ICS65.020

B30

DB5206

銅仁市地方標準

DB5206/T85—2018

代替DB522200/T57-2009

紅薯脫毒種薯繁育技術規(guī)程

2018-12-06發(fā)布2018-12-06實施

銅仁市質(zhì)量技術監(jiān)督局發(fā)布

DB5206/T85-2018

紅薯脫毒種薯繁育技術規(guī)程

1范圍

本標準規(guī)定了紅薯脫毒種薯及種苗的繁育技術規(guī)程，適用于銅仁市各紅薯種薯（苗）繁

育基地、產(chǎn)地及栽培區(qū)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本

適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB4406種薯

GB7413紅薯種苗產(chǎn)地檢疫規(guī)范

NY/T402脫毒甘薯種薯(苗)病毒檢測技術規(guī)程

NY/T1200甘薯脫毒種薯

3術語和定義

下列術語和定義適用于本標準

3.1

脫毒試管苗virus-freetubeseedIing

應用莖尖分生組織培養(yǎng)技術獲得,經(jīng)檢測確認不帶紅薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)、紅薯潛

隱病毒（SPLV）、紅薯褪綠斑病毒（SPCFV）的試管苗。

3.2

脫毒種薯（苗）virus-freetube（seedIing）

從育種家種子繁殖脫毒試管苗開始,逐漸繁殖增加種薯(苗)數(shù)量的種薯生產(chǎn)體系出來的

種薯(苗)

注:分為育種家種子、原原種、原種生產(chǎn)用種四個級別。

3.2.1

育種家種子breederˊsseed

由育種者直接和掌握的原始種子,具有該品種的典型性的遺傳穩(wěn)定性,純度100%,不帶病

毒的其他病蟲害,產(chǎn)量及其他主要性狀符合推廣時的原有水平。

3.2.2

原原種pre-eIite

由育種家種子或典型品種的脫毒試管苗在防蟲網(wǎng)室、溫室條件下生產(chǎn)的符合質(zhì)量標準的

種薯（苗）。

3.2.3

原種eIite

用原原種作種薯,在良好隔離條件下生產(chǎn)的符合質(zhì)量標準的種薯(苗)。

3.2.4

生產(chǎn)用種certiedseed

1

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用原種作種薯,在良好隔離條件下生產(chǎn)的符合質(zhì)量標準的種薯(苗)。

3.3

病毒病株允許率

脫毒種薯繁殖田中病毒病株的比率。

3.4

真菌、細菌病株允許率

脫毒種薯（苗）繁殖田中真菌、細菌病株的比率。

3.5

蟲害株允許率

脫毒種薯（苗）繁殖田中蟲害株的比率

3.6

混雜植株的允許率

脫毒種薯（苗）繁殖田中混雜的其它紅薯品種植株的比率。

3.7

脫毒種薯塊根整齊度

單塊質(zhì)量在100g的—500g的紅薯種薯塊根質(zhì)量占塊根總質(zhì)量的比率。

3.8

有缺陷薯

機械損傷、蟲鼠傷、畸形塊根總質(zhì)量的比率。

3.9

雜質(zhì)

一批塊根中除具有價值的塊根外,其他物質(zhì)稱為雜質(zhì)。包含浮土、塊根上所沾的泥土、

無種用價值的塊根，以及其他有機、無機物質(zhì)質(zhì)量。

3.10

腐爛

本標準中指根腐爛、軟腐病、鐮刀菌干腐病造成的腐爛外,其他原因造成的腐爛。

4總則

4.1脫毒紅薯高級脫毒試管苗、脫毒紅薯原原種、原種、生產(chǎn)種繁育單位所生產(chǎn)的種薯（苗），

必須符合國家規(guī)定的有關標準。

4.2脫毒繁育體系的建立要根據(jù)種植面積及具備的技術條件確定。原原種、原種的繁育由省、

市、縣級具備脫毒、組培條件的科研單位或繁育基地（企業(yè)）進行。生產(chǎn)種的繁育由縣（區(qū)）、

鄉(xiāng)級農(nóng)業(yè)繁育基地（企業(yè)）單位進行。各育種單位應設立專用繁育基地，繁種必須持有關部

門發(fā)放的脫毒種薯繁育許可證。

4.3進行脫毒所用的品種，必須是當?shù)卮竺娣e的主栽品種或已經(jīng)審定即將推廣的新品種。

4.4脫毒紅薯是經(jīng)過脫除紅薯羽狀斑駁病毒、紅薯潛隱病毒、紅薯褪綠斑病毒、紅薯煙草花

葉病毒的種薯種苗。

5脫毒種薯的質(zhì)量

5.1品種純度

高級脫毒試管苗必須是經(jīng)過嚴格病毒檢測，確任不含有已知病毒或指定病毒，且經(jīng)過株

2

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系評選而中選的試管苗以及用其它離體快繁或防蚜條件下速繁后的試管莖蔓苗。原原種和原

種的純度不低于99%，生產(chǎn)種純度不低于96%。

5.2薯塊病蟲

5.2.1病毒?。涸N薯的帶毒率0，原種和生產(chǎn)種的帶毒率不能超過2%、10%。

5.2.2其它病蟲害：紅薯黑班病、根腐病，原原種帶病率為0，原種和生產(chǎn)種帶病率不能超

過0.1%、1%。原原種、原種、生產(chǎn)種的莖線蟲病、根結(jié)線蟲病的帶病率均為0。

5.3其它

5.3.1薯塊整齊度：是指種薯重100—500g的薯塊占總量的百分比；整齊度不低于85%。即

原種、生產(chǎn)種薯塊要求每塊重100—500g。

5.3.2不完整薯率：機械損傷、自然干、畸形薯所占比率為：原原種不超過1%、原種不超

過3%、生產(chǎn)種不超過6%。

6脫毒紅薯試管苗繁育技術標準

6.1脫毒紅薯莖尖苗的培育

利用植物莖尖頂部分生組織不帶或很少攜帶病毒的原理，在無菌條件下切取紅薯莖尖分

生組織，并在特定的培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng)，就能夠再生出不帶有病毒的莖尖脫毒苗。即：

選則具有該品種特征特性的無病紅薯苗莖頂部3厘米長的芽段，用70%酒精、3%漂白粉液分

別消毒，在超凈工作臺內(nèi)解剖鏡下剝離莖尖。將剝離的長0.2-0.5毫米（一般帶1-2個葉原

基）的莖尖接種在附加1-2mg每升6-ba的ms培養(yǎng)基上，26-28℃溫度下補光培養(yǎng)，莖尖膨

大變綠后轉(zhuǎn)入無激系的ms培養(yǎng)基上培養(yǎng)成莖尖試管苗。待苗長至5-6片葉時移到營養(yǎng)缽內(nèi)

進行病毒檢測。一般來講，從剝莖尖到誘導出5-7片葉的莖尖苗至少要用60-90d。利用分

生組織和外殖體培養(yǎng)誘導紅薯莖尖苗是紅薯脫毒的技術關鍵。

6.2病毒檢測

莖尖分生組織培養(yǎng)得到的莖尖苗并不都是脫毒苗，只有部分苗不含病毒，是脫毒苗；莖

尖苗必須經(jīng)過嚴格的病毒檢測確認不帶病毒后才是脫毒莖尖苗。莖尖苗的檢測一般首先采取

目測法淘汰弱苗和顯癥苗，然后再用血清學方法或分子生物學方法進行篩選。經(jīng)血清學或分

子生物學方法檢測呈陰性的樣品再進行指示植物嫁接檢測。

6.3優(yōu)良株系評選

紅薯的芽變率比較高，莖尖分生組織培養(yǎng)再生的莖尖苗株系間在形態(tài)和產(chǎn)量方面往往存

在較大差異。因此，經(jīng)病毒檢測確認的脫毒苗必須進行優(yōu)良株系評選，淘汰變異株系，保留

優(yōu)良株系。株系評選的方法是：將脫毒苗株系每系5-10株栽種到防蟲網(wǎng)室內(nèi)，以同品種普

通帶毒薯為對照，進行形態(tài)、長勢、產(chǎn)量等多方面的觀察評定，選出若干既符合品種特性又

高產(chǎn)的最優(yōu)株系，混合繁殖。

7高級脫毒試管苗速繁

利用莖尖分生組織培養(yǎng)獲得脫毒苗后，要獲得大田生產(chǎn)利用的足夠脫毒苗，快速繁殖技

術起著決定性作用。脫毒紅薯莖尖苗的大量繁殖，可以采用試管苗單葉節(jié)快繁或溫網(wǎng)棚繁殖

2種方式來完成。

7.1高級脫毒苗試管快繁脫毒苗試管快繁具有以下優(yōu)越性：（1）繁殖速度快。在合適的培

養(yǎng)條件下（溫度25℃，每天光照18小時），1個莖節(jié)1個月內(nèi)即可長成具5-6片葉的小植株，

以繼代1次增殖5株計算，其繁殖系數(shù)為5n。（2）避免病毒再侵染。脫毒苗的試管快繁是

3

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在嚴格的無菌條件下進行的，即沒有病毒源也沒有傳播媒介。（3）繼代繁殖成活率高。除極

少數(shù)由于操作不慎造成試管苗污染外，單莖葉成苗率達100%。（4）不受季節(jié)、氣候和空間

限制，可以進行工廠化生產(chǎn)。

7.1.1脫毒苗試管快繁采用不加任何激素的MS培養(yǎng)基。

7.1.2將待繁的高級脫毒試管苗在無菌條件下切成一葉一節(jié)的切段，扦插在無激素的MS培

養(yǎng)基上，在26-28℃、14-16h光照條件下離體培養(yǎng)，25-30d左右即可長成5-7片葉大小的

幼苗，即又可進行下一輪切段快繁。繁殖系數(shù)呈幾何級數(shù)增加。

7.2高級脫毒試管苗的田間快繁

7.2.1脫毒試管苗的田間快繁采用防蚜塑料大棚設備或防蚜竹（木）大棚設備。

7.2.2隔離措施500米內(nèi)無普通帶毒紅薯空間隔離，繁殖棚加蓋40目防蚜網(wǎng)。

7.2.3苗床培養(yǎng)土用林間表層細土加經(jīng)高溫發(fā)酵過篩的生物有機肥，土、肥比例6：4

或7：3，充分混勻即為苗床營養(yǎng)土，苗床營養(yǎng)土厚度10-15cm。

7.2.4脫毒紅薯試管苗防蚜塑料大棚快繁

在3月上-中旬將5-7片葉的脫毒試管苗打開瓶口，室溫下加光照煉苗5-7d。栽前頭天

下午在棚內(nèi)苗床上撤上用100g50%辛硫硫乳油兌水2.5-5kg稀釋后與15-25kg干餌料拌成的

毒餌，以消滅地下害蟲。然后按5×5cm行株距栽種在覆蓋防蟲網(wǎng)的塑料大棚內(nèi)，澆足水后

加蓋一層小拱棚，把溫度控制在25攝氏度左右。待苗長至15-20cm時剪下蔓頭苗繼續(xù)栽種、

快繁。采用這種雙膜育苗方法繁殖系數(shù)可以達到100倍以上。但要注意小水勤澆，通風通氣，

保證溫度既不能低于10℃，也不能高于30℃。

7.2.5脫毒紅薯試管苗防蚜竹（木）網(wǎng)棚快繁

在3月下旬至4月上旬將經(jīng)過鍛煉的5-7片葉的脫毒試管苗或在塑料大棚內(nèi)剪下的試管

蔓頭苗（按每苗2-3片葉），栽植于防蚜蟲大棚內(nèi)營養(yǎng)土苗床上，行株距10×8cm。栽前仍

用藥劑處理苗床防治地下害蟲。栽后勤施肥水，溫度控制在25-30℃，待苗長至15厘米左

右時摘心，以促進其分枝。以后待分枝苗長至5片葉時繼續(xù)剪苗快繁，或直接用于繁殖原原

種。

7.2.6繁苗過程中傳毒再侵染的防止。從栽植苗之日計每隔7-10d定期對苗床上栽植的紅薯

試管苗噴灑防治蚜蟲藥劑，以防止蚜蟲帶毒傳播。

8脫毒紅薯原原種繁育技術標準

8.1原原種

指在防蚜蟲網(wǎng)棚內(nèi)無病原土壤上栽種的高級脫毒試管苗或用棚內(nèi)脫毒試管苗繁育的莖

蔓苗生產(chǎn)的種薯。用原原種薯在防蚜蟲條件下育出的薯苗叫原原種苗。

8.2脫毒紅薯原原種繁育必須具備的條件

8.2.1栽種的種苗必須是高級脫毒試管苗或用高級脫毒試管苗在防蚜條件下繁育的莖蔓苗。

8.2.2必須在防蟲網(wǎng)棚內(nèi)生產(chǎn)原原種。防蟲網(wǎng)棚是繁育原原種的重要條件之一，所用防蟲網(wǎng)

的網(wǎng)眼必須在40目以上，這樣的網(wǎng)目蚜蟲才不能通過，可以較大限度地減少蚜蟲傳播病毒

的機會。

8.2.3網(wǎng)棚內(nèi)所用地塊必須是無病原土壤，最好是多年未栽種過紅薯的土壤。

8.2.4在繁育原原種的整個過程中，要始終貫穿防止病毒再侵染的意識以及防止再侵染的措

施。

8.2.5在網(wǎng)棚內(nèi)每隔5-10米種植5株以上的指示植物，并在原原種生產(chǎn)過程中定期逐株觀

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察是否有病毒癥狀，一旦發(fā)現(xiàn)病株，須對全棚進行普查，要堅決拔除帶毒病株。如果網(wǎng)棚內(nèi)

所栽植的指示植物表現(xiàn)病毒癥狀，整個棚內(nèi)繁殖的種薯應降級使用。

8.2.6每隔10-15d噴灑一次殺蟲藥劑，防治蚜蟲，以防傳毒，藥劑應輪換使用，避免產(chǎn)生

抗藥性，達不到防蚜效果。

8.3技術工藝流程

隔離條件——土地選擇——土壤消毒——生物有機肥加復合肥（基肥）——單行起壟移

栽——5000株/667m2密度——夏薯栽培——多次滅蚜（成活后每10d一次）——提蔓管理

——適時采收——分級包裝——入窖。

8.4技術及經(jīng)濟指標

種薯純度≥99%種薯大小100g-500g，每667m2種薯產(chǎn)量≥1000kg,無病蟲率≥99%

8.5材料（以667m2計）

種苗5000株、生物有機肥200kg、復合肥25kg，50%硫酸鉀20kg、土壤消毒劑、滅蚜

劑等。

8.6繁種移栽時間

6月上旬至中旬

8.7種薯收獲時間

10月下旬至11月初

9脫毒紅薯原種繁育技術標準

9.1原種

指利用原原種苗在具備500m以上隔離條件（即500m內(nèi)沒有種植普通帶毒紅薯）而且

土壤無病原的田塊生產(chǎn)的種薯。由原種在防蚜條件下育出的薯苗叫原種苗。

9.2原種繁育必須具備的條件

9.2.1所用薯苗為原原種苗；

9.2.2具有500m內(nèi)無普通帶毒紅薯種植的空間隔離條件；

9.2.3所用田塊至少3年以上沒種過普通帶毒紅薯，且為無莖線蟲病、根腐病、黑斑病等。

原種繁殖時要密切注意防止病毒再侵染。要在繁殖田內(nèi)每隔15-20米種植一些指示植

物，每15d定期噴灑防蚜蟲藥劑，以防蚜蟲傳毒。收獲前要觀察病毒發(fā)病情況，及時拔去病

株。收獲時嚴把質(zhì)量關，不符合質(zhì)量要求的薯塊堅決不入窖。

9.3技術工藝流程

種薯加溫育苗——隔離條件——土地選擇——土壤消毒——生物有機肥加復合肥（基

肥）——單行起壟移栽——密度6000株/667m2——夏薯栽培——滅蚜——提蔓——噴施矮

壯素——適時采收——分級包裝——入窖。

9.4技術及經(jīng)濟指標

種薯純度≥99%種薯大小100-500g，667m2種薯產(chǎn)量1200-1500kg，無病蟲率≥99%

9.5材料（以667m2計）

原原種薯50kg、育苗生物增溫劑1包（25kg）；移栽用生物有機肥200kg、復合肥25kg；

50%硫酸鉀20kg；土壤消毒劑、滅蚜劑、育苗用薄膜。

9.6種薯育苗時間及方法

種薯于3月下旬至4月上旬播種育苗，采用網(wǎng)室大棚增溫育苗法，每50kg種薯可出壯

苗6000——8000株。

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9.7移栽時間

6月中旬至下旬

9.8種薯收獲時間

10月下旬至11月初

10脫毒紅薯生產(chǎn)種繁育技術標準

10.1生產(chǎn)種

指利用原種苗在普通無病留種田塊生產(chǎn)的種薯。由生產(chǎn)種在防蚜條件下培育的苗叫生產(chǎn)

種苗。

10.2生產(chǎn)種繁育必須具備的條件

10.2.1必須用原種苗進行繁育。

10.2.2所用田塊應為無病留種田，無莖線蟲病、根腐病、黑斑病等。

10.2.3在整個繁育過程中，每隔15d定期噴灑防蚜蟲藥劑，以防止蚜蟲傳毒，保證生產(chǎn)種

質(zhì)量。

10.3技術工藝流程

種薯竹拱棚加溫育苗——隔離條件——土地選擇——土壤消毒——生物有機肥加復合

肥（基肥）——單行起壟移栽——密度6000/667m2——夏薯栽培——滅蚜——提蔓——噴

施矮壯素——適時采收——分級包裝——入窖——提供農(nóng)戶大田用種薯。

10.4技術及經(jīng)濟指標

種薯純度≥96%種薯大小100-500g，667m2種薯產(chǎn)量1500—2000kg、無病率≥96%

10.5育苗方法及時間

在選擇確定的隔離區(qū)內(nèi)、采用大田竹拱棚保溫、增溫劑苗床育苗法，每50kg原種薯可

出苗6000——8000株種苗。種薯于3月中旬-下旬播種育苗。

10.6移栽時間和收獲時間

參照脫毒紅薯原種繁殖。

11脫毒紅薯不同級別脫毒苗的病毒檢測方法

11.1紅薯病毒病的癥狀

紅薯病毒病主要包括：

（1）葉斑型。主要有紫色羽狀斑、紫斑、紫環(huán)斑、黃色斑或者枯斑

（2）花葉型。苗期感病后，初期葉脈呈網(wǎng)狀透明。后沿葉脈出現(xiàn)不規(guī)則黃綠相間的花葉

斑紋。

（3）卷葉型。葉片邊緣上卷，嚴重者可形成杯狀。

（4）葉片皺

縮型。病苗葉片較小，皺縮，葉緣不整齊，甚至扭曲畸形。

（5）葉片黃化型。包括葉片黃化型及網(wǎng)狀黃脈。薯塊上的癥狀主要是產(chǎn)生黑褐色龜裂紋。

11.2紅薯不同級別脫毒苗的檢測方法

由于紅薯脫毒苗在繁育過程中極易受到病毒的再侵染，因此，在繁種過程中，除根據(jù)

不同級別種薯的繁種要求采取防治蚜蟲等必要措施外，還應加強病毒的檢測，，及時淘汰

感病種薯以保證脫毒種薯的質(zhì)量。根據(jù)不同級別種薯對病毒感染率的要求，可采取不同的

病毒檢測方法。

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11.2.1莖尖苗的檢測

莖尖苗的檢測可首先采取目測法。由于脫毒莖尖苗和帶毒莖尖苗在形態(tài)、長勢上有明顯

差異，前者生長快、葉片平展、植株較健壯；后者長勢弱，葉片上常出現(xiàn)花葉、明脈和褪綠

斑等癥狀，因此，可先用目測法淘汰弱苗和顯癥苗。然后再用血清學方法或分子生物學方法

進行篩選，經(jīng)血清學或分子生物學方法檢測呈陰性的樣品再進行嫁接。每個莖尖苗一般嫁接

3-5株，有1株發(fā)病即認為該樣帶毒，對于都不發(fā)病的樣品應再重復嫁接1次。

11.2.2原原種田的檢測

脫毒原原種的繁殖一般在防蟲網(wǎng)室內(nèi)進行，原原種田病毒的檢測方法是：首先在原原

種田種植若干株巴西牽牛植物，定期觀察巴西牽牛是否顯癥、以判斷是否有蚜蟲傳毒；對

原原種田還要進行定期普查，及時淘汰顯癥株和變異株；另外對原原種田要定期取樣，用

血清學方法或嫁接指標植物的方法進行檢測，以判斷原原種田病毒的感染情況，對于病毒

感染率超標的繁種田要降級使用。

11.2.3原種田的檢測

脫毒原種的繁殖要在有一定隔離區(qū)的地方進行，即周圍500米內(nèi)不能種植非脫毒薯。

原種田的病毒檢測以目測法和田間種植巴西牽牛為主，必要時田間取樣用血清學方法檢測

病毒的感染率。

11.2.4生產(chǎn)種田的檢測

生產(chǎn)種田的病毒檢測以目測法為主，就是要定期對生產(chǎn)種田的發(fā)病率進行調(diào)查，必要

時也可抽樣用血清學方法檢測，當發(fā)病率超過一定標準時就不能再作為種薯使用。

11.3脫毒紅薯病毒檢測操作方法

11.3.1目測法

根據(jù)紅薯葉片和薯塊上出現(xiàn)的典型癥狀（見本標準9.1）來判斷紅薯是否感染病毒。但

病毒病的癥狀可因病毒種類、紅薯品種以及環(huán)境條件等因素的影響而改變，因此根據(jù)目測法

只能作為初步判斷。進行目測法還要注意區(qū)分紅薯品種特性以及由于土壤水分過大，營養(yǎng)失

調(diào)等原因造成的生理病害與紅薯病毒病癥狀之間的區(qū)別。

11.3.2指標植物法

常用巴西牽牛（Ipomoeasetosa）作指示植物，幾乎所有侵染紅薯的病毒都能感染巴西

牽牛，因此，將薯苗嫁接在巴西牽牛上，從巴西牽年的顯癥情況可判斷薯苗是否帶毒。具體

嫁接方法如下：以薯苗芽尖作接穗，將芽尖削成楔型，另將具3-4片真葉的巴西牽牛作砧木，

在其莖葉部切一斜口把楔形接穗插入，用封口膜扎住，置防蟲網(wǎng)室內(nèi)遮陰保濕3-4d，然后

在自然光照下觀察記載牽牛的顯癥情況，一般嫁接后25-30d左右開始出現(xiàn)癥狀，顯癥初期

新生葉出現(xiàn)系統(tǒng)性明脈，以后發(fā)展為花葉或皺縮等癥狀。

11.3.3紅薯病毒的血清學檢測

常用的血清學檢測方法為酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）或在此基礎上改變的斑點酶聯(lián)免

疫吸附法（Dot-BlotELISA）等。Dot-BlotELISA具有快速和可檢測大量樣品的特點，在

大量檢測樣品時經(jīng)常應用。具體檢測方法如下：

（1）樣品處理：取直徑約為1cm的樣品葉片（約0.1g），加入1ml抽提緩沖液，迅速

研磨，置小離心管中，取上清液供檢測用。

（2）點樣：將NC膜在TBS（20mMTris-HCL,pH7.5，150mMNaCl,）中充分濕潤，然

后放在一張干燥濾紙上，讓其稍干燥，用鉛管作好記號，用微量取樣器進行點樣，點樣后讓

NC膜自然干燥。

（3）反應：

（a）封閉：將點樣后的NC膜轉(zhuǎn)入封閉液（TBST+5%脫脂奶粉）中封閉1小時或4℃封

閉過夜。

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（b）第一抗體反應：封閉后的NC膜用TBST（20mMTris-HCL,pH7.5，150mMNaCl,

0.05%Tween-20）漂先2-3次，每次5-10分鐘，加入用TBST稀釋的病毒?；寡澹?：

2000）37℃保溫1h，再用TBST洗膜3次，每次5-10min。

（c）第二抗體反應：加入TBST稀釋的堿性磷酸脂酶標記的羊抗兔IgG（1：5000），37℃

保溫1h，TBST洗膜3次，每次5-10min。

（d）顯色：避光條件下，將NC膜置于含330ug/mlNBT和165ug/mlBCIP的堿性磷酸

脂酶緩沖液（100mMTris-HCL,pH9.5，100mMNaCl,5mMMgCl2）中顯色至樣點清晰，將膜

放入蒸餾水中漂洗，終止顯色反應。取出晾干，拍照。

11.3.4分子生物學方法檢測

隨著分子病毒學的發(fā)展，一些紅薯病毒（例如SPFMV、SPLV等）的核苷酸序列已經(jīng)清楚，

根據(jù)已知的核酸序列，設計特異引物，利用RT-PCR可快速檢測紅薯病毒和病毒的不同株系。

也可利用核酸探針，通過核酸雜交的方法檢測病毒的存在。

12脫毒紅薯不同級別脫毒苗的質(zhì)量標準

根據(jù)不同級別脫毒苗對病毒感染率的不同要求，初步制定以下判斷標準，病毒感染率超

過一定標準的應降級使用。

紅薯脫毒苗病毒檢測方法及標準（試行）

種苗級別檢測方法取樣方法檢樣數(shù)量重復次數(shù)判斷依據(jù)檢測標準備注

a.血清學檢測陰性

a.血清法

試管苗試管苗3株/株系2b.嫁接所有重復均顯癥率為0

b.指示植物法

不顯癥

a.目測法目測普查目測顯癥率為0；血目測顯癥率大

5點樣嫁接不顯癥或血

原原種苗b.血清法100株/畝2清及指標植陽性率于0.1%者可降

方取樣清反應陰性

c.指示植物法50株/畝小于0.1%級為原種使用

a.目測法多點普查目測顯癥率小于顯癥率大于1%

5點樣方取嫁接不顯癥或血

原種苗b.血清法100株/畝20.1%；血清及指示植者可降級為生

樣清反應陰性

c.指示植物法50株/畝物陽性率小于1%產(chǎn)種使用

a.目測法隨機多

生產(chǎn)種苗100株/點3-5依癥狀判斷目測顯癥率小于1%

b.血清法點取樣

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附錄A

(規(guī)范性附錄)

斑點酶聯(lián)免疫檢測法(DOT-ISA)

A1試劑

所用化學試劑為分析純級規(guī)格,用水為蒸餾水。

A1.1三羥甲基氨基甲烷（TBS）（pH7.5）

TrisBase4.84g

氯化鈉（NaCl）58.44g

疊氮鈉（NaN3）0.40g

溶于1.990mL蒸餾水中，用鹽酸（37%）調(diào)pH至7.5，定容至2000mL。

A1.2洗滌緩沖液（T-TBS）

1.0mL吐溫-20（Tween-20）i溶于2000mLTBS中。

A1.3抽提緩沖液

亞硫酸納（Na2SO3）0.2g溶于TBS中，定溶至100mL。

A1.4封閉緩沖液（現(xiàn)用現(xiàn)配）

脫脂奶粉0.50g

粹通X-100(TritonX-100)0.5LmL

TBS25mL

先將脫脂奶粉溶于少量TBS中，再用TBS定容至25mL中。加入TritonX-100混合均勻。

A1.5抗體稀釋緩沖液

脫脂奶粉1.00g

TBS50mL

先將脫脂奶粉溶于少量TBS中，再用TBS定容至50mL。

A1.6底物緩沖液（pH9.5）

TrisBase6.05g

氯化鈉(NaCI)2.92g

氯化鎂(MgCI2.6H2O)0.51g

疊氮鈉(NaN3)0.05g

溶于450mL蒸餾水中，用濃鹽酸調(diào)pH至9.5，定溶至500ML。

A1.7硝基藍四唑鹽（NBT）和5-溴-4氯-3-吲哚磷酸脂（BCIP）儲備液

NBT儲備液：

NBT0.04g

70%N,N-二甲基甲酰胺1.2mL

混合均勻，4℃避光保存。

BCIP儲備液：

BCIP：0.02g

70%N,N-二甲基甲酰胺1.2mL

混合均勻，4℃避光保存。

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A1.8底物溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）

底物緩沖液25mL

NBT儲備液75μL

BCIP儲備液75μL

先將NBT儲備液溶于25ml底物緩沖液中，再逐滴加入BCIP儲備液，邊加邊振搖混勻。

A.2樣品制備

將待測葉片用清水清洗干凈，從每一樣品葉上各取一直徑約1cm圓片，放入樣品袋中，

加入3mL抽提緩沖液充分研磨，4℃靜置30min~40min，取澄清汁液點樣。樣品為塊根時，

催芽處理后取幼芽、葉制樣。

A.3操作步驟

A3.1點樣

將打好方格的硝化纖維素膜用TBS緩沖液處理后放在潔凈的濾紙上，每個樣品各吸取

17μL上清液滴在膜上方格的正中，干燥15min~30min。同時設陽性、陰性和空白對照，可

根據(jù)需要設置重復。

A3.2封閉

將干燥后的膜浸泡在封閉緩沖液中，室溫下?lián)u床振蕩（50r/min）1h。

A3.3孵育第一抗體

將膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的抗血清中，室溫下?lián)u床振蕩（50r/min）過夜。

A3.4洗滌

用洗滌緩沖液洗膜3次，每次搖床振蕩（100r/min）3min。

A3.5孵育第二抗體

將膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作深度的酶標抗體中，室溫下?lián)u床振蕩（50r/min）1h。

A3.6洗滌

洗滌4次，方法同A3.4。

A3.7顯色

將膜置于NBT/BCIP底物溶液中，室溫下?lián)u床振蕩（50r/min）孵育30min。

A3.8終止反應

棄去底物溶液并用蒸餾水洗膜3次，每次搖床振蕩（100r/min）3min。

A3.9陽性判斷

晾干后觀察顏色反應，出現(xiàn)藍紫色顏色反應的樣品為陽性。

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附錄B

（規(guī)范性附錄）

指示植物檢測法

B1材料準備

B1.1將待檢脫毒苗或種苗盆栽于防蟲措施良好的溫室中。

B1.2盆播批示植物——巴西牽牛（Ipomoeasetosa），花盆直徑不小于10cm，每待檢樣品

及陽性對照各需生長健壯巴西牽牛5株。

B2嫁接

B2.1巴西牽牛生長出1~2片真葉時嫁接，以待檢樣品莖蔓為接穗，巴西牽牛為砧木。將待

檢樣品莖蔓中下部莖段切成3段~5段，每個接穗帶一個單芽及葉片，去葉后將底端削成楔

形，插入巴西牽牛砧木切口內(nèi)，封口膜扎緊。嫁接后白天保持氣溫26℃~32℃，相對濕度

80%~90%，適當遮蔭，嫁接成活后，給予充足光照。

B2.2陽性判斷

嫁接后2~3周顯癥，在所有嫁接指示植物中只要有一株表現(xiàn)典型癥狀即為陽性，癥狀

為：

SPEMV羽狀斑駁

SPLV葉脈變黃

SPCF葉片褪綠斑

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附錄C

（規(guī)范性附錄）

表C.1甘薯種薯（苗）田間帶病植株癥狀

病害名稱植株塊根

輕病薯塊乳汁明顯減少，有苦臭味，煮后不

從育苗到結(jié)薯均能發(fā)病。晴天中午，病苗

爛，外表癥狀常不明顯，僅薯蒂附近呈黑褐色或

頂部葉片萎垂，莖基呈現(xiàn)黑褐色水爛狀，維管

細菌性尾根呈不同程度病變，剖開橫切面為分散的褐色

束從下而上黃褐色條紋狀，嚴重時，莖內(nèi)全部

萎蔫病小斑點或黃褐色至深褐色斑塊，縱切面從藤頭或

腐爛，僅殘留纖維。成株發(fā)病，葉色暗淡，無

（甘薯瘟）自尾根始，維管束呈黃褐色條紋狀，可擠出乳狀

光澤，蔓出現(xiàn)水漬狀斑點，呈黑褐色，剖視維

菌膿。重癥薯塊，整塊呈黑褐色腐爛或一端腐爛，

管束，褐色條紋用手拉易脫皮，留下纖維。

有膿液狀或淡黃色菌液，臭味很甚

薯塊上形成黑色近圓形斑，病部稍凹陷，輪

廓清晰，組織堅實，如用刀橫割病斑部，可見薯

莖基部形成黑褐色梭形或橢圓形病斑，稍

皮下的薯肉呈青褐色或黑褐色，深

甘薯黑斑病凹陷，病斑初期有灰色霉層，后變成黑色粉狀

0.5cm-2cm,有苦味和強烈的臭味。病部木栓

物，病斑逐漸擴大，重者基部全部變黑，枯死。

化，堅硬，干腐，在適當條件下，病斑中央會長

出黑色剌毛狀物——子囊殼

葉片卷皺呈木耳形；嫩芽僵縮；莖蔓和葉

柄生出無數(shù)凸凹粗糙的病斑，病蔓先端硬化僵

直不再伏地蜿蜒；頂芽受害病斑初為透明深紅

甘薯瘡痂病不表現(xiàn)癥狀

色，擴大后逐漸變黑褐色而枯死；新梢和幼葉

不能長大，整個頂梢收縮僵硬而直立，表現(xiàn)粗

糙成麻臉狀。

幼苗、葉脈間葉肉變黃，莖內(nèi)維管束變褐

色。潮濕時，病部產(chǎn)生白色至淡紅色的霉層。

維管束變褐，橫切薯塊蒂部，可見褐色圓環(huán)形斑

輕者分枝增生和節(jié)間縮短，莖基膨大，出現(xiàn)青

甘薯蔓割病點，嚴重時，上部莖蔓枯死，而薯塊并不腐爛，

暈，表皮似裂呈絲狀。罹病植株發(fā)生全株性枯

且在土表抽出很多幼蔓

萎、死亡，地上部葉片自下而上變黃脫落，莖

最后開裂

根系腐爛，多從不定根的尖端或中部開始

變黑，逐漸向上蔓延至根莖部位1-2個葉節(jié)，

形成黑褐色病斑。病斑表皮縱裂，重病株地下

一般不結(jié)薯，輕病株結(jié)薯畸形，呈大腸狀或葫蘆

根莖大部分變黑，地上部莖蔓縮短，分枝少或

根腐病狀，表皮松軟，表面小病斑，用手一拉就下來，

無分枝，形成獨桿苗，葉片發(fā)黃、反卷、葉變

未向薯肉深入

小，組織硬化，并且發(fā)脆，葉片自下而上干枯

脫落、植株大量現(xiàn)蕾開花，常造成大片死苗，

重者全部死亡

根系形成繩結(jié)狀，使地下部多牛蒡狀，毛根縱龜裂型：塊根畸形，褐色縱裂口

根結(jié)線蟲病生，細根上有米粒大小的根結(jié)，有的成串，剝棒根型：粗1cm~2cm，棒狀塊根

開根結(jié)，可見一至數(shù)個雌蟲線根型：只有線狀牛蒡根，不膨大成薯塊

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表C.1（續(xù)）

病害名稱植株塊根

糠心型：薯苗、種薯帶病，先塊根縱剖面內(nèi)部

苗期：發(fā)病重的出苗稀、矮小、發(fā)黃、剖視莖

呈稀絮狀白色糠道，后期由于伴隨其他雜菌形

基部，內(nèi)有褐色空隙，剪斷后不流或很少流白

成褐色相間的褐色糠道。有時內(nèi)部雖毀壞，但

漿。后期侵入部位表皮裂成小口，髓部呈褐色

外表接近健者

莖線蟲病干腐狀，剪斷后無白漿。

裂皮型；輕病肉眼不易看出，開始外皮褪色，

莖蔓癥狀：主蔓基部髓部先白色干腐，后漸變

不久變青，有的稍凹陷，有的有小裂口，皮下

褐色，嚴重時基部蔓短、葉黃甚至主蔓枯死。

組織變褐，最后皮色呈暗紫色，并多龜裂，內(nèi)

根部癥狀；根部表皮壞裂

呈褐白相間的干腐。

開始時僅薯塊變軟，水漬狀，發(fā)黏，以后薯

塊表現(xiàn)長出茂盛的菌絲和孢子囊，用手指一

軟腐病觸，即流出草黃色汁液，具芳香酒味，如被次

生寄生物入侵則變成霉酸或臭味，以后干縮成

硬塊。病菌侵入時由一點或多點橫向發(fā)展

薯塊上先產(chǎn)生黑褐色凹陷小斑點，后擴展成

鐮刀菌

圓形凹陷斑，表面有粉紅色或白色霉狀物，最

干腐病

后薯塊干腐成褐色僵塊

甘薯外露的塊根和莖葉被啃食，常使植株變黃，塊根變褐、黑褐色，木質(zhì)化，鉆成傷口和孔

蟻象重者死亡，造成田間缺苗道，伴有臭味

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附錄D

（規(guī)范性附錄）

塊根質(zhì)量檢測方法

D1雜質(zhì)

D1.1挑選出無種用價值的塊根，以及其他有機、無機物質(zhì)，去掉塊根上的泥土，并用毛刷

刷去塊根上的浮土，對這些雜質(zhì)進行稱重（mo）。

D1.2稱重所有的塊根（m1）。

D1.3

式中：n1為雜質(zhì)。

D2薯塊整齊度

D2.1稱重100g~500g塊根（m2）。

D2.2

式中：n2為薯塊整齊度。

D3有缺陷薯

D3.1目測塊根，挑選出有機械損傷、蟲鼠傷、畸形薯塊稱重（m3）。

D3.2

式中：n3為有缺陷薯。

D4軟腐病

D4.1根據(jù)附錄C中軟腐病癥狀對塊根進行判斷，挑選出軟腐病薯稱重（m4）。

D4.2

式中：n4為軟腐病。

D5鐮刀菌干腐病和腐爛

D5.1根據(jù)附錄C中鐮刀菌干腐病癥對塊根進行判斷，挑選出鐮刀菌干腐病薯稱重（m5）。

D5.2挑選出除因軟腐病、根腐病和鐮刀菌干腐造成的腐爛外，其他原因造成的腐爛薯稱重

（m6）。

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D5.3

式中：n5為鐮刀菌干腐病和腐爛。

D6莖線蟲病

D6.1根據(jù)附錄C中莖線蟲病癥狀對塊根進行判斷，挑選出莖線蟲病病薯稱重（m7）。

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附錄E

（資料性附錄）

甘薯瘟病室內(nèi)檢驗方法

E1細菌溢檢驗法

在檢驗可疑病苗時，選發(fā)病未腐爛的部位，將表皮剝開，用刀片縱切一小塊（大約長

5mm、寬3mm、厚1mm）黃褐色維管束組織放在載玻片上，滴一滴清水，如果1min后有乳白

色的細菌溢在切口處出現(xiàn)，十幾分鐘后病組織四周布滿細菌液（肉眼或放大鏡可看到）就證

明有薯瘟病細菌。

在檢驗可疑薯塊時，選發(fā)病未腐爛的部位，取一小塊變色的維管束組織，制成玻片，

在顯微鏡下檢查，若有細菌液出現(xiàn)，即為薯瘟病菌。

E2番茄苗接種測定法

選感病品種的番茄（如沈陽番茄）為接種材料，先把番茄種在小缽中，每缽4株，等

長出2~3片真葉時備用?？梢刹≈臧瓷鲜龇椒ㄖ瞥?/p>