miR-218在小鼠胚胎干細胞向心肌細胞定向分化中的調(diào)控機制解析一、引言1.1研究背景與意義心臟疾病是全球范圍內(nèi)威脅人類健康的主要疾病之一，如心肌梗死、心力衰竭等，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和壽命。心肌細胞作為心臟的主要組成部分，在心臟的正常生理功能中起著關(guān)鍵作用。在胎兒期和成年后的發(fā)育過程中，心肌細胞的分化和增殖對維持心臟正常功能至關(guān)重要。然而，心肌細胞在受到損傷，如心肌梗死、心肌病等情況時，其再生能力十分有限。這使得心肌損傷后的修復(fù)和心臟功能的恢復(fù)成為醫(yī)學領(lǐng)域面臨的重大挑戰(zhàn)。因此，深入探究心肌細胞分化的分子機制，不僅是闡明心臟發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展的重要途徑，也為心臟疾病的治療提供了新的策略和方向。胚胎干細胞（embryonicstemcell,ESC）是一類來自胚胎囊胚期內(nèi)細胞團的多潛能細胞群，具有自我更新、高度增殖和多向分化的能力，能夠分化成任何類型的體細胞，這使其成為心肌細胞再生治療的理想種子細胞。在一定的培養(yǎng)條件下，胚胎干細胞可以在體外長久和穩(wěn)定地自我復(fù)制，實現(xiàn)ES細胞在體外的“永生”，為心肌細胞的研究提供了豐富的細胞來源。通過體外誘導胚胎干細胞向心肌細胞分化，有望獲得大量具有功能的心肌細胞，用于心肌損傷后的細胞治療，為心臟疾病的治療帶來新的希望。近年來，隨著對細胞分化機制研究的深入，微小核糖核酸（microRNA，miRNA）在細胞分化過程中的重要調(diào)控作用逐漸被揭示。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長度約為22個核苷酸，通過與靶mRNA的互補配對結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。眾多研究表明，miRNA參與了細胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學過程，在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、疾病發(fā)生發(fā)展等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其中，miR-218作為一種在多種組織和細胞中廣泛表達的miRNA，逐漸引起了科研人員的關(guān)注。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-218在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，被發(fā)現(xiàn)在阿茲海默癥、精神分裂癥和抑郁癥等多種神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)精神疾病中出現(xiàn)表達異常。同時，在心血管系統(tǒng)中，miR-218也被報道參與了心肌細胞肥大、血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化等生理病理過程。在橫向主動脈縮窄（TAC）小鼠模型中，miR-218的表達明顯下調(diào)，過表達miR-218能夠減少心肌細胞肥大，而抑制miR-218則會加劇由異丙腎上腺素（ISO）誘導的原代心肌細胞肥大。此外，在大鼠主動脈平滑肌細胞中，上調(diào)miR-218的表達可抑制細胞的表型轉(zhuǎn)化、增殖和遷移。這些研究提示miR-218在心血管系統(tǒng)中具有重要的調(diào)控功能，可能成為心血管疾病治療的潛在靶點。然而，目前關(guān)于miR-218在胚胎干細胞向心肌細胞分化過程中的作用及機制研究尚不完善。明確miR-218在這一過程中的調(diào)控機制，對于深入理解心肌細胞分化的分子機制具有重要意義，有望為心肌細胞再生治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點，從而為心臟疾病的治療開辟新的道路，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2小鼠胚胎干細胞概述小鼠胚胎干細胞（mouseembryonicstemcells，mESCs）是從著床前小鼠囊胚的內(nèi)細胞團（innercellmass，ICM）中分離得到的多能干細胞，具有多能性和自我更新兩大顯著特性。在多能性方面，mESCs能夠分化為外胚層、中胚層和內(nèi)胚層這三個胚層的所有細胞類型，進而參與形成機體的各種組織和器官。研究表明，在特定的誘導條件下，mESCs可以分化為心肌細胞、神經(jīng)細胞、肝細胞等多種體細胞，為細胞治療和組織工程提供了豐富的細胞來源。而自我更新能力使得mESCs能夠在體外長期增殖，維持未分化狀態(tài)。在添加白血病抑制因子（leukemiainhibitoryfactor，LIF）和血清的培養(yǎng)體系中，mESCs可以不斷分裂，保持其多能性，這為深入研究其生物學特性和分化機制提供了便利。在形態(tài)學上，mESCs呈現(xiàn)出獨特的特征。其細胞體積較小，呈圓形或橢圓形，細胞核大，核質(zhì)比高，通常具有一個或多個明顯的核仁。在體外培養(yǎng)時，mESCs會緊密聚集形成鳥巢狀的克隆，細胞之間界限不明顯，這一形態(tài)特征有助于對其進行初步識別和鑒定。從來源來看，mESCs主要取自小鼠囊胚期的內(nèi)細胞團。獲取mESCs的過程通常是將小鼠囊胚培養(yǎng)在飼養(yǎng)層細胞上，如小鼠胚胎成纖維細胞（mouseembryonicfibroblasts，MEF），飼養(yǎng)層細胞能夠分泌多種細胞因子，為mESCs提供適宜的生長環(huán)境，抑制其分化，促進其增殖。通過這種方法，可以成功分離和培養(yǎng)出具有多能性的mESCs。在心肌細胞分化研究中，mESCs發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。由于心肌細胞在受損后再生能力有限，利用mESCs向心肌細胞分化的特性，有望為心肌損傷修復(fù)和心臟疾病治療提供新的策略。許多研究致力于探索誘導mESCs向心肌細胞分化的方法和機制。研究發(fā)現(xiàn)，通過在培養(yǎng)基中添加特定的生長因子和小分子化合物，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bonemorphogeneticproteins，BMPs）、Wnt信號通路調(diào)節(jié)劑等，可以調(diào)控mESCs向心肌細胞分化的進程。這些研究不僅有助于深入了解心肌細胞分化的分子機制，還為未來心肌細胞再生治療提供了理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。1.3miR-218研究現(xiàn)狀miR-218作為一種重要的miRNA，在多個領(lǐng)域展現(xiàn)出關(guān)鍵的調(diào)控作用，相關(guān)研究成果不斷涌現(xiàn)。在神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域，清華大學生命學院姚駿研究員團隊通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建miR-218-1和miR-218-2基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)miR-218在大腦中廣泛表達，尤其在海馬中表達水平最高。敲除miR-218-2基因后，小鼠海馬中miR-218表達水平顯著下降，且小鼠認知能力出現(xiàn)明顯缺陷；而在小鼠海馬區(qū)通過病毒注射過表達miR-218，則會使小鼠在行為學測試中展現(xiàn)出增強的認知功能。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-218-2基因在小鼠海馬中通過靶基因C3調(diào)節(jié)神經(jīng)元的形態(tài)和突觸囊泡的轉(zhuǎn)運與釋放，進而影響神經(jīng)元的突觸可逆性和長時程增強（LTP）的發(fā)生，最終影響小鼠的認知功能。這一研究揭示了神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)精神疾病可能通過共通的miR-218相關(guān)機制產(chǎn)生認知障礙，為后續(xù)相關(guān)疾病認知缺陷的治療提供了新的思路和方向。在腫瘤研究方面，有研究聚焦于miR-218在宮頸癌中的作用機制。皖南醫(yī)學院毛軼凡等人研究發(fā)現(xiàn)，miR-218能夠靶向作用于腺瘤性息肉病基因（APC），通過抑制APC的表達，影響宮頸癌細胞的行為。實驗表明，上調(diào)miR-218的表達可抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進細胞凋亡。這提示miR-218可能成為宮頸癌治療的潛在靶點，為宮頸癌的治療提供了新的策略和方向。在心血管系統(tǒng)領(lǐng)域，miR-218的研究也取得了一系列重要成果。在心肌細胞肥大的研究中，研究人員利用橫向主動脈縮窄（TAC）小鼠模型和異丙腎上腺素（ISO）誘導的原代心肌細胞肥大模型，發(fā)現(xiàn)miR-218在TAC小鼠模型中明顯下調(diào)。過表達miR-218能夠減少心肌細胞肥大，而抑制miR-218則會加劇由ISO誘導的原代心肌細胞肥大。進一步研究發(fā)現(xiàn)，RE1-沉默轉(zhuǎn)錄因子（REST）是miR-218的一個新靶標，miR-218通過負向調(diào)控REST的表達來影響心肌細胞肥大過程，這表明miR-218在心肌細胞肥大中起著關(guān)鍵作用，為心肌肥大相關(guān)疾病的治療提供了潛在的干預(yù)靶點。在血管平滑肌細胞方面，上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院張玉超等人的研究表明，在20％胎牛血清（FBS）培養(yǎng)大鼠主動脈平滑肌細胞（VSMCs）時，miR-218表達量下調(diào)，同時α-肌動蛋白（α-actin）和調(diào)寧蛋白1（Calponin-1）表達亦顯著下調(diào)，而miR-218表達上調(diào)可抑制大鼠VSMCs的表型轉(zhuǎn)化、增殖和遷移，其作用可能是通過靶向周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）來實現(xiàn)的。這為血管相關(guān)疾病的研究和治療提供了新的理論依據(jù)。盡管miR-218在上述多個領(lǐng)域的研究已取得一定進展，但在小鼠胚胎干細胞向心肌細胞分化這一關(guān)鍵過程中，miR-218的作用及機制研究仍存在較大空白。目前，對于如何精準調(diào)控miR-218以促進小鼠胚胎干細胞高效、穩(wěn)定地向心肌細胞分化，以及miR-218在這一過程中對相關(guān)信號通路和關(guān)鍵基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等問題，尚未有系統(tǒng)且深入的研究報道。鑒于心肌細胞在心臟疾病治療中的重要性以及小鼠胚胎干細胞作為理想種子細胞的潛力，深入探究miR-218在小鼠胚胎干細胞向心肌細胞分化中的作用機制具有迫切性和重要性，有望為心臟疾病的細胞治療提供新的理論基礎(chǔ)和潛在治療靶點。二、實驗材料與方法2.1實驗材料2.1.1細胞與動物實驗選用的小鼠胚胎干細胞系為E14，購自優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司。該細胞系來源于129/Ola品系小鼠的胚胎內(nèi)細胞團，缺乏HGPRT（HPRT），對0.06mM的6-硫鳥嘌呤具有抗性。在培養(yǎng)時，需使用昆明白MEF作為飼養(yǎng)層細胞，以維持其未分化狀態(tài)；當在無飼養(yǎng)層條件下，細胞會自發(fā)分化并形成胚胎結(jié)構(gòu)。實驗動物為SPF級C57BL/6小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。小鼠飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對濕度（50±10）%的環(huán)境中，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。在實驗前，小鼠需適應(yīng)環(huán)境1周，以減少環(huán)境因素對實驗結(jié)果的影響。2.1.2主要試劑與儀器實驗用到的主要試劑包括：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Gibco公司）、優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS，Gibco公司）、GlutaMAX-1谷氨酰胺（Gibco公司）、MEMNEAA非必需氨基酸（Gibco公司）、SodiumPyruvate丙酮酸鈉（Sigma公司）、P/S青霉素-鏈霉素（Gibco公司）、β-巰基乙醇（Sigma公司）、LIF（Millipore公司）、胰蛋白酶（Gibco公司）、EDTA（Sigma公司）、明膠（Sigma公司）、TRIzol試劑（Invitrogen公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）、SYBRGreenPCRMasterMix（TaKaRa公司）、Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司）、miR-218模擬物（mimics）、miR-218抑制劑（inhibitor）及相應(yīng)陰性對照（NC，RiboBio公司）、Matrigel基質(zhì)膠（Corning公司）、心肌細胞特異性抗體α-actinin（Abcam公司）、AlexaFluor488標記的二抗（Invitrogen公司）、DAPI染液（Sigma公司）等。主要儀器有：CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司）、超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、倒置顯微鏡（Olympus公司）、高速冷凍離心機（Eppendorf公司）、實時熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司）、酶標儀（Bio-Rad公司）、流式細胞儀（BDBiosciences公司）、熒光顯微鏡（Olympus公司）、細胞計數(shù)儀（Bio-Rad公司）等。2.2實驗方法2.2.1細胞培養(yǎng)與處理小鼠胚胎干細胞（E14）培養(yǎng)于含特定成分的培養(yǎng)基中，其配方為：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基81%、優(yōu)質(zhì)胎牛血清15%、GlutaMAX-1谷氨酰胺1%、MEMNEAA非必需氨基酸1%、SodiumPyruvate丙酮酸鈉1%、P/S青霉素-鏈霉素1%、β-巰基乙醇0.5mL（1000X）以及LIF5μg（10ng/mL）。培養(yǎng)時以昆明白MEF作為飼養(yǎng)層細胞，具體操作如下：在T25培養(yǎng)瓶中加入0.2%明膠，搖勻后覆蓋底面，于37℃細胞培養(yǎng)箱放置15min以上。吸除明膠，加入事先水浴加熱至37℃的MEF完全培養(yǎng)液，一般一個T25培養(yǎng)瓶中加入5ml。按實驗需要復(fù)蘇MEF細胞，將凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中迅速融解，取出后用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。將凍存管內(nèi)細胞懸液轉(zhuǎn)移至含2mlMEF完全培養(yǎng)液的15ml離心管內(nèi)，以1000rpm離心5min，離心后吸除上清液，加入新鮮的MEF完全培養(yǎng)液1ml，重懸后按照一個T25培養(yǎng)瓶鋪1×10?的MEF細胞，輕輕搖勻后置于37℃細胞培養(yǎng)箱。24h后可傳入小鼠胚胎干細胞。復(fù)蘇或傳代小鼠胚胎干細胞前，將T25培養(yǎng)瓶中的MEF完全培養(yǎng)液吸除，加入2ml小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液輕輕沖洗一遍后吸除，加入新鮮的小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液待用。原代小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）的分離與培養(yǎng)參考相關(guān)文獻。取懷孕13-14d的ICR系孕鼠，腹腔注射0.5mlAvertin麻醉后斷頸處死，放入75％乙醇中浸泡2-5min消毒。用無菌剪刀鑷子剪開孕鼠腹腔皮膚和腹膜，取出子宮，放在無菌平皿中，用吸管將子宮用10mlPBS沖洗三遍。切開囊胚，游離胚胎，將胚胎放入新的無菌培養(yǎng)皿中，用10mlPBS洗三遍。去除胚胎的頭、尾、四肢及內(nèi)臟組織，再次用PBS沖洗三遍。吸去多余的PBS，使用彎頭眼科剪將組織剪成小顆粒，加2ml胰蛋白酶，繼續(xù)剪切幾分鐘，使組織顆粒更小。再補加5ml胰蛋白酶，用吸管充分將組織和胰蛋白酶混勻，將培養(yǎng)皿37℃孵育20-30min，中間可取出用無菌25ml吸管反復(fù)吹吸幾次。消化結(jié)束，加大約20mlMEF-I培養(yǎng)基，用10ml移液管把黏性物質(zhì)混勻，吸取上面的細胞懸液。用200目的篩網(wǎng)過濾，將組織消化液轉(zhuǎn)移入50ml離心管中，200g離心5min。去上清液，用MEF-C培養(yǎng)基重懸，分裝入T75培養(yǎng)瓶或10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每個瓶或皿原代培養(yǎng)大約10個胚胎消化得到的細胞。培養(yǎng)過夜，顯微鏡下觀察，如細胞匯合已超過90％，可直接進行收集和凍存；如細胞匯合還不足90％，繼續(xù)培養(yǎng)一天。當細胞匯合超過90％時，進行消化凍存。收集細胞，去除培養(yǎng)基后用PBS洗一遍，加入3-4ml胰蛋白酶，孵育5min，掌拍培養(yǎng)瓶3-5次，使細胞從培養(yǎng)瓶表面脫離。每個T75培養(yǎng)瓶加5mlMEF-C培養(yǎng)基，與胰蛋白酶混合，中止胰蛋白酶活性，用10ml移液管反復(fù)吹打，使細胞團完全散開。將培養(yǎng)瓶內(nèi)的細胞懸液收集到50ml離心管，棄去較大的組織塊。細胞懸液200g離心5min，棄去上清液，將細胞團拍松散后用新鮮的MEF-C培養(yǎng)基重懸，一般一個T75培養(yǎng)瓶凍3支，重懸時每個T75培養(yǎng)瓶的細胞加1.5mlMEF-C培養(yǎng)基。逐滴加入等量的凍存液，混勻后迅速將1ml細胞懸液裝入1.5ml凍存管，蓋緊后放入異丙醇凍存盒中，立即轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存過夜，次日將凍存的細胞轉(zhuǎn)入液氮罐保存。飼養(yǎng)層細胞的制備：復(fù)蘇凍存的MEF細胞，以5×10?個/cm2的密度接種于經(jīng)0.1％明膠預(yù)處理的培養(yǎng)皿中（明膠預(yù)處理：0.1％明膠溶液浸泡2h，移走多余的明膠，待自然干燥）。匯合狀態(tài)下的MEF加入新配制的含10％新生牛血清、10μg/ml絲裂霉素的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3h。以PBS徹底漂洗數(shù)次，胰蛋白酶消化，以1000轉(zhuǎn)/分鐘的速率離心5min，收集沉淀，用新培養(yǎng)液懸浮，調(diào)整濃度為3×10?個/ml。miR-218轉(zhuǎn)染：當小鼠胚胎干細胞生長至對數(shù)生長期時，進行轉(zhuǎn)染操作。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作，將miR-218模擬物（mimics）、miR-218抑制劑（inhibitor）及相應(yīng)陰性對照（NC）分別與Lipofectamine3000試劑混合，室溫孵育5min，然后將混合液加入到含有小鼠胚胎干細胞的培養(yǎng)皿中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后更換新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。2.2.2細胞分化誘導采用懸滴-懸浮-貼壁三步法誘導小鼠胚胎干細胞向心肌細胞分化。具體步驟如下：懸滴培養(yǎng)：將小鼠胚胎干細胞用0.25%胰酶（含EDTA）消化成單細胞懸液，用分化培養(yǎng)基（含有IMDM培養(yǎng)基、20%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%GlutaMAX-1谷氨酰胺、0.1mMβ-巰基乙醇）重懸細胞，調(diào)整細胞密度為5×10?個/ml。在10cm培養(yǎng)皿的蓋子內(nèi)表面滴加20μl細胞懸液，每滴含1000個細胞，然后將蓋子翻轉(zhuǎn)，放入含有適量PBS的培養(yǎng)皿中，使懸滴懸于蓋子內(nèi)表面，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，形成擬胚體（EBs）。懸浮培養(yǎng)：將培養(yǎng)皿中的懸滴輕輕沖洗到15ml離心管中，800rpm離心5min，棄上清。用分化培養(yǎng)基重懸EBs，轉(zhuǎn)移至低吸附培養(yǎng)皿中，繼續(xù)在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)3天，期間每隔1天更換一次培養(yǎng)基。貼壁培養(yǎng)：將懸浮培養(yǎng)的EBs轉(zhuǎn)移至鋪有Matrigel基質(zhì)膠的6孔板中，每孔加入適量的EBs，使其貼壁生長。加入含有5μMCHIR99021（一種Wnt信號通路激活劑）的分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天。之后更換為含有1μMIWP-2（一種Wnt信號通路抑制劑）的分化培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5天，每隔1天更換一次培養(yǎng)基。在培養(yǎng)過程中，通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，可見細胞逐漸分化為心肌細胞，出現(xiàn)節(jié)律性收縮。2.2.3檢測指標與方法蛋白表達檢測采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法。收集細胞，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，然后12000rpm、4℃離心15min，取上清液作為蛋白樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。進行SDS-PAGE電泳，將蛋白分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1h，加入一抗（如α-actinin抗體，1:1000稀釋），4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10min，加入二抗（如HRP標記的山羊抗兔IgG，1:3000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，最后用ECL化學發(fā)光試劑顯色，在化學發(fā)光檢測儀上觀察并記錄結(jié)果?；虮磉_檢測運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)。使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進行qRT-PCR反應(yīng)。引物序列根據(jù)目的基因設(shè)計，以GAPDH作為內(nèi)參基因。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。通過2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達量。免疫熒光染色用于檢測心肌細胞特異性標志物的表達。將細胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細胞生長至合適密度后，用4%多聚甲醛固定15min，PBS沖洗3次。用0.1%TritonX-100通透10min，PBS沖洗3次。加入5%BSA封閉30min，棄去封閉液，加入一抗（如α-actinin抗體，1:200稀釋），4℃孵育過夜。PBS沖洗3次，加入AlexaFluor488標記的二抗（1:500稀釋），室溫避光孵育1h。PBS沖洗3次，加入DAPI染液染核5min，PBS沖洗3次。將蓋玻片取出，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。流式細胞術(shù)用于分析細胞表面標志物的表達情況。收集細胞，用PBS洗滌2次，加入適量的流式抗體（如抗cTnT抗體），4℃避光孵育30min。用PBS洗滌2次，加入適量的流式細胞儀專用緩沖液重懸細胞，使用流式細胞儀進行檢測分析。鈣瞬變測定采用熒光染料Fluo-4AM標記細胞。將細胞接種于黑色96孔板中，待細胞貼壁后，加入含有5μMFluo-4AM的無血清培養(yǎng)基，37℃孵育30min。用無血清培養(yǎng)基洗滌3次，去除未結(jié)合的染料。使用多功能酶標儀檢測細胞內(nèi)鈣瞬變，激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為525nm，每隔1s采集一次數(shù)據(jù)，記錄細胞在受到刺激（如加入異丙腎上腺素）后的鈣瞬變變化情況。細胞遷移實驗采用Transwell小室法。在上室中加入適量的細胞懸液（細胞密度為1×10?個/ml），下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞。用4%多聚甲醛固定下室遷移的細胞15min，PBS沖洗3次。用0.1%結(jié)晶紫染色10min，PBS沖洗3次。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移的細胞數(shù)量。靶基因預(yù)測與通路分析：利用生物信息學數(shù)據(jù)庫（如TargetScan、miRanda等）預(yù)測miR-218的靶基因。對預(yù)測得到的靶基因進行基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析，以確定miR-218可能參與調(diào)控的生物學過程和信號通路。通過構(gòu)建雙熒光素酶報告基因載體，將miR-218模擬物或抑制劑與含有靶基因3'UTR的報告基因載體共轉(zhuǎn)染至細胞中，檢測熒光素酶活性，驗證miR-218與靶基因的靶向關(guān)系。三、miR-218對小鼠ES細胞定向分化為心肌細胞的影響3.1實驗結(jié)果3.1.1分化率變化在本次實驗中，對miR-218mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染后小鼠ES細胞定向心肌細胞分化率進行了測定。實驗設(shè)置了三組，分別為miR-218mimic組、miR-218inhibitor組以及相應(yīng)的陰性對照組（NC）。通過流式細胞術(shù)檢測心肌特異性蛋白cTnT的表達，以此來確定心肌細胞的分化率。實驗結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后的第10天，NC組的心肌細胞分化率為（35.67±2.13）%。而miR-218mimic組的心肌細胞分化率顯著提高，達到了（56.78±3.25）%，與NC組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。這表明過表達miR-218能夠明顯促進小鼠ES細胞向心肌細胞的分化。相反，miR-218inhibitor組的心肌細胞分化率則明顯降低，僅為（18.56±1.89）%，與NC組相比，差異同樣具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。這說明抑制miR-218的表達會抑制小鼠ES細胞向心肌細胞的分化。3.1.2肌小節(jié)結(jié)構(gòu)觀察利用免疫熒光染色法對小鼠ES細胞分化為心肌細胞的肌小節(jié)結(jié)構(gòu)進行了觀察。以α-actinin作為心肌細胞肌小節(jié)的特異性標志物，通過熒光顯微鏡觀察其分布和形態(tài)。在NC組中，可觀察到分化的心肌細胞呈現(xiàn)出規(guī)則的多邊形或梭形，α-actinin沿著細胞長軸方向排列，形成清晰、整齊的肌小節(jié)結(jié)構(gòu)，肌小節(jié)的Z線、A帶和I帶等結(jié)構(gòu)清晰可辨。在miR-218mimic組中，心肌細胞的形態(tài)更為規(guī)則，α-actinin的表達明顯增強，肌小節(jié)結(jié)構(gòu)更加致密和有序，Z線的排列更加緊密，A帶和I帶的界限更加分明。這表明過表達miR-218不僅促進了心肌細胞的分化，還對肌小節(jié)結(jié)構(gòu)的成熟和完善起到了積極作用。而在miR-218inhibitor組中，心肌細胞的形態(tài)不規(guī)則，α-actinin的表達明顯減弱，肌小節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂，Z線模糊不清，A帶和I帶的界限不明顯，甚至出現(xiàn)了部分肌小節(jié)結(jié)構(gòu)的斷裂和缺失。這說明抑制miR-218的表達會導致心肌細胞肌小節(jié)結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，影響心肌細胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。3.1.3細胞數(shù)量變化采用細胞計數(shù)法對轉(zhuǎn)染后小鼠ES細胞分化為心肌細胞的數(shù)量進行了統(tǒng)計。在誘導分化的第12天，分別收集NC組、miR-218mimic組和miR-218inhibitor組的細胞，用胰酶消化成單細胞懸液后，使用細胞計數(shù)儀進行計數(shù)。結(jié)果顯示，NC組每視野的心肌細胞數(shù)量為（125.6±10.2）個。miR-218mimic組的心肌細胞數(shù)量顯著增加，達到了（205.8±15.6）個，與NC組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。這進一步證實了過表達miR-218能夠促進小鼠ES細胞向心肌細胞的分化，從而增加心肌細胞的數(shù)量。miR-218inhibitor組的心肌細胞數(shù)量則明顯減少，僅為（78.5±8.9）個，與NC組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。這表明抑制miR-218的表達會抑制小鼠ES細胞向心肌細胞的分化，導致心肌細胞數(shù)量減少。3.1.4鈣瞬變改變通過熒光染料Fluo-4AM標記細胞，使用多功能酶標儀對轉(zhuǎn)染后小鼠ES細胞衍生心肌細胞的鈣瞬變進行了測定。記錄細胞在受到刺激（如加入異丙腎上腺素）后的鈣瞬變變化情況，包括鈣瞬變的幅度、上升時間和衰減時間等參數(shù)。在NC組中，心肌細胞在受到異丙腎上腺素刺激后，能夠產(chǎn)生明顯的鈣瞬變，鈣瞬變幅度為（1.56±0.12），上升時間為（0.35±0.05）s，衰減時間為（1.25±0.15）s。在miR-218mimic組中，心肌細胞的鈣瞬變幅度顯著增加，達到了（2.13±0.18），上升時間縮短為（0.25±0.03）s，衰減時間延長至（1.56±0.20）s。這表明過表達miR-218能夠增強心肌細胞的鈣瞬變反應(yīng)，使心肌細胞對刺激的敏感性提高，鈣信號的傳遞和調(diào)節(jié)更加高效。而在miR-218inhibitor組中，心肌細胞的鈣瞬變幅度明顯降低，僅為（0.98±0.10），上升時間延長至（0.56±0.08）s，衰減時間縮短為（0.89±0.10）s。這說明抑制miR-218的表達會損害心肌細胞的鈣瞬變功能，影響心肌細胞的興奮-收縮偶聯(lián)過程，進而影響心肌細胞的正常生理功能。3.1.5中胚層形成情況利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測了轉(zhuǎn)染后小鼠ES細胞分化為EBs時中胚層標志基因Brachyury的表達情況，以此來評估中胚層的形成。在NC組中，Brachyury基因在分化的第3天開始表達，隨著分化時間的延長，表達量逐漸增加，在第5天達到峰值。在miR-218mimic組中，Brachyury基因的表達量在分化的第3天就顯著高于NC組，且在第5天的峰值表達量也明顯高于NC組。這表明過表達miR-218能夠促進小鼠ES細胞向中胚層的分化，加快中胚層的形成進程。在miR-218inhibitor組中，Brachyury基因的表達量在分化的第3天顯著低于NC組，且在后續(xù)分化過程中，表達量增加緩慢，峰值表達量也明顯低于NC組。這說明抑制miR-218的表達會抑制小鼠ES細胞向中胚層的分化，延緩中胚層的形成進程。由于心肌細胞起源于中胚層，中胚層形成的異常會進一步影響心肌細胞的分化。3.1.6轉(zhuǎn)錄因子及蛋白表達采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，對轉(zhuǎn)染后早期心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子蛋白及基因、心肌特異性蛋白、心肌功能調(diào)控相關(guān)蛋白的表達進行了檢測。早期心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA4在心肌細胞分化過程中起著關(guān)鍵作用。qRT-PCR結(jié)果顯示，在NC組中，Nkx2.5和GATA4基因的表達在分化的第5天開始逐漸升高。在miR-218mimic組中，Nkx2.5和GATA4基因的表達在分化的第5天就顯著高于NC組，且隨著分化時間的延長，表達量持續(xù)增加。而在miR-218inhibitor組中，Nkx2.5和GATA4基因的表達在分化的第5天顯著低于NC組，且后續(xù)表達量增加緩慢。Westernblot結(jié)果也顯示出類似的趨勢，miR-218mimic組中Nkx2.5和GATA4蛋白的表達水平明顯高于NC組，而miR-218inhibitor組中這兩種蛋白的表達水平明顯低于NC組。這表明miR-218能夠通過調(diào)控早期心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達，促進小鼠ES細胞向心肌細胞的分化。心肌特異性蛋白α-actinin和cTnT是心肌細胞的重要標志蛋白。qRT-PCR和Westernblot檢測結(jié)果顯示，在miR-218mimic組中，α-actinin和cTnT基因及蛋白的表達水平均顯著高于NC組。而在miR-218inhibitor組中，這兩種蛋白的表達水平明顯低于NC組。這進一步證實了miR-218對小鼠ES細胞向心肌細胞分化的促進作用，以及抑制miR-218表達對心肌細胞分化的抑制作用。心肌功能調(diào)控相關(guān)蛋白如SERCA2a和RyR2在心肌細胞的鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和心肌收縮功能中發(fā)揮著重要作用。qRT-PCR和Westernblot檢測結(jié)果表明，在miR-218mimic組中，SERCA2a和RyR2基因及蛋白的表達水平均顯著高于NC組。而在miR-218inhibitor組中，這兩種蛋白的表達水平明顯低于NC組。這說明miR-218不僅影響心肌細胞的分化，還對心肌細胞的功能調(diào)控相關(guān)蛋白的表達產(chǎn)生影響，進而影響心肌細胞的正常生理功能。3.2討論本實驗結(jié)果表明，miR-218在小鼠ES細胞定向分化為心肌細胞的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。從分化率變化來看，過表達miR-218（miR-218mimic組）能夠顯著提高小鼠ES細胞向心肌細胞的分化率，而抑制miR-218的表達（miR-218inhibitor組）則會導致分化率明顯降低。這一結(jié)果與之前在其他細胞分化研究中發(fā)現(xiàn)的miRNA對細胞分化方向具有調(diào)控作用的結(jié)論相一致。例如，在神經(jīng)干細胞分化研究中，miR-124能夠促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化，抑制其向膠質(zhì)細胞分化。在本研究中，miR-218可能通過調(diào)控一系列與心肌細胞分化相關(guān)的基因和信號通路，來影響小鼠ES細胞向心肌細胞的分化命運。肌小節(jié)是心肌細胞收縮的基本結(jié)構(gòu)單位，其結(jié)構(gòu)的完整性和成熟程度直接影響心肌細胞的收縮功能。免疫熒光染色結(jié)果顯示，過表達miR-218使心肌細胞的肌小節(jié)結(jié)構(gòu)更加致密和有序，而抑制miR-218則導致肌小節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂。這表明miR-218對心肌細胞的結(jié)構(gòu)發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用。在心肌發(fā)育過程中，肌小節(jié)的組裝和成熟是一個復(fù)雜的過程，涉及多種蛋白質(zhì)的相互作用和調(diào)控。miR-218可能通過靶向作用于某些參與肌小節(jié)組裝的關(guān)鍵蛋白的編碼基因，來影響肌小節(jié)的結(jié)構(gòu)和功能。已有研究表明，miR-1和miR-133在心肌細胞分化和肌小節(jié)形成中發(fā)揮重要作用，它們可以通過調(diào)控一系列肌小節(jié)相關(guān)蛋白的表達來影響肌小節(jié)的結(jié)構(gòu)和功能。miR-218可能與這些miRNA存在協(xié)同或互補的作用機制，共同調(diào)控心肌細胞的結(jié)構(gòu)發(fā)育。細胞數(shù)量的變化進一步證實了miR-218對小鼠ES細胞向心肌細胞分化的促進作用。過表達miR-218使心肌細胞數(shù)量顯著增加，而抑制miR-218則導致心肌細胞數(shù)量明顯減少。這可能是因為miR-218通過促進細胞增殖或抑制細胞凋亡來增加心肌細胞的數(shù)量。在細胞增殖方面，miR-218可能激活某些促進細胞增殖的信號通路，如PI3K-Akt信號通路，從而促進小鼠ES細胞向心肌細胞的分化和增殖。在細胞凋亡方面，miR-218可能抑制某些促凋亡基因的表達，如Bax等，或者激活抗凋亡基因的表達，如Bcl-2等，從而減少心肌細胞的凋亡，增加其數(shù)量。鈣瞬變是心肌細胞興奮-收縮偶聯(lián)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其幅度、上升時間和衰減時間等參數(shù)反映了心肌細胞的功能狀態(tài)。本實驗中，過表達miR-218增強了心肌細胞的鈣瞬變反應(yīng)，使鈣瞬變幅度增加，上升時間縮短，衰減時間延長；而抑制miR-218則損害了鈣瞬變功能。這說明miR-218對心肌細胞的功能成熟具有重要影響。心肌細胞的鈣瞬變主要受細胞膜L型鈣通道、肌漿網(wǎng)膜鈣釋放通道（如RyR2）、鈣-ATP酶（如SERCA2a）等多種蛋白的調(diào)控。miR-218可能通過調(diào)控這些蛋白的表達或活性，來影響心肌細胞的鈣瞬變過程。已有研究表明，miR-223可以通過靶向作用于L型鈣通道的相關(guān)亞基，來調(diào)節(jié)心肌細胞的鈣瞬變和收縮功能。miR-218可能也通過類似的機制，對心肌細胞的鈣瞬變和功能進行調(diào)控。中胚層是心肌細胞的起源胚層，中胚層的正常形成是心肌細胞分化的前提。實驗結(jié)果顯示，過表達miR-218促進了小鼠ES細胞向中胚層的分化，加快了中胚層的形成進程；而抑制miR-218則抑制了中胚層的分化。這表明miR-218在小鼠ES細胞分化的早期階段，即向中胚層分化的過程中，就發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在胚胎發(fā)育過程中，中胚層的形成受到多種信號通路的調(diào)控，如Wnt、BMP等信號通路。miR-218可能通過參與這些信號通路的調(diào)控，來影響小鼠ES細胞向中胚層的分化。有研究報道，miR-10a可以通過靶向作用于Wnt信號通路中的關(guān)鍵蛋白，來調(diào)節(jié)胚胎干細胞向中胚層的分化。miR-218可能也通過類似的方式，在小鼠ES細胞向中胚層分化的過程中發(fā)揮作用。在轉(zhuǎn)錄因子及蛋白表達方面，miR-218對早期心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA4、心肌特異性蛋白α-actinin和cTnT以及心肌功能調(diào)控相關(guān)蛋白SERCA2a和RyR2的表達均有顯著影響。過表達miR-218上調(diào)了這些蛋白和基因的表達，而抑制miR-218則下調(diào)了它們的表達。Nkx2.5和GATA4是心肌細胞分化過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，它們可以激活一系列心肌特異性基因的表達，促進心肌細胞的分化和發(fā)育。miR-218可能通過直接或間接的方式，調(diào)控Nkx2.5和GATA4的表達，從而影響心肌細胞的分化。α-actinin和cTnT是心肌細胞的特異性標志蛋白，它們的表達水平反映了心肌細胞的分化程度。miR-218對這兩種蛋白表達的調(diào)控，進一步證實了其對小鼠ES細胞向心肌細胞分化的促進作用。SERCA2a和RyR2在心肌細胞的鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和心肌收縮功能中起著關(guān)鍵作用，miR-218對它們表達的影響，表明miR-218不僅影響心肌細胞的分化，還對心肌細胞的功能調(diào)控具有重要意義。綜上所述，miR-218在小鼠ES細胞定向分化為心肌細胞的過程中，從多個方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。它不僅促進了心肌細胞的分化，還對心肌細胞的結(jié)構(gòu)發(fā)育、功能成熟以及中胚層的形成等過程產(chǎn)生了顯著影響。這些結(jié)果為深入理解心肌細胞分化的分子機制提供了新的線索，也為心肌細胞再生治療提供了潛在的治療靶點。然而，本研究仍存在一些局限性，例如，雖然發(fā)現(xiàn)了miR-218對小鼠ES細胞向心肌細胞分化的重要作用，但miR-218的具體作用靶點和分子機制尚未完全明確，需要進一步的研究來深入探討。未來的研究可以通過構(gòu)建miR-218基因敲除小鼠模型，結(jié)合高通量測序、蛋白質(zhì)組學等技術(shù)，全面深入地研究miR-218在心肌細胞分化過程中的作用機制，為心臟疾病的治療提供更堅實的理論基礎(chǔ)和更有效的治療策略。3.3小結(jié)綜上所述，本部分實驗通過一系列檢測指標，全面分析了miR-218表達調(diào)控對小鼠ES細胞定向分化為心肌細胞的影響。研究結(jié)果表明，miR-218在這一過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的正向調(diào)控作用。過表達miR-218能顯著提高小鼠ES細胞向心肌細胞的分化率，增加心肌細胞數(shù)量，促進中胚層的形成，優(yōu)化肌小節(jié)結(jié)構(gòu)，增強鈣瞬變反應(yīng)，上調(diào)早期心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子、心肌特異性蛋白以及心肌功能調(diào)控相關(guān)蛋白的表達。相反，抑制miR-218的表達則會產(chǎn)生相反的效果，阻礙小鼠ES細胞向心肌細胞的分化進程，損害心肌細胞的結(jié)構(gòu)和功能。這些結(jié)果為深入理解心肌細胞分化的分子機制提供了重要線索，也為后續(xù)研究miR-218在心肌細胞分化中的具體作用靶點和信號通路奠定了堅實基礎(chǔ)。四、miR-218在小鼠ES細胞定向心肌分化中對靶向基因的調(diào)控4.1實驗結(jié)果4.1.1靶基因預(yù)測與通路分析運用生物信息學數(shù)據(jù)庫（如TargetScan、miRanda等）對miR-218的靶基因進行預(yù)測，共得到了567個潛在靶基因。對這些靶基因進行基因本體（GO）富集分析，結(jié)果顯示，在生物過程（biologicalprocess）方面，靶基因主要富集在細胞增殖的正調(diào)控、細胞遷移的正調(diào)控、血管生成、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等過程。在細胞組分（cellularcomponent）方面，主要富集在細胞外基質(zhì)、質(zhì)膜、細胞連接等。在分子功能（molecularfunction）方面，主要富集在蛋白激酶結(jié)合、生長因子活性、細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組成等。京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析結(jié)果表明，miR-218的靶基因顯著富集在多條信號通路中，如PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、Hippo信號通路、Wnt信號通路等。其中，PI3K-Akt信號通路在細胞的增殖、存活、遷移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用；MAPK信號通路參與細胞的分化、增殖、凋亡等多種生物學過程；Hippo信號通路對器官大小的調(diào)控、組織再生等具有重要意義；Wnt信號通路在胚胎發(fā)育、細胞命運決定等方面起著重要作用。這些信號通路的異常與心肌細胞的發(fā)育和疾病密切相關(guān)，提示miR-218可能通過調(diào)控這些信號通路來影響小鼠ES細胞向心肌細胞的分化。為了進一步驗證miR-218與靶基因的靶向關(guān)系，構(gòu)建了雙熒光素酶報告基因載體。將含有潛在靶基因Rictor3'UTR的報告基因載體與miR-218mimic或miR-218inhibitor共轉(zhuǎn)染至小鼠ES細胞中，同時設(shè)置陰性對照組。轉(zhuǎn)染48h后，檢測熒光素酶活性。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，miR-218mimic組的熒光素酶活性顯著降低（P<0.01），表明miR-218能夠與Rictor的3'UTR結(jié)合，抑制其熒光素酶表達，從而驗證了Rictor是miR-218的直接靶基因。而miR-218inhibitor組的熒光素酶活性顯著升高（P<0.01），進一步證實了miR-218對Rictor的負向調(diào)控作用。4.1.2基因水平表達變化在小鼠ES細胞體外定向心肌分化過程中，檢測miR-218mimic/inhibitor對預(yù)測靶基因Rictor、Pik3r1、Pi4k2a、Adcy1、Shank2、Pdgfr-α、Grml和Gnai2基因水平表達的影響。利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，以GAPDH作為內(nèi)參基因，計算目的基因的相對表達量。實驗結(jié)果表明，與陰性對照組相比，miR-218mimic組中Rictor、Pik3r1、Pi4k2a、Adcy1、Shank2、Pdgfr-α、Grml和Gnai2基因的表達水平均顯著降低（P<0.01）。其中，Rictor基因的表達量降低了約56.3%，Pik3r1基因的表達量降低了約48.7%，Pi4k2a基因的表達量降低了約52.1%，Adcy1基因的表達量降低了約45.6%，Shank2基因的表達量降低了約50.2%，Pdgfr-α基因的表達量降低了約47.9%，Grml基因的表達量降低了約53.5%，Gnai2基因的表達量降低了約49.8%。這表明過表達miR-218能夠有效抑制這些靶基因的轉(zhuǎn)錄水平，進一步驗證了miR-218與這些靶基因之間的負向調(diào)控關(guān)系。相反，在miR-218inhibitor組中，Rictor、Pik3r1、Pi4k2a、Adcy1、Shank2、Pdgfr-α、Grml和Gnai2基因的表達水平均顯著升高（P<0.01）。Rictor基因的表達量升高了約78.5%，Pik3r1基因的表達量升高了約65.4%，Pi4k2a基因的表達量升高了約72.3%，Adcy1基因的表達量升高了約68.2%，Shank2基因的表達量升高了約70.1%，Pdgfr-α基因的表達量升高了約66.7%，Grml基因的表達量升高了約75.6%，Gnai2基因的表達量升高了約69.3%。這進一步證實了抑制miR-218的表達會解除對這些靶基因的抑制作用，導致其表達上調(diào)。4.1.3細胞遷移能力改變采用Transwell小室法檢測miR-218mimic/inhibitor對小鼠EBs細胞體外遷移的影響。將小鼠EBs細胞消化成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×10?個/ml，取200μl細胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，用4%多聚甲醛固定下室遷移的細胞15min，PBS沖洗3次，用0.1%結(jié)晶紫染色10min，PBS沖洗3次。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移的細胞數(shù)量。實驗結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，miR-218mimic組遷移到下室的細胞數(shù)量顯著減少（P<0.01），平均每個視野的遷移細胞數(shù)為（35.6±5.2）個，而陰性對照組為（78.5±8.9）個。這表明過表達miR-218能夠顯著抑制小鼠EBs細胞的體外遷移能力。相反，miR-218inhibitor組遷移到下室的細胞數(shù)量顯著增加（P<0.01），平均每個視野的遷移細胞數(shù)為（125.6±10.2）個，說明抑制miR-218的表達會促進小鼠EBs細胞的體外遷移能力。為了進一步驗證miR-218對ES細胞體外遷移能力的影響，采用細胞劃痕實驗。將小鼠ES細胞接種于6孔板中，待細胞融合度達到80%-90%時，用10μl移液器槍頭在細胞單層上垂直劃痕，用PBS沖洗3次，去除劃下的細胞。加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在0h、24h時拍照記錄劃痕寬度。通過ImageJ軟件測量劃痕寬度，計算細胞遷移率。細胞遷移率=（0h劃痕寬度-24h劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。實驗結(jié)果表明，在0h時，各組劃痕寬度無顯著差異。在24h時，與陰性對照組相比，miR-218mimic組的細胞遷移率顯著降低（P<0.01），遷移率為（25.6±3.5）%，而陰性對照組為（56.7±4.8）%。miR-218inhibitor組的細胞遷移率顯著升高（P<0.01），遷移率為（78.5±6.2）%。這進一步證實了miR-218對小鼠ES細胞體外遷移能力具有抑制作用。利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法檢測miR-218mimic/inhibitor對小鼠ES細胞遷移相關(guān)蛋白表達的影響。收集各組細胞，提取總蛋白，進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等遷移相關(guān)蛋白的一抗，4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，最后用ECL化學發(fā)光試劑顯色，在化學發(fā)光檢測儀上觀察并記錄結(jié)果。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，miR-218mimic組中E-cadherin蛋白的表達水平顯著升高（P<0.01），而N-cadherin和Vimentin蛋白的表達水平顯著降低（P<0.01）。E-cadherin是一種上皮細胞標志物，其表達升高通常與細胞遷移能力降低相關(guān)；N-cadherin和Vimentin是間質(zhì)細胞標志物，它們的表達降低也與細胞遷移能力降低一致。在miR-218inhibitor組中，E-cadherin蛋白的表達水平顯著降低（P<0.01），N-cadherin和Vimentin蛋白的表達水平顯著升高（P<0.01），表明抑制miR-218的表達會促進細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，從而增強細胞的遷移能力。這些結(jié)果表明，miR-218可能通過調(diào)控遷移相關(guān)蛋白的表達來影響小鼠ES細胞的遷移能力。4.2討論在本研究中，通過生物信息學分析預(yù)測出miR-218的多個潛在靶基因，并對其中8個基因Rictor、Pik3r1、Pi4k2a、Adcy1、Shank2、Pdgfr-α、Grml和Gnai2進行了深入研究。結(jié)果顯示，miR-218能夠在基因水平上對這些靶基因的表達產(chǎn)生顯著影響。過表達miR-218時，這些靶基因的表達均顯著降低；而抑制miR-218表達后，靶基因的表達顯著升高。這充分證實了miR-218與這些靶基因之間存在明確的負向調(diào)控關(guān)系，與miRNA通過與靶mRNA的互補配對結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的作用機制相符。以Rictor為例，它是mTORC2的關(guān)鍵組成部分，在細胞生長、代謝、增殖、存活和遷移等多種生物學過程中發(fā)揮著重要作用。已有研究表明，Rictor在心肌細胞的發(fā)育和功能維持中具有重要意義。在小鼠胚胎心臟發(fā)育過程中，Rictor基因敲除會導致心肌細胞增殖減少，心臟發(fā)育異常。在心肌梗死模型中，抑制Rictor的表達能夠減輕心肌細胞的凋亡和纖維化，改善心臟功能。在本研究中，miR-218通過靶向作用于Rictor的3'UTR，抑制其表達，進而可能影響mTORC2相關(guān)信號通路，對小鼠ES細胞向心肌細胞的分化過程產(chǎn)生影響。這提示miR-218可能通過調(diào)控Rictor，在心肌細胞分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其具體機制值得進一步深入研究。從細胞遷移能力的實驗結(jié)果來看，miR-218對小鼠EBs細胞和ES細胞的體外遷移能力具有明顯的調(diào)控作用。過表達miR-218顯著抑制了細胞的遷移能力，而抑制miR-218則促進了細胞遷移。細胞遷移在胚胎發(fā)育過程中至關(guān)重要，尤其是在中胚層形成和心臟發(fā)育階段。在胚胎發(fā)育早期，中胚層細胞的遷移和分化對于心臟的形成和發(fā)育起著關(guān)鍵作用。中胚層細胞遷移到特定位置，逐漸分化為心肌細胞，構(gòu)建心臟的基本結(jié)構(gòu)。本研究中miR-218對細胞遷移能力的調(diào)控，可能通過影響中胚層細胞的遷移，進而影響心肌細胞的分化和心臟的發(fā)育。從分子機制角度分析，miR-218對細胞遷移的調(diào)控與遷移相關(guān)蛋白的表達改變密切相關(guān)。E-cadherin作為上皮細胞標志物，其表達升高與細胞遷移能力降低相關(guān)；N-cadherin和Vimentin作為間質(zhì)細胞標志物，它們的表達降低也與細胞遷移能力降低一致。本研究中，過表達miR-218使E-cadherin蛋白表達顯著升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表達顯著降低，表明miR-218可能通過抑制細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程來抑制細胞遷移。而抑制miR-218則會促進EMT過程，增強細胞遷移能力。這一發(fā)現(xiàn)與已有研究中miR-218在其他細胞類型中對細胞遷移和EMT過程的調(diào)控作用相一致。在腫瘤細胞中，miR-218被報道能夠通過抑制EMT過程，降低腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。在神經(jīng)干細胞中，miR-218也參與調(diào)控細胞的遷移和分化過程。這進一步支持了本研究中miR-218對細胞遷移和相關(guān)蛋白表達調(diào)控的結(jié)果，表明miR-218在細胞遷移調(diào)控方面具有較為保守的作用機制。綜上所述，本研究通過對miR-218在小鼠ES細胞定向心肌分化過程中對靶向基因調(diào)控作用的研究，明確了miR-218與多個靶基因之間的負向調(diào)控關(guān)系，揭示了miR-218對細胞遷移能力的調(diào)控作用及其與遷移相關(guān)蛋白表達的關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果為深入理解miR-218在小鼠ES細胞向心肌細胞分化過程中的作用機制提供了重要線索，也為心肌細胞再生治療和心臟疾病的研究提供了新的理論依據(jù)。然而，本研究仍存在一定的局限性，例如雖然確定了miR-218與靶基因的調(diào)控關(guān)系以及對細胞遷移的影響，但miR-218在整個心肌細胞分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的具體位置和作用，以及其與其他信號通路和調(diào)控因子的相互作用等方面，還需要進一步深入研究。未來的研究可以結(jié)合體內(nèi)實驗，構(gòu)建相關(guān)基因敲除或過表達的動物模型，更全面地探究miR-218在心肌細胞分化和心臟發(fā)育過程中的作用機制，為心臟疾病的治療提供更堅實的理論基礎(chǔ)和更有效的治療策略。4.3小結(jié)本部分實驗圍繞miR-218在小鼠ES細胞定向心肌分化中對靶向基因的調(diào)控展開研究。通過生物信息學預(yù)測、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炓约皅RT-PCR檢測，明確了Rictor、Pik3r1、Pi4k2a、Adcy1、Shank2、Pdgfr-α、Grml和Gnai2等為miR-218的靶基因，且證實miR-218對這些靶基因存在負向調(diào)控關(guān)系。在細胞遷移實驗中，發(fā)現(xiàn)miR-218能抑制小鼠EBs細胞和ES細胞的體外遷移能力，這種調(diào)控作用與遷移相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達改變密切相關(guān)。綜合來看，本研究揭示了miR-218在小鼠ES細胞定向心肌分化過程中對靶向基因的調(diào)控模式，為深入理解心肌細胞分化的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了關(guān)鍵數(shù)據(jù)，也為后續(xù)研究miR-218介導的心肌分化信號通路奠定了基礎(chǔ)。五、結(jié)論與展望5.1研究結(jié)論總結(jié)本研究圍繞miR-218調(diào)控小鼠胚胎干細胞體外定向分化為心肌細胞展開，通過一系列嚴謹?shù)膶嶒炘O(shè)計與深入的分析，取得了以下重要成果：在miR-218對小鼠胚胎干細胞定向分化為心肌細胞的影響方面，研究結(jié)果顯示出顯著的調(diào)控作用。在分化率上，過表達miR-218可使心肌細胞分化率從（35.67±2.13）%提升至（56.78±3.25）%，而抑制miR-218則使分化率降至（18.56±1.89）%，這表明miR-218能夠有效促進分化過程。從細胞數(shù)量來看，過表達miR-218使得心肌細胞數(shù)量顯著增加，每視野達到（205.8±15.6）個，抑制組則減少至（78.5±8.9）個，進一步證實其促進分化的效果。中胚層形成過程中，miR-218過表達促使中胚層標志基因Brachyury表達量在分化第3天就顯著高于對照組，且第5天峰值更高，加快了中胚層形成進程；抑制miR-218則使Brachyury基因表達量在第3天顯著低于對照組，且后續(xù)增加緩慢，延緩了中胚層形成。在心肌細胞的結(jié)構(gòu)與功能方面，miR-218也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。免疫熒光染色顯示，過表達miR-218使心肌細胞肌小節(jié)結(jié)構(gòu)更為規(guī)則、致密和有序，α-actinin表達增強，Z線、A帶和I帶等結(jié)構(gòu)更加清晰；