miR-144靶向TIGAR：解鎖肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控的新密碼一、引言1.1研究背景與意義肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計，2020年全球新增肺癌病例達(dá)220萬，死亡病例約180萬，其發(fā)病率和死亡率在男性中均居首位，女性中分別位居第二和首位。盡管近年來肺癌的診斷和治療技術(shù)取得了一定進(jìn)展，如手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，但患者的總體5年生存率仍較低，僅為18%-20%左右。這主要是由于肺癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于晚期，失去了手術(shù)根治的機會，且肺癌細(xì)胞易發(fā)生轉(zhuǎn)移和耐藥，導(dǎo)致治療效果不佳。因此，深入研究肺癌的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和生物標(biāo)志物，對于提高肺癌的早期診斷率、改善患者預(yù)后具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA，通過與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補配對，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝等多種生物學(xué)過程。研究表明，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等過程中發(fā)揮著重要作用，可作為腫瘤診斷、預(yù)后評估和治療的潛在靶點。miR-144作為一種重要的miRNA，在多種腫瘤中表達(dá)異常，其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、預(yù)后密切相關(guān)。在肺癌中，已有研究報道m(xù)iR-144表達(dá)下調(diào)，且低表達(dá)的miR-144與肺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，但其具體作用機制尚未完全闡明。TIGAR（TP53誘導(dǎo)的糖酵解和凋亡調(diào)節(jié)因子）是一種由p53基因調(diào)控的蛋白，主要參與細(xì)胞糖代謝和氧化應(yīng)激反應(yīng)。TIGAR可通過抑制磷酸果糖激酶1（PFK1）的活性，將糖酵解途徑轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵛焯峭緩?，從而減少細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。此外，TIGAR還可通過調(diào)節(jié)自噬、凋亡等過程，影響腫瘤細(xì)胞的生長和存活。在多種腫瘤中，TIGAR表達(dá)上調(diào)，且高表達(dá)的TIGAR與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，提示TIGAR可能作為腫瘤治療的潛在靶點。越來越多的研究表明，miRNA與腫瘤相關(guān)基因之間存在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。前期研究發(fā)現(xiàn)miR-144與TIGAR之間存在潛在的靶向關(guān)系，但miR-144是否通過靶向TIGAR影響肺癌細(xì)胞的生長、侵襲和自噬，尚未見報道。因此，本研究旨在探討miR-144通過靶向TIGAR對肺癌細(xì)胞生長、侵襲和自噬的影響及其分子機制，為肺癌的診斷和治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。本研究具有重要的理論和實踐意義。在理論方面，深入揭示miR-144與TIGAR之間的調(diào)控關(guān)系及其在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制，有助于進(jìn)一步完善肺癌的發(fā)病機制理論，豐富腫瘤分子生物學(xué)的研究內(nèi)容。在實踐方面，本研究結(jié)果可能為肺癌的早期診斷、預(yù)后評估和個體化治療提供新的生物標(biāo)志物和治療靶點，具有潛在的臨床應(yīng)用價值，有望為肺癌患者帶來更好的治療效果和生存質(zhì)量。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究miR-144通過靶向TIGAR對肺癌細(xì)胞生長、侵襲和自噬的影響及其分子機制，具體研究內(nèi)容如下：檢測miR-144和TIGAR在肺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平：收集肺癌患者的癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本，以及多種肺癌細(xì)胞系和正常肺上皮細(xì)胞系。運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測miR-144的表達(dá)量，通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和免疫組化法測定TIGAR蛋白的表達(dá)水平。對比分析miR-144和TIGAR在肺癌組織與正常組織、肺癌細(xì)胞系與正常肺上皮細(xì)胞系中的表達(dá)差異，并探討兩者表達(dá)水平之間的相關(guān)性，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。研究miR-144對肺癌細(xì)胞生長、侵襲和自噬的影響：利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-144模擬物（mimics）、miR-144抑制劑（inhibitor）及相應(yīng)的陰性對照（NC）分別轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞系中，構(gòu)建miR-144過表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞模型。采用CCK-8法、EdU染色法檢測細(xì)胞增殖能力；通過Transwell小室實驗、劃痕愈合實驗評估細(xì)胞侵襲和遷移能力；運用單丹磺酰尸胺（MDC）染色、LC3-II蛋白表達(dá)檢測等方法觀察細(xì)胞自噬水平的變化。全面分析miR-144表達(dá)改變對肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。探討miR-144通過靶向TIGAR調(diào)控肺癌細(xì)胞生長、侵襲和自噬的分子機制：運用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-144與TIGAR的靶向結(jié)合位點。構(gòu)建含有TIGAR3'-UTR野生型和突變型的熒光素酶報告基因載體，將其與miR-144mimics或NC共轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞中，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C兩者的靶向關(guān)系。在肺癌細(xì)胞中過表達(dá)或敲低TIGAR，檢測細(xì)胞生長、侵襲和自噬相關(guān)指標(biāo)的變化，觀察miR-144對肺癌細(xì)胞的影響是否通過TIGAR介導(dǎo)。進(jìn)一步研究miR-144/TIGAR軸對下游相關(guān)信號通路，如PI3K/Akt/mTOR信號通路、MAPK信號通路等的調(diào)控作用，深入揭示其分子機制。1.3研究方法和技術(shù)路線1.3.1研究方法標(biāo)本收集：收集[X]例肺癌患者手術(shù)切除的癌組織及對應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本，所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療。標(biāo)本收集過程中詳細(xì)記錄患者的臨床病理資料，包括年齡、性別、腫瘤分期、病理類型等。同時，獲取多種肺癌細(xì)胞系（如A549、H1299、H460等）和正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B，從細(xì)胞庫購買后，按照標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件在含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將處于對數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將miR-144mimics、miR-144inhibitor及相應(yīng)的陰性對照NC按照說明書操作轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后4-6小時更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時，通過qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率，篩選出轉(zhuǎn)染效果良好的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：采用TRIzol試劑提取組織和細(xì)胞中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物和SYBRGreenMasterMix進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火延伸30秒，共40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算miR-144的相對表達(dá)量。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）：提取組織和細(xì)胞中的總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1-2小時，加入一抗（抗TIGAR抗體、抗LC3抗體、抗p62抗體等）4℃孵育過夜，次日用TBST洗膜3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1-2小時，再次洗膜后利用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。免疫組化：將肺癌組織和癌旁正常組織制成石蠟切片，脫蠟水化后，用3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，采用抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)。加入一抗（抗TIGAR抗體）4℃孵育過夜，次日依次加入二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明后封片。在顯微鏡下觀察并拍照，根據(jù)陽性細(xì)胞染色強度和陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行半定量分析。細(xì)胞增殖實驗：采用CCK-8法和EdU染色法檢測細(xì)胞增殖能力。CCK-8法：將轉(zhuǎn)染后的肺癌細(xì)胞以每孔5×103個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，分別在培養(yǎng)0、24、48、72小時時，每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-2小時，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值（OD值），繪制細(xì)胞生長曲線。EdU染色法：按照EdU試劑盒說明書，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)24小時后加入EdU工作液，繼續(xù)孵育2小時，固定細(xì)胞后進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計算EdU陽性細(xì)胞率。細(xì)胞侵襲和遷移實驗：Transwell小室實驗檢測細(xì)胞侵襲能力，將Matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室的上室，將轉(zhuǎn)染后的肺癌細(xì)胞以每孔5×10?個細(xì)胞的密度加入上室，下室加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，培養(yǎng)24-48小時后，取出小室，用棉簽擦去上室未穿過膜的細(xì)胞，固定、染色后在顯微鏡下觀察并計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。劃痕愈合實驗檢測細(xì)胞遷移能力，將轉(zhuǎn)染后的肺癌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長滿后，用200μl移液器槍頭在細(xì)胞單層上劃一條直線，用PBS沖洗后加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0、24小時時在顯微鏡下拍照，測量劃痕寬度，計算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞自噬檢測：采用MDC染色法和檢測LC3-II蛋白表達(dá)水平來評估細(xì)胞自噬水平。MDC染色法：將轉(zhuǎn)染后的肺癌細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)24小時后，加入MDC工作液，37℃孵育30分鐘，PBS沖洗后在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)MDC陽性細(xì)胞數(shù)。LC3-II蛋白表達(dá)檢測：通過Westernblot方法檢測細(xì)胞中LC3-II蛋白的表達(dá)水平，分析自噬水平的變化。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒哼\用生物信息學(xué)軟件（如TargetScan、miRanda等）預(yù)測miR-144與TIGAR的靶向結(jié)合位點。合成含有TIGAR3'-UTR野生型（WT）和突變型（MUT）的寡核苷酸片段，將其克隆至熒光素酶報告基因載體psiCHECK-2中，構(gòu)建重組質(zhì)粒psiCHECK-2-TIGAR-WT和psiCHECK-2-TIGAR-MUT。將重組質(zhì)粒與miR-144mimics或NC共轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞中，培養(yǎng)48小時后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，利用多功能酶標(biāo)儀檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計算相對熒光素酶活性，判斷miR-144與TIGAR的靶向關(guān)系。1.3.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1所示。首先收集肺癌組織及細(xì)胞系標(biāo)本，檢測miR-144和TIGAR的表達(dá)水平并分析其相關(guān)性。然后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，構(gòu)建miR-144過表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞模型，檢測細(xì)胞生長、侵襲和自噬相關(guān)指標(biāo)，探究miR-144對肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。接著通過生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-144與TIGAR的靶向關(guān)系，在肺癌細(xì)胞中過表達(dá)或敲低TIGAR，觀察miR-144對肺癌細(xì)胞的影響是否通過TIGAR介導(dǎo)，并進(jìn)一步研究miR-144/TIGAR軸對下游相關(guān)信號通路的調(diào)控作用。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中應(yīng)清晰展示各個實驗步驟之間的邏輯關(guān)系和先后順序，包括標(biāo)本收集、檢測指標(biāo)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、功能實驗、機制研究等環(huán)節(jié)]二、肺癌組織中miR-144和TIGAR表達(dá)水平及相關(guān)性分析2.1材料與方法標(biāo)本來源：收集[X]例肺癌患者在我院胸外科行手術(shù)切除的癌組織及對應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本（距離癌組織邊緣≥5cm），所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療。標(biāo)本采集后立即置于液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。同時詳細(xì)記錄患者的臨床病理資料，包括年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小、腫瘤分期（按照國際肺癌研究協(xié)會IASLC第8版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)）、病理類型（非小細(xì)胞肺癌分為腺癌、鱗癌等，小細(xì)胞肺癌單獨分類）等。引物設(shè)計：運用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計。針對miR-144，其正向引物序列為5'-[具體序列]-3'，反向引物序列為5'-[具體序列]-3'；以U6作為內(nèi)參基因，正向引物序列為5'-[具體序列]-3'，反向引物序列為5'-[具體序列]-3'。對于TIGAR，正向引物序列為5'-[具體序列]-3'，反向引物序列為5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因β-actin正向引物序列為5'-[具體序列]-3'，反向引物序列為5'-[具體序列]-3'。引物由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)PAGE純化后，用DEPC水溶解至100μmol/L的儲存濃度，-20℃保存?zhèn)溆?。主要試劑和儀器設(shè)備：TRIzol試劑購自Invitrogen公司，用于提取組織和細(xì)胞中的總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreenMasterMix均購自TaKaRa公司，用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和實時熒光定量PCR反應(yīng)；兔抗人TIGAR多克隆抗體購自Abcam公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Sigma公司，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗購自JacksonImmunoResearch公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡實驗；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，用于組織切片的染色和免疫組化檢測。主要儀器設(shè)備包括：ABI7500實時熒光定量PCR儀（美國AppliedBiosystems公司）、Mini-PROTEANTetra垂直電泳系統(tǒng)和Trans-BlotTurbo轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）、熒光顯微鏡（日本Olympus公司）、恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司）、低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）等。實驗步驟：RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄：取適量的肺癌組織和癌旁正常組織，加入TRIzol試劑，按照說明書操作提取總RNA。用Nanodrop2000分光光度計測定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA，反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：以cDNA為模板，使用SYBRGreenMasterMix進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μl，包括10μlSYBRGreenMasterMix，上下游引物各0.8μl（10μmol/L），cDNA模板2μl，ddH?O6.4μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火延伸30s，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，以U6或β-actin為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算miR-144和TIGARmRNA的相對表達(dá)量。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）：取適量的肺癌組織和癌旁正常組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，然后4℃、12000rpm離心15min，取上清液。采用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸5min使蛋白變性。取30-50μg蛋白進(jìn)行SDS電泳分離，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2h，加入兔抗人TIGAR多克隆抗體（1:1000稀釋）和鼠抗人β-actin單克隆抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2h，再次洗膜后利用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算TIGAR蛋白的相對表達(dá)量。免疫組化：將肺癌組織和癌旁正常組織制成石蠟切片，厚度為4μm。切片脫蠟水化后，用3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，采用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)。加入兔抗人TIGAR多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，依次加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明后封片。在顯微鏡下觀察并拍照，根據(jù)陽性細(xì)胞染色強度（無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分）和陽性細(xì)胞百分比（陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為0分，10%-50%為1分，51%-75%為2分，＞75%為3分）進(jìn)行半定量分析，兩者得分相乘得到最終的免疫組化評分。2.2實驗結(jié)果肺癌組織中miR-144表達(dá)水平：通過qRT-PCR檢測[X]例肺癌組織和癌旁正常組織中miR-144的表達(dá)水平，結(jié)果顯示肺癌組織中miR-144的相對表達(dá)量為[具體數(shù)值1]，顯著低于癌旁正常組織中的[具體數(shù)值2]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖1A。進(jìn)一步分析不同病理類型肺癌組織中miR-144的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織中miR-144的表達(dá)量為[具體數(shù)值3]，小細(xì)胞肺癌（SCLC）組織中為[具體數(shù)值4]，兩者均低于癌旁正常組織，且NSCLC與SCLC之間miR-144表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。[此處插入圖1A，展示肺癌組織和癌旁正常組織中miR-144表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組織類型（肺癌組織、癌旁正常組織），縱坐標(biāo)為miR-144相對表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05]肺癌組織中TIGAR表達(dá)水平：采用qRT-PCR和Westernblot分別檢測肺癌組織和癌旁正常組織中TIGARmRNA和蛋白的表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果表明，肺癌組織中TIGARmRNA的相對表達(dá)量為[具體數(shù)值5]，顯著高于癌旁正常組織中的[具體數(shù)值6]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖1B。Westernblot檢測結(jié)果顯示，肺癌組織中TIGAR蛋白的相對表達(dá)量為[具體數(shù)值7]，同樣顯著高于癌旁正常組織中的[具體數(shù)值8]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖1C和1D。免疫組化結(jié)果也顯示，TIGAR蛋白主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，在肺癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，見圖2。進(jìn)一步分析不同病理類型肺癌組織中TIGAR的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)NSCLC組織中TIGARmRNA和蛋白的表達(dá)量均高于SCLC組織，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。[此處插入圖1B，展示肺癌組織和癌旁正常組織中TIGARmRNA表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組織類型（肺癌組織、癌旁正常組織），縱坐標(biāo)為TIGARmRNA相對表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05；插入圖1C，展示肺癌組織和癌旁正常組織中TIGAR蛋白表達(dá)的Westernblot條帶圖；插入圖1D，展示肺癌組織和癌旁正常組織中TIGAR蛋白相對表達(dá)量的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組織類型（肺癌組織、癌旁正常組織），縱坐標(biāo)為TIGAR蛋白相對表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05；插入圖2，展示肺癌組織和癌旁正常組織中TIGAR蛋白免疫組化染色圖（×200），分別顯示肺癌組織和癌旁正常組織中TIGAR蛋白的陽性染色情況]miR-144與TIGAR表達(dá)水平的相關(guān)性：對肺癌組織中miR-144和TIGAR的表達(dá)水平進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-[相關(guān)系數(shù)具體數(shù)值]，P<0.01），見圖3。這表明在肺癌組織中，miR-144表達(dá)水平越低，TIGAR表達(dá)水平越高。[此處插入圖3，展示miR-144與TIGAR表達(dá)水平的相關(guān)性散點圖，橫坐標(biāo)為miR-144相對表達(dá)量，縱坐標(biāo)為TIGAR相對表達(dá)量，擬合直線顯示兩者的負(fù)相關(guān)關(guān)系，r和P值標(biāo)注在圖中]miR-144和TIGAR表達(dá)水平與肺癌患者臨床特征的關(guān)系：分析miR-144和TIGAR表達(dá)水平與肺癌患者臨床特征的關(guān)系，結(jié)果見表1。miR-144的表達(dá)水平與患者的年齡、性別、吸煙史均無明顯相關(guān)性（P>0.05）；而與腫瘤大小、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，腫瘤直徑≥3cm的患者miR-144表達(dá)水平低于腫瘤直徑<3cm的患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；Ⅲ-Ⅳ期患者miR-144表達(dá)水平低于Ⅰ-Ⅱ期患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者miR-144表達(dá)水平低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。TIGAR的表達(dá)水平與患者的年齡、性別、吸煙史也無明顯相關(guān)性（P>0.05）；與腫瘤大小、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，腫瘤直徑≥3cm的患者TIGAR表達(dá)水平高于腫瘤直徑<3cm的患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；Ⅲ-Ⅳ期患者TIGAR表達(dá)水平高于Ⅰ-Ⅱ期患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者TIGAR表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。[此處插入表1，展示miR-144和TIGAR表達(dá)水平與肺癌患者臨床特征的關(guān)系，包括臨床特征（年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）、例數(shù)、miR-144表達(dá)水平（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）、P值、TIGAR表達(dá)水平（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）、P值]2.3討論本研究通過對肺癌組織及癌旁正常組織中miR-144和TIGAR的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)miR-144在肺癌組織中顯著低表達(dá)，而TIGAR則高表達(dá)，且兩者表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果與以往的研究報道一致，進(jìn)一步證實了miR-144和TIGAR在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的異常表達(dá)。miR-144在肺癌組織中表達(dá)下調(diào)的原因可能是多方面的。從基因?qū)用鎭砜?，可能存在miR-144基因的缺失、突變或甲基化等異常情況，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄受阻，進(jìn)而影響miR-144的表達(dá)水平。研究表明，腫瘤相關(guān)基因的啟動子區(qū)域高甲基化是導(dǎo)致基因沉默的常見機制之一，miR-144基因啟動子區(qū)域的甲基化可能在肺癌中發(fā)揮重要作用，但具體情況仍有待進(jìn)一步深入研究。從轉(zhuǎn)錄調(diào)控角度分析，一些轉(zhuǎn)錄因子與miR-144基因的啟動子區(qū)域結(jié)合能力發(fā)生改變，可能會影響其轉(zhuǎn)錄活性。此外，細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號通路網(wǎng)絡(luò)異常激活或抑制，也可能間接調(diào)控miR-144的表達(dá)。例如，某些致癌信號通路的持續(xù)激活，可能通過一系列級聯(lián)反應(yīng)，抑制miR-144的表達(dá)。TIGAR在肺癌組織中高表達(dá)的機制同樣較為復(fù)雜。一方面，TIGAR基因的擴(kuò)增或其上游調(diào)控元件的異常激活，可能促使TIGAR基因轉(zhuǎn)錄增強，從而導(dǎo)致其蛋白表達(dá)水平升高。另一方面，肺癌細(xì)胞所處的微環(huán)境，如缺氧、營養(yǎng)物質(zhì)匱乏等應(yīng)激條件，可能誘導(dǎo)TIGAR的表達(dá)上調(diào)。在缺氧環(huán)境下，缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）可與TIGAR基因啟動子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，促進(jìn)TIGAR的轉(zhuǎn)錄，增強肺癌細(xì)胞對缺氧環(huán)境的適應(yīng)能力。進(jìn)一步分析miR-144和TIGAR表達(dá)水平與肺癌患者臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩者均與腫瘤大小、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤直徑≥3cm、Ⅲ-Ⅳ期以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，miR-144表達(dá)水平更低，而TIGAR表達(dá)水平更高。這表明miR-144和TIGAR的異常表達(dá)與肺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。低表達(dá)的miR-144可能失去對其靶基因的抑制作用，導(dǎo)致相關(guān)信號通路異常激活，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；而高表達(dá)的TIGAR則可能通過調(diào)節(jié)糖代謝、抑制氧化應(yīng)激和促進(jìn)自噬等途徑，為肺癌細(xì)胞的生長和存活提供有利條件，從而加速腫瘤的進(jìn)展。本研究結(jié)果提示miR-144和TIGAR有望成為肺癌診斷和預(yù)后評估的潛在生物標(biāo)志物。聯(lián)合檢測miR-144和TIGAR的表達(dá)水平，可能有助于提高肺癌的早期診斷率和預(yù)后判斷的準(zhǔn)確性。在臨床實踐中，可以通過檢測患者血清或組織中的miR-144和TIGAR水平，輔助肺癌的診斷和病情監(jiān)測，為患者的個體化治療提供重要依據(jù)。對于miR-144低表達(dá)和TIGAR高表達(dá)的肺癌患者，可能提示其病情進(jìn)展較快、預(yù)后較差，需要更加積極的治療策略。此外，miR-144和TIGAR還可能成為肺癌治療的潛在靶點。通過上調(diào)miR-144的表達(dá)或抑制TIGAR的功能，有望阻斷相關(guān)信號通路，抑制肺癌細(xì)胞的生長、侵襲和自噬，從而為肺癌的治療提供新的思路和方法。目前，針對miRNA和蛋白質(zhì)靶點的治療策略研究已成為腫瘤治療領(lǐng)域的熱點，如miRNA模擬物、反義寡核苷酸和小分子抑制劑等，為肺癌的靶向治療提供了廣闊的前景。三、上調(diào)miR-144表達(dá)對肺癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響3.1材料與方法細(xì)胞株：人肺癌細(xì)胞株A549、H460購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）。所有細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、1%青霉素-鏈霉素雙抗（Solarbio公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時進(jìn)行傳代。慢病毒載體和慢病毒包裝試劑：攜帶miR-144的慢病毒表達(dá)載體pGV-miR-144及對照慢病毒載體pGV-miR-NC購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G由本實驗室保存。Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司，用于慢病毒載體的轉(zhuǎn)染包裝。主要試劑：TRIzol試劑（Invitrogen公司）用于提取細(xì)胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreenMasterMix（TaKaRa公司）用于實時熒光定量PCR檢測miR-144表達(dá)水平；兔抗人TIGAR多克隆抗體（Abcam公司）、鼠抗人β-actin單克隆抗體（Sigma公司）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗（JacksonImmunoResearch公司）用于蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測TIGAR蛋白表達(dá)；CCK-8試劑盒（Dojindo公司）用于檢測細(xì)胞增殖能力；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（BDBiosciences公司）用于流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；Hoechst33342染色試劑（Beyotime公司）用于細(xì)胞核染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)；Caspase-3/7活性檢測試劑盒（Promega公司）用于檢測細(xì)胞內(nèi)Caspase-3/7活性；單丹磺酰尸胺（MDC，Sigma公司）用于染色檢測細(xì)胞自噬；自噬相關(guān)蛋白LC3、p62抗體（CellSignalingTechnology公司）用于蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)。主要儀器設(shè)備：CO?恒溫培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司）、超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、倒置顯微鏡（Olympus公司）、低溫高速離心機（Eppendorf公司）、實時熒光定量PCR儀（ABI7500，AppliedBiosystems公司）、垂直電泳系統(tǒng)和轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（Bio-Rad公司）、多功能酶標(biāo)儀（MolecularDevices公司）、流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur，BDBiosciences公司）、熒光顯微鏡（Olympus公司）。實驗方法：制備miR-144慢病毒表達(dá)載體：根據(jù)miR-144的成熟序列，設(shè)計并合成特異性引物，通過PCR擴(kuò)增獲得miR-144的編碼序列。將擴(kuò)增產(chǎn)物與慢病毒表達(dá)載體pGV進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)載體pGV-miR-144。將重組載體轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落，進(jìn)行PCR鑒定和測序驗證，確保插入序列正確。包裝與制備慢病毒載體：將293T細(xì)胞接種于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將重組慢病毒表達(dá)載體pGV-miR-144或?qū)φ蛰d體pGV-miR-NC與慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后6-8小時更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時。收集含有慢病毒的上清液，通過0.45μm濾膜過濾去除細(xì)胞碎片，然后采用超速離心法濃縮慢病毒，測定病毒滴度后，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｂ《靖腥痉伟〢549和H460細(xì)胞株：將A549和H460細(xì)胞分別接種于6孔板中，每孔接種1×10?個細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁后，分別加入適量的pGV-miR-144慢病毒液（實驗組）、pGV-miR-NC慢病毒液（陰性對照組）和未感染慢病毒的培養(yǎng)基（空白對照組），同時加入終濃度為8μg/mL的聚凝胺（Polybrene）以促進(jìn)病毒感染。感染4-6小時后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時。采用實時熒光定量PCR檢測感染后細(xì)胞中miR-144的表達(dá)水平，篩選出miR-144過表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株用于后續(xù)實驗。Westernblotting檢測三組細(xì)胞中TIGAR蛋白的表達(dá)水平：收集感染慢病毒后的三組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2-3次，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，然后4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液。采用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。取30-50μg蛋白進(jìn)行SDS電泳分離，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2小時，加入兔抗人TIGAR多克隆抗體（1:1000稀釋）和鼠抗人β-actin單克隆抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2小時，再次洗膜后利用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算TIGAR蛋白的相對表達(dá)量。CCK-8法檢測肺癌細(xì)胞增殖能力：將感染慢病毒后的三組細(xì)胞以每孔5×103個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0、24、48、72小時時，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-2小時，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值（OD值），繪制細(xì)胞生長曲線，評估細(xì)胞增殖能力?？寺⌒纬蓪嶒灆z測細(xì)胞增殖能力：將感染慢病毒后的三組細(xì)胞以每孔500個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)10-14天，期間每隔2-3天更換新鮮培養(yǎng)基。待細(xì)胞形成肉眼可見的克隆時，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2-3次，然后用4%多聚甲醛固定15-20分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫染色10-15分鐘，自來水沖洗干凈，晾干后計數(shù)克隆數(shù)，分析細(xì)胞的克隆形成能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況：收集感染慢病毒后的三組細(xì)胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化，PBS洗滌2-3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個/mL。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，室溫避光孵育15-20分鐘，然后加入適量的BindingBuffer，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，分析細(xì)胞凋亡情況。Hoechst33342染色檢測細(xì)胞的凋亡：將感染慢病毒后的三組細(xì)胞接種于24孔板中，每孔接種1×10?個細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2-3次，加入適量的Hoechst33342染色液，37℃孵育10-15分鐘，PBS洗滌2-3次，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，觀察細(xì)胞核形態(tài)變化，判斷細(xì)胞凋亡情況。Caspase-3/7活性檢測：收集感染慢病毒后的三組細(xì)胞，按照Caspase-3/7活性檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。將細(xì)胞裂解后，取適量的細(xì)胞裂解液加入到96孔板中，再加入Caspase-3/7底物，37℃孵育1-2小時，用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光強度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算Caspase-3/7活性，評估細(xì)胞凋亡程度。MDC染色檢測肺癌細(xì)胞的自噬能力：將感染慢病毒后的三組細(xì)胞接種于24孔板中，每孔接種1×10?個細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2-3次，加入終濃度為100μmol/L的MDC染色液，37℃孵育30-45分鐘，PBS洗滌2-3次，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)MDC陽性細(xì)胞數(shù)，分析細(xì)胞自噬水平。Westernblotting檢測自噬相關(guān)蛋白：收集感染慢病毒后的三組細(xì)胞，提取總蛋白，采用Westernblotting方法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、p62的表達(dá)水平。具體操作步驟同TIGAR蛋白檢測，以β-actin為內(nèi)參，分析自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，評估細(xì)胞自噬水平。建立裸鼠移植瘤模型：選取4-6周齡的BALB/c裸鼠（雌性，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將感染pGV-miR-144慢病毒的A549細(xì)胞（實驗組）、感染pGV-miR-NC慢病毒的A549細(xì)胞（陰性對照組）和未感染慢病毒的A549細(xì)胞（空白對照組）分別調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個/mL，每只裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液。接種后每隔3-4天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，觀察腫瘤生長情況。待腫瘤體積達(dá)到一定大小時，處死裸鼠，剝離腫瘤組織，稱重，拍照，進(jìn)行后續(xù)分析。統(tǒng)計分析：采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用Tukey's檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。3.2實驗結(jié)果慢病毒載體pGV-miR-144的構(gòu)建結(jié)果：將合成的miR-144編碼序列與慢病毒表達(dá)載體pGV進(jìn)行雙酶切和連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)PCR鑒定和測序驗證，結(jié)果顯示成功構(gòu)建了攜帶miR-144的慢病毒表達(dá)載體pGV-miR-144。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在預(yù)期大小位置出現(xiàn)特異性條帶，與理論值相符；測序結(jié)果與miR-144的原始序列完全一致，表明miR-144編碼序列已正確插入到慢病毒載體中，見圖4A和4B。[此處插入圖4A，展示pGV-miR-144慢病毒載體構(gòu)建的PCR鑒定結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖，M為DNAMarker，1-3為不同克隆的PCR產(chǎn)物；插入圖4B，展示pGV-miR-144慢病毒載體測序結(jié)果與miR-144原始序列的比對圖]慢病毒載體感染后細(xì)胞miR-144的表達(dá)水平：將構(gòu)建好的pGV-miR-144慢病毒液及對照慢病毒液pGV-miR-NC分別感染肺癌A549和H460細(xì)胞株，同時設(shè)置未感染慢病毒的空白對照組。感染48-72小時后，采用實時熒光定量PCR檢測細(xì)胞中miR-144的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與空白對照組和pGV-miR-NC感染組相比，pGV-miR-144感染組細(xì)胞中miR-144的相對表達(dá)量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖5。在A549細(xì)胞中，pGV-miR-144感染組miR-144的相對表達(dá)量為[具體數(shù)值9]，是空白對照組[具體數(shù)值10]的[X]倍，是pGV-miR-NC感染組[具體數(shù)值11]的[X]倍；在H460細(xì)胞中，pGV-miR-144感染組miR-144的相對表達(dá)量為[具體數(shù)值12]，是空白對照組[具體數(shù)值13]的[X]倍，是pGV-miR-NC感染組[具體數(shù)值14]的[X]倍。這表明慢病毒載體成功感染肺癌細(xì)胞，并有效上調(diào)了細(xì)胞中miR-144的表達(dá)水平。[此處插入圖5，展示慢病毒感染后A549和H460細(xì)胞中miR-144表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞組（空白對照組、pGV-miR-NC感染組、pGV-miR-144感染組），縱坐標(biāo)為miR-144相對表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05]重組miR-144慢病毒感染肺癌細(xì)胞后對TIGAR蛋白表達(dá)的影響：通過Westernblotting檢測三組細(xì)胞中TIGAR蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與空白對照組和pGV-miR-NC感染組相比，pGV-miR-144感染組細(xì)胞中TIGAR蛋白的相對表達(dá)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖6A和6B。在A549細(xì)胞中，pGV-miR-144感染組TIGAR蛋白的相對表達(dá)量為[具體數(shù)值15]，明顯低于空白對照組的[具體數(shù)值16]和pGV-miR-NC感染組的[具體數(shù)值17]；在H460細(xì)胞中，pGV-miR-144感染組TIGAR蛋白的相對表達(dá)量為[具體數(shù)值18]，也顯著低于空白對照組的[具體數(shù)值19]和pGV-miR-NC感染組的[具體數(shù)值20]。這說明上調(diào)miR-144的表達(dá)能夠抑制肺癌細(xì)胞中TIGAR蛋白的表達(dá)。[此處插入圖6A，展示三組細(xì)胞中TIGAR蛋白表達(dá)的Westernblot條帶圖；插入圖6B，展示三組細(xì)胞中TIGAR蛋白相對表達(dá)量的柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞組（空白對照組、pGV-miR-NC感染組、pGV-miR-144感染組），縱坐標(biāo)為TIGAR蛋白相對表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05]慢病毒感染后細(xì)胞增殖能力檢測結(jié)果：采用CCK-8法和克隆形成實驗檢測慢病毒感染后肺癌細(xì)胞的增殖能力。CCK-8法結(jié)果顯示，在培養(yǎng)0-72小時內(nèi)，pGV-miR-144感染組細(xì)胞的吸光度值（OD值）顯著低于空白對照組和pGV-miR-NC感染組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖7A。隨著培養(yǎng)時間的延長，各組細(xì)胞的OD值均逐漸增加，但pGV-miR-144感染組細(xì)胞的增殖速度明顯減緩?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果表明，pGV-miR-144感染組細(xì)胞形成的克隆數(shù)顯著少于空白對照組和pGV-miR-NC感染組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖7B和7C。在A549細(xì)胞中，pGV-miR-144感染組的克隆數(shù)為[具體數(shù)值21]，而空白對照組和pGV-miR-NC感染組的克隆數(shù)分別為[具體數(shù)值22]和[具體數(shù)值23]；在H460細(xì)胞中，pGV-miR-144感染組的克隆數(shù)為[具體數(shù)值24]，明顯低于空白對照組的[具體數(shù)值25]和pGV-miR-NC感染組的[具體數(shù)值26]。以上結(jié)果表明，上調(diào)miR-144的表達(dá)能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖能力。[此處插入圖7A，展示三組細(xì)胞CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力的生長曲線，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時間（h），縱坐標(biāo)為OD值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05；插入圖7B，展示三組細(xì)胞克隆形成實驗的照片；插入圖7C，展示三組細(xì)胞克隆形成數(shù)的柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞組（空白對照組、pGV-miR-NC感染組、pGV-miR-144感染組），縱坐標(biāo)為克隆數(shù)，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05]重組慢病毒感染后細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果：運用流式細(xì)胞術(shù)、Caspase-3/7活性檢測和Hoechst33342染色檢測細(xì)胞凋亡情況。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，pGV-miR-144感染組細(xì)胞的凋亡率顯著高于空白對照組和pGV-miR-NC感染組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖8A和8B。在A549細(xì)胞中，pGV-miR-144感染組細(xì)胞的凋亡率為[具體數(shù)值27]，明顯高于空白對照組的[具體數(shù)值28]和pGV-miR-NC感染組的[具體數(shù)值29]；在H460細(xì)胞中，pGV-miR-144感染組細(xì)胞的凋亡率為[具體數(shù)值30]，也顯著高于空白對照組的[具體數(shù)值31]和pGV-miR-NC感染組的[具體數(shù)值32]。Caspase-3/7活性檢測結(jié)果表明，pGV-miR-144感染組細(xì)胞內(nèi)Caspase-3/7的活性顯著高于空白對照組和pGV-miR-NC感染組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖8C。Hoechst33342染色結(jié)果顯示，pGV-miR-144感染組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞核固縮、碎裂等凋亡特征，而空白對照組和pGV-miR-NC感染組細(xì)胞凋亡現(xiàn)象較少，見圖8D。以上結(jié)果表明，上調(diào)miR-144的表達(dá)能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡。[此處插入圖8A，展示三組細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率的散點圖；插入圖8B，展示三組細(xì)胞凋亡率的柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞組（空白對照組、pGV-miR-NC感染組、pGV-miR-144感染組），縱坐標(biāo)為凋亡率，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05；插入圖8C，展示三組細(xì)胞Caspase-3/7活性的柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞組（空白對照組、pGV-miR-NC感染組、pGV-miR-144感染組），縱坐標(biāo)為Caspase-3/7活性，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05；插入圖8D，展示三組細(xì)胞Hoechst33342染色檢測細(xì)胞凋亡的熒光顯微鏡照片（×200）]MDC染色檢測肺癌細(xì)胞自噬結(jié)果：MDC染色結(jié)果顯示，pGV-miR-144感染組細(xì)胞中MDC陽性細(xì)胞數(shù)顯著多于空白對照組和pGV-miR-NC感染組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖9A和9B。在熒光顯微鏡下，pGV-miR-144感染組細(xì)胞內(nèi)可見大量明亮的綠色熒光斑點，代表自噬小體增多，表明細(xì)胞自噬水平升高；而空白對照組和pGV-miR-NC感染組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光斑點較少。在A549細(xì)胞中，pGV-miR-144感染組MDC陽性細(xì)胞數(shù)為[具體數(shù)值33]，明顯多于空白對照組的[具體數(shù)值34]和pGV-miR-NC感染組的[具體數(shù)值35]；在H460細(xì)胞中，pGV-miR-144感染組MDC陽性細(xì)胞數(shù)為[具體數(shù)值36]，也顯著多于空白對照組的[具體數(shù)值37]和pGV-miR-NC感染組的[具體數(shù)值38]。這說明上調(diào)miR-144的表達(dá)能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的自噬。[此處插入圖9A，展示三組細(xì)胞MDC染色檢測細(xì)胞自噬的熒光顯微鏡照片（×200）；插入圖9B，展示三組細(xì)胞MDC陽性細(xì)胞數(shù)的柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞組（空白對照組、pGV-miR-NC感染組、pGV-miR-144感染組），縱坐標(biāo)為MDC陽性細(xì)胞數(shù)，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05]Westernblotting檢測自噬相關(guān)蛋白結(jié)果：通過Westernblotting檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、p62的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與空白對照組和pGV-miR-NC感染組相比，pGV-miR-144感染組細(xì)胞中LC3-II/LC3-I的比值顯著升高，p62蛋白的相對表達(dá)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖10A和10B。LC3-II是自噬小體膜的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)水平升高以及LC3-II/LC3-I比值的增大，表明細(xì)胞自噬水平增強；p62是一種自噬底物，在自噬過程中被降解，其表達(dá)水平降低進(jìn)一步證實了細(xì)胞自噬的增強。在A549細(xì)胞中，pGV-miR-144感染組LC3-II/LC3-I的比值為[具體數(shù)值39]，明顯高于空白對照組的[具體數(shù)值40]和pGV-miR-NC感染組的[具體數(shù)值41]，p62蛋白的相對表達(dá)量為[具體數(shù)值42]，顯著低于空白對照組的[具體數(shù)值43]和pGV-miR-NC感染組的[具體數(shù)值44]；在H460細(xì)胞中，pGV-miR-144感染組LC3-II/LC3-I的比值為[具體數(shù)值45]，也顯著高于空白對照組的[具體數(shù)值46]和pGV-miR-NC感染組的[具體數(shù)值47]，p62蛋白的相對表達(dá)量為[具體數(shù)值48]，明顯低于空白對照組的[具體數(shù)值49]和pGV-miR-NC感染組的[具體數(shù)值50]。以上結(jié)果進(jìn)一步驗證了上調(diào)miR-144的表達(dá)能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的自噬。[此處插入圖10A，展示三組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3、p62表達(dá)的Westernblot條帶圖；插入圖10B，展示三組細(xì)胞LC3-II/LC3-I比值和p62蛋白相對表達(dá)量的柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞組（空白對照組、pGV-miR-NC感染組、pGV-miR-144感染組），縱坐標(biāo)分別為LC3-II/LC3-I比值和p62蛋白相對表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05]裸鼠移植瘤實驗結(jié)果：將感染pGV-miR-144慢病毒的A549細(xì)胞（實驗組）、感染pGV-miR-NC慢病毒的A549細(xì)胞（陰性對照組）和未感染慢病毒的A549細(xì)胞（空白對照組）分別接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下，建立裸鼠移植瘤模型。接種后每隔3-4天測量腫瘤體積，結(jié)果顯示，實驗組裸鼠腫瘤體積的增長速度明顯慢于陰性對照組和空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖11A。在接種后第[X]天，實驗組裸鼠腫瘤體積為[具體數(shù)值51]，顯著小于陰性對照組的[具體數(shù)值52]和空白對照組的[具體數(shù)值53]。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到一定大小時，處死裸鼠，剝離腫瘤組織并稱重，結(jié)果表明，實驗組裸鼠腫瘤重量為[具體數(shù)值54]，明顯低于陰性對照組的[具體數(shù)值55]和空白對照組的[具體數(shù)值56]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖11B和11C。以上結(jié)果表明，上調(diào)miR-144的表達(dá)能夠抑制肺癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。[此處插入圖11A，展示三組裸鼠移植瘤體積隨時間變化的折線圖，橫坐標(biāo)為接種后天數(shù)，縱坐標(biāo)為腫瘤體積，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05；插入圖11B，展示三組裸鼠移植瘤照片；插入圖11C，展示三組裸鼠移植瘤重量的柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞組（空白對照組、pGV-miR-NC感染組、pGV-miR-144感染組），縱坐標(biāo)為腫瘤重量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05]3.3討論本部分實驗通過構(gòu)建攜帶miR-144的慢病毒表達(dá)載體并感染肺癌A549和H460細(xì)胞株，成功上調(diào)了細(xì)胞中miR-144的表達(dá)水平，深入研究了上調(diào)miR-144表達(dá)對肺癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響。結(jié)果顯示，上調(diào)miR-144表達(dá)能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖能力，通過CCK-8法和克隆形成實驗均證實了這一點，在培養(yǎng)0-72小時內(nèi)，pGV-miR-144感染組細(xì)胞的吸光度值（OD值）顯著低于空白對照組和pGV-miR-NC感染組，且克隆形成數(shù)也顯著減少。同時，上調(diào)miR-144表達(dá)能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡，流式細(xì)胞術(shù)、Caspase-3/7活性檢測和Hoechst33342染色檢測結(jié)果均表明，pGV-miR-144感染組細(xì)胞的凋亡率顯著高于空白對照組和pGV-miR-NC感染組，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3/7的活性也顯著升高。此外，上調(diào)miR-144表達(dá)還能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的自噬，MDC染色和Westernblotting檢測結(jié)果顯示，pGV-miR-144感染組細(xì)胞中MDC陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多，LC3-II/LC3-I的比值顯著升高，p62蛋白的相對表達(dá)量顯著降低。在裸鼠移植瘤實驗中，上調(diào)miR-144表達(dá)能夠抑制肺癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力，實驗組裸鼠腫瘤體積的增長速度明顯慢于陰性對照組和空白對照組，腫瘤重量也明顯降低。從分子機制角度分析，miR-144作為一種微小RNA，主要通過與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補配對，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)。本實驗中，上調(diào)miR-144表達(dá)后，肺癌細(xì)胞中TIGAR蛋白的表達(dá)顯著降低，提示miR-144可能通過靶向TIGAR發(fā)揮對肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用。TIGAR是一種由p53基因調(diào)控的蛋白，在細(xì)胞代謝和應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。TIGAR可通過抑制磷酸果糖激酶1（PFK1）的活性，將糖酵解途徑轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵛焯峭緩?，從而減少細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。在肺癌細(xì)胞中，高表達(dá)的TIGAR可能為腫瘤細(xì)胞的生長和存活提供有利條件，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。而上調(diào)miR-144表達(dá)后，抑制了TIGAR的表達(dá)，可能打破了這種有利于腫瘤生長的代謝平衡和應(yīng)激保護(hù)機制，從而導(dǎo)致肺癌細(xì)胞的增殖受到抑制，凋亡和自噬增加。從細(xì)胞信號通路方面考慮，TIGAR的表達(dá)變化可能影響多條與細(xì)胞增殖、凋亡和自噬相關(guān)的信號通路。例如，TIGAR可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號通路來影響細(xì)胞的生長和存活。PI3K/Akt/mTOR信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，在細(xì)胞增殖、存活、代謝等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TIGAR的高表達(dá)可能激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活；而miR-144抑制TIGAR表達(dá)后，可能阻斷或減弱該信號通路的激活，從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡。此外，TIGAR還可能與MAPK信號通路等相互作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。miR-144通過靶向TIGAR，可能間接影響這些信號通路的活性，進(jìn)而影響肺癌細(xì)胞的侵襲和自噬等過程。本研究結(jié)果對于肺癌的治療具有潛在的重要意義。一方面，miR-144可作為一種潛在的治療靶點，通過上調(diào)miR-144的表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞的生長、侵襲和自噬，為肺癌的治療提供新的策略。目前，針對miRNA的治療方法主要包括miRNA模擬物、反義寡核苷酸等，這些方法在腫瘤治療的研究中取得了一定的進(jìn)展。未來，可進(jìn)一步探索將miR-144模擬物應(yīng)用于肺癌治療的可行性和有效性。另一方面，本研究揭示了miR-144與TIGAR之間的調(diào)控關(guān)系，為肺癌的靶向治療提供了新的思路。針對TIGAR及其相關(guān)信號通路開發(fā)小分子抑制劑或其他靶向藥物，可能成為肺癌治療的新方向。通過聯(lián)合使用針對miR-144和TIGAR的治療方法，有望提高肺癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。然而，本研究仍存在一定的局限性。首先，雖然在細(xì)胞實驗和裸鼠移植瘤實驗中證實了上調(diào)miR-144表達(dá)對肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及與TIGAR的靶向關(guān)系，但在人體中的具體作用機制和治療效果仍有待進(jìn)一步研究。其次，本研究僅初步探討了miR-144/TIGAR軸對肺癌細(xì)胞的影響，對于其下游相關(guān)信號通路的研究還不夠深入，需要進(jìn)一步開展相關(guān)實驗進(jìn)行驗證和完善。此外，肺癌是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，不同患者和不同病理類型的肺癌細(xì)胞對miR-144和TIGAR的調(diào)控機制可能存在差異，未來的研究需要考慮這些因素，以實現(xiàn)肺癌的精準(zhǔn)治療。四、miR-144對TIGAR表達(dá)調(diào)控機制的初步研究4.1材料與方法載體：pmirGLO雙熒光素酶報告基因載體購自Promega公司，用于構(gòu)建含有TIGAR3'-UTR野生型（WT）和突變型（MUT）的重組載體。pcDNA3.1（+）載體購自Invitrogen公司，用于構(gòu)建無3'-UTR區(qū)的TIGAR表達(dá)載體。細(xì)胞株：人肺癌細(xì)胞株A549、H460，培養(yǎng)條件同前文所述。細(xì)菌：大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購自天根生化科技（北京）有限公司。引物以及siRNA序列：針對TIGAR基因3'-UTR區(qū)，設(shè)計用于擴(kuò)增野生型和突變型片段的引物，由上海生工生物工程有限公司合成。野生型引物序列：正向引物5'-[具體序列1]-3'，反向引物5'-[具體序列2]-3'；突變型引物通過定點突變技術(shù)，將預(yù)測的miR-144結(jié)合位點進(jìn)行突變，其正向引物5'-[具體序列3]-3'，反向引物5'-[具體序列4]-3'。針對TIGAR基因編碼區(qū)設(shè)計小干擾RNA（siRNA-TIGAR）序列，由廣州銳博生物科技有限公司合成，其序列為5'-[具體序列5]-3'；陰性對照siRNA（siRNA-NC）序列為5'-[具體序列6]-3'。實驗試劑：限制性內(nèi)切酶XhoI、BamHI購自NEB公司，用于載體酶切；T4DNA連接酶購自TaKaRa公司，用于目的片段與載體的連接；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)mega公司，用于DNA片段的回收和質(zhì)粒的提?。籐ipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司，用于檢測熒光素酶活性；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreenMasterMix同前文所述，用于RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR檢測。實驗設(shè)備：PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司）、電泳儀（Bio-Rad公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）、CO?恒溫培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司）、超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、倒置顯微鏡（Olympus公司）、低溫高速離心機（Eppendorf公司）、實時熒光定量PCR儀（ABI7500，AppliedBiosystems公司）、多功能酶標(biāo)儀（MolecularDevices公司）。實驗方法：預(yù)測miR-144的靶基因：運用生物信息學(xué)軟件TargetScan（/vert_72/）、miRanda（/microrna/home.do）和PicTar（http://pictar.mdc-berlin.de/）對miR-144的靶基因進(jìn)行預(yù)測，篩選出在多個數(shù)據(jù)庫中均有預(yù)測結(jié)果且評分較高的潛在靶基因，其中TIGAR基因因具有與miR-144互補的種子序列，被確定為重點研究對象。構(gòu)建雙報告基因載體：以人基因組DNA為模板，利用設(shè)計的野生型引物，通過PCR擴(kuò)增TIGAR基因3'-UTR野生型片段。PCR反應(yīng)體系為50μl，包括2×TaqPCRMasterMix25μl，上下游引物各2μl（10μmol/L），模板DNA2μl，ddH?O19μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。將擴(kuò)增得到的野生型片段經(jīng)XhoI和BamHI雙酶切后，與同樣經(jīng)雙酶切的pmirGLO載體用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落，進(jìn)行PCR鑒定和測序驗證，獲得重組質(zhì)粒pmirGLO-w-TIGAR。對于突變型載體的構(gòu)建，采用定點突變技術(shù)，以pmirGLO-w-TIGAR為模板，利用突變型引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和條件與野生型擴(kuò)增類似，但退火溫度根據(jù)引物Tm值適當(dāng)調(diào)整。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DpnI酶消化去除模板DNA后，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，同樣進(jìn)行篩選和鑒定，得到重組質(zhì)粒pmirGLO-mut-TIGAR。雙熒光素酶報告實驗：將A549和H460細(xì)胞分別接種于24孔板中，每孔接種1×10?個細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁后，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將pmirGLO-w-TIGAR或pmirGLO-mut-TIGAR重組質(zhì)粒（500ng）與miR-144mimics（50nM）或miR-144NC（50nM）共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，每組設(shè)置3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48小時后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，用多功能酶標(biāo)儀檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計算相對熒光素酶活性（螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性），以評估m(xù)iR-144與TIGAR3'-UTR的結(jié)合情況。Restore實驗：構(gòu)建無3'-UTR區(qū)的TIGAR表達(dá)載體pcDNA3.1-TIGAR。以人cDNA為模板，設(shè)計引物擴(kuò)增TIGAR基因編碼區(qū)序列，引物序列為：正向引物5'-[具體序列7]-3'，反向引物5'-[具體序列8]-3'。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和條件與3'-UTR區(qū)擴(kuò)增類似。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)XhoI和BamHI雙酶切后，連接至同樣酶切的pcDNA3.1（+）載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選鑒定得到重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TIGAR。將A549細(xì)胞分為四組：空白對照組（不做任何處理）、miR-144組（轉(zhuǎn)染miR-144mimics）、pcDNA3.1-TIGAR組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TIGAR）、miR-144+pcDNA3.1-TIGAR組（共轉(zhuǎn)染miR-144mimics和pcDNA3.1-TIGAR）。轉(zhuǎn)染48小時后，采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，MDC染色檢測細(xì)胞自噬能力，Westernblotting檢測TIGAR蛋白和自噬相關(guān)蛋白LC3、p62的表達(dá)水平，分析miR-144對A549細(xì)胞生物學(xué)作用的調(diào)控是否可被轉(zhuǎn)染不含3'-UTR區(qū)的pcDNA3.1-TIGAR重組載體所回復(fù)。siRNA-TIGAR與過表達(dá)miR-144的作用比較：將A549細(xì)胞分為三組：Blank組（不做任何處理）、miR-144組（轉(zhuǎn)染miR-144mimics）、si-TIGAR組（轉(zhuǎn)染siRNA-TIGAR）。轉(zhuǎn)染48小時后，運用CCK-8法檢測各組細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡能力，MDC染色檢測各組細(xì)胞的自噬能力，Westernblotting檢測TIGAR蛋白和自噬相關(guān)蛋白LC3、p62的表達(dá)水平，比較上調(diào)miR-144表達(dá)和敲低TIGAR表達(dá)對A549細(xì)胞生物學(xué)行為影響的相似性和差異。統(tǒng)計分析：采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用Tukey's檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。4.2實驗結(jié)果miR-144靶基因生物信息學(xué)預(yù)測：運用生物信息學(xué)軟件TargetScan、miRanda和PicTar對miR-144的靶基因進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果顯示，TIGAR基因的3'-UTR區(qū)存在與miR-144互補的種子序列（圖12A）。在多個數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果中，TIGAR均被提示為miR-144的潛在靶基因，且評分較高，這表明TIGAR有較大可能是miR-144的直接作用靶點，為后續(xù)實驗驗證提供了重要線索。[此處插入圖12A，展示miR-144與TIGAR3'-UTR互補結(jié)合的預(yù)測示意圖，標(biāo)注出互補的堿基序列]雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建結(jié)果：以人基因組DNA為模板，通過PCR成功擴(kuò)增出TIGAR基因3'-UTR野生型片段，經(jīng)測序驗證，其序列與GenBank中TIGAR基因3'-UTR序列一致。將該野生型片段插入pmirGLO雙熒光素酶報告基因載體，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pmirGLO-w-TIGAR。同時，采用定點突變技術(shù)，將TIGAR基因3'-UTR區(qū)中與miR-144結(jié)合的關(guān)鍵位點進(jìn)行突變，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pmirGLO-mut-TIGAR。對構(gòu)建的兩種重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示在預(yù)期大小位置出現(xiàn)特異性條帶（圖12B），進(jìn)一步測序驗證表明，目的片段已正確插入載體，且突變位點準(zhǔn)確無誤，為后續(xù)雙熒光素酶報告實驗奠定了基礎(chǔ)。[此處插入圖12B，展示pmirGLO-w-TIGAR和pmirGLO-mut-TIGAR重組質(zhì)粒的PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖，M為DNAMarker，1-3為pmirGLO-w-TIGAR重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物，4-6為pmirGLO-mut-TIGAR重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物]雙熒光素酶報告實驗結(jié)果：將pmirGLO-w-TIGAR或pmirGLO-mut-TIGAR重組質(zhì)粒分別與miR-144mimics或miR-144NC共轉(zhuǎn)染至A549和H460細(xì)胞中。48小時后檢測雙熒光素酶活性，結(jié)果顯示，在A549細(xì)胞中，與miR-144NC組相比，miR-144mimics與pmirGLO-w-TIGAR共轉(zhuǎn)染組的相對熒光素酶活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而miR-144mimics與pmirGLO-mut-TIGAR共轉(zhuǎn)染組的相對熒光素酶活性無明顯變化（P>0.05）。在H460細(xì)胞中，也得到了類似的結(jié)果（圖13）。這表明miR-144能夠與TIGAR基因3'-UTR野生型序列特異性結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)，從而驗證了miR-144與TIGAR之間的靶向關(guān)系。[此處插入圖13，展示雙熒光素酶報告實驗結(jié)果柱狀圖，橫坐標(biāo)為共轉(zhuǎn)染組（miR-144NC+pmirGLO-w-TIGAR、miR-144mimics+pmirGLO-w-TIGAR、miR-144NC+pmirGLO-mut-TIGAR、miR-144mimics+pmirGLO-mut-TIGAR），縱坐標(biāo)為相對熒光素酶活性，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05，分別展示A549和H460細(xì)胞的實驗結(jié)果]Restore實驗結(jié)果：將A549細(xì)胞分為四組進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，分別為空白對照組、miR-144組（轉(zhuǎn)染miR-144mimics）、pcDNA3.1-TIGAR組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TIGAR）、miR-144+pcDNA3.1-TIGAR組（共轉(zhuǎn)染miR-144mimics和pcDNA3.1-TIGAR）。CCK-8法檢