LncRNAH19在胃癌血管生成中的角色與調(diào)控機制探究一、引言1.1研究背景胃癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，在各類癌癥中占據(jù)著突出的地位。據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，其發(fā)病率在全球癌癥中位居第五，死亡率更是高居第四，成為導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。在中國，胃癌同樣是高發(fā)的惡性腫瘤，由于人口基數(shù)龐大，發(fā)病人數(shù)眾多，給患者家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。胃癌的早期癥狀往往不明顯，很多患者在確診時已處于中晚期，此時病情進(jìn)展迅速，治療難度顯著增加，患者的預(yù)后情況不容樂觀，5年生存率較低。因此，深入探究胃癌的發(fā)病機制，尋找有效的治療靶點和干預(yù)策略，對于提高胃癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有至關(guān)重要的意義。腫瘤血管生成在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著核心角色，對于胃癌也不例外。在腫瘤生長初期，由于缺乏新生血管提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，腫瘤細(xì)胞的增殖和存活受到極大限制，生長速度緩慢。隨著腫瘤的不斷發(fā)展，腫瘤細(xì)胞會釋放多種血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）等，這些因子能夠誘導(dǎo)腫瘤組織內(nèi)新生血管的形成。新生血管不僅為腫瘤細(xì)胞提供了必要的營養(yǎng)和氧氣，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的快速增殖和生長，還為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)和淋巴循環(huán)提供了通道，使得腫瘤細(xì)胞能夠通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)移到身體其他部位，從而引發(fā)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這是導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后不良的重要因素之一。此外，腫瘤血管的異常結(jié)構(gòu)和功能還會影響腫瘤微環(huán)境，使得腫瘤細(xì)胞更容易逃避機體的免疫監(jiān)視，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。因此，腫瘤血管生成已成為腫瘤治療領(lǐng)域的重要研究靶點，針對血管生成的治療策略，如抗血管生成藥物的研發(fā)和應(yīng)用，在胃癌治療中展現(xiàn)出了一定的療效，但仍存在諸多問題，如耐藥性、副作用等，迫切需要深入研究血管生成的調(diào)控機制，以尋找更有效的治療方法。長鏈非編碼RNA（lncRNA）作為一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA分子，近年來在腫瘤研究領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。越來越多的研究表明，lncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等多個過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。它們可以通過多種機制參與基因表達(dá)的調(diào)控，如與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用，影響染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄后加工以及mRNA的穩(wěn)定性和翻譯等過程。在胃癌中，許多l(xiāng)ncRNA的表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化，并且與胃癌的臨床病理特征和預(yù)后密切相關(guān)。例如，某些lncRNA的高表達(dá)與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)，提示其可能在胃癌的進(jìn)展中起到促進(jìn)作用；而另一些lncRNA的低表達(dá)則與患者的不良預(yù)后相關(guān)，表明其可能具有抑制腫瘤的功能。因此，深入研究lncRNA在胃癌中的作用及機制，有望為胃癌的診斷、治療和預(yù)后評估提供新的靶點和生物標(biāo)志物。LncRNAH19是一種在多種腫瘤中廣泛研究的長鏈非編碼RNA，在胃癌中也呈現(xiàn)出異常表達(dá)。已有研究報道，胃癌患者血清中l(wèi)ncRNAH19水平明顯升高，且與腫瘤浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)，高血清lncRNAH19水平組的總生存率明顯低于低血清lncRNAH19水平組，提示lncRNAH19可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。然而，目前關(guān)于lncRNAH19影響胃癌血管生成的功能及機制研究尚不完善，仍存在許多未知的領(lǐng)域有待探索。進(jìn)一步深入研究lncRNAH19在胃癌血管生成中的作用及分子機制，不僅有助于揭示胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，還可能為胃癌的抗血管生成治療提供新的靶點和理論依據(jù)，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究LncRNAH19在胃癌血管生成過程中的具體功能及分子機制。通過一系列實驗方法，包括細(xì)胞實驗、動物實驗以及分子生物學(xué)技術(shù)，明確LncRNAH19對胃癌血管生成相關(guān)因子表達(dá)的影響，以及其在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為中的作用。同時，分析LncRNAH19與胃癌患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，為胃癌的診斷、治療和預(yù)后評估提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。從理論意義上看，本研究有助于進(jìn)一步揭示胃癌血管生成的分子調(diào)控機制，豐富對lncRNA功能和作用機制的認(rèn)識。目前，雖然對腫瘤血管生成的研究取得了一定進(jìn)展，但仍有許多未知的調(diào)控因素和分子機制有待闡明。LncRNAH19作為一種在胃癌中異常表達(dá)的長鏈非編碼RNA，其在血管生成中的作用尚未完全明確。深入研究LncRNAH19影響胃癌血管生成的功能及機制，將為理解胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程提供新的視角，填補該領(lǐng)域在這方面的理論空白，有助于構(gòu)建更加完善的胃癌分子生物學(xué)理論體系，為后續(xù)相關(guān)研究奠定堅實的基礎(chǔ)。在實踐意義方面，本研究的成果具有重要的臨床應(yīng)用價值。一方面，LncRNAH19有望成為胃癌診斷和預(yù)后評估的新型生物標(biāo)志物。通過檢測胃癌患者血清或組織中LncRNAH19的表達(dá)水平，結(jié)合其他臨床指標(biāo)，能夠更準(zhǔn)確地判斷患者的病情、預(yù)測疾病的進(jìn)展和預(yù)后情況，為臨床醫(yī)生制定個性化的治療方案提供重要參考依據(jù)。另一方面，明確LncRNAH19在胃癌血管生成中的作用機制后，可以將其作為潛在的治療靶點，開發(fā)針對LncRNAH19的新型治療策略，如RNA干擾技術(shù)、反義寡核苷酸技術(shù)等，以阻斷LncRNAH19的功能，抑制胃癌血管生成，從而達(dá)到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的目的。這將為胃癌的治療提供新的思路和方法，有望提高胃癌患者的治療效果和生存率，改善患者的生活質(zhì)量，具有重要的臨床實踐意義和社會經(jīng)濟效益。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1胃癌概述2.1.1胃癌的發(fā)病現(xiàn)狀胃癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率和死亡率。根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，當(dāng)年全世界胃癌新發(fā)病例約108.9萬，在所有惡性腫瘤發(fā)病人數(shù)中位居第五；死亡病例數(shù)約76.9萬，居惡性腫瘤死亡人數(shù)的第四位。這表明胃癌在全球癌癥負(fù)擔(dān)中占據(jù)著重要地位，給患者及其家庭帶來了沉重的痛苦和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，也對社會的發(fā)展造成了一定的影響。中國是胃癌高發(fā)國家，發(fā)病和死亡人數(shù)均占全球近一半。2020年，我國胃癌新發(fā)病例約47.8萬，死亡病例約37.3萬。我國胃癌的發(fā)病和死亡人數(shù)之多，與龐大的人口基數(shù)、地域差異、生活飲食習(xí)慣以及幽門螺桿菌感染率高等多種因素密切相關(guān)。從地域分布來看，我國農(nóng)村地區(qū)的胃癌發(fā)病率高于城市，偏遠(yuǎn)地區(qū)高于沿海地區(qū)。這可能與農(nóng)村和偏遠(yuǎn)地區(qū)的居民飲食結(jié)構(gòu)相對單一，新鮮蔬菜水果攝入不足，而腌制、煙熏、霉變食物攝入較多有關(guān)，同時這些地區(qū)的衛(wèi)生條件和醫(yī)療資源相對有限，幽門螺桿菌感染的防控難度較大，也增加了胃癌的發(fā)病風(fēng)險。此外，胃癌的發(fā)病還存在明顯的性別和年齡差異。男性胃癌的發(fā)病率是女性的3倍，死亡率是女性的2.7倍，主要高發(fā)年齡段在60-69歲。男性患胃癌風(fēng)險較高，可能與男性吸煙、飲酒比例遠(yuǎn)高于女性，以及社會壓力大、飲食習(xí)慣較差等因素有關(guān)。長期吸煙會導(dǎo)致胃黏膜血管收縮，降低胃黏膜的保護(hù)作用，同時煙草中的有害物質(zhì)還可能直接損傷胃黏膜細(xì)胞，增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險；過量飲酒則會刺激胃黏膜，引起胃炎、胃潰瘍等疾病，長期反復(fù)刺激可促使胃黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生癌變。隨著年齡的增長，人體的免疫系統(tǒng)功能逐漸下降，胃黏膜的修復(fù)能力減弱，對致癌物質(zhì)的抵抗力降低，使得老年人更容易患胃癌。盡管近年來隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步，胃癌的診斷和治療水平有了一定提高，但總體而言，胃癌患者的5年生存率仍然較低。尤其是在中晚期胃癌患者中，由于腫瘤已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療難度大大增加，預(yù)后情況不容樂觀。早期胃癌患者經(jīng)過及時有效的治療，5年生存率可達(dá)90%以上，但目前我國早期胃癌的發(fā)現(xiàn)率較低，大部分患者確診時已處于中晚期，這也是導(dǎo)致我國胃癌死亡率居高不下的重要原因之一。因此，加強胃癌的早期篩查、預(yù)防和治療研究，對于降低胃癌的發(fā)病率和死亡率，提高患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。2.1.2胃癌的發(fā)病機制胃癌的發(fā)病是一個多因素、多步驟、復(fù)雜的病理過程，涉及環(huán)境因素、感染因素、遺傳因素、癌前狀態(tài)以及分子標(biāo)志物等多個方面。目前，雖然對胃癌的發(fā)病機制尚未完全明確，但大量的研究表明，多種因素相互作用，共同促進(jìn)了胃癌的發(fā)生和發(fā)展。環(huán)境和飲食因素：流行病學(xué)研究提示，環(huán)境因素在胃癌的發(fā)病中起著重要作用，其中飲食因素尤為關(guān)鍵。多吃新鮮水果和蔬菜，可降低胃癌的發(fā)生風(fēng)險，這是因為新鮮蔬果中富含維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維以及抗氧化物質(zhì)等，這些成分有助于維持胃黏膜的正常結(jié)構(gòu)和功能，增強機體的免疫力，抵抗致癌物質(zhì)的侵害。相反，經(jīng)常食用霉變的食物、咸菜、腌制、煙熏食品以及過多攝入食鹽，可增加胃癌的危險性。霉變食物中含有大量的霉菌毒素，如黃曲霉毒素，具有很強的致癌性；咸菜、腌制食品中含有較高濃度的亞硝酸鹽，在胃內(nèi)酸性環(huán)境下，亞硝酸鹽可與胺類物質(zhì)結(jié)合，形成亞硝胺類化合物，而亞硝胺是一類強致癌物質(zhì)，可誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生癌變；煙熏食品在制作過程中會產(chǎn)生多環(huán)芳烴等致癌物質(zhì)，長期食用會增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險；過多攝入食鹽會導(dǎo)致胃黏膜損傷，使胃黏膜對致癌物質(zhì)的敏感性增加，同時高鹽飲食還可能改變胃內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)幽門螺桿菌的生長和繁殖，進(jìn)一步加重胃黏膜的損傷，增加胃癌的發(fā)生風(fēng)險。感染因素：幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）感染是導(dǎo)致胃癌形成和發(fā)病的重要原因之一。Hp與胃癌有著共同的流行病學(xué)特點，在胃癌高發(fā)區(qū)人群中，Hp的感染率通常較高。研究表明，Hp抗體陽性的人群發(fā)生胃癌的危險性明顯高于陰性人群。Hp感染后，會在胃內(nèi)定植，通過產(chǎn)生多種毒力因子，如尿素酶、細(xì)胞毒素相關(guān)基因A（CagA）、空泡毒素A（VacA）等，損傷胃黏膜上皮細(xì)胞，引發(fā)慢性炎癥反應(yīng)。長期的慢性炎癥刺激可導(dǎo)致胃黏膜萎縮、腸化生和異型增生，進(jìn)而增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險。此外，Hp感染還可能通過影響胃內(nèi)微生態(tài)環(huán)境、調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)以及誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和凋亡失衡等多種機制，促進(jìn)胃癌的發(fā)生和發(fā)展。除了Hp感染外，EB病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）感染也與胃癌的發(fā)生有關(guān)。EBV是一種嗜人類B淋巴細(xì)胞的皰疹病毒，在胃癌組織中，EBV的檢出率約為10%-15%。EBV感染后，可通過其基因產(chǎn)物，如潛伏膜蛋白1（LMP1）等，激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，從而參與胃癌的發(fā)病過程。遺傳因素：部分胃癌患者存在家族病史，表明胃癌的發(fā)病與遺傳因素密切相關(guān)。家族性胃癌約占所有胃癌病例的10%，其中遺傳性彌漫型胃癌（HDGC）是一種常染色體顯性遺傳性疾病，主要由E-鈣黏蛋白（CDH1）基因突變引起。CDH1基因編碼的E-鈣黏蛋白是一種細(xì)胞黏附分子，在維持上皮細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能中起著重要作用。CDH1基因突變可導(dǎo)致E-鈣黏蛋白表達(dá)缺失或功能異常，使細(xì)胞間的黏附力下降，細(xì)胞易于發(fā)生遷移和侵襲，從而增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險。此外，還有一些其他基因的突變或多態(tài)性也與胃癌的遺傳易感性相關(guān)，如腫瘤蛋白p53（TP53）基因、乳腺癌易感基因2（BRCA2）基因等，這些基因參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡等重要生物學(xué)過程，其異常改變可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控和癌變。癌前狀態(tài)：癌前狀態(tài)包括癌前疾病和癌前病變。癌前疾病是指與胃癌相關(guān)的胃良性病變，具有一定的癌變風(fēng)險，如胃息肉、慢性萎縮性胃炎、巨大胃黏膜肥厚癥等。胃息肉是胃黏膜表面長出的突起狀乳頭狀組織，其中腺瘤性息肉的癌變率較高，尤其是直徑大于2cm的廣基腺瘤性息肉，癌變風(fēng)險顯著增加。慢性萎縮性胃炎是一種以胃黏膜固有腺體萎縮為主要特征的慢性炎癥，可伴有腸化生和異型增生。隨著病情的進(jìn)展，胃黏膜的萎縮和腸化生程度逐漸加重，胃黏膜上皮細(xì)胞的異型增生也會逐漸發(fā)展，最終可能導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。巨大胃黏膜肥厚癥又稱Menetrier病，是一種少見的胃黏膜過度增生性疾病，主要表現(xiàn)為胃黏膜皺襞粗大、肥厚，胃酸分泌減少，患者常伴有低蛋白血癥。該病的癌變率約為10%，其癌變機制可能與胃黏膜上皮細(xì)胞的過度增殖和分化異常有關(guān)。癌前病變則是指胃黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生的異型增生，是介于良性上皮與癌之間的一種過渡性病變，根據(jù)異型增生的程度可分為輕度、中度和重度。重度異型增生被認(rèn)為是胃癌的癌前病變，如不及時治療，很容易發(fā)展為胃癌。分子標(biāo)志物：在胃癌的發(fā)病過程中，多種分子標(biāo)志物參與其中，它們在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著重要作用。人表皮生長因子受體2（HER2）基因或蛋白的過表達(dá)在胃癌的發(fā)病中具有重要意義。HER2是一種跨膜酪氨酸激酶受體，其過表達(dá)可激活下游的信號通路，如PI3K-AKT-mTOR通路、RAS-RAF-MEK-ERK通路等，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、增強細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，從而推動胃癌的發(fā)展。研究表明，約15%-20%的胃癌患者存在HER2過表達(dá)，這類患者的預(yù)后通常較差。此外，抑癌基因的失活和錯配修復(fù)基因的異常也參與了胃癌的發(fā)病。抑癌基因如p53、p16等，其功能是抑制細(xì)胞的異常增殖和腫瘤的發(fā)生。當(dāng)這些抑癌基因發(fā)生突變、缺失或甲基化等異常改變時，其抑癌功能喪失，細(xì)胞增殖失去控制，容易發(fā)生癌變。錯配修復(fù)基因如MLH1、MSH2等，參與DNA復(fù)制過程中的錯配修復(fù)，保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。錯配修復(fù)基因的異常可導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI），使細(xì)胞內(nèi)的基因突變頻率增加，從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生和發(fā)展。具有MSI的胃癌患者在臨床病理特征和治療反應(yīng)上與非MSI胃癌患者存在差異，因此，檢測錯配修復(fù)基因狀態(tài)和MSI對于胃癌的診斷、治療和預(yù)后評估具有重要價值。綜上所述，胃癌的發(fā)病是多種因素相互作用的結(jié)果，這些因素通過影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及基因表達(dá)等生物學(xué)過程，導(dǎo)致胃黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生癌變。深入研究胃癌的發(fā)病機制，對于早期診斷、預(yù)防和治療胃癌具有重要的理論和實踐意義。2.2血管生成理論2.2.1血管生成的過程血管生成是一個從已存在的毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后靜脈發(fā)展形成新血管的復(fù)雜過程，在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)以及腫瘤生長等生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。這一過程涉及多個有序且相互關(guān)聯(lián)的步驟，每個步驟都受到多種細(xì)胞和分子的精細(xì)調(diào)控。血管生成的起始階段是內(nèi)皮細(xì)胞的激活。在生理刺激下，如炎癥、缺氧或組織損傷等，內(nèi)皮細(xì)胞被激活，進(jìn)入細(xì)胞周期開始分裂和增殖。正常情況下，內(nèi)皮細(xì)胞處于相對靜止的狀態(tài)，但當(dāng)受到特定信號刺激時，它們會發(fā)生一系列變化，包括基因表達(dá)的改變和細(xì)胞內(nèi)信號通路的激活。例如，缺氧環(huán)境會誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和周圍的間質(zhì)細(xì)胞釋放血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），VEGF與其在內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游的信號通路，促使內(nèi)皮細(xì)胞從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋碃顟B(tài)。內(nèi)皮細(xì)胞激活后，進(jìn)入增殖和遷移階段，形成新的血管芽。在這一過程中，內(nèi)皮細(xì)胞開始大量增殖，并沿著預(yù)先存在的血管或淋巴管向周圍組織遷移。內(nèi)皮細(xì)胞的遷移需要與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相互作用，通過整合素等黏附分子與ECM中的成分結(jié)合，在內(nèi)皮細(xì)胞表面形成黏著斑，從而為細(xì)胞遷移提供牽引力。同時，內(nèi)皮細(xì)胞還會分泌多種蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），降解ECM中的成分，為細(xì)胞遷移開辟通道。此外，趨化因子和生長因子也會引導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移方向，使它們朝著需要血管生成的部位移動。隨著血管芽的生長，管腔開始形成。當(dāng)血管芽生長到一定程度時，內(nèi)皮細(xì)胞會開始分泌細(xì)胞外基質(zhì)，形成管腔結(jié)構(gòu)。管腔的形成是一個復(fù)雜的過程，涉及內(nèi)皮細(xì)胞的極性建立、細(xì)胞間連接的形成以及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。在管腔形成過程中，內(nèi)皮細(xì)胞會排列成單層，通過緊密連接和黏著連接相互連接，形成一個封閉的管道。同時，內(nèi)皮細(xì)胞還會分泌一些物質(zhì)，如膠原蛋白、層粘連蛋白等，形成基底膜，進(jìn)一步穩(wěn)定管腔結(jié)構(gòu)。管腔的形成使得血管能夠運輸血液和營養(yǎng)物質(zhì)，為組織提供必要的支持。血管芽的成熟需要平滑肌細(xì)胞的募集和分化。平滑肌細(xì)胞從血管周圍的組織中遷移到血管芽中，并在內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)下分化為血管平滑肌細(xì)胞，形成血管的肌層。平滑肌細(xì)胞的募集和分化受到多種因素的調(diào)控，包括血小板衍生生長因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等。PDGF可以吸引平滑肌細(xì)胞向血管芽遷移，而TGF-β則可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的分化和增殖。平滑肌細(xì)胞的存在對于血管的穩(wěn)定性和功能至關(guān)重要，它們可以調(diào)節(jié)血管的收縮和舒張，維持血管內(nèi)的血壓和血流。血管的成熟還包括血管壁的加固和血管收縮、舒張功能的建立。在這一過程中，細(xì)胞外基質(zhì)的沉積不斷增加，使血管壁更加堅固。同時，血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞之間的相互作用也更加完善，形成了一個功能完整的血管系統(tǒng)。此外，各種生長因子和信號分子，如一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素-1（ET-1）等，也參與了血管收縮和舒張功能的調(diào)節(jié)。NO可以舒張血管平滑肌，增加血管的血流量，而ET-1則可以收縮血管平滑肌，減少血流量。綜上所述，血管生成是一個涉及多種細(xì)胞和分子的復(fù)雜過程，從內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖和遷移，到管腔的形成、平滑肌細(xì)胞的募集和分化，再到血管的成熟，每個步驟都緊密相連，共同構(gòu)成了新血管的形成過程。深入了解血管生成的過程，對于理解腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移機制以及開發(fā)抗血管生成治療策略具有重要意義。2.2.2血管生成的調(diào)控機制血管生成是一個受到嚴(yán)格調(diào)控的復(fù)雜過程，其調(diào)控機制涉及多種血管生成因子及其相關(guān)信號通路，這些因子和信號通路之間相互作用、相互影響，共同維持著血管生成的平衡。當(dāng)這種平衡被打破時，就可能導(dǎo)致血管生成異常，從而引發(fā)一系列疾病，如腫瘤、糖尿病視網(wǎng)膜病變等。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，血管生成異?；钴S，為腫瘤細(xì)胞提供了充足的營養(yǎng)和氧氣，促進(jìn)了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。因此，研究血管生成的調(diào)控機制對于揭示腫瘤的發(fā)病機制和開發(fā)有效的治療方法具有重要意義。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是目前已知的作用最強、特異性最高的促血管生成因子之一，在血管生成過程中起著核心調(diào)控作用。VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盤生長因子（PIGF）等多個成員，其中VEGF-A最為重要，通常所說的VEGF即指VEGF-A。VEGF通過與內(nèi)皮細(xì)胞表面的兩種酪氨酸激酶受體，即VEGFR-1（Flt-1）和VEGFR-2（KDR）高親和力結(jié)合，激活下游的信號通路，發(fā)揮其促血管生成作用。當(dāng)VEGF與VEGFR-2結(jié)合后，會引起受體的二聚化和自身磷酸化，進(jìn)而激活一系列下游信號分子，如磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號通路。PI3K/AKT信號通路主要參與細(xì)胞的增殖、存活和遷移過程，通過激活下游的雷帕霉素靶蛋白（mTOR），促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和存活；MAPK信號通路則主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和遷移，通過激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK），促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管芽的形成。此外，VEGF還可以增加微血管的通透性，使血漿蛋白外滲，形成富含纖維蛋白的基質(zhì)，為內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖提供支架，進(jìn)一步促進(jìn)血管生成。堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）也是一種重要的促血管生成因子，又稱FGF-2。bFGF可以與多種細(xì)胞表面的受體結(jié)合，包括成纖維細(xì)胞生長因子受體（FGFR）家族，通過激活下游的信號通路，如RAS-RAF-MEK-ERK和PI3K-AKT等，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，從而誘導(dǎo)血管生成。bFGF還可以上調(diào)VEGF的表達(dá)，間接增強血管生成作用。此外，bFGF還參與了胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和創(chuàng)傷愈合等生理過程中的血管生成調(diào)控。除了促血管生成因子外，體內(nèi)還存在多種血管生成抑制因子，它們與促血管生成因子相互制衡，共同維持血管生成的平衡。內(nèi)皮抑素（Endostatin）是一種內(nèi)源性的血管生成抑制因子，由膠原蛋白ⅩⅧ的C末端片段裂解產(chǎn)生。內(nèi)皮抑素可以特異性地抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而抑制血管生成。其作用機制主要包括：抑制VEGF和bFGF等促血管生成因子的生物學(xué)作用；與基質(zhì)金屬蛋白酶原及整合素ανβ3、ανβ5結(jié)合，抑制內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的遷移、黏附；調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號通路，如抑制PI3K/AKT和MAPK信號通路的激活，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和存活。血管抑制素（Angiostatin）是另一種重要的內(nèi)源性血管生成抑制因子，由纖溶酶原裂解產(chǎn)生。血管抑制素可以選擇性地抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，抑制血管生成。它主要通過與內(nèi)皮細(xì)胞表面的ATP合酶α/β亞基結(jié)合，干擾內(nèi)皮細(xì)胞的能量代謝，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。此外，血管抑制素還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號通路，如抑制ERK1/2的磷酸化，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。血管生成的調(diào)控是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，促血管生成因子和抑制因子之間的平衡至關(guān)重要。在正常生理狀態(tài)下，促血管生成因子和抑制因子處于相對平衡的狀態(tài)，血管生成維持在適度的水平。當(dāng)機體受到損傷或處于疾病狀態(tài)時，這種平衡可能被打破，導(dǎo)致血管生成異常。在腫瘤組織中，腫瘤細(xì)胞會大量分泌VEGF等促血管生成因子，同時抑制血管生成抑制因子的表達(dá)或活性，使得血管生成過度活躍，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供了有利條件。因此，深入研究血管生成的調(diào)控機制，尋找調(diào)節(jié)血管生成平衡的方法，對于腫瘤等疾病的治療具有重要的臨床意義。2.3LncRNA的基本特性與功能2.3.1LncRNA的定義與分類長鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA分子，不具備編碼蛋白質(zhì)的能力。其基本定義為超過200nt的長鏈非編碼轉(zhuǎn)錄本，部分lncRNA具有polyA結(jié)構(gòu)，而其他沒有polyA結(jié)構(gòu)的lncRNA，可以是基因間的、反義的或內(nèi)含子的，它們通常來源于“假基因”。在小鼠基因組中鑒定出超過10000個假基因，在人類基因組中鑒定出近15000個。LncRNA的表達(dá)水平相對較低，但在特定細(xì)胞類型或生理狀態(tài)下可能會出現(xiàn)特異高表達(dá)，這表明其表達(dá)具有很強的組織和細(xì)胞類型特異性，且與發(fā)育、病理等過程中基因表達(dá)的精確時空調(diào)控密切相關(guān)。根據(jù)lncRNA與蛋白質(zhì)編碼區(qū)（sequencecodingforaminoacidsinprotein，CDS）的相對位置，通常將lncRNA分為5類：正義鏈lncRNA：這類lncRNA與編碼基因的一個或多個外顯子重疊，并且轉(zhuǎn)錄方向相同。它們可能參與調(diào)控相鄰基因的表達(dá)，例如通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝，從而促進(jìn)或抑制相鄰基因的轉(zhuǎn)錄。反義鏈lncRNA：與正義鏈lncRNA相對，它與編碼基因轉(zhuǎn)錄方向相反。反義鏈lncRNA可以通過與mRNA形成互補雙鏈，影響mRNA的穩(wěn)定性、翻譯過程或可變剪切，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)。例如，某些反義鏈lncRNA可以與mRNA的特定區(qū)域結(jié)合，阻止核糖體的結(jié)合，抑制翻譯的起始；或者促進(jìn)mRNA的降解，降低其表達(dá)水平?；騼?nèi)lncRNA：由基因的內(nèi)含子產(chǎn)生，既可以是獨立轉(zhuǎn)錄的，也可以是前體mRNA（pre-mRNA）加工的副產(chǎn)物?；騼?nèi)lncRNA在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著多種作用，比如通過招募染色質(zhì)修飾復(fù)合物，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)，影響基因的轉(zhuǎn)錄活性。雙向lncRNA：與蛋白質(zhì)編碼基因共用相同的啟動子，但轉(zhuǎn)錄方向相反。雙向lncRNA的轉(zhuǎn)錄通常受到與編碼基因相同的調(diào)控元件的影響，它們可以與編碼基因相互作用，共同調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，雙向lncRNA可以通過與轉(zhuǎn)錄因子競爭結(jié)合啟動子區(qū)域，或者招募共激活因子或共抑制因子，影響編碼基因的轉(zhuǎn)錄起始?；蜷glncRNA：也稱為“l(fā)incRNA”（長間隔非編碼RNA），由位于蛋白質(zhì)編碼基因之間的序列獨立轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生?；蜷glncRNA在基因表達(dá)調(diào)控中具有重要作用，它們可以通過與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)控基因的表達(dá)。例如，一些基因間lncRNA可以作為分子支架，招募多種轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)修飾酶，形成大型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物，從而調(diào)控遠(yuǎn)距離基因的表達(dá)。盡管lncRNA整體保守性不如mRNA，但它們的核心區(qū)域和啟動子等元件還是相對保守的，這使得lncRNA在快速適應(yīng)環(huán)境的同時，能有效表達(dá)并找到自己的作用目標(biāo)。隨著研究的不斷深入，對lncRNA的分類也在不斷完善，未來可能會出現(xiàn)更加精細(xì)和細(xì)致的分類方式，以更好地理解其在細(xì)胞調(diào)控中的作用。2.3.2LncRNA的作用機制LncRNA在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，其作用機制涉及轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和表觀遺傳水平等多個層面，通過與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用，實現(xiàn)對基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控。在轉(zhuǎn)錄水平，lncRNA可以與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，影響轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合能力或轉(zhuǎn)錄活性。某些lncRNA可以作為轉(zhuǎn)錄啟動子的調(diào)控因子，直接影響基因的轉(zhuǎn)錄起始。LncRNAHOTAIR（HomeoboxtranscriptantisenseRNA）能夠與多個蛋白復(fù)合物相互作用，如與多梳抑制復(fù)合物2（PRC2）結(jié)合，將其招募到特定的基因位點，通過對組蛋白H3賴氨酸27（H3K27）的甲基化修飾，抑制基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。此外，lncRNA還可以通過與RNA聚合酶II相互作用，調(diào)控轉(zhuǎn)錄的延伸和終止過程，影響基因的表達(dá)水平。在轉(zhuǎn)錄后水平，lncRNA可以作為微RNA（miRNA）海綿進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。一個lncRNA可以含有多個miRNA結(jié)合位點，通過與miRNA特異性結(jié)合，競爭性地抑制miRNA與靶mRNA的結(jié)合，從而解除miRNA對靶mRNA的抑制作用，促進(jìn)靶mRNA的翻譯過程。例如，lncRNAMEG3可以作為miR-21的海綿，抑制miR-21的活性，從而上調(diào)miR-21的靶基因PTEN的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。此外，lncRNA還可以參與和調(diào)控mRNA的生成，與同源性較高的mRNA結(jié)合，競爭性地減少miRNA與其3'UTR的結(jié)合；或者參與pre-mRNA的剪接過程，調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性或使mRNA降解，從而調(diào)控基因表達(dá)。在表觀遺傳水平，lncRNA在細(xì)胞核中可與DNA產(chǎn)生三螺旋體或R環(huán)等復(fù)雜結(jié)構(gòu)，招募蛋白質(zhì)復(fù)合物，從而影響染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄。LncRNA-DNA三螺旋體可以通過甲基化介導(dǎo)基因沉默，未來進(jìn)一步研究可能會發(fā)現(xiàn)更多的lncRNA-DNA復(fù)合物作為分子信標(biāo)來招募蛋白質(zhì)，最終形成相互作用網(wǎng)絡(luò)。定位于細(xì)胞核內(nèi)的lncRNA也可通過影響染色質(zhì)調(diào)控蛋白或與蛋白質(zhì)相互作用參與基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制特定基因組位點或增強蛋白的功能。例如，一些lncRNA可以招募DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，使基因啟動子區(qū)域發(fā)生甲基化，從而抑制基因的表達(dá)；或者招募組蛋白乙?；富蛉ヒ阴；?，改變組蛋白的乙?；癄顟B(tài)，影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因的轉(zhuǎn)錄活性。LncRNA的作用機制復(fù)雜多樣，不同的lncRNA可能通過不同的方式參與基因表達(dá)調(diào)控，且在不同的細(xì)胞類型和生理病理狀態(tài)下，其作用機制也可能存在差異。深入研究lncRNA的作用機制，對于理解細(xì)胞的生物學(xué)過程和疾病的發(fā)生發(fā)展機制具有重要意義。2.3.3LncRNA與腫瘤的關(guān)系越來越多的研究表明，lncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤發(fā)生過程中，許多l(xiāng)ncRNA的表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，并且與腫瘤的發(fā)生風(fēng)險相關(guān)。一些lncRNA可以作為致癌基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)化。LncRNAH19在多種腫瘤中高表達(dá)，通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。研究發(fā)現(xiàn)，H19可以與miR-675結(jié)合，抑制miR-675的活性，從而上調(diào)miR-675的靶基因IGF2的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。相反，一些lncRNA則發(fā)揮抑癌基因的作用，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。LncRNAMEG3在多種腫瘤中低表達(dá)，通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的發(fā)生。在腫瘤發(fā)展過程中，lncRNA參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。LncRNAMALAT1在多種腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的分期、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。MALAT1可以通過調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。此外，MALAT1還可以與多種蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，lncRNA也發(fā)揮著重要作用。一些lncRNA可以通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和血管生成等過程，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。LncRNAUCA1在膀胱癌等多種腫瘤中高表達(dá)，通過與miR-143結(jié)合，抑制miR-143的活性，從而上調(diào)miR-143的靶基因MMP9的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，UCA1還可以通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的代謝和免疫逃逸等過程，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。在腫瘤耐藥方面，lncRNA也參與其中。一些lncRNA的表達(dá)變化與腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性相關(guān)。LncRNAPVT1在乳腺癌等多種腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性密切相關(guān)。PVT1可以通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，PVT1可以與miR-125b結(jié)合，抑制miR-125b的活性，從而上調(diào)miR-125b的靶基因ABCB1的表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的外排，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性增強。LncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等過程中發(fā)揮著重要作用，深入研究lncRNA與腫瘤的關(guān)系，對于揭示腫瘤的發(fā)病機制、開發(fā)新的診斷標(biāo)志物和治療靶點具有重要意義。三、LncRNAH19與胃癌相關(guān)性研究3.1LncRNAH19的結(jié)構(gòu)與表達(dá)特征3.1.1LncRNAH19的基因結(jié)構(gòu)LncRNAH19位于人類染色體11p15.5上，全長約2500bp，擁有復(fù)雜且獨特的基因結(jié)構(gòu)。其包含5個外顯子及4個內(nèi)含子，這種外顯子和內(nèi)含子的組合方式，使得H19在轉(zhuǎn)錄和加工過程中具備了特殊的調(diào)控能力。H19是最早被鑒定的印跡基因之一，具有父系印記特性，即選擇性地表達(dá)母源性等位基因。這種印記調(diào)控機制使得H19在不同組織和發(fā)育階段的表達(dá)具有高度特異性，主要受其上游4000bp處差異甲基化區(qū)（DMR）富含CpG島的甲基化調(diào)控。當(dāng)DMR區(qū)域發(fā)生甲基化改變時，會直接影響H19基因的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而調(diào)控其表達(dá)水平。雖然H19整體保守性不如一些編碼基因，但在進(jìn)化過程中，其核心區(qū)域和啟動子等關(guān)鍵元件仍保持相對保守。這些保守序列對于維持H19的基本生物學(xué)功能至關(guān)重要，它們可能參與了與其他分子的相互作用，在調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞增殖、分化等過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。通過對不同物種的H19基因進(jìn)行序列比對分析，發(fā)現(xiàn)這些保守區(qū)域在調(diào)控H19的表達(dá)以及與其他分子的相互作用方面具有重要意義。LncRNAH19還具有獨特的二級結(jié)構(gòu)，包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)、環(huán)狀結(jié)構(gòu)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)等。這些復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)賦予了H19多樣的生物學(xué)功能，它們可以作為分子識別的位點，與蛋白質(zhì)、DNA或其他RNA分子特異性結(jié)合，從而參與基因表達(dá)的調(diào)控。H19的二級結(jié)構(gòu)還可以影響其在細(xì)胞內(nèi)的定位和穩(wěn)定性，進(jìn)一步調(diào)節(jié)其生物學(xué)活性。通過生物信息學(xué)預(yù)測和實驗驗證，發(fā)現(xiàn)H19的二級結(jié)構(gòu)在不同細(xì)胞類型和生理病理狀態(tài)下可能會發(fā)生動態(tài)變化，這種變化與H19的功能密切相關(guān)。3.1.2LncRNAH19在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況大量研究表明，LncRNAH19在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常胃黏膜組織?？芤热说难芯窟x取了2018年1月至2021年1月接受手術(shù)治療的96例胃癌患者，通過實時定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，人胃癌組織中l(wèi)ncRNAH19mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織（P<0.05）。尤梁惠等人采用實時定量PCR檢測30例胃癌組織及其對應(yīng)癌旁組織，以及胃癌細(xì)胞株MGC-803、SGC-7901和胃黏膜上皮正常GES-1細(xì)胞中H19的表達(dá)情況，結(jié)果顯示與癌旁組織和黏膜上皮正常細(xì)胞相比較，胃癌組織和細(xì)胞株中H19的表達(dá)水平升高。這些研究結(jié)果一致表明，H19在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，暗示其在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要作用。在胃癌細(xì)胞系中，H19同樣表現(xiàn)出高表達(dá)。研究人員對多種胃癌細(xì)胞系進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)H19的表達(dá)水平明顯高于正常胃黏膜上皮細(xì)胞系。這一現(xiàn)象在不同實驗室的研究中均得到了證實，進(jìn)一步說明H19在胃癌細(xì)胞中的高表達(dá)具有普遍性。H19在胃癌細(xì)胞中的高表達(dá)可能與其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)。通過體外實驗，如細(xì)胞增殖實驗、劃痕實驗和Transwell實驗等，發(fā)現(xiàn)沉默H19的表達(dá)可以顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，而恢復(fù)H19的表達(dá)則能夠逆轉(zhuǎn)這種抑制作用。LncRNAH19的表達(dá)與胃癌患者的臨床病理參數(shù)存在密切關(guān)聯(lián)?？芤热说难芯糠治隽薼ncRNAH19表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果表明lncRNAH19mRNA表達(dá)水平與胃癌患者分化程度、浸潤深度、腫瘤TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P<0.05）。在分化程度低、浸潤深度深、TNM分期晚以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中，H19的表達(dá)水平往往更高。尤梁惠等人的研究也指出，胃癌組織中H19表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)（P<0.05）。這些研究結(jié)果表明，H19的表達(dá)水平可以作為評估胃癌患者病情進(jìn)展和預(yù)后的重要指標(biāo)，為臨床治療提供了有價值的參考依據(jù)。3.2LncRNAH19在胃癌發(fā)展進(jìn)程中的作用3.2.1促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖LncRNAH19在胃癌細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用，其作用機制涉及多個方面。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，H19通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。研究表明，H19可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)。CyclinD1是細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)上調(diào)能夠加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。H19可能通過與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相互作用，或者影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和修飾，從而增強CyclinD1基因的轉(zhuǎn)錄活性，使其表達(dá)水平升高。此外，H19還可以下調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21的表達(dá)。p21能夠抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，從而阻止細(xì)胞周期的進(jìn)展。H19降低p21的表達(dá)，解除了對CDK的抑制作用，使得細(xì)胞周期能夠順利進(jìn)行，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。H19還參與調(diào)控多條與細(xì)胞增殖相關(guān)的信號通路，其中Wnt/β-catenin信號通路是其重要的作用靶點之一。在正常情況下，β-catenin與細(xì)胞膜上的E-鈣黏蛋白結(jié)合，維持細(xì)胞間的黏附。當(dāng)Wnt信號通路激活時，β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。H19可以通過與Wnt信號通路中的關(guān)鍵分子相互作用，激活該信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，H19可以與Dishevelled（Dvl）蛋白結(jié)合，增強Dvl對β-catenin的穩(wěn)定作用，使得β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，從而激活Wnt/β-catenin信號通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。此外，H19還可以通過調(diào)節(jié)其他信號通路，如PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路等，影響細(xì)胞的增殖和存活。PI3K/AKT信號通路在細(xì)胞生長、增殖和存活中起著重要作用，H19可能通過激活該信號通路，促進(jìn)AKT的磷酸化，進(jìn)而上調(diào)下游靶基因的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。作為miRNA前體，H19可以加工生成miR-675，間接調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖。miR-675可以通過靶向抑制某些抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。研究表明，miR-675可以靶向抑制腫瘤抑制基因RUNX1的表達(dá)。RUNX1在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，其表達(dá)下調(diào)會導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控。miR-675通過與RUNX1mRNA的3'UTR區(qū)域互補配對，抑制RUNX1的翻譯過程，使其蛋白表達(dá)水平降低，從而解除了對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。此外，miR-675還可能靶向其他抑癌基因，如RB基因等，進(jìn)一步促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。RB基因是一種重要的腫瘤抑制基因，其功能失活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-675通過抑制RB基因的表達(dá)，使得細(xì)胞周期調(diào)控失衡，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。綜上所述，LncRNAH19通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因、激活細(xì)胞增殖相關(guān)信號通路以及作為miRNA前體間接調(diào)控基因表達(dá)等多種方式，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。深入研究H19促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的機制，對于揭示胃癌的發(fā)病機制和開發(fā)新的治療策略具有重要意義。3.2.2增強胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力LncRNAH19在增強胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其作用機制主要通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、細(xì)胞外基質(zhì)降解和細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白等途徑實現(xiàn)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，這一過程賦予細(xì)胞更強的遷移和侵襲能力。H19可以通過多種方式調(diào)節(jié)EMT過程，從而增強胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。研究表明，H19能夠上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如Snail、Slug和ZEB1等。這些轉(zhuǎn)錄因子可以抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達(dá)，同時上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣黏蛋白、波形蛋白（Vimentin）等的表達(dá)，促使上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。H19可能通過與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相互作用，或者影響染色質(zhì)的修飾狀態(tài)，從而增強這些EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的轉(zhuǎn)錄活性，使其表達(dá)水平升高。此外，H19還可以通過調(diào)控miRNA的表達(dá)來間接影響EMT過程。H19可以作為miR-200家族的競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA），通過與miR-200家族成員競爭性結(jié)合，解除miR-200對其靶基因ZEB1和ZEB2的抑制作用，從而促進(jìn)EMT過程，增強胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。細(xì)胞外基質(zhì)的降解對于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，而基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的關(guān)鍵酶類。H19可以通過調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)而增強胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。研究發(fā)現(xiàn)，H19能夠上調(diào)MMP2和MMP9的表達(dá)。MMP2和MMP9可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、層粘連蛋白等成分，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開辟通道。H19可能通過激活相關(guān)信號通路，如PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路等，促進(jìn)MMP2和MMP9基因的轉(zhuǎn)錄，使其表達(dá)水平升高。此外，H19還可以通過調(diào)節(jié)其他與細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)的分子，如組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）等，來影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程。TIMPs可以抑制MMPs的活性，H19可能通過降低TIMPs的表達(dá)，解除對MMPs的抑制作用，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，增強胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白在腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲過程中也起著重要作用，H19可以通過調(diào)節(jié)這些蛋白的表達(dá)和功能，增強胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。研究表明，H19能夠上調(diào)細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白，如整合素（Integrin）家族成員、趨化因子受體等的表達(dá)。整合素可以介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲；趨化因子受體則可以引導(dǎo)細(xì)胞朝著趨化因子濃度高的方向遷移。H19可能通過與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相互作用，或者影響信號通路的傳導(dǎo)，從而增強這些細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄活性，使其表達(dá)水平升高。此外，H19還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，影響胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。細(xì)胞骨架的重組對于細(xì)胞的形態(tài)改變和遷移運動至關(guān)重要，H19可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，如RhoGTPase信號通路等，影響細(xì)胞骨架蛋白的磷酸化和聚合狀態(tài)，從而促進(jìn)細(xì)胞骨架的重組，增強胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。LncRNAH19通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞外基質(zhì)降解和細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白等多種途徑，增強胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，在胃癌的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。深入研究H19增強胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的機制，對于揭示胃癌的轉(zhuǎn)移機制和開發(fā)有效的抗轉(zhuǎn)移治療策略具有重要意義。3.2.3影響胃癌細(xì)胞凋亡LncRNAH19在胃癌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，其作用機制涉及多個層面，通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因和信號通路，影響胃癌細(xì)胞的凋亡命運。在凋亡相關(guān)基因調(diào)控方面，H19可以通過多種方式影響凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的凋亡。研究表明，H19能夠下調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)。Bax是一種促凋亡蛋白，它可以在線粒體外膜上形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。H19可能通過與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相互作用，或者影響染色質(zhì)的修飾狀態(tài)，抑制Bax基因的轉(zhuǎn)錄，使其表達(dá)水平降低，從而減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。相反，H19可以上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它可以抑制Bax的活性，阻止細(xì)胞色素C的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡。H19可能通過激活相關(guān)信號通路，促進(jìn)Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄，使其表達(dá)水平升高，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的凋亡。此外，H19還可以調(diào)節(jié)其他凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，如caspase家族成員等，進(jìn)一步影響胃癌細(xì)胞的凋亡過程。caspase家族在細(xì)胞凋亡中起著核心作用，H19可能通過調(diào)節(jié)caspase的激活或抑制，影響細(xì)胞凋亡的信號傳導(dǎo)通路。H19還參與調(diào)控多條與細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號通路，其中P53信號通路是其重要的作用靶點之一。P53是一種重要的腫瘤抑制蛋白，在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控和DNA損傷修復(fù)等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷等應(yīng)激刺激時，P53蛋白被激活，通過上調(diào)促凋亡基因的表達(dá)，如Bax、PUMA等，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，H19可以通過與P53蛋白相互作用，抑制P53的活性，從而抑制胃癌細(xì)胞的凋亡。H19可能通過結(jié)合P53蛋白的特定結(jié)構(gòu)域，阻止P53與DNA的結(jié)合，使其無法發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用，進(jìn)而抑制促凋亡基因的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。此外，H19還可以通過調(diào)節(jié)其他信號通路，如PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路等，影響細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的磷酸化狀態(tài)和活性，從而調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的凋亡。PI3K/AKT信號通路可以通過抑制促凋亡蛋白Bad的活性，促進(jìn)細(xì)胞存活；MAPK信號通路則可以通過激活或抑制caspase等凋亡相關(guān)蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。H19可能通過激活PI3K/AKT信號通路，抑制Bad的磷酸化，使其無法發(fā)揮促凋亡作用，從而抑制胃癌細(xì)胞的凋亡；或者通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路，影響caspase的活性，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的凋亡過程。LncRNAH19通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)和細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路，抑制胃癌細(xì)胞的凋亡，在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。深入研究H19影響胃癌細(xì)胞凋亡的機制，對于揭示胃癌的發(fā)病機制和開發(fā)新的治療策略具有重要意義，為通過誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡來治療胃癌提供了新的靶點和思路。四、LncRNAH19影響胃癌血管生成的功能研究4.1研究方法與實驗設(shè)計4.1.1細(xì)胞實驗細(xì)胞培養(yǎng)：選用人胃癌細(xì)胞系MGC-803和SGC-7901，以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）。將胃癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，HUVECs培養(yǎng)于含20%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和1ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（ECM）中。所有細(xì)胞均置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時進(jìn)行后續(xù)實驗。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：針對LncRNAH19設(shè)計特異性的短發(fā)夾RNA（shRNA），以沉默H19的表達(dá)；同時構(gòu)建H19過表達(dá)質(zhì)粒。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將shRNA或過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中。具體操作按照轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后48-72小時，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測H19的表達(dá)水平，以驗證轉(zhuǎn)染效率。分組：將胃癌細(xì)胞分為空白對照組（未進(jìn)行任何處理）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照shRNA或空質(zhì)粒）、H19敲低組（轉(zhuǎn)染H19shRNA）和H19過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染H19過表達(dá)質(zhì)粒）。檢測血管生成相關(guān)指標(biāo)：血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)檢測：轉(zhuǎn)染后48小時，收集各組胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測VEGF的含量；同時提取細(xì)胞總RNA，通過qRT-PCR檢測VEGFmRNA的表達(dá)水平；提取細(xì)胞總蛋白，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法檢測VEGF蛋白的表達(dá)水平。內(nèi)皮細(xì)胞增殖實驗：將HUVECs以適當(dāng)密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24小時后，加入各組胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72小時。采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）法檢測HUVECs的增殖情況。在不同時間點，向每孔加入10μLCCK-8溶液，孵育1-4小時后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測吸光度值（OD值），根據(jù)OD值計算細(xì)胞增殖率。內(nèi)皮細(xì)胞遷移實驗：采用Transwell小室進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞遷移實驗。將Transwell小室的上室加入HUVECs懸液，下室加入各組胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)上清液。培養(yǎng)一定時間后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，然后將小室固定、染色，在顯微鏡下觀察并計數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，以此評估內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力。內(nèi)皮細(xì)胞成管實驗：在24孔板中鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，待其凝固后，將HUVECs以適當(dāng)密度接種于Matrigel上，加入各組胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)上清液。培養(yǎng)6-8小時后，在顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞的成管情況，拍照記錄并測量管腔的長度和分支點數(shù)，評估內(nèi)皮細(xì)胞的成管能力。4.1.2動物實驗動物模型構(gòu)建：選取4-6周齡的BALB/c裸鼠，將對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞（MGC-803或SGC-7901）用無血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/mL。在裸鼠的右側(cè)腋窩皮下注射0.1mL細(xì)胞懸液，建立胃癌移植瘤模型。動物處理：待腫瘤體積長至約100-150mm3時，將裸鼠隨機分為4組，每組5-6只。分別為空白對照組（不做任何處理）、陰性對照組（注射陰性對照shRNA或空質(zhì)粒）、H19敲低組（注射H19shRNA）和H19過表達(dá)組（注射H19過表達(dá)質(zhì)粒）。采用瘤內(nèi)注射的方式，每隔3天注射一次，共注射4-5次。檢測腫瘤生長和血管生成情況：腫瘤體積測量：從接種腫瘤細(xì)胞后開始，每隔3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（L）和短徑（W），根據(jù)公式V=1/2×L×W2計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。腫瘤重量測量：在實驗結(jié)束時，將裸鼠處死，取出腫瘤組織，用電子天平稱重，比較各組腫瘤重量的差異。免疫組織化學(xué)染色：將腫瘤組織制成石蠟切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測腫瘤組織中微血管密度（MVD）和VEGF的表達(dá)情況。MVD采用CD31抗體進(jìn)行檢測，VEGF采用相應(yīng)的抗體進(jìn)行檢測。在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，計數(shù)MVD和分析VEGF的表達(dá)強度，評估腫瘤血管生成情況。實時熒光定量PCR：提取腫瘤組織的總RNA，通過qRT-PCR檢測LncRNAH19和VEGFmRNA的表達(dá)水平，分析其與腫瘤血管生成的關(guān)系。蛋白質(zhì)免疫印跡：提取腫瘤組織的總蛋白，采用Westernblot法檢測VEGF蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步驗證免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果。4.2LncRNAH19對胃癌血管生成的影響結(jié)果分析4.2.1體外實驗結(jié)果在細(xì)胞實驗中，通過CCK-8法檢測內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，H19敲低組中加入胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的增殖能力明顯受到抑制（圖1）。在48小時和72小時時，H19敲低組的吸光度值（OD值）顯著低于其他兩組（P<0.05），表明H19表達(dá)降低可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。而在H19過表達(dá)組，HUVECs的增殖能力顯著增強，48小時和72小時時的OD值明顯高于空白對照組和陰性對照組（P<0.05），說明H19過表達(dá)能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。【此處插入圖1：CCK-8法檢測不同處理組HUVECs增殖能力的柱狀圖，橫坐標(biāo)為不同處理組（空白對照組、陰性對照組、H19敲低組、H19過表達(dá)組），縱坐標(biāo)為OD值，不同時間點（24小時、48小時、72小時）用不同顏色柱子表示】內(nèi)皮細(xì)胞遷移實驗結(jié)果表明，Transwell小室中遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量在不同組間存在顯著差異（圖2）。H19敲低組的遷移細(xì)胞數(shù)明顯少于空白對照組和陰性對照組（P<0.05），說明敲低H19可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力。相反，H19過表達(dá)組的遷移細(xì)胞數(shù)顯著多于其他兩組（P<0.05），表明H19過表達(dá)能夠增強內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力?！敬颂幉迦雸D2：Transwell實驗檢測不同處理組HUVECs遷移能力的圖片及統(tǒng)計柱狀圖，圖片展示不同處理組Transwell小室下室遷移細(xì)胞的染色情況，統(tǒng)計柱狀圖橫坐標(biāo)為不同處理組，縱坐標(biāo)為遷移細(xì)胞數(shù)量】內(nèi)皮細(xì)胞成管實驗結(jié)果顯示，在Matrigel基質(zhì)膠上，H19敲低組形成的管腔長度和分支點數(shù)明顯少于空白對照組和陰性對照組（P<0.05）（圖3），表明H19表達(dá)降低會削弱內(nèi)皮細(xì)胞的成管能力，抑制血管生成。而H19過表達(dá)組形成的管腔長度和分支點數(shù)顯著多于其他兩組（P<0.05），說明H19過表達(dá)能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞成管，增強血管生成能力?！敬颂幉迦雸D3：內(nèi)皮細(xì)胞成管實驗檢測不同處理組HUVECs成管能力的圖片及統(tǒng)計柱狀圖，圖片展示不同處理組內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel基質(zhì)膠上形成的管腔結(jié)構(gòu)，統(tǒng)計柱狀圖橫坐標(biāo)為不同處理組，縱坐標(biāo)分別為管腔長度和分支點數(shù)】通過ELISA、qRT-PCR和Westernblot檢測血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)，結(jié)果顯示，H19敲低組胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF的含量、細(xì)胞中VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著低于空白對照組和陰性對照組（P<0.05）（圖4）。而H19過表達(dá)組中VEGF的表達(dá)水平顯著高于其他兩組（P<0.05）。這表明LncRNAH19能夠調(diào)控VEGF的表達(dá)，進(jìn)而影響血管生成?！敬颂幉迦雸D4：ELISA檢測VEGF含量、qRT-PCR檢測VEGFmRNA表達(dá)水平、Westernblot檢測VEGF蛋白表達(dá)水平的結(jié)果圖，包括柱狀圖和蛋白條帶圖，橫坐標(biāo)為不同處理組，縱坐標(biāo)分別為VEGF含量、mRNA相對表達(dá)量、蛋白相對表達(dá)量】4.2.2體內(nèi)實驗結(jié)果在動物實驗中，通過測量腫瘤體積繪制腫瘤生長曲線，結(jié)果顯示，H19敲低組的腫瘤體積增長速度明顯慢于空白對照組和陰性對照組（圖5）。從接種腫瘤細(xì)胞后的第9天開始，H19敲低組的腫瘤體積顯著小于其他兩組（P<0.05）。而H19過表達(dá)組的腫瘤體積增長迅速，從第6天起，其腫瘤體積就顯著大于空白對照組和陰性對照組（P<0.05）。在實驗結(jié)束時，H19敲低組的腫瘤重量也顯著低于其他兩組（P<0.05），H19過表達(dá)組的腫瘤重量則顯著高于其他兩組（P<0.05）。這表明LncRNAH19能夠促進(jìn)胃癌移植瘤的生長?！敬颂幉迦雸D5：不同處理組胃癌移植瘤生長曲線及實驗結(jié)束時腫瘤重量統(tǒng)計柱狀圖，生長曲線橫坐標(biāo)為時間（天），縱坐標(biāo)為腫瘤體積（mm3），不同處理組用不同線條表示；統(tǒng)計柱狀圖橫坐標(biāo)為不同處理組，縱坐標(biāo)為腫瘤重量（g）】免疫組織化學(xué)染色檢測腫瘤組織中微血管密度（MVD）和VEGF的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，H19敲低組腫瘤組織中的MVD和VEGF表達(dá)強度明顯低于空白對照組和陰性對照組（P<0.05）（圖6）。在顯微鏡下觀察，H19敲低組腫瘤組織中的微血管數(shù)量較少，染色較淺。而H19過表達(dá)組的MVD和VEGF表達(dá)強度顯著高于其他兩組（P<0.05），該組腫瘤組織中的微血管數(shù)量較多，染色較深。這表明LncRNAH19能夠促進(jìn)腫瘤血管生成，增加腫瘤組織中的微血管密度和VEGF表達(dá)?！敬颂幉迦雸D6：免疫組織化學(xué)染色檢測不同處理組腫瘤組織中MVD和VEGF表達(dá)的圖片及統(tǒng)計柱狀圖，圖片展示不同處理組腫瘤組織中CD31（標(biāo)記微血管）和VEGF的染色情況，統(tǒng)計柱狀圖橫坐標(biāo)為不同處理組，縱坐標(biāo)分別為MVD和VEGF表達(dá)強度評分】通過qRT-PCR和Westernblot檢測腫瘤組織中LncRNAH19和VEGF的表達(dá)水平，結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色一致。H19敲低組中LncRNAH19和VEGF的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著低于空白對照組和陰性對照組（P<0.05）（圖7），H19過表達(dá)組中兩者的表達(dá)水平顯著高于其他兩組（P<0.05）。進(jìn)一步證實了LncRNAH19在體內(nèi)能夠調(diào)控VEGF的表達(dá)，從而影響胃癌腫瘤血管生成和腫瘤生長?！敬颂幉迦雸D7：qRT-PCR檢測LncRNAH19和VEGFmRNA表達(dá)水平、Westernblot檢測LncRNAH19和VEGF蛋白表達(dá)水平的結(jié)果圖，包括柱狀圖和蛋白條帶圖，橫坐標(biāo)為不同處理組，縱坐標(biāo)分別為mRNA相對表達(dá)量、蛋白相對表達(dá)量】五、LncRNAH19影響胃癌血管生成的機制探討5.1調(diào)控血管生成相關(guān)因子的表達(dá)5.1.1VEGF等關(guān)鍵因子的調(diào)控LncRNAH19對血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的調(diào)控機制復(fù)雜多樣，涉及多個層面。從基因轉(zhuǎn)錄水平來看，H19可能通過順式作用或反式作用對VEGF基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。順式作用方面，H19可能與VEGF基因的啟動子區(qū)域直接相互作用，影響轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的結(jié)合，從而調(diào)控VEGF基因的轉(zhuǎn)錄起始。研究表明，H19可以招募一些轉(zhuǎn)錄激活因子，如Sp1等，到VEGF基因的啟動子區(qū)域，增強轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，促進(jìn)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄。反式作用方面，H19可能通過與其他轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控蛋白相互作用，間接影響VEGF基因的轉(zhuǎn)錄。H19可以與一些轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合，使其從VEGF基因的啟動子區(qū)域解離，解除對VEGF轉(zhuǎn)錄的抑制作用，從而促進(jìn)VEGF的表達(dá)。H19還可能作為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）來調(diào)控VEGF的表達(dá)。ceRNA機制是指不同的RNA分子通過競爭結(jié)合相同的微小RNA（miRNA），從而相互影響表達(dá)水平。H19含有多個miRNA結(jié)合位點，其中一些miRNA可以靶向VEGFmRNA，抑制其表達(dá)。H19通過與這些miRNA結(jié)合，競爭性地抑制miRNA與VEGFmRNA的結(jié)合，從而解除miRNA對VEGF的抑制作用，促進(jìn)VEGF的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，H19可以作為miR-126的ceRNA，miR-126能夠靶向VEGFmRNA，抑制其表達(dá)。當(dāng)H19表達(dá)上調(diào)時，它會與miR-126結(jié)合，減少miR-126與VEGFmRNA的結(jié)合，使得VEGFmRNA的穩(wěn)定性增加，翻譯效率提高，從而促進(jìn)VEGF的表達(dá)。此外，H19還可能通過調(diào)節(jié)其他與VEGF表達(dá)相關(guān)的信號通路，如PI3K/AKT、MAPK等信號通路，間接影響VEGF的表達(dá)。PI3K/AKT信號通路可以通過激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB等，促進(jìn)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄；MAPK信號通路則可以通過調(diào)節(jié)VEGFmRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，影響VEGF的表達(dá)。H19可能通過與這些信號通路中的關(guān)鍵分子相互作用，激活或抑制信號通路的傳導(dǎo)，從而調(diào)控VEGF的表達(dá)。5.1.2其他血管生成因子的關(guān)聯(lián)除了VEGF，LncRNAH19還與其他多種血管生成因子存在密切關(guān)聯(lián)，對胃癌血管生成產(chǎn)生協(xié)同影響。成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）家族在血管生成過程中發(fā)揮著重要作用，其中堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF，即FGF-2）是研究較為深入的一種。H19與bFGF之間存在相互作用，共同影響胃癌血管生成。研究表明，H19可以通過調(diào)節(jié)bFGF的表達(dá)來影響血管生成。在胃癌細(xì)胞中，敲低H19的表達(dá)會導(dǎo)致bFGF的表達(dá)水平下降，進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成能力，減少血管生成。相反，過表達(dá)H19則會促進(jìn)bFGF的表達(dá)，增強血管生成能力。其作用機制可能是H19通過與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控bFGF基因的轉(zhuǎn)錄。H19可能與一些轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合，促進(jìn)它們與bFGF基因啟動子區(qū)域的結(jié)合，從而增強bFGF基因的轉(zhuǎn)錄活性。此外，H19還可能通過影響bFGF信號通路的傳導(dǎo)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)血管生成。bFGF與其受體FGFR結(jié)合后，會激活下游的PI3K/AKT、MAPK等信號通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。H19可能通過調(diào)節(jié)這些信號通路中的關(guān)鍵分子，影響bFGF信號的傳遞，從而協(xié)同調(diào)控胃癌血管生成。血小板衍生生長因子（PDGF）也是一種重要的血管生成因子，在腫瘤血管生成中起著關(guān)鍵作用。H19與PDGF之間存在相互作用，對胃癌血管生成產(chǎn)生協(xié)同影響。研究發(fā)現(xiàn)，H19可以調(diào)節(jié)PDGF的表達(dá)和功能，進(jìn)而影響血管生成。在胃癌組織中，H19的高表達(dá)與PDGF的高表達(dá)呈正相關(guān)。敲低H19的表達(dá)會降低PDGF的表達(dá)水平，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，減少血管生成。其作用機制可能是H19通過與PDGF基因的調(diào)控區(qū)域相互作用，影響PDGF的轉(zhuǎn)錄。H19還可能通過調(diào)節(jié)PDGF信號通路，影響血管生成。PDGF與其受體PDGFR結(jié)合后，會激活下游的信號通路，如PI3K/AKT、RAS-RAF-MEK-ERK等，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活。H19可能通過調(diào)節(jié)這些信號通路中的關(guān)鍵分子，影響PDGF信號的傳導(dǎo)，從而協(xié)同調(diào)控胃癌血管生成。此外，H19還可能通過影響PDGF誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞募集和分化，進(jìn)一步調(diào)節(jié)血管生成。平滑肌細(xì)胞在血管生成過程中起著重要作用，它們可以穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)血管的收縮和舒張。PDGF可以誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，并促進(jìn)其分化為血管平滑肌細(xì)胞。H19可能通過調(diào)節(jié)PDGF對平滑肌細(xì)胞的作用，影響血管的成熟和穩(wěn)定性，從而協(xié)同調(diào)控胃癌血管生成。5.2參與信號通路的調(diào)節(jié)5.2.1PI3K/Akt信號通路LncRNAH19對PI3K/Akt信號通路的調(diào)控在胃癌血管生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)H19表達(dá)上調(diào)時，它可以與PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85相互作用，促進(jìn)PI3K的激活。研究表明，在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)H19能夠增加PI3K的活性，使p85與催化亞基p110的結(jié)合更加緊密，從而增強PI3K的催化活性，促進(jìn)磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，能夠招募蛋白激酶B（Akt）到細(xì)胞膜上，并在磷酸肌醇依賴性激酶-1（PDK1）的作用下，使Akt的蘇氨酸殘基（Thr308）和絲氨酸殘基（Ser473）發(fā)生磷酸化，從而激活A(yù)kt。激活的Akt可以進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游一系列與血管生成相關(guān)的靶蛋白，如內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等。在血管生成過程中，激活的Akt可以磷酸化eNOS，使其活性增強，促進(jìn)一氧化氮（NO）的合成。NO是一種重要的血管舒張因子，它能夠調(diào)節(jié)血管平滑肌的舒張和收縮，增加血管的通透性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而有利于血管生成。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞中敲低H19的表達(dá)，會抑制PI3K/Akt信號通路的激活，導(dǎo)致eNOS的磷酸化水平降低，NO的合成減少，進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，減少血管生成。此外，激活的Akt還可以通過磷酸化mTOR，調(diào)節(jié)其下游的蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞代謝過程，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和存活。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它在細(xì)胞生長、增殖、代謝和存活等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。當(dāng)Akt激活mTOR后，mTOR可以通過調(diào)節(jié)核糖體蛋白S6激酶（S6K1）和真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）的活性，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，為內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管生成提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。LncRNAH19通過激活PI3K/Akt信號通路，調(diào)節(jié)eNOS和mTOR等下游靶蛋白的活性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，從而促進(jìn)胃癌血管生成。深入研究H19對PI3K/Akt信號通路的調(diào)控機制，對于揭示胃癌血管生成的分子機制和開發(fā)新的治療策略具有重要意義。5.2.2MAPK信號通路LncRNAH19在胃癌血管生成中通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路，對血管生成相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生重要影響。當(dāng)H19表達(dá)上調(diào)時，它可以與絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）相互作用，促進(jìn)MEK的磷酸化和激活。研究表明，在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)H19能夠顯著增加MEK的磷酸化水平，進(jìn)而激活下游的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）。MEK是一種雙特異性激酶，它能夠磷酸化ERK的蘇氨酸和酪氨酸殘基，使其激活。激活的ERK可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)一系列與血管生成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）等。在血管生成過程中，激活的ERK可以與VEGF基因啟動子區(qū)域的特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，增強轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的親和力，促進(jìn)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加VEGF的表達(dá)。VEGF是一種重要的促血管生成因子，它能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，在腫瘤血管生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞中敲低H19的表達(dá)，會抑制MAPK信號通路的激活，導(dǎo)致ERK的磷酸化水平降低，VEGF基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制，VEGF的表達(dá)減少，進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，減少血管生成。此外，激活的ERK還可以調(diào)節(jié)bFGF基因的表達(dá)。bFGF也是一種重要的促血管生成因子，它能夠與內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游的信號通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。ERK可以通過調(diào)節(jié)bFGF基因的轉(zhuǎn)錄因子活性，促進(jìn)bFGF基因的轉(zhuǎn)錄，增加bFGF的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)胃癌血管生成。LncRNAH19通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路中MEK和ERK的活性，影響血管生成相關(guān)基因VEGF和bFGF的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌血管生成。深入研究H19對MAPK信號通路的調(diào)控機制，對于揭示胃癌血管生成的分子機制和開發(fā)新的治療策略具有重要意義。5.2.3其他相關(guān)信號通路除了PI