醫(yī)療藥品管理鈉鈣交換體基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及藥物篩選細(xì)胞模型的建立材料與方法實(shí)驗(yàn)材料1.細(xì)胞系：選用人胚胎腎293細(xì)胞（HEK293），因其易于培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染效率高且生長(zhǎng)迅速，適合用于基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.質(zhì)粒載體：含有鈉鈣交換體（NCX）基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-NCX，該質(zhì)粒帶有綠色熒光蛋白（EGFP）標(biāo)簽，便于后續(xù)觀察轉(zhuǎn)染效果。同時(shí)準(zhǔn)備對(duì)照質(zhì)粒pEGFP-N1。3.試劑：Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑、G418抗生素、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、EDTA、PBS緩沖液、細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、抗-NCX抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗、ECL發(fā)光液等。4.儀器設(shè)備：CO?培養(yǎng)箱、倒置熒光顯微鏡、離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀等。實(shí)驗(yàn)方法1.細(xì)胞培養(yǎng)與傳代-將凍存的HEK293細(xì)胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中解凍。-解凍后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含10ml完全培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心5min，棄上清。-加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。-當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。棄去舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞兩次，加入1ml0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，37℃孵育1-2min，待細(xì)胞變圓、脫壁后，加入2ml完全培養(yǎng)基終止消化。-將細(xì)胞吹打均勻，按1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。2.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染-轉(zhuǎn)染前一天，將HEK293細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種2×10?個(gè)細(xì)胞，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)融合度達(dá)到70%-80%。-按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。分別取2μgpEGFP-NCX質(zhì)粒和5μlP3000試劑加入125μlOpti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5min。另取5μlLipofectamine3000試劑加入125μlOpti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5min。-將上述兩種溶液混合，輕輕混勻，室溫孵育20min，形成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物。-棄去6孔板中的舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞一次，每孔加入800μlOpti-MEM培養(yǎng)基。然后將脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物逐滴加入孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。-轉(zhuǎn)染6h后，棄去含轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，加入2ml完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選-轉(zhuǎn)染48h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)情況，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。-更換含有不同濃度G418的完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。首先進(jìn)行G418致死濃度的測(cè)定，將HEK293細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，分別加入不同濃度（0、200、400、600、800、1000μg/ml）的G418培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)10-14天，觀察細(xì)胞死亡情況，確定能在10-14天內(nèi)殺死所有未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的最低G418濃度為篩選濃度。-確定篩選濃度后，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞用胰蛋白酶消化，按1:10的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入含篩選濃度G418的完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。每3-4天更換一次篩選培養(yǎng)基，直至未轉(zhuǎn)染細(xì)胞全部死亡，出現(xiàn)抗性克隆。-用克隆環(huán)將抗性克隆挑出，接種到24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量。4.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的鑒定-熒光顯微鏡觀察：將篩選得到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)情況，確認(rèn)細(xì)胞中EGFP-NCX融合蛋白的表達(dá)。-RT-PCR檢測(cè)：提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。NCX基因的引物序列為：上游引物5’-ATGCCAGCCCTGCTGCTG-3’，下游引物5’-CTAGTTGCTGCTGCTGCTG-3’。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。-Westernblot檢測(cè)：收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉膜1h，加入抗-NCX抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。TBST洗膜3次，每次10min，加入ECL發(fā)光液，暗室中曝光顯影。5.藥物篩選模型的建立與驗(yàn)證-藥物處理：將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NCX基因的細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓處理12h。然后加入不同濃度的候選藥物，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組（不加藥物）和陽(yáng)性對(duì)照組（已知的NCX抑制劑）。繼續(xù)培養(yǎng)24h或48h。-細(xì)胞活力檢測(cè)：采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。每孔加入10μlCCK-8試劑，37℃孵育1-4h，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值/陰性對(duì)照組吸光度值）×100%。-鈣流檢測(cè)：將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24h后，用含鈣熒光探針Fluo-4AM負(fù)載細(xì)胞。加入不同濃度的候選藥物，用激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，記錄熒光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)變化曲線。-數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果轉(zhuǎn)染48h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染pEGFP-NCX質(zhì)粒的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，表明EGFP-NCX融合蛋白在細(xì)胞中成功表達(dá)。轉(zhuǎn)染效率約為30%-40%。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選與鑒定1.G418致死濃度測(cè)定：經(jīng)過(guò)10-14天的培養(yǎng)，確定G418的篩選濃度為600μg/ml。2.熒光顯微鏡觀察：篩選得到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡下可見(jiàn)均勻的綠色熒光表達(dá)，表明EGFP-NCX融合蛋白在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。3.RT-PCR檢測(cè)：從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中擴(kuò)增出NCX基因的特異性條帶，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中未檢測(cè)到該條帶，說(shuō)明NCX基因已成功整合到細(xì)胞基因組中并轉(zhuǎn)錄。4.Westernblot檢測(cè)：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中檢測(cè)到NCX蛋白的表達(dá)，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中未檢測(cè)到，進(jìn)一步證實(shí)了NCX蛋白在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)。藥物篩選模型的驗(yàn)證1.細(xì)胞活力檢測(cè)：不同濃度的候選藥物處理穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞活力發(fā)生不同程度的變化。陽(yáng)性對(duì)照組（已知的NCX抑制劑）細(xì)胞活力明顯降低，表明該模型對(duì)NCX抑制劑有響應(yīng)。2.鈣流檢測(cè)：加入候選藥物后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯降低，說(shuō)明該模型能夠檢測(cè)到NCX功能的變化。討論本研究成功建立了鈉鈣交換體基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及藥物篩選細(xì)胞模型。通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法將NCX基因?qū)際EK293細(xì)胞，并利用G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。經(jīng)過(guò)熒光顯微鏡觀察、RT-PCR和Westernblot檢測(cè)，證實(shí)了NCX基因在細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)。藥物篩選模型的驗(yàn)證結(jié)果表明，該模型能夠檢測(cè)候選藥物對(duì)細(xì)胞活力和鈣流的影響，可用于篩選作用于鈉鈣交換體的藥物。該模型具有以下優(yōu)點(diǎn)：一是細(xì)胞來(lái)源方便，HEK293細(xì)胞易于培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染；二是通過(guò)EGFP標(biāo)簽便于觀察轉(zhuǎn)染效果和細(xì)胞定位；三是結(jié)合細(xì)胞活力檢測(cè)和鈣流檢測(cè)，能夠從多個(gè)角度評(píng)估藥物對(duì)NCX的作用。然而，本研究也存在一定的局限性。例如，細(xì)胞模型與體內(nèi)生理環(huán)境存在一定差異，篩選得到的藥物在體內(nèi)的效果可能與細(xì)胞模型有所不同。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步優(yōu)化模型，如聯(lián)合使用多種細(xì)胞系或進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以提高藥物篩選的準(zhǔn)確性和可靠性。結(jié)論本研究成功建立了鈉鈣交換體基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及藥物篩選細(xì)胞模型，該模型可用于篩選作用于鈉鈣交換體的藥物，為相關(guān)藥物的研發(fā)提供了有效的工具。后續(xù)研究可在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步完善模型，推動(dòng)鈉鈣交換體相關(guān)藥物的研發(fā)進(jìn)程。相關(guān)試題1.本實(shí)驗(yàn)選用HEK293細(xì)胞的原因不包括以下哪項(xiàng)？A.易于培養(yǎng)B.轉(zhuǎn)染效率高C.具有天然的鈉鈣交換體高表達(dá)D.生長(zhǎng)迅速答案：C分析：HEK293細(xì)胞易于培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染效率高且生長(zhǎng)迅速，這是選用它的原因，而它本身并非天然高表達(dá)鈉鈣交換體，需要通過(guò)轉(zhuǎn)染導(dǎo)入相關(guān)基因，所以選C。2.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)，P3000試劑的作用是什么？A.促進(jìn)質(zhì)粒與脂質(zhì)體結(jié)合B.提高轉(zhuǎn)染效率C.保護(hù)質(zhì)粒不被降解D.以上都是答案：D分析：P3000試劑可以促進(jìn)質(zhì)粒與脂質(zhì)體結(jié)合，提高轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)在一定程度上保護(hù)質(zhì)粒不被降解，所以選D。3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選時(shí)，G418致死濃度測(cè)定的目的是？A.確定能殺死所有細(xì)胞的濃度B.確定能在最短時(shí)間內(nèi)殺死細(xì)胞的濃度C.確定能在10-14天內(nèi)殺死所有未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的最低濃度D.確定能殺死一半細(xì)胞的濃度答案：C分析：進(jìn)行G418致死濃度測(cè)定是為了找到能在10-14天內(nèi)殺死所有未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的最低G418濃度作為篩選濃度，所以選C。4.以下哪種方法不能用于鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中NCX基因的表達(dá)？A.熒光顯微鏡觀察B.流式細(xì)胞術(shù)C.RT-PCRD.Westernblot答案：B分析：熒光顯微鏡可觀察EGFP-NCX融合蛋白的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄情況，Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，而流式細(xì)胞術(shù)在本題中未用于鑒定NCX基因表達(dá)，所以選B。5.藥物篩選模型中，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力的原理是？A.檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的酶活性B.檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)含量C.檢測(cè)細(xì)胞的代謝活性D.檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況答案：C分析：CCK-8法是通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的代謝活性來(lái)反映細(xì)胞活力的，所以選C。6.實(shí)驗(yàn)中使用的Opti-MEM培養(yǎng)基的作用是？A.提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)B.降低血清對(duì)轉(zhuǎn)染的影響C.促進(jìn)細(xì)胞貼壁D.調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓答案：B分析：Opti-MEM培養(yǎng)基血清含量低，可降低血清對(duì)轉(zhuǎn)染的影響，更適合轉(zhuǎn)染操作，所以選B。7.轉(zhuǎn)染6h后更換培養(yǎng)基的原因是？A.去除未進(jìn)入細(xì)胞的質(zhì)粒B.去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物，減少對(duì)細(xì)胞的毒性C.提供更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)D.調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值答案：B分析：轉(zhuǎn)染6h后更換培養(yǎng)基是為了去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物，減少其對(duì)細(xì)胞的毒性，利于細(xì)胞后續(xù)生長(zhǎng)，所以選B。8.以下哪種試劑用于提取細(xì)胞總RNA？A.細(xì)胞裂解液B.TRIzol試劑C.BCA蛋白定量試劑盒D.ECL發(fā)光液答案：B分析：TRIzol試劑常用于提取細(xì)胞總RNA，細(xì)胞裂解液用于提取蛋白，BCA用于蛋白定量，ECL用于Westernblot顯影，所以選B。9.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)，一般選用的培養(yǎng)容器是？A.96孔板B.24孔板C.T25培養(yǎng)瓶D.6孔板答案：C分析：擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量時(shí)，T25培養(yǎng)瓶空間較大，適合細(xì)胞大量生長(zhǎng)，96孔板和24孔板多用于藥物篩選等小體積實(shí)驗(yàn)，6孔板常用于轉(zhuǎn)染等操作，所以選C。10.鈣流檢測(cè)中，F(xiàn)luo-4AM探針的作用是？A.標(biāo)記細(xì)胞B.檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度C.促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子流動(dòng)D.增強(qiáng)細(xì)胞的熒光信號(hào)答案：B分析：Fluo-4AM是含鈣熒光探針，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，所以選B。11.本實(shí)驗(yàn)中脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物形成的時(shí)間是？A.室溫孵育5minB.室溫孵育10minC.室溫孵育20minD.室溫孵育30min答案：C分析：按照操作步驟，脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物需室溫孵育20min形成，所以選C。12.以下哪種因素不會(huì)影響質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率？A.細(xì)胞的融合度B.質(zhì)粒的純度C.轉(zhuǎn)染試劑的用量D.培養(yǎng)箱的溫度答案：D分析：細(xì)胞融合度、質(zhì)粒純度、轉(zhuǎn)染試劑用量都會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，而培養(yǎng)箱溫度一般固定在37℃，不是影響轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵因素，所以選D。13.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選過(guò)程中，更換篩選培養(yǎng)基的時(shí)間間隔是？A.1-2天B.3-4天C.5-6天D.7-8天答案：B分析：篩選過(guò)程中每3-4天更換一次篩選培養(yǎng)基，以保證篩選效果，所以選B。14.RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，退火溫度的設(shè)定依據(jù)是？A.引物的長(zhǎng)度B.引物的GC含量C.模板的濃度D.以上都是答案：D分析：退火溫度的設(shè)定需要考慮引物的長(zhǎng)度、GC含量以及模板的濃度等因素，所以選D。15.Westernblot實(shí)驗(yàn)中，封閉的目的是？A.防止抗體非特異性結(jié)合B.增強(qiáng)抗體的結(jié)合能力C.提高膜的穩(wěn)定性D.去除膜上的雜質(zhì)答案：A分析：封閉是為了防止抗體與膜上非特異性位點(diǎn)結(jié)合，減少背景干擾，所以選A。16.藥物篩選實(shí)驗(yàn)中，陰性對(duì)照組的設(shè)置是？A.不加任何藥物B.加入已知的無(wú)效藥物C.加入低濃度的候選藥物D.加入高濃度的候選藥物答案：A分析：陰性對(duì)照組是不加任何藥物的組，用于對(duì)比觀察藥物對(duì)細(xì)胞的影響，所以選A。17.細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，胰蛋白酶-EDTA消化液的作用是？A.去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)B.使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離C.促進(jìn)細(xì)胞的分裂D.調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓答案：B分析：胰蛋白酶-EDTA消化液可以分解細(xì)胞與培養(yǎng)瓶壁之間的連接蛋白，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離，便于傳代等操作，所以選B。18.本實(shí)驗(yàn)中使用的PBS緩沖液的主要作用是？A.清洗細(xì)胞B.提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的離子C.調(diào)節(jié)細(xì)胞的pH值D.以上都是答案：D分析：PBS緩沖液可用于清洗細(xì)胞，提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的離子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的pH值，所以選D。19.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株鑒定時(shí)，熒光顯微鏡觀察主要觀察的是？A.細(xì)胞的形態(tài)B.細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光表達(dá)C.細(xì)胞的增殖情況D.細(xì)胞的凋亡情況答案：B分析：由于質(zhì)粒帶有EGFP標(biāo)簽，熒光顯微鏡主要觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光表達(dá)情況來(lái)確定轉(zhuǎn)染效果，所以選B。20.藥物篩選模型中，鈣流檢測(cè)使用的儀器是？A.酶標(biāo)儀B.流式細(xì)胞儀C.激光共聚焦顯微鏡D.PCR儀答案：C分析：激光共聚焦顯微鏡可實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的動(dòng)態(tài)變化，用于鈣流檢測(cè)，所以選C。21.轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，P3000試劑和Lipofectamine3000試劑分別與Opti-MEM培養(yǎng)基混合后，室溫孵育的時(shí)間是？A.相同，都是5minB.P3000試劑5min，Lipofectamine3000試劑10minC.P3000試劑10min，Lipofectamine3000試劑5minD.相同，都是10min答案：A分析：P3000試劑和Lipofectamine3000試劑分別與Opti-MEM培養(yǎng)基混合后，室溫孵育時(shí)間都是5min，所以選A。22.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選過(guò)程中，出現(xiàn)抗性克隆的時(shí)間一般是？A.1-2天B.3-5天C.7-10天D.10-14天答案：D分析：在加入G418篩選10-14天左右會(huì)出現(xiàn)抗性克隆，所以選D。23.RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，PCR反應(yīng)的延伸溫度一般是？A.55℃B.72℃C.95℃D.以上都不是答案：B分析：PCR反應(yīng)的延伸溫度一般是72℃，所以選B。24.Westernblot實(shí)驗(yàn)中，HRP標(biāo)記的二抗的作用是？A.識(shí)別一抗B.催化底物發(fā)光C.增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度D.以上都是答案：D分析：HRP標(biāo)記的二抗可識(shí)別一抗，催化底物發(fā)光，增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度，便于檢測(cè)，所以選D。25.藥物篩選實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞活力的計(jì)算方法是？A.（實(shí)驗(yàn)組吸光度值/陽(yáng)性對(duì)照組吸光度值）×100%B.（實(shí)驗(yàn)組吸光度值/陰性對(duì)照組吸光度值）×100%C.（陰性對(duì)照組吸光度值/實(shí)驗(yàn)組吸光度值）×100%D.（陽(yáng)性對(duì)照組吸光度值/實(shí)驗(yàn)組吸光度值）×100%答案：B分析：細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值/陰性對(duì)照組吸光度值）×100%，所以選B。26.細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，胎牛血清的作用不包括以下哪項(xiàng)？A.提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)B.促進(jìn)細(xì)胞貼壁C.抑制細(xì)胞的凋亡D.調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓答案：D分析：胎牛血清可提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、促進(jìn)細(xì)胞貼壁、抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)滲透壓不是其主要作用，所以選D。27.轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)孔后，需要進(jìn)行的操作是？A.立即搖晃培養(yǎng)板B.輕輕搖勻C.靜置培養(yǎng)D.以上都不是答案：B分析：加入脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物后需輕輕搖勻，使復(fù)合物均勻分布在細(xì)胞周?chē)?，所以選B。28.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株鑒定時(shí)，RT-PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法是？A.熒光定量PCRB.瓊脂糖凝膠電泳C.聚丙烯酰胺凝膠電泳D.以上都不是答案：B分析：RT-PCR產(chǎn)物一般用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離和檢測(cè)，所以選B。29.藥物篩選模型中，鈣流檢測(cè)時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低可能表示？A.鈉鈣交換體功能被抑制B.鈉鈣交換體功能被激活C.細(xì)胞代謝增強(qiáng)D.細(xì)胞凋亡增加答案：A分析：鈉鈣交換體功能被抑制時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子外流減少，鈣離子濃度可能降低，所以選A。30.細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基的pH值一般控制在？A.6.0-6.5B.6.5-7.0C.7.0-7.4D.7.4-7.8答案：C分析：細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基pH值一般控制在7.0-7.4之間，所以選C。31.轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，影響轉(zhuǎn)染效率的最重要因素是？A.細(xì)胞的狀態(tài)B.質(zhì)粒的大小C.轉(zhuǎn)染試劑的品牌D.培養(yǎng)箱的濕度答案：A分析：細(xì)胞的狀態(tài)，如融合度、生長(zhǎng)活力等對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響最大，所以選A。32.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選時(shí)，G418篩選的持續(xù)時(shí)間是？A.直到所有細(xì)胞死亡B.直到出現(xiàn)抗性克隆C.1-2周D.2-3周答案：B分析：G418篩選持續(xù)到出現(xiàn)抗性克隆為止，所以選B。33.RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，引物設(shè)計(jì)的原則不包括以下哪項(xiàng)？A.引物長(zhǎng)度適中B.引物的GC含量合適C.引物與模板完全互補(bǔ)D.引物的3’端可以有多個(gè)連續(xù)的G或C答案：D分析：引物的3’端應(yīng)避免有多個(gè)連續(xù)的G或C，以免出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，所以選D。34.Westernblot實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)膜的目的是？A.將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上B.增強(qiáng)蛋白的活性C.提高蛋白的穩(wěn)定性D.去除蛋白中的雜質(zhì)答案：A分析：轉(zhuǎn)膜是為了將SDS-PAGE電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，便于后續(xù)檢測(cè)，所以選A。35.藥物篩選實(shí)驗(yàn)中，陽(yáng)性對(duì)照組的作用是？A.驗(yàn)證模型的有效性B.對(duì)比不同藥物的效果C.確定藥物的最佳濃度D.以上都是答案：A分析：陽(yáng)性對(duì)照組使用已知的有效藥物，用于驗(yàn)證模型對(duì)藥物的響應(yīng)能力，即驗(yàn)證模型的有效性，所以選A。36.細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，CO?培養(yǎng)箱中CO?的作用是？A.調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值B.提供細(xì)胞呼吸所需的氣體C.促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)D.以上都是答案：A分析：CO?培養(yǎng)箱中CO?的主要作用是與培養(yǎng)基中的碳酸氫鹽緩沖體系共同調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，所以選A。37.轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物的形成與以下哪種因素?zé)o關(guān)？A.孵育時(shí)間B.孵育溫度C.試劑的用量D.細(xì)胞的數(shù)量答案：D分析：脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物的形成與孵育時(shí)間、溫度、試劑用量有關(guān)，與細(xì)胞數(shù)量無(wú)關(guān)，所以選D。38.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株鑒定時(shí)，Westernblot檢測(cè)的是？A.基因的轉(zhuǎn)錄水平B.蛋白的表達(dá)水平C.細(xì)胞的代謝水平D.細(xì)胞的增殖水平答案：B分析：Westernblot檢測(cè)的是蛋白的表達(dá)水平，所以選B。39.藥物篩選模型中，細(xì)胞活力檢測(cè)時(shí)，CCK-8試劑的孵育時(shí)間一般是？A.1-2hB.1-4hC.4-6hD.6-8h答案：B分析：CCK-8試劑孵育1-4h后進(jìn)行吸光度測(cè)定，所以選B。40.細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到多少時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)比較合適？A.50%-60%B.60%-70%C.80%-90%D.90%-100%答案：C分析：細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)比較合適，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，所以選C。41.轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，Opti-MEM培養(yǎng)基與完全培養(yǎng)基相比，其特點(diǎn)是？A.營(yíng)養(yǎng)成分更豐富B.