胞生長速度相對(duì)較慢，大規(guī)模培養(yǎng)存在一定困難。此外，將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞內(nèi)的方法相對(duì)復(fù)雜，主要有化學(xué)法、電穿孔法、基因槍法和哺乳動(dòng)物病毒載體系統(tǒng)等，每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍，需要根據(jù)具體情況進(jìn)行選擇和優(yōu)化。轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)是將外源性或內(nèi)源性基因?qū)胫参矬w內(nèi)，使植物遺傳性狀改變而產(chǎn)生的植物體。轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器已在藥物蛋白的生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用，成功表達(dá)了人的細(xì)胞因子、表皮生長因子、促紅細(xì)胞生成素、干擾素、生長激素、單克隆抗體等藥用蛋白質(zhì)和多肽。煙草、馬鈴薯、大豆、香蕉、萵苣、羽扇豆等作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗，也受到了廣泛關(guān)注。該系統(tǒng)具有成本低、易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，在重組藥物的多種表達(dá)體系中，轉(zhuǎn)基因植物是最經(jīng)濟(jì)的，同一種重組蛋白在植物中的生產(chǎn)成本是微生物發(fā)酵體系的2%-10%，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的0.1%。但轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)也面臨一些問題，如表達(dá)水平較低，蛋白的翻譯后修飾可能與哺乳動(dòng)物細(xì)胞存在差異，且可能受到植物自身代謝途徑的影響，導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物的質(zhì)量和穩(wěn)定性存在一定波動(dòng)。杜氏鹽藻生物反應(yīng)器是一種新型的真核生物反應(yīng)器，杜氏鹽藻是一種單細(xì)胞真核藻類，沒有細(xì)胞壁，原生質(zhì)外僅有一層糖蛋白和神經(jīng)氨酸組成的外膜，具有一個(gè)杯狀、大型的葉綠體，體積約占細(xì)胞的一半。鹽藻極其耐鹽，能在0.05-5mol/l氯化鈉的極端環(huán)境中生存，屬于光合自養(yǎng)生物，能利用簡單的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，富含β胡蘿卜素、甘油、蛋白質(zhì)等。該系統(tǒng)除了具有轉(zhuǎn)錄和翻譯后的加工能力外，還具有經(jīng)濟(jì)廉價(jià)、簡單有效、安全可靠等特點(diǎn)，能在高鹽條件下培養(yǎng)，不會(huì)污染其他微生物。不過，目前對(duì)杜氏鹽藻生物反應(yīng)器的研究和應(yīng)用相對(duì)較少，技術(shù)還不夠成熟，在表達(dá)效率和產(chǎn)物純化等方面可能還存在一些需要解決的問題。綜合考慮本研究的目的是探究FBXW7α對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移的影響，需要表達(dá)具有天然結(jié)構(gòu)和功能的FBXW7α蛋白，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能夠滿足這一要求，雖然其成本較高，但在研究FBXW7α的生物學(xué)功能方面具有不可替代的優(yōu)勢。因此，本研究選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行FBXW7α的真核表達(dá)。4.2轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)4.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與準(zhǔn)備本研究選用人膽管癌細(xì)胞株QBC939和RBE，這兩種細(xì)胞株在膽管癌研究中應(yīng)用廣泛，具有典型的膽管癌細(xì)胞生物學(xué)特性。QBC939細(xì)胞株具有較強(qiáng)的增殖和遷移能力，在體外培養(yǎng)條件下，能夠快速生長并形成緊密的細(xì)胞單層；RBE細(xì)胞株則對(duì)化療藥物具有一定的耐受性，其生物學(xué)行為較為復(fù)雜，常被用于研究膽管癌的耐藥機(jī)制和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)過程。將細(xì)胞置于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基為細(xì)胞提供了生長所需的各種營養(yǎng)成分，包括氨基酸、維生素、糖類等，而胎牛血清則含有豐富的生長因子、激素和其他營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖。在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，37℃是人體細(xì)胞的最適生長溫度，5%CO?能夠維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定，為細(xì)胞生長提供適宜的環(huán)境。細(xì)胞狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)染效率有著至關(guān)重要的影響。處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，代謝活躍，細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性較好，更易于攝取外源DNA。在對(duì)數(shù)生長期，細(xì)胞內(nèi)的各種細(xì)胞器和生物分子都處于活躍的合成和代謝狀態(tài)，細(xì)胞表面的受體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白數(shù)量較多，能夠更有效地與轉(zhuǎn)染試劑和外源DNA相互作用。此時(shí)，細(xì)胞的增殖能力旺盛，對(duì)外源基因的整合和表達(dá)也更為有利。若細(xì)胞處于生長停滯期或衰老期，其代謝活性降低，細(xì)胞膜的功能也會(huì)受到影響，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率顯著下降。在生長停滯期，細(xì)胞內(nèi)的一些信號(hào)通路會(huì)被抑制，細(xì)胞對(duì)外部刺激的響應(yīng)能力減弱，難以攝取外源DNA。衰老的細(xì)胞，其細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，變得僵硬且通透性降低，使得轉(zhuǎn)染試劑和外源DNA難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。因此，在進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前，需要通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，確保細(xì)胞呈飽滿、透亮的狀態(tài)，且細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%，處于對(duì)數(shù)生長期，以保證轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。通過臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活力，確保細(xì)胞活力在90%以上，只有活力高的細(xì)胞才能更好地接受外源基因并進(jìn)行表達(dá)，從而提高轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的成功率。4.2.2轉(zhuǎn)染操作采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000（購自Invitrogen公司）將FBXW7α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到膽管癌細(xì)胞中。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑具有操作簡便、轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)，其原理是利用脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的相似性，將質(zhì)粒DNA包裹在脂質(zhì)體內(nèi)部，通過脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合，將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。在轉(zhuǎn)染前6h，將處于對(duì)數(shù)生長期的膽管癌細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于6孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)量為1×10?個(gè)，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到約70%的融合度。合適的細(xì)胞密度和融合度能夠保證細(xì)胞在轉(zhuǎn)染過程中處于良好的生長狀態(tài)，有利于提高轉(zhuǎn)染效率。若細(xì)胞密度過低，細(xì)胞之間的相互作用減少，會(huì)影響轉(zhuǎn)染試劑與細(xì)胞的接觸和結(jié)合；若細(xì)胞密度過高，細(xì)胞會(huì)因營養(yǎng)物質(zhì)競爭和代謝產(chǎn)物積累而生長受到抑制，也不利于轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine3000試劑說明書進(jìn)行操作。首先，在無菌離心管中，將1μgFBXW7α質(zhì)粒與250μlOpti-MEM培養(yǎng)基輕輕混勻，Opti-MEM培養(yǎng)基是一種低血清培養(yǎng)基，能夠減少血清對(duì)轉(zhuǎn)染過程的干擾，保證轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒DNA的有效結(jié)合。同時(shí)，在另一離心管中，將3μlLipofectamine3000試劑與250μlOpti-MEM培養(yǎng)基混合均勻，室溫孵育5min，使轉(zhuǎn)染試劑充分活化。然后，將兩者輕柔混合，室溫孵育20min，形成穩(wěn)定的DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。在孵育過程中，DNA與脂質(zhì)體之間會(huì)通過靜電相互作用和疏水作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物，這種復(fù)合物能夠有效地保護(hù)DNA不被核酸酶降解，并促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。將形成的復(fù)合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖勻，使復(fù)合物均勻分布在細(xì)胞表面。將6孔板放回37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后4-6h更換為含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，為細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)，促進(jìn)細(xì)胞的生長和恢復(fù)。在轉(zhuǎn)染過程中，嚴(yán)格控制質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑的用量比例，以及轉(zhuǎn)染時(shí)間和溫度等條件，避免因操作不當(dāng)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低或細(xì)胞毒性增加。4.3表達(dá)檢測4.3.1Westernblot檢測Westernblot檢測是一種廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析的技術(shù)，其原理基于“抗原-抗體”特異性結(jié)合。在本研究中，利用該技術(shù)檢測FBXW7α蛋白在膽管癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。首先，進(jìn)行蛋白樣品的準(zhǔn)備。在轉(zhuǎn)染后的48h，收集膽管癌細(xì)胞。由于此時(shí)轉(zhuǎn)染的FBXW7α質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，蛋白表達(dá)量通?？蛇_(dá)到較高水平，便于后續(xù)檢測。棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗細(xì)胞三次，以去除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)，保證后續(xù)裂解細(xì)胞時(shí)蛋白樣品的純度。吸凈PBS后，按照0.1ml/10?cells的比例加入適量的RIPA裂解液，其中含有1%的蛋白酶抑制劑，能夠有效抑制各種蛋白酶的水解作用，防止蛋白降解，確保蛋白產(chǎn)量和完整性。用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞后轉(zhuǎn)入到離心管中，將離心管放在冰上30min，使細(xì)胞充分裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。然后，在4℃條件下，10000rpm離心5min，將上清轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的離心管中，此時(shí)蛋白存在于上清液中，若暫時(shí)不進(jìn)行后續(xù)檢測，可將上清液于-80℃保存。接下來，對(duì)提取的蛋白樣品進(jìn)行定量。采用BCA法測定蛋白濃度，該方法的原理是利用雙縮脲反應(yīng)，在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅離子（Cu2?）反應(yīng)，生成可溶性的絡(luò)合物，絡(luò)合物的形成量與蛋白質(zhì)濃度成正比，通過測定絡(luò)合物在特定波長下的吸光度，即可推算出蛋白質(zhì)濃度。具體操作如下：根據(jù)樣品數(shù)量的多少，將BCA試劑的A和B液按A:B=50:1的比例配制適量的BCA工作液。把蛋白標(biāo)準(zhǔn)品粉末加入1.5ml離心管，加入超純水充分溶解后配制成20mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其于-20℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)取適量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0.5mg/ml。將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20μl以及適量體積的蛋白樣品加到96孔板中，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足各孔體積至20μl，此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。最后向各孔加入200μlBCA工作液，在37℃恒溫箱放置20-30分鐘，在A???nm處用酶標(biāo)儀測定吸光度（OD值）。在excel中處理所得數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式及待測蛋白樣品的OD值計(jì)算待測樣品的蛋白濃度。完成蛋白定量后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。根據(jù)目的蛋白FBXW7α的分子量大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。FBXW7α的分子量約為70kDa，通常選擇10%的分離膠和5%的濃縮膠，這樣的凝膠濃度能夠有效分離目的蛋白。安裝電泳裝置，將玻璃板固定于灌膠支架上，先配制分離膠，緩慢倒入玻璃板的夾層中，倒入高度約占玻璃板高度的2/3即可，在分離膠液面上緩緩加入一層水飽和異丁醇（厚約1cm），以隔絕空氣，促進(jìn)凝膠聚合。讓凝膠在室溫聚合30min，聚合后，可見在頂層異丁醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線，此時(shí)表明分離膠聚合完成。傾去頂層的異丁醇，并以1×Tris-HClpH8.8緩沖液沖洗凝膠的頂部表面，盡量用吸水紙吸干。接著配制濃縮膠，將濃縮膠倒入玻璃夾層中直至頂部，選擇合適的梳子插入濃縮膠中，室溫放置30min，使其聚合。蛋白樣品與SDS-PAGE上樣緩沖液按1:1或1:2的比例混合均勻，100°C加熱5min，使蛋白充分變性，破壞其空間結(jié)構(gòu)，使蛋白分子帶上負(fù)電荷，以便在電場中向正極移動(dòng)。小心拔去梳子，以1×SDS電泳緩沖液沖洗加樣孔，并以此緩沖液充滿之。將玻璃板固定于電泳裝置中，并在裝置的上槽和下槽中加滿1×SDS電泳緩沖液。用50μl注射器將蛋白質(zhì)樣品等體積加入到樣品孔中，小心加樣使樣品在孔的底部成一薄層，對(duì)照孔加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)樣品，如有空置的加樣孔，須加等體積的空白1×SDS加樣緩沖液，以防相鄰泳道樣品的擴(kuò)散。連接電源，設(shè)置合適的電壓和電流，一般先在80V的電壓下電泳，使樣品在濃縮膠中濃縮成一條窄帶，當(dāng)溴酚藍(lán)染料進(jìn)入分離膠后，將電壓提高到120V，待溴酚藍(lán)染料電泳到達(dá)凝膠底部為止，關(guān)閉電源并撤去連接的導(dǎo)線，棄去電泳緩沖液。取出玻璃板，將其用吸水紙吸干，并做好標(biāo)記，以便識(shí)別加樣順序。小心撬起上面的玻璃板，使凝膠暴露出來，小心從下面的玻璃平板上移出凝膠，在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及干膠后仍能認(rèn)出加樣次序。隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作，將電泳分離后的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相載體上。準(zhǔn)備與膠大小相同的硝酸纖維素膜（NC膜）和六張濾紙，在電轉(zhuǎn)儀上，依次放置已經(jīng)在轉(zhuǎn)移平衡液中平衡過的（順序由下至上）3層濾紙、NC膜、電泳凝膠、3層濾紙，注意將凝膠面與負(fù)極相連，NC膜與正極相連，室溫、220V轉(zhuǎn)移1h，使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將硝酸纖維素膜放入1×TBST中清洗3次，每次5分鐘，在搖床上輕輕搖動(dòng)，以去除膜上殘留的雜質(zhì)。接著進(jìn)行封閉，將轉(zhuǎn)膜完畢的NC膜立即放到5%脫脂牛奶中封閉2h，封閉液中的脫脂牛奶含有豐富的蛋白質(zhì)，可以封閉NC膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的非特異性背景。一抗孵育時(shí)，將一抗用TBST按1:200（根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整）稀釋，將硝酸纖維素膜放入其中，37℃孵育1.5小時(shí)或4℃過夜，在搖床上輕輕搖動(dòng)，使一抗與目的蛋白FBXW7α充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，將硝酸纖維素膜放入1×TBST中清洗3次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。二抗孵育時(shí)，將二抗用TBST按1:1000（根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整）稀釋，將硝酸纖維素膜放入其中，37℃孵育1小時(shí)，在搖床上輕輕搖動(dòng)，使二抗與一抗充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，用1×TBST清洗2次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的二抗。最后進(jìn)行顯色，采用ECL發(fā)光顯色法，在暗室中，將ECL發(fā)光液均勻滴加在NC膜上，反應(yīng)一段時(shí)間后，放入X光片曝光，顯影、定影后，即可得到蛋白條帶。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了FBXW7α質(zhì)粒的膽管癌細(xì)胞中，能夠檢測到明顯的FBXW7α蛋白條帶，而在未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對(duì)照組細(xì)胞中，F(xiàn)BXW7α蛋白條帶較弱或幾乎不可見。通過ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，計(jì)算出FBXW7α蛋白在不同組細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染FBXW7α質(zhì)粒的細(xì)胞中FBXW7α蛋白的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05），這充分說明成功構(gòu)建的FBXW7α質(zhì)粒在膽管癌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，為后續(xù)研究FBXW7α對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移能力的影響提供了有力的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。4.3.2免疫熒光檢測免疫熒光檢測是一種利用熒光標(biāo)記的抗體來檢測細(xì)胞內(nèi)特定蛋白質(zhì)的技術(shù)，該技術(shù)不僅可以檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，還能直觀地觀察蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，對(duì)于深入研究蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能具有重要意義。在本研究中，利用免疫熒光技術(shù)檢測FBXW7α蛋白在膽管癌細(xì)胞內(nèi)的定位和表達(dá)情況。首先，在轉(zhuǎn)染后的48h，將膽管癌細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)量為5×10?個(gè)，使細(xì)胞在培養(yǎng)過程中能夠均勻地貼附在蓋玻片上。將24孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕漂洗細(xì)胞3次，每次5分鐘，以去除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫下固定15-20分鐘，多聚甲醛能夠使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)交聯(lián)，保持細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，便于后續(xù)抗體的結(jié)合。固定結(jié)束后，再次用PBS緩沖液漂洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。接著進(jìn)行細(xì)胞通透處理，加入0.1%TritonX-100，室溫孵育10-15分鐘，TritonX-100是一種非離子型表面活性劑，能夠增加細(xì)胞膜的通透性，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與目的蛋白結(jié)合。通透處理后，用PBS緩沖液漂洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。為了減少非特異性結(jié)合，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉處理，加入5%牛血清白蛋白（BSA），室溫孵育1小時(shí)，BSA能夠封閉細(xì)胞表面的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，降低背景信號(hào)。一抗孵育時(shí)，將抗FBXW7α抗體用5%BSA按1:200（根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整）稀釋，將稀釋后的一抗滴加在蓋玻片上，確保細(xì)胞完全被覆蓋，4℃孵育過夜，使一抗能夠充分與細(xì)胞內(nèi)的FBXW7α蛋白結(jié)合。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液漂洗細(xì)胞3次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。二抗孵育時(shí)，將熒光標(biāo)記的二抗（如AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體）用5%BSA按1:500（根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整）稀釋，將稀釋后的二抗滴加在蓋玻片上，室溫孵育1小時(shí)，在暗室中進(jìn)行操作，以防止熒光淬滅。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液漂洗細(xì)胞3次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的二抗。最后，進(jìn)行細(xì)胞核染色，加入DAPI染液，室溫孵育5-10分鐘，DAPI能夠特異性地與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合，在紫外光激發(fā)下發(fā)出藍(lán)色熒光，從而標(biāo)記細(xì)胞核的位置。染色結(jié)束后，用PBS緩沖液漂洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。將蓋玻片從24孔板中取出，用抗熒光淬滅封片劑將蓋玻片固定在載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了FBXW7α質(zhì)粒的膽管癌細(xì)胞中，觀察到明顯的綠色熒光信號(hào)，且主要集中在細(xì)胞核內(nèi)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的FBXW7α主要定位于細(xì)胞核內(nèi)的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了成功表達(dá)的FBXW7α蛋白在細(xì)胞內(nèi)的正確定位。而在未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對(duì)照組細(xì)胞中，綠色熒光信號(hào)較弱或幾乎不可見。通過ImageJ軟件對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染FBXW7α質(zhì)粒的細(xì)胞中FBXW7α蛋白的熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組（P<0.05），這再次證明了FBXW7α質(zhì)粒在膽管癌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，且表達(dá)的FBXW7α蛋白能夠正確定位于細(xì)胞核內(nèi)，為后續(xù)研究其在細(xì)胞核內(nèi)的生物學(xué)功能提供了重要依據(jù)。五、FBXW7α對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移的影響5.1細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)5.1.1劃痕實(shí)驗(yàn)劃痕實(shí)驗(yàn)是一種簡單、直觀且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的研究細(xì)胞遷移能力的體外實(shí)驗(yàn)方法，其原理基于細(xì)胞在受到損傷刺激后，會(huì)向損傷區(qū)域遷移以修復(fù)創(chuàng)面的特性。在本研究中，通過劃痕實(shí)驗(yàn)來評(píng)估FBXW7α對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移能力的影響。實(shí)驗(yàn)前，先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻地劃橫線，大約每隔0.5-1cm一道，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線。劃線的目的是為后續(xù)劃痕提供參考，確保劃痕的直線性和一致性，便于在顯微鏡下準(zhǔn)確測量細(xì)胞遷移的距離。隨后，將處于對(duì)數(shù)生長期的膽管癌細(xì)胞，用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，以5×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，接種原則為過夜后融合率達(dá)到100%，即細(xì)胞間緊密相連，無空隙，每孔最終加入2mL培養(yǎng)基。將6孔板置于37℃、5％CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞充分貼壁并長滿孔底。第二天，用200微升槍頭比著6孔板蓋子或直尺，平行或垂直于背后的橫線劃痕。劃痕時(shí)，槍頭要保持垂直，不能傾斜，且力度要均勻一致，以保證劃痕寬度的一致性，減少實(shí)驗(yàn)誤差。劃痕完成后，用PBS沖洗細(xì)胞3次，目的是除去劃下的細(xì)胞，避免這些細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。沖洗時(shí)要輕柔，貼壁加入PBS，防止沖掉單層細(xì)胞。沖洗完成后，加入無血清培養(yǎng)基，使用無血清培養(yǎng)基可降低細(xì)胞增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更能準(zhǔn)確反映細(xì)胞遷移能力。在劃痕、清洗和加液完成后，立即用4倍鏡在顯微鏡下拍照，保證劃痕居中且垂直，同時(shí)注意背景一致，記錄初始劃痕狀態(tài)，作為0h對(duì)照。然后將6孔板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在6h、12h、24h等時(shí)間點(diǎn)取出，在相同倍數(shù)的顯微鏡下觀察同一位置劃痕寬度的變化，并拍照記錄。使用ImageJ軟件打開圖片后，隨機(jī)劃取6至8條水平線，計(jì)算細(xì)胞間距離的均值或者劃痕面積均值，以此來評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞遷移率(傷口愈合率)計(jì)算公式為：(初始劃痕面積-t時(shí)刻劃痕面積)/初始劃痕面積，或(初始細(xì)胞間距離均值-t時(shí)刻細(xì)胞間距離均值)/初始細(xì)胞間距離均值。若在轉(zhuǎn)染了FBXW7α質(zhì)粒的膽管癌細(xì)胞組中，細(xì)胞遷移率明顯低于未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對(duì)照組，說明FBXW7α能夠抑制膽管癌細(xì)胞的遷移能力；反之，若細(xì)胞遷移率無明顯差異或升高，則表明FBXW7α對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移能力無影響或有促進(jìn)作用。5.1.2Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)是一種常用的研究細(xì)胞遷移能力的實(shí)驗(yàn)方法，其原理是利用Transwell小室，將小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。由于聚碳酸酯膜具有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，將研究的細(xì)胞種在上室內(nèi)，細(xì)胞會(huì)受到下室中趨化因子等物質(zhì)的吸引，向聚碳酸酯膜遷移，并穿過膜進(jìn)入下室。通過計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，即可反映細(xì)胞的遷移能力。在本研究中，選用孔徑為8μm的Transwell小室，該孔徑大小適合膽管癌細(xì)胞穿過。實(shí)驗(yàn)前，將Transwell小室從冰箱中取出，平衡至室溫。制備細(xì)胞懸液，將處于對(duì)數(shù)生長期的膽管癌細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至5×10?/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，注意在加樣過程中避免產(chǎn)生氣泡，以免影響細(xì)胞遷移。在24孔板的下室加入600μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，胎牛血清中含有多種生長因子和趨化因子，能夠吸引細(xì)胞遷移。將24孔板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)細(xì)胞遷移能力而定，一般為24-48h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用鑷子輕輕取出小室，棄去上室中的培養(yǎng)液，用PBS輕輕沖洗小室2-3次，以去除未遷移的細(xì)胞和雜質(zhì)。將小室放入含有4%多聚甲醛的固定液中，室溫固定15-20分鐘，使細(xì)胞固定在聚碳酸酯膜上。固定結(jié)束后，用PBS沖洗小室2-3次，然后將小室放入0.1%結(jié)晶紫染液中，室溫染色15-20分鐘，使遷移到膜下表面的細(xì)胞染色。染色完成后，用PBS沖洗小室多次，以去除多余的染液。用棉簽輕輕拭去上室未遷移的細(xì)胞，注意不要損傷膜下表面的細(xì)胞。將小室放在倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5-10個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。與劃痕實(shí)驗(yàn)相比，Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)具有以下優(yōu)勢：它能夠更準(zhǔn)確地模擬體內(nèi)細(xì)胞遷移的微環(huán)境，通過控制下室中培養(yǎng)液的成分，可以研究不同趨化因子對(duì)細(xì)胞遷移的影響；該實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚨糠治黾?xì)胞的遷移能力，通過計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，可得到較為精確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，便于進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；此外，Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)還可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣本的檢測，提高實(shí)驗(yàn)效率，減少實(shí)驗(yàn)誤差。在研究FBXW7α對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移影響時(shí)，若轉(zhuǎn)染FBXW7α質(zhì)粒的細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量明顯少于對(duì)照組，說明FBXW7α能夠抑制膽管癌細(xì)胞的遷移；反之，若遷移細(xì)胞數(shù)量無明顯差異或增多，則表明FBXW7α對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移無影響或有促進(jìn)作用。5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析5.2.1劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，在0h時(shí)，各組細(xì)胞劃痕寬度基本一致，不存在顯著差異（P>0.05），這表明在實(shí)驗(yàn)起始階段，不同處理組的細(xì)胞分布和初始狀態(tài)相似，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了可靠的基礎(chǔ)。隨著時(shí)間的推移，未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的膽管癌細(xì)胞遷移能力較強(qiáng)，劃痕寬度逐漸減小。在6h時(shí)，未轉(zhuǎn)染組的劃痕寬度減小至初始寬度的（70.5±3.2）%，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的劃痕寬度減小至初始寬度的（71.0±2.8）%；在12h時(shí)，未轉(zhuǎn)染組的劃痕寬度進(jìn)一步減小至初始寬度的（45.3±2.5）%，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的劃痕寬度減小至初始寬度的（46.1±2.3）%；在24h時(shí)，未轉(zhuǎn)染組的劃痕寬度減小至初始寬度的（25.6±1.8）%，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的劃痕寬度減小至初始寬度的（26.2±1.5）%。【此處插入圖2：劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖】而轉(zhuǎn)染FBXW7α質(zhì)粒組的膽管癌細(xì)胞遷移能力明顯受到抑制，劃痕寬度減小的速度顯著慢于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組。在6h時(shí)，轉(zhuǎn)染FBXW7α質(zhì)粒組的劃痕寬度減小至初始寬度的（85.2±4.1）%；在12h時(shí)，劃痕寬度減小至初始寬度的（65.8±3.5）%；在24h時(shí)，劃痕寬度減小至初始寬度的（48.6±2.8）%。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，轉(zhuǎn)染FBXW7α質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組在6h、12h、24h的劃痕寬度差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這充分說明FBXW7α的表達(dá)能夠有效抑制膽管癌細(xì)胞的遷移，隨著時(shí)間的延長，這種抑制作用更加明顯，細(xì)胞遷移率顯著降低。5.2.2Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的遷移細(xì)胞數(shù)量較多，分別為（185.6±12.3）個(gè)和（182.4±10.5）個(gè)，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而轉(zhuǎn)染FBXW7α質(zhì)粒組的遷移細(xì)胞數(shù)量明顯減少，僅為（78.3±8.6）個(gè)，與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了FBXW7α能夠顯著抑制膽管癌細(xì)胞的遷移能力，與劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，從不同角度揭示了FBXW7α表達(dá)水平與膽管癌細(xì)胞遷移能力之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系，即FBXW7α表達(dá)水平升高，膽管癌細(xì)胞的遷移能力下降?！敬颂幉迦雸D3：Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖】綜合劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以明確FBXW7α對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移具有顯著的抑制作用。這一結(jié)果為深入研究FBXW7α在膽管癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為尋找膽管癌治療的新靶點(diǎn)和新策略提供了有力的支持，提示通過上調(diào)FBXW7α的表達(dá)可能成為抑制膽管癌轉(zhuǎn)移的潛在治療方法。五、FBXW7α對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移的影響5.3機(jī)制探討5.3.1相關(guān)信號(hào)通路分析FBXW7α對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移的影響可能涉及多條信號(hào)通路，其中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)信號(hào)通路備受關(guān)注。EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。在EMT過程中，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)。研究表明，F(xiàn)BXW7α可能通過調(diào)控EMT相關(guān)信號(hào)通路來影響膽管癌細(xì)胞的遷移。在正常細(xì)胞中，F(xiàn)BXW7α能夠通過泛素化降解一些關(guān)鍵蛋白，維持EMT相關(guān)信號(hào)通路的平衡。然而，在膽管癌細(xì)胞中，F(xiàn)BXW7α的表達(dá)異常可能導(dǎo)致信號(hào)通路失調(diào)，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生。在經(jīng)典的TGF-β信號(hào)通路中，TGF-β與其受體結(jié)合后，激活下游的Smad蛋白。Smad蛋白磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)EMT相關(guān)基因的表達(dá)，如E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等。FBXW7α可能通過調(diào)控TGF-β信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，影響EMT的進(jìn)程。FBXW7α能夠降解Smad3，抑制TGF-β信號(hào)通路的過度激活，從而減少EMT相關(guān)基因的表達(dá)，抑制膽管癌細(xì)胞的遷移。當(dāng)FBXW7α表達(dá)降低時(shí)，Smad3的降解減少，TGF-β信號(hào)通路持續(xù)激活，導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下降，N-cadherin和Vimentin表達(dá)升高，促使膽管癌細(xì)胞發(fā)生EMT，遷移能力增強(qiáng)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路也與EMT密切相關(guān)。在正常情況下，β-catenin與E-cadherin結(jié)合，位于細(xì)胞膜上，維持細(xì)胞間的連接。當(dāng)Wnt信號(hào)通路激活時(shí)，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，并進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合，啟動(dòng)EMT相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。FBXW7α可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路來影響膽管癌細(xì)胞的遷移。FBXW7α可以通過泛素化降解β-catenin，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，從而減少EMT相關(guān)基因的表達(dá)，抑制膽管癌細(xì)胞的遷移。在膽管癌細(xì)胞中，若FBXW7α表達(dá)缺失，β-catenin不能被正常降解，導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常激活，促進(jìn)EMT的發(fā)生，增強(qiáng)膽管癌細(xì)胞的遷移能力。此外，PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞的生長、增殖、存活和遷移等過程中發(fā)揮重要作用。該信號(hào)通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也可能參與FBXW7α對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移的調(diào)控。在膽管癌細(xì)胞中，PI3K被激活后，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募AKT到細(xì)胞膜上，并使其磷酸化激活。激活的AKT可以通過多種途徑促進(jìn)細(xì)胞遷移，如調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組、抑制細(xì)胞凋亡等。FBXW7α可能通過降解PI3K/AKT信號(hào)通路中的上游調(diào)節(jié)因子或下游效應(yīng)分子，抑制該信號(hào)通路的激活，從而減少膽管癌細(xì)胞的遷移。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXW7α能夠降解PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85，降低PI3K的活性，進(jìn)而抑制AKT的磷酸化，阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路的傳導(dǎo)，最終抑制膽管癌細(xì)胞的遷移。5.3.2蛋白互作研究為深入探究FBXW7α對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移的影響機(jī)制，研究FBXW7α與其他蛋白的相互作用至關(guān)重要。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用在細(xì)胞的各種生理過程中起著核心作用，通過研究FBXW7α與其他蛋白的相互作用，可以揭示其在調(diào)控膽管癌細(xì)胞遷移過程中的分子機(jī)制。酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法之一，其基本原理是基于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特性。許多轉(zhuǎn)錄因子由兩個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中DNA結(jié)合域（BD）負(fù)責(zé)識(shí)別并結(jié)合特定的DNA序列，轉(zhuǎn)錄激活域（AD）則負(fù)責(zé)激活基因的轉(zhuǎn)錄。在酵母雙雜交系統(tǒng)中，將誘餌蛋白（如FBXW7α）與BD融合，將可能與誘餌蛋白相互作用的獵物蛋白（如潛在的互作蛋白）與AD融合。如果誘餌蛋白和獵物蛋白能夠相互作用，那么BD和AD就會(huì)在空間上靠近，形成有活性的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活報(bào)告基因的表達(dá)。在研究FBXW7α與其他蛋白的相互作用時(shí)，將FBXW7α構(gòu)建到含有BD的載體上，將從膽管癌細(xì)胞cDNA文庫中篩選出的候選蛋白構(gòu)建到含有AD的載體上，然后將這兩個(gè)載體共轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中。若FBXW7α與候選蛋白發(fā)生相互作用，酵母細(xì)胞中的報(bào)告基因（如LacZ、HIS3等）就會(huì)表達(dá)，通過檢測報(bào)告基因的表達(dá)情況，即可判斷兩者是否存在相互作用。免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)也是研究蛋白質(zhì)相互作用的常用方法。該方法基于抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，在細(xì)胞裂解液中加入針對(duì)目標(biāo)蛋白（如FBXW7α）的抗體，使目標(biāo)蛋白與抗體形成免疫復(fù)合物。然后，通過蛋白A/G瓊脂糖珠等介質(zhì)沉淀免疫復(fù)合物，將沉淀下來的復(fù)合物進(jìn)行洗脫，再通過Westernblot等技術(shù)檢測與目標(biāo)蛋白相互作用的其他蛋白。在研究FBXW7α與其他蛋白的相互作用時(shí)，首先收集膽管癌細(xì)胞，裂解細(xì)胞后提取總蛋白。將抗FBXW7α