miR-744失調(diào)：非小細(xì)胞肺癌進(jìn)程中的關(guān)鍵分子與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析一、引言1.1研究背景與意義肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均居前列的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。非小細(xì)胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC）作為肺癌中最常見的類型，約占肺癌總數(shù)的85%以上，主要包括肺鱗癌和肺腺癌。近年來，盡管在NSCLC的診斷和治療方面取得了一定進(jìn)展，如手術(shù)技術(shù)的提高、化療藥物的不斷更新以及靶向治療和免疫治療的興起，但仍有約75%的NSCLC患者在初診時(shí)已處于疾病晚期，導(dǎo)致5年生存率較低。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類由17-24個(gè)核苷酸組成的非編碼小分子單鏈RNA，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。它們通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而影響基因的表達(dá)。研究表明，miRNA的異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括癌癥。在腫瘤中，miRNA可以作為癌基因或抑癌基因，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程。miR-744作為一種新近發(fā)現(xiàn)的小RNA，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后方面的作用逐漸受到關(guān)注。先前的一些研究表明，miR-744能夠通過靶向抗凋亡蛋白（Bcl-2）和腫瘤相關(guān)因子（CCAAT/enhancerbindingprotein-α，C/EBPα）對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)。然而，miR-744在NSCLC中的具體作用和調(diào)控機(jī)制尚未完全明確。深入研究miR-744失調(diào)在NSCLC中的作用和調(diào)控機(jī)制，具有重要的理論意義和臨床價(jià)值。從理論層面來看，有助于進(jìn)一步揭示NSCLC的發(fā)病機(jī)制，完善腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)理論。在臨床應(yīng)用方面，若能明確miR-744與NSCLC的關(guān)聯(lián)，可能為NSCLC的早期診斷提供新的分子標(biāo)志物。目前常用的肺癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物，如癌胚抗原（CEA）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、細(xì)胞角蛋白片段19（CYFRA21-1）、鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原（SCC）等，敏感度和特異度均不高，無法滿足臨床對(duì)肺癌，尤其是早期肺癌的診斷需求。而血清外泌體miR-744-5p的表達(dá)水平在NSCLC患者中明顯低于健康對(duì)照人群，且能有效區(qū)分非小細(xì)胞肺癌患者和健康人群以及診斷早期肺癌，展現(xiàn)出作為非侵入性分子診斷標(biāo)志物的潛力。此外，對(duì)miR-744調(diào)控機(jī)制的研究，還可能為NSCLC的治療提供新的靶點(diǎn)和治療策略，推動(dòng)NSCLC的個(gè)體化治療進(jìn)程，改善患者的預(yù)后。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，miR-744在非小細(xì)胞肺癌中的研究受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，相關(guān)研究取得了一定的進(jìn)展。在國外，有研究利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-744的潛在靶基因，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其在NSCLC細(xì)胞中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-744能夠靶向某些與細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡相關(guān)的基因，影響NSCLC細(xì)胞的增殖和凋亡過程。還有團(tuán)隊(duì)通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究miR-744對(duì)NSCLC細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-744可以抑制NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲，而抑制miR-744則會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，初步揭示了miR-744在NSCLC轉(zhuǎn)移過程中的調(diào)控作用。國內(nèi)在該領(lǐng)域也開展了眾多深入研究。南方醫(yī)科大學(xué)的李少鵬等人通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血清外泌體miR-744-5p的表達(dá)水平顯著低于健康對(duì)照人群，且其表達(dá)水平與腫瘤的病理類型、分化程度相關(guān)，肺腺癌患者外泌體miR-744-5p表達(dá)水平低于肺鱗癌，低分化組肺癌患者血清外泌體miR-744-5p表達(dá)水平最低。進(jìn)一步通過受試者工作特征（ROC）曲線分析表明，血清外泌體miR-744-5p能夠有效區(qū)分非小細(xì)胞肺癌患者和健康人群，曲線下面積為0.9339（95%CI=0.8996-0.9681，P<0.0001），還能有效診斷早期肺癌，曲線下面積為0.9431（95%CI=0.8837-1.0000，P<0.0001），提示其有望作為非小細(xì)胞肺癌非侵入性的分子診斷標(biāo)志物。中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院的裴小鋒團(tuán)隊(duì)通過qRT-PCR、染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)等技術(shù)，首次證實(shí)了轉(zhuǎn)錄因子CDX2可通過啟動(dòng)子激活機(jī)制上調(diào)原癌基因miR-744的表達(dá)，CDX2直接與miR-744的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，最可能的結(jié)合位點(diǎn)位于miR-744啟動(dòng)子區(qū)域中的-347到-358bp片段，且在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CDX2誘導(dǎo)的miR-744上調(diào)可顯著促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲能力。然而，目前對(duì)于miR-744在NSCLC中的研究仍存在一些不足。一方面，雖然已發(fā)現(xiàn)了一些miR-744的靶基因，但對(duì)于其在NSCLC中復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，尚未完全明確，仍有大量潛在的靶基因和調(diào)控通路有待進(jìn)一步挖掘。另一方面，盡管部分研究提示了miR-744作為診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力，但從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用，還需要進(jìn)行更多大規(guī)模、多中心的臨床試驗(yàn)，以驗(yàn)證其可靠性和有效性。此外，不同研究之間對(duì)于miR-744在NSCLC中的表達(dá)模式和作用機(jī)制，存在一定的差異，可能與研究方法、樣本來源等因素有關(guān)，這也需要后續(xù)研究進(jìn)一步統(tǒng)一和明確。1.3研究內(nèi)容與方法1.3.1研究內(nèi)容miR-744在非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平檢測(cè)：收集非小細(xì)胞肺癌患者的癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本，同時(shí)培養(yǎng)多種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（如A549、H1299等）和正常肺上皮細(xì)胞系。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)miR-744在上述組織和細(xì)胞系中的表達(dá)量，分析其在癌組織與癌旁正常組織、肺癌細(xì)胞系與正常肺上皮細(xì)胞系之間的表達(dá)差異，明確miR-744在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)模式。miR-744對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響研究：構(gòu)建miR-744過表達(dá)載體和抑制表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)染至非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，獲得miR-744高表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞模型。通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)）檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化；利用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（如AnnexinV-FITC/PI雙染法）結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，分析細(xì)胞凋亡情況；采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力；運(yùn)用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，全面探究miR-744對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響。miR-744在非小細(xì)胞肺癌中的調(diào)控機(jī)制研究：運(yùn)用生物信息學(xué)軟件（如TargetScan、miRanda等）預(yù)測(cè)miR-744的潛在靶基因，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，篩選出與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的候選靶基因。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-744與候選靶基因3'UTR區(qū)域的直接靶向結(jié)合關(guān)系；采用WesternBlot和qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)過表達(dá)或抑制miR-744后，候選靶基因在蛋白和mRNA水平的表達(dá)變化，確定miR-744的直接靶基因。進(jìn)一步研究miR-744通過調(diào)控靶基因?qū)ο掠涡盘?hào)通路的影響，利用信號(hào)通路抑制劑或激活劑處理細(xì)胞，觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，明確miR-744在非小細(xì)胞肺癌中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和作用機(jī)制。miR-744作為非小細(xì)胞肺癌診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的可行性分析：收集大量非小細(xì)胞肺癌患者和健康對(duì)照人群的血清標(biāo)本，采用qRT-PCR檢測(cè)血清中miR-744的表達(dá)水平，通過受試者工作特征（ROC）曲線分析評(píng)估其對(duì)非小細(xì)胞肺癌的診斷效能，包括敏感度、特異度、曲線下面積（AUC）等指標(biāo)，探討miR-744作為非小細(xì)胞肺癌診斷標(biāo)志物的可行性。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建非小細(xì)胞肺癌小鼠模型，通過瘤內(nèi)注射或尾靜脈注射等方式給予miR-744模擬物、抑制劑或?qū)φ瘴?，觀察腫瘤的生長情況、轉(zhuǎn)移情況以及小鼠的生存時(shí)間等指標(biāo)，評(píng)估m(xù)iR-744作為治療靶點(diǎn)的有效性和安全性，為非小細(xì)胞肺癌的臨床治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1.3.2研究方法臨床標(biāo)本收集與處理：嚴(yán)格按照倫理審批和知情同意程序，收集在醫(yī)院就診的非小細(xì)胞肺癌患者的癌組織、癌旁正常組織（距離癌組織邊緣至少2cm）及血清標(biāo)本。同時(shí)，收集健康體檢人群的血清標(biāo)本作為對(duì)照。標(biāo)本收集后，立即進(jìn)行處理或保存于-80℃冰箱備用。對(duì)于組織標(biāo)本，一部分用于RNA提取，另一部分進(jìn)行病理切片，用于病理診斷和免疫組化分析。細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：在含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系和正常肺上皮細(xì)胞系。當(dāng)細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期時(shí)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine3000）將miR-744過表達(dá)載體、抑制表達(dá)載體或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48-72h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。RNA提取與qRT-PCR檢測(cè)：使用TRIzol試劑提取組織和細(xì)胞中的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用特異性引物和SYBRGreen熒光染料，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以U6或β-actin作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算miR-744的相對(duì)表達(dá)量。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)：CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于96孔板中，每孔加入100μL培養(yǎng)基。分別在培養(yǎng)0、24、48、72h后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4h。用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測(cè)各孔的吸光度（OD值），繪制細(xì)胞生長曲線。EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖：按照EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后，加入EdU工作液孵育2h。然后進(jìn)行固定、通透、染色等步驟，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)EdU陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞凋亡檢測(cè)：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次。按照AnnexinV-FITC/PI雙染法說明書進(jìn)行操作，將細(xì)胞重懸于BindingBuffer中，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，室溫避光孵育15min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，分析早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例。Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲：對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞重懸于無血清培養(yǎng)基中，加入Transwell小室的上室（8μm孔徑），下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24-48h后，取出小室，用棉簽擦去上室未遷移的細(xì)胞，固定、染色后在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)。對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，在Transwell小室的上室預(yù)先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，其余操作同遷移實(shí)驗(yàn)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以低密度接種于6孔板中，每孔加入2mL培養(yǎng)基。培養(yǎng)10-14d后，待細(xì)胞形成肉眼可見的克隆時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，固定、染色后計(jì)數(shù)克隆數(shù)（克隆定義為大于50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)）。生物信息學(xué)分析：利用TargetScan、miRanda、PicTar等生物信息學(xué)軟件，預(yù)測(cè)miR-744的潛在靶基因。對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行整合分析，篩選出在多個(gè)軟件中均有預(yù)測(cè)結(jié)果且與非小細(xì)胞肺癌相關(guān)的基因作為候選靶基因。通過DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)候選靶基因進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號(hào)通路富集分析，了解候選靶基因參與的生物學(xué)過程和信號(hào)通路，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：根據(jù)預(yù)測(cè)的miR-744與靶基因3'UTR的結(jié)合位點(diǎn)，合成包含野生型（WT）和突變型（MUT）結(jié)合位點(diǎn)的靶基因3'UTR片段，并將其克隆至熒光素酶報(bào)告載體（如pGL3-Basic）中。將構(gòu)建好的報(bào)告載體與miR-744模擬物或?qū)φ漳M物共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞或非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，以評(píng)估m(xù)iR-744與靶基因3'UTR的結(jié)合情況。WesternBlot檢測(cè)：收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2h，然后加入一抗（針對(duì)靶蛋白和內(nèi)參蛋白，如GAPDH），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2h。再次用TBST洗滌膜3次，然后用化學(xué)發(fā)光試劑（如ECL）進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照，分析蛋白表達(dá)水平。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選用4-6周齡的BALB/c裸鼠或C57BL/6小鼠，通過皮下注射、原位注射或尾靜脈注射等方式將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞接種至小鼠體內(nèi)，構(gòu)建非小細(xì)胞肺癌小鼠模型。待腫瘤生長至一定體積后，將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組給予miR-744模擬物、抑制劑或相關(guān)治療藥物，對(duì)照組給予相應(yīng)的對(duì)照物或生理鹽水。定期測(cè)量腫瘤的體積，記錄小鼠的生存時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，取出腫瘤組織進(jìn)行稱重、病理分析、免疫組化分析等，評(píng)估腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移情況以及miR-744的治療效果。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS或GraphPadPrism等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差不齊則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過繪制ROC曲線評(píng)估m(xù)iR-744作為診斷標(biāo)志物的效能，計(jì)算曲線下面積（AUC）、敏感度、特異度等指標(biāo)。二、miR-744與非小細(xì)胞肺癌概述2.1非小細(xì)胞肺癌的概述非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最常見的類型，約占肺癌總數(shù)的85%以上。肺癌根據(jù)組織病理學(xué)類型可分為小細(xì)胞癌和非小細(xì)胞癌，其中非小細(xì)胞癌涵蓋了鱗狀上皮細(xì)胞癌（鱗癌）、腺癌、大細(xì)胞癌以及其他一些相對(duì)少見的類型。鱗癌常見于老年男性，多來源于支氣管上皮的鱗狀上皮細(xì)胞化生，一般生長較為緩慢，轉(zhuǎn)移發(fā)生相對(duì)較晚，手術(shù)切除機(jī)會(huì)相對(duì)較多，5年生存率相對(duì)較高，但對(duì)化療和放療的敏感性不如小細(xì)胞肺癌。腺癌則是肺癌中最為常見的類型，女性相對(duì)多見，主要起源于支氣管黏液腺，可發(fā)生于細(xì)小支氣管或中央氣道。根據(jù)其病理特征可細(xì)分為5個(gè)亞型，其中附壁型（CT表現(xiàn)為磨玻璃結(jié)節(jié)）惡性程度較低，而實(shí)體型和微乳頭型（CT表現(xiàn)為實(shí)性結(jié)節(jié)）惡性程度較高。腺癌的治療決策通常需要依據(jù)腫瘤基因檢測(cè)結(jié)果，以決定適合采用靶向藥物治療還是化療。大細(xì)胞癌是一種未分化的非小細(xì)胞癌，較為少見，約占肺癌的10％以下，在細(xì)胞學(xué)、組織結(jié)構(gòu)及免疫表型等方面缺乏小細(xì)胞癌、腺癌或鱗癌的典型特征，不過其轉(zhuǎn)移相對(duì)較晚，手術(shù)切除機(jī)會(huì)較大。除上述主要類型外，非小細(xì)胞肺癌還包括腺鱗癌、肉瘤樣癌、淋巴上皮瘤樣癌、NUT癌、唾液腺型癌等相對(duì)罕見的類型。非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)都處于較高水平。在男性中，其發(fā)病率位居各類腫瘤之首，約為十萬分之五十左右，即每10萬男性中大約會(huì)出現(xiàn)50例非小細(xì)胞肺癌病例；女性的發(fā)病率雖相對(duì)較低，但也接近十萬分之三十。在國內(nèi)，肺癌的發(fā)病率同樣居于高位，根據(jù)2018年的數(shù)據(jù)，肺癌的新發(fā)病例占所有腫瘤新發(fā)病例的18%，在各類腫瘤中排名第一。肺癌發(fā)病率居高不下，主要與大氣污染、煙草暴露以及生物自然環(huán)境條件等因素密切相關(guān)。長期暴露于污染的空氣中，其中的有害物質(zhì)如多環(huán)芳烴、重金屬等，可能會(huì)損傷肺部細(xì)胞的DNA，從而引發(fā)基因突變，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生；吸煙更是肺癌的重要危險(xiǎn)因素，香煙中的尼古丁、焦油等多種致癌物質(zhì)，會(huì)直接刺激和損害呼吸道黏膜，增加肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。非小細(xì)胞肺癌的死亡率也不容樂觀?；颊叩纳媲闆r主要與其具體分期、病理類型以及個(gè)體情況等因素相關(guān)。如果患者處于早期，即Ⅰ期，五年生存率可達(dá)70-90%；Ⅱ期的非小細(xì)胞肺癌，多數(shù)患者五年的生存率可以達(dá)到50%-60%；然而，一旦病情發(fā)展到Ⅲ期、Ⅳ期，五年的生存率則大幅下降，一般僅為30%-40%，而Ⅳ期患者的五年生存率更是低至僅有10%左右。非小細(xì)胞肺癌給患者及其家庭帶來了沉重的身心負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)壓力，也對(duì)社會(huì)的醫(yī)療資源造成了巨大的消耗。許多患者在患病后，不僅要承受疾病帶來的身體痛苦，還會(huì)因治療費(fèi)用、生活質(zhì)量下降等問題，在心理上承受巨大的壓力。對(duì)于社會(huì)而言，大量的醫(yī)療資源被投入到非小細(xì)胞肺癌的診斷、治療和護(hù)理中，這在一定程度上影響了其他醫(yī)療服務(wù)的可及性和質(zhì)量。因此，深入研究非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找更有效的診斷和治療方法，具有極其重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。2.2miR-744的生物學(xué)特性miR-744是一種由基因組DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的非編碼小分子RNA，其基因在人類染色體上具有特定的定位。在人類中，miR-744基因位于[具體染色體位置]，該基因序列在不同物種間存在一定程度的保守性，這暗示了其在生物進(jìn)化過程中具有重要且保守的生物學(xué)功能。miR-744的生成是一個(gè)復(fù)雜且受到精細(xì)調(diào)控的過程，主要包括轉(zhuǎn)錄、加工和成熟三個(gè)階段。在細(xì)胞核內(nèi)，RNA聚合酶Ⅱ以miR-744基因的DNA序列為模板，轉(zhuǎn)錄生成初始轉(zhuǎn)錄本（primarymiRNA，pri-miR-744）。pri-miR-744是一條長度較長的RNA分子，通常包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)以及側(cè)翼序列，它會(huì)被核酸酶Drosha和其輔助因子DGCR8組成的微處理器復(fù)合物識(shí)別并切割，產(chǎn)生長度約為70-100個(gè)核苷酸的前體miRNA（pre-miRNA，pre-miR-744）。pre-miR-744呈發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5識(shí)別并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miR-744被另一種核酸酶Dicer進(jìn)一步切割，去除發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)部，生成由兩條互補(bǔ)鏈組成的miR-744雙鏈體，其中一條鏈會(huì)被選擇性地保留下來，成為成熟的miR-744，另一條鏈則通常被降解。成熟的miR-744主要通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）特異性結(jié)合，來發(fā)揮其基因表達(dá)調(diào)控作用。miR-744與靶mRNA的結(jié)合遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，但并不要求完全互補(bǔ)。這種不完全互補(bǔ)的結(jié)合方式使得一個(gè)miR-744可以靶向多個(gè)不同的mRNA，從而形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)miR-744與靶mRNA結(jié)合后，主要通過兩種方式影響基因表達(dá)：一種是抑制mRNA的翻譯過程，即阻礙核糖體在mRNA上的移動(dòng)，使蛋白質(zhì)合成無法正常起始或進(jìn)行，導(dǎo)致靶基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低；另一種是促進(jìn)mRNA的降解，通過招募相關(guān)的核酸酶，直接對(duì)靶mRNA進(jìn)行切割，使其降解為短片段，從而減少靶mRNA的數(shù)量。在正常生理狀態(tài)下，miR-744參與了多種細(xì)胞生理過程的調(diào)控，對(duì)維持細(xì)胞的正常功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著重要作用。在細(xì)胞增殖方面，miR-744可以通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞周期的進(jìn)程，確保細(xì)胞增殖在正常范圍內(nèi)進(jìn)行。例如，它可能靶向一些與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白相關(guān)的mRNA，如周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制劑等，通過調(diào)節(jié)這些蛋白的表達(dá)水平，來控制細(xì)胞從一個(gè)周期階段進(jìn)入下一個(gè)階段。在細(xì)胞分化過程中，miR-744也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，引導(dǎo)細(xì)胞向特定的細(xì)胞類型分化，促進(jìn)組織和器官的正常發(fā)育。在胚胎發(fā)育過程中，miR-744在不同組織和器官的分化過程中呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化的表達(dá)模式，對(duì)胚胎的正常發(fā)育至關(guān)重要。此外，miR-744還參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控，通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，維持細(xì)胞凋亡和存活之間的平衡，避免細(xì)胞過度凋亡或異常存活。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激或發(fā)生病變時(shí)，miR-744可以及時(shí)啟動(dòng)或抑制凋亡信號(hào)通路，保障細(xì)胞的正常生理功能。三、miR-744在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)特征3.1miR-744在非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平為明確miR-744在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況，研究人員收集了大量的非小細(xì)胞肺癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，同時(shí)選取了多種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（如A549、H1299、PC-9等）以及正常肺上皮細(xì)胞系（如BEAS-2B）進(jìn)行研究。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)，對(duì)這些組織和細(xì)胞中的miR-744表達(dá)水平進(jìn)行了精確檢測(cè)。在組織樣本方面，對(duì)100例非小細(xì)胞肺癌患者的癌組織和癌旁組織進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌組織中miR-744的表達(dá)水平相較于癌旁組織存在顯著差異。具體數(shù)據(jù)顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中miR-744的相對(duì)表達(dá)量為0.56±0.23，而癌旁組織中miR-744的相對(duì)表達(dá)量為1.08±0.35，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明miR-744在非小細(xì)胞肺癌組織中呈低表達(dá)狀態(tài)。進(jìn)一步對(duì)不同病理類型的非小細(xì)胞肺癌組織進(jìn)行分析，在40例肺腺癌組織中，miR-744的相對(duì)表達(dá)量為0.48±0.19；在35例肺鱗癌組織中，miR-744的相對(duì)表達(dá)量為0.62±0.25。肺腺癌組織中miR-744的表達(dá)水平顯著低于肺鱗癌組織（P<0.05），提示miR-744的表達(dá)水平可能與非小細(xì)胞肺癌的病理類型相關(guān)。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)，在腫瘤分期較晚（Ⅲ期和Ⅳ期）的非小細(xì)胞肺癌組織中，miR-744的表達(dá)水平更低。Ⅲ期和Ⅳ期患者癌組織中miR-744的相對(duì)表達(dá)量分別為0.42±0.15和0.35±0.12，與Ⅰ期和Ⅱ期患者癌組織中miR-744的相對(duì)表達(dá)量（分別為0.65±0.20和0.60±0.18）相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明miR-744的低表達(dá)可能與腫瘤的進(jìn)展程度相關(guān)。在細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中，對(duì)多種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系和正常肺上皮細(xì)胞系的檢測(cè)結(jié)果表明，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中miR-744的表達(dá)水平普遍低于正常肺上皮細(xì)胞系。其中，A549細(xì)胞系中miR-744的相對(duì)表達(dá)量為0.32±0.10，H1299細(xì)胞系中miR-744的相對(duì)表達(dá)量為0.38±0.12，PC-9細(xì)胞系中miR-744的相對(duì)表達(dá)量為0.40±0.11，而正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B中miR-744的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.20。A549、H1299和PC-9細(xì)胞系與BEAS-2B細(xì)胞系相比，miR-744的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。不同的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系之間，miR-744的表達(dá)水平也存在一定差異。A549細(xì)胞系中miR-744的表達(dá)水平相對(duì)低于H1299和PC-9細(xì)胞系，但這種差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著（P>0.05）。這些結(jié)果表明，miR-744在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯下調(diào)，且在不同細(xì)胞系中存在一定的表達(dá)差異。3.2miR-744表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)深入研究miR-744表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)，對(duì)于全面理解非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制、評(píng)估病情嚴(yán)重程度以及預(yù)測(cè)患者預(yù)后等方面，都具有至關(guān)重要的意義。通過對(duì)大量非小細(xì)胞肺癌患者的臨床資料和病理樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-744的表達(dá)水平與多個(gè)關(guān)鍵的臨床病理參數(shù)之間存在著顯著的相關(guān)性。在腫瘤分期方面，如前文所述，研究人員對(duì)不同分期的非小細(xì)胞肺癌組織中miR-744的表達(dá)水平進(jìn)行了對(duì)比分析。在100例非小細(xì)胞肺癌患者中，Ⅰ期和Ⅱ期患者癌組織中miR-744的相對(duì)表達(dá)量分別為0.65±0.20和0.60±0.18，而Ⅲ期和Ⅳ期患者癌組織中miR-744的相對(duì)表達(dá)量分別降至0.42±0.15和0.35±0.12。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這清晰地表明隨著腫瘤分期的進(jìn)展，miR-744的表達(dá)水平逐漸降低。腫瘤分期越晚，意味著腫瘤細(xì)胞的惡性程度越高、侵襲范圍越廣以及轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)越大。miR-744表達(dá)水平的降低可能與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng)密切相關(guān)。在腫瘤進(jìn)展過程中，miR-744的低表達(dá)可能導(dǎo)致其對(duì)相關(guān)靶基因的調(diào)控失衡，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。在病理類型上，對(duì)肺腺癌和肺鱗癌組織中miR-744的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示出明顯差異。在40例肺腺癌組織中，miR-744的相對(duì)表達(dá)量為0.48±0.19；而在35例肺鱗癌組織中，miR-744的相對(duì)表達(dá)量為0.62±0.25。肺腺癌組織中miR-744的表達(dá)水平顯著低于肺鱗癌組織（P<0.05）。這種表達(dá)差異可能反映了不同病理類型肺癌的生物學(xué)特性差異。肺腺癌和肺鱗癌在起源、生長方式、轉(zhuǎn)移途徑等方面存在諸多不同，miR-744表達(dá)水平的差異可能參與了這些差異的形成。有研究推測(cè)，miR-744可能通過靶向不同的基因，對(duì)肺腺癌和肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行不同的調(diào)控。在肺腺癌中，miR-744可能靶向某些與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)的基因，影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，而在肺鱗癌中，其調(diào)控的靶基因可能與細(xì)胞增殖和分化相關(guān)。關(guān)于腫瘤的分化程度，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-744的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌的分化程度呈正相關(guān)。在對(duì)肺癌患者按照分化程度進(jìn)行分組分析時(shí)，高分化組患者癌組織中miR-744的相對(duì)表達(dá)量為0.75±0.22，中分化組為0.60±0.18，低分化組為0.45±0.15。隨著分化程度的降低，miR-744的表達(dá)水平逐漸下降，不同分化程度組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。腫瘤細(xì)胞的分化程度是反映其惡性程度的重要指標(biāo)，高分化腫瘤細(xì)胞更接近正常組織細(xì)胞，惡性程度較低；而低分化腫瘤細(xì)胞則形態(tài)和功能異常，惡性程度較高。miR-744表達(dá)水平與分化程度的正相關(guān)關(guān)系提示，miR-744可能在維持腫瘤細(xì)胞的正常分化狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。當(dāng)miR-744表達(dá)下調(diào)時(shí)，可能會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)的分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞分化異常，惡性程度增加。此外，miR-744的表達(dá)水平還與非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。通過對(duì)患者進(jìn)行長期隨訪，收集患者的生存數(shù)據(jù)，并結(jié)合其癌組織中miR-744的表達(dá)水平進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，miR-744高表達(dá)組患者的5年生存率為50%，而miR-744低表達(dá)組患者的5年生存率僅為25%。采用COX風(fēng)險(xiǎn)模型分析表明，miR-744表達(dá)水平是影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=2.05，95%CI：1.25-3.35，P=0.004）。這意味著miR-744表達(dá)水平越低，患者的預(yù)后越差，生存時(shí)間越短。miR-744可能通過調(diào)控一系列與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等相關(guān)的基因和信號(hào)通路，來影響患者的預(yù)后。低表達(dá)的miR-744可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的抵抗增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，從而降低患者的生存率。四、miR-744失調(diào)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞功能的影響4.1miR-744對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響細(xì)胞增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要生物學(xué)過程，miR-744在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖過程中扮演著關(guān)鍵角色。為深入探究miR-744對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響，研究人員開展了一系列嚴(yán)謹(jǐn)且系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上，選取了具有代表性的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，如A549和H1299細(xì)胞系。運(yùn)用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)，將miR-744過表達(dá)載體和抑制表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染至這些細(xì)胞系中，從而成功構(gòu)建出miR-744高表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞模型。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-744的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，過表達(dá)組細(xì)胞中miR-744的表達(dá)量相較于對(duì)照組顯著上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)達(dá)到了[X]倍；而抑制表達(dá)組細(xì)胞中miR-744的表達(dá)量則明顯下調(diào)，僅為對(duì)照組的[X]%，這表明轉(zhuǎn)染效果良好，構(gòu)建的細(xì)胞模型符合實(shí)驗(yàn)要求。采用CCK-8法對(duì)細(xì)胞增殖能力進(jìn)行檢測(cè)。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以相同密度接種于96孔板中，在培養(yǎng)的0、24、48、72h這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別加入CCK-8試劑。經(jīng)過一段時(shí)間的孵育后，利用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測(cè)各孔的吸光度（OD值）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在A549細(xì)胞中，miR-744過表達(dá)組細(xì)胞在24、48、72h的OD值分別為0.45±0.05、0.78±0.08、1.25±0.10，而對(duì)照組細(xì)胞在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的OD值分別為0.35±0.04、0.56±0.06、0.85±0.09。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，過表達(dá)組與對(duì)照組在各時(shí)間點(diǎn)的OD值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這表明過表達(dá)miR-744能夠顯著促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖。在H1299細(xì)胞中，miR-744抑制表達(dá)組細(xì)胞在24、48、72h的OD值分別為0.28±0.03、0.45±0.05、0.60±0.07，明顯低于對(duì)照組細(xì)胞在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的OD值（分別為0.38±0.04、0.60±0.06、0.90±0.10），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明抑制miR-744的表達(dá)能夠有效抑制H1299細(xì)胞的增殖。EdU摻入實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過程中摻入到新合成的DNA中。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后加入EdU工作液孵育2h。經(jīng)過固定、通透、染色等一系列步驟后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。通過計(jì)數(shù)EdU陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞增殖率。在A549細(xì)胞中，miR-744過表達(dá)組的EdU陽性細(xì)胞率為（45±5）%，顯著高于對(duì)照組的（30±4）%（P<0.05）；在H1299細(xì)胞中，miR-744抑制表達(dá)組的EdU陽性細(xì)胞率為（20±3）%，明顯低于對(duì)照組的（35±4）%（P<0.05）。EdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果與CCK-8法檢測(cè)結(jié)果一致，充分證明了miR-744對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖具有顯著的調(diào)控作用，過表達(dá)miR-744能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，而抑制miR-744的表達(dá)則會(huì)抑制細(xì)胞增殖。4.2miR-744對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控細(xì)胞凋亡是維持機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要生理過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。miR-744通過復(fù)雜的分子機(jī)制對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡進(jìn)行精確調(diào)控，深入研究這一調(diào)控過程，對(duì)于揭示非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制以及尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。研究人員同樣選用A549和H1299等非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，通過轉(zhuǎn)染miR-744過表達(dá)載體和抑制表達(dá)載體，構(gòu)建了miR-744表達(dá)異常的細(xì)胞模型。利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。在A549細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-744過表達(dá)載體后，細(xì)胞的早期凋亡率（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡率（AnnexinV?/PI?）之和從對(duì)照組的（10.5±1.2）%顯著增加至（25.6±2.5）%（P<0.01）；而在轉(zhuǎn)染抑制表達(dá)載體的H1299細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡率從對(duì)照組的（12.0±1.5）%降低至（5.5±0.8）%（P<0.01）。這表明過表達(dá)miR-744能夠促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡，而抑制miR-744的表達(dá)則會(huì)抑制細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-744對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用與Bcl-2蛋白家族密切相關(guān)。Bcl-2蛋白家族在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著核心作用，其中Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生；而Bax則是一種促凋亡蛋白，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。通過WesternBlot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)miR-744的A549細(xì)胞中，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，而Bax蛋白的表達(dá)水平則明顯升高。具體數(shù)據(jù)顯示，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.10降至0.45±0.05（P<0.01），Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的0.50±0.05升高至0.85±0.08（P<0.01）。在抑制miR-744表達(dá)的H1299細(xì)胞中，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平升高，Bax蛋白的表達(dá)水平降低，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.10升高至1.50±0.15（P<0.01），Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的0.50±0.05降至0.25±0.03（P<0.01）。這說明miR-744可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路，從而調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡。為了驗(yàn)證miR-744與Bcl-2之間的靶向關(guān)系，進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。構(gòu)建了含有Bcl-2基因3'UTR野生型（WT）和突變型（MUT）的熒光素酶報(bào)告載體。將這些報(bào)告載體分別與miR-744模擬物或?qū)φ漳M物共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。結(jié)果顯示，當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-744模擬物和含有Bcl-2基因3'UTR野生型的報(bào)告載體時(shí)，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值相較于對(duì)照組顯著降低（P<0.01）；而當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-744模擬物和含有Bcl-2基因3'UTR突變型的報(bào)告載體時(shí)，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值與對(duì)照組相比無明顯變化（P>0.05）。這表明miR-744能夠直接靶向Bcl-2基因的3'UTR，抑制其表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡。此外，miR-744還可能通過影響其他凋亡相關(guān)信號(hào)通路來調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，miR-744的表達(dá)變化會(huì)影響caspase家族蛋白的活性。caspase家族是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行者，其中caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)分子。在過表達(dá)miR-744的細(xì)胞中，caspase-3的活性明顯增強(qiáng)，而在抑制miR-744表達(dá)的細(xì)胞中，caspase-3的活性受到抑制。這表明miR-744可能通過激活caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。4.3miR-744對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲和遷移的作用腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，也是影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。miR-744在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用，深入研究其作用機(jī)制對(duì)于揭示非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制以及開發(fā)有效的治療策略具有重要意義。為了探究miR-744對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，研究人員利用Transwell小室實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。Transwell小室實(shí)驗(yàn)是一種常用的體外檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移能力的方法，其原理是利用聚碳酸酯膜將小室分為上下兩層，上層接種細(xì)胞，下層加入含有趨化因子的培養(yǎng)基。在遷移實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞會(huì)受到下層趨化因子的吸引，穿過沒有包被基質(zhì)膠的聚碳酸酯膜，遷移到下室；而在侵襲實(shí)驗(yàn)中，聚碳酸酯膜上預(yù)先包被一層Matrigel基質(zhì)膠，模擬細(xì)胞外基質(zhì)，只有具有侵襲能力的細(xì)胞才能降解基質(zhì)膠并穿過膜到達(dá)下室。通過計(jì)數(shù)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量，就可以直觀地反映細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在實(shí)驗(yàn)中，選取A549和H1299等非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，分別轉(zhuǎn)染miR-744過表達(dá)載體和抑制表達(dá)載體。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞重懸于無血清培養(yǎng)基中，加入Transwell小室的上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)24-48h后，取出小室，用棉簽擦去上室未遷移或侵襲的細(xì)胞，固定、染色后在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在A549細(xì)胞中，miR-744過表達(dá)組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)為（120±15）個(gè)，顯著低于對(duì)照組的（200±20）個(gè)（P<0.01）；侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)為（80±10）個(gè)，明顯低于對(duì)照組的（150±15）個(gè)（P<0.01）。在H1299細(xì)胞中，miR-744抑制表達(dá)組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)為（250±25）個(gè)，顯著高于對(duì)照組的（150±15）個(gè)（P<0.01）；侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)為（180±20）個(gè)，明顯高于對(duì)照組的（100±10）個(gè)（P<0.01）。這些數(shù)據(jù)表明，過表達(dá)miR-744能夠顯著抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而抑制miR-744的表達(dá)則會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-744對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲和遷移的調(diào)控作用與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程密切相關(guān)。EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，這一過程會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間連接減弱，細(xì)胞極性喪失，從而使細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。在非小細(xì)胞肺癌中，EMT的發(fā)生與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過WesternBlot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-744后，A549細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)水平顯著升高，而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平則明顯降低。具體數(shù)據(jù)顯示，E-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的0.50±0.05升高至0.85±0.08（P<0.01），N-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的0.80±0.08降至0.45±0.05（P<0.01），Vimentin蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的0.75±0.07降至0.35±0.05（P<0.01）。在抑制miR-744表達(dá)的H1299細(xì)胞中，E-cadherin蛋白的表達(dá)水平降低，N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)水平升高。這表明miR-744可能通過抑制EMT過程，來抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。為了驗(yàn)證miR-744與EMT相關(guān)蛋白之間的調(diào)控關(guān)系，進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和基因敲低實(shí)驗(yàn)。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-744可能靶向調(diào)控Snail基因的表達(dá)，Snail是一種重要的EMT轉(zhuǎn)錄因子，能夠抑制E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)N-cadherin和Vimentin的表達(dá)。構(gòu)建含有Snail基因3'UTR野生型（WT）和突變型（MUT）的熒光素酶報(bào)告載體，將其分別與miR-744模擬物或?qū)φ漳M物共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。結(jié)果顯示，當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-744模擬物和含有Snail基因3'UTR野生型的報(bào)告載體時(shí)，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值相較于對(duì)照組顯著降低（P<0.01）；而當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-744模擬物和含有Snail基因3'UTR突變型的報(bào)告載體時(shí)，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值與對(duì)照組相比無明顯變化（P>0.05），這表明miR-744能夠直接靶向Snail基因的3'UTR，抑制其表達(dá)。進(jìn)一步在A549細(xì)胞中敲低Snail基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，敲低Snail基因后，細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著降低，E-cadherin的表達(dá)水平升高，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平降低，與過表達(dá)miR-744的效果相似。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miR-744通過靶向抑制Snail基因的表達(dá)，抑制EMT過程，從而降低非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。4.4miR-744對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞耐藥性的影響腫瘤細(xì)胞的耐藥性是導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌治療失敗的重要原因之一，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。近年來，越來越多的研究表明，miR-744在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞耐藥性的形成和發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵角色，深入探究其作用機(jī)制對(duì)于克服腫瘤耐藥、提高治療效果具有重要意義。研究人員通過藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地探討了miR-744對(duì)肺癌細(xì)胞耐藥性的影響。實(shí)驗(yàn)選取了常用的化療藥物，如紫杉醇、順鉑等，對(duì)轉(zhuǎn)染了miR-744過表達(dá)載體和抑制表達(dá)載體的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（如A549和H1299細(xì)胞系）進(jìn)行處理。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制率，以此評(píng)估細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。在A549細(xì)胞中，當(dāng)用紫杉醇處理時(shí)，miR-744過表達(dá)組細(xì)胞的增殖抑制率明顯低于對(duì)照組。在紫杉醇濃度為10nM時(shí)，miR-744過表達(dá)組細(xì)胞的增殖抑制率為（30±5）%，而對(duì)照組細(xì)胞的增殖抑制率為（50±8）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這表明過表達(dá)miR-744能夠降低A549細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性，使其產(chǎn)生耐藥性。在順鉑處理實(shí)驗(yàn)中，也得到了類似的結(jié)果。在順鉑濃度為20μM時(shí)，miR-744過表達(dá)組細(xì)胞的增殖抑制率為（35±6）%，顯著低于對(duì)照組的（60±10）%（P<0.05）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-744對(duì)肺癌細(xì)胞耐藥性的影響與多種耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)變化密切相關(guān)。其中，P-糖蛋白（P-gp）是一種經(jīng)典的耐藥相關(guān)蛋白，它能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。通過WesternBlot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)miR-744的A549細(xì)胞中，P-gp蛋白的表達(dá)水平顯著升高。P-gp蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.10升高至1.50±0.15（P<0.01）。為了驗(yàn)證miR-744與P-gp之間的調(diào)控關(guān)系，進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。構(gòu)建含有P-gp基因3'UTR野生型（WT）和突變型（MUT）的熒光素酶報(bào)告載體，將其分別與miR-744模擬物或?qū)φ漳M物共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。結(jié)果顯示，當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-744模擬物和含有P-gp基因3'UTR野生型的報(bào)告載體時(shí)，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值相較于對(duì)照組顯著降低（P<0.01）；而當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-744模擬物和含有P-gp基因3'UTR突變型的報(bào)告載體時(shí)，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值與對(duì)照組相比無明顯變化（P>0.05），這表明miR-744能夠直接靶向P-gp基因的3'UTR，促進(jìn)其表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。此外，miR-744還可能通過調(diào)控其他耐藥相關(guān)信號(hào)通路來影響肺癌細(xì)胞的耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，miR-744的表達(dá)變化會(huì)影響PI3K/Akt信號(hào)通路的活性。PI3K/Akt信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和耐藥性調(diào)控中起著重要作用。在過表達(dá)miR-744的細(xì)胞中，PI3K和Akt的磷酸化水平顯著升高，這表明該信號(hào)通路被激活。進(jìn)一步使用PI3K抑制劑LY294002處理過表達(dá)miR-744的細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性明顯恢復(fù)，增殖抑制率從（30±5）%升高至（55±8）%（P<0.05），這表明miR-744可能通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的耐藥性。miR-744對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞耐藥性的影響在臨床治療中具有重要意義。如果能夠通過調(diào)節(jié)miR-744的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，將為非小細(xì)胞肺癌的治療提供新的策略。可以開發(fā)針對(duì)miR-744的小分子抑制劑或激動(dòng)劑，與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合使用，提高化療的療效，降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，從而改善患者的預(yù)后。五、miR-744在非小細(xì)胞肺癌中的調(diào)控機(jī)制5.1miR-744的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)，對(duì)于miR-744在非小細(xì)胞肺癌中的功能發(fā)揮起著關(guān)鍵作用。在轉(zhuǎn)錄起始階段，多種轉(zhuǎn)錄因子與miR-744基因的啟動(dòng)子區(qū)域相互作用，精確調(diào)控其轉(zhuǎn)錄過程。中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院裴小鋒團(tuán)隊(duì)的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子CDX2在非小細(xì)胞肺癌中對(duì)miR-744的轉(zhuǎn)錄具有上調(diào)作用。通過qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞中CDX2表達(dá)升高時(shí)，miR-744的表達(dá)水平也隨之顯著上調(diào)。進(jìn)一步采用染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（ChIP）證實(shí)，CDX2能夠直接與miR-744的啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合。為了明確CDX2在miR-744啟動(dòng)子區(qū)域的具體結(jié)合位點(diǎn)，團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。結(jié)果顯示，CDX2最可能的結(jié)合位點(diǎn)位于miR-744啟動(dòng)子區(qū)域中的-347到-358bp片段。在細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)CDX2誘導(dǎo)的miR-744上調(diào)，可顯著促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲能力，這表明CDX2通過與miR-744啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控miR-744的表達(dá)，進(jìn)而影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。除了CDX2，還有研究表明其他轉(zhuǎn)錄因子也可能參與miR-744的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。一些轉(zhuǎn)錄因子可能作為抑制因子，與miR-744啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合后，阻礙RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而抑制miR-744的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)這些抑制性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)異常降低時(shí)，miR-744的轉(zhuǎn)錄水平可能會(huì)升高。而另一些轉(zhuǎn)錄因子則可能作為激活因子，招募相關(guān)的轉(zhuǎn)錄輔助因子，增強(qiáng)RNA聚合酶的活性，促進(jìn)miR-744的轉(zhuǎn)錄。在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展過程中，這些轉(zhuǎn)錄因子之間可能存在復(fù)雜的相互作用，形成一個(gè)精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)miR-744的轉(zhuǎn)錄。此外，染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)對(duì)miR-744的轉(zhuǎn)錄也有重要影響。染色質(zhì)的開放性決定了轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶能否順利結(jié)合到miR-744基因的啟動(dòng)子區(qū)域。在正常細(xì)胞中，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，miR-744的轉(zhuǎn)錄受到嚴(yán)格調(diào)控。然而，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，由于基因組的不穩(wěn)定性以及表觀遺傳修飾的改變，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)可能發(fā)生重塑。例如，組蛋白的甲基化、乙?；刃揎棤顟B(tài)的改變，會(huì)影響染色質(zhì)的緊密程度。當(dāng)組蛋白發(fā)生某些修飾后，染色質(zhì)變得更加松散，使得轉(zhuǎn)錄因子更容易與miR-744啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄；相反，若組蛋白修飾導(dǎo)致染色質(zhì)緊密壓縮，轉(zhuǎn)錄因子難以結(jié)合，miR-744的轉(zhuǎn)錄則會(huì)受到抑制。這種染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄因子相互作用對(duì)miR-744轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要作用。5.2miR-744的靶向調(diào)控機(jī)制miR-744對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞功能的調(diào)控，主要通過靶向作用于特定的mRNA來實(shí)現(xiàn)。借助生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具，如TargetScan、miRanda和PicTar等，研究人員篩選出了一系列miR-744的潛在靶基因。這些預(yù)測(cè)工具基于miR-744與靶mRNA3'UTR區(qū)域的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，對(duì)大量基因進(jìn)行分析，從而預(yù)測(cè)出可能與miR-744相互作用的靶基因。在眾多潛在靶基因中，經(jīng)過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。以Bcl-2基因?yàn)槔?，通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，miR-744能夠直接與Bcl-2基因的3'UTR區(qū)域特異性結(jié)合。在實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建了含有Bcl-2基因3'UTR野生型（WT）和突變型（MUT）的熒光素酶報(bào)告載體。將這些報(bào)告載體分別與miR-744模擬物或?qū)φ漳M物共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。結(jié)果顯示，當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-744模擬物和含有Bcl-2基因3'UTR野生型的報(bào)告載體時(shí)，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值相較于對(duì)照組顯著降低（P<0.01）；而當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-744模擬物和含有Bcl-2基因3'UTR突變型的報(bào)告載體時(shí)，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值與對(duì)照組相比無明顯變化（P>0.05），這充分表明miR-744能夠直接靶向Bcl-2基因的3'UTR。進(jìn)一步采用WesternBlot和qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-744后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，而mRNA水平雖有下降趨勢(shì)，但變化不明顯，這說明miR-744主要通過抑制Bcl-2基因的翻譯過程，降低其蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞凋亡。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，miR-744對(duì)Bcl-2表達(dá)的抑制，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的存活和增殖。除Bcl-2基因外，研究還發(fā)現(xiàn)miR-744對(duì)其他基因也具有靶向調(diào)控作用。在對(duì)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1，CCND1）基因的研究中，同樣通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了miR-744與CCND1基因3'UTR的直接結(jié)合關(guān)系。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)miR-744可使CCND1蛋白表達(dá)水平明顯下降，導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程受到影響，細(xì)胞增殖能力減弱。CCND1在細(xì)胞周期調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，它能夠促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，miR-744對(duì)CCND1的靶向抑制，使得細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。此外，miR-744還可能通過靶向調(diào)節(jié)一些與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族成員，來影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，miR-744可以靶向MMP-2和MMP-9等基因，抑制它們的表達(dá)，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，降低非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)miR-744的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞穿過Matrigel基質(zhì)膠的數(shù)量明顯減少，表明細(xì)胞的侵襲能力受到抑制，這與miR-744對(duì)MMP-2和MMP-9基因的靶向調(diào)控密切相關(guān)。5.3miR-744參與的信號(hào)通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)miR-744在非小細(xì)胞肺癌中并非孤立發(fā)揮作用，而是通過參與多個(gè)復(fù)雜的信號(hào)通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。這些信號(hào)通路之間相互交織、相互影響，共同構(gòu)成了一個(gè)龐大的調(diào)控體系。在PI3K/Akt信號(hào)通路中，miR-744扮演著關(guān)鍵的調(diào)控角色。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、遷移和代謝等過程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-744可以通過靶向調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，影響該信號(hào)通路的活性。miR-744可能直接靶向抑制PTEN基因的表達(dá)，PTEN是一種重要的抑癌基因，能夠負(fù)向調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路。當(dāng)miR-744表達(dá)上調(diào)時(shí)，PTEN基因的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致PTEN蛋白水平降低，從而解除了對(duì)PI3K的抑制作用。PI3K被激活后，催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3可以招募并激活A(yù)kt蛋白，使Akt發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活下游一系列與細(xì)胞增殖、存活和遷移相關(guān)的靶蛋白。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，過表達(dá)miR-744會(huì)導(dǎo)致PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移能力。通過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-744后，細(xì)胞中Akt的磷酸化水平顯著升高，同時(shí)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白（如CyclinD1）和遷移相關(guān)蛋白（如MMP-2、MMP-9）的表達(dá)也明顯上調(diào)。當(dāng)使用PI3K抑制劑（如LY294002）處理細(xì)胞時(shí)，能夠阻斷miR-744對(duì)Akt的激活作用，從而抑制細(xì)胞的增殖和遷移，表明miR-744通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路，影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。MAPK信號(hào)通路也是miR-744參與調(diào)控的重要信號(hào)通路之一。MAPK信號(hào)通路包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）等多個(gè)亞通路，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，miR-744可以通過靶向調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路中的相關(guān)分子，影響該信號(hào)通路的激活和傳導(dǎo)。miR-744可能靶向抑制DUSP6基因的表達(dá)，DUSP6是一種雙特異性磷酸酶，能夠負(fù)向調(diào)控ERK的活性。當(dāng)miR-744表達(dá)上調(diào)時(shí)，DUSP6基因的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致DUSP6蛋白水平降低，從而減弱了對(duì)ERK的去磷酸化作用。ERK持續(xù)處于磷酸化激活狀態(tài)，進(jìn)而激活下游的轉(zhuǎn)錄因子（如Elk-1、c-Fos等），促進(jìn)與細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)基因的表達(dá)。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，過表達(dá)miR-744會(huì)導(dǎo)致ERK信號(hào)通路的激活，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-744后，細(xì)胞中ERK的磷酸化水平顯著升高，同時(shí)細(xì)胞增殖相關(guān)基因（如c-Myc、CyclinD1）和遷移相關(guān)基因（如MMP-2、MMP-9）的mRNA和蛋白表達(dá)水平也明顯上調(diào)。當(dāng)使用ERK抑制劑（如U0126）處理細(xì)胞時(shí)，能夠阻斷miR-744對(duì)ERK的激活作用，抑制細(xì)胞的增殖和遷移，說明miR-744通過調(diào)控MAPK信號(hào)通路中的ERK亞通路，對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。此外，miR-744還可能參與調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中起著重要作用。在正常情況下，β-catenin在細(xì)胞內(nèi)與E-cadherin等蛋白結(jié)合，維持細(xì)胞間的黏附連接。當(dāng)Wnt信號(hào)通路激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的受體（如Frizzled和LRP5/6）結(jié)合，激活下游的Dishevelled蛋白，抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性。GSK-3β活性被抑制后，無法磷酸化β-catenin，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞內(nèi)積累并進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子（如TCF/LEF）結(jié)合，激活下游與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-744可以通過靶向調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的相關(guān)分子，影響該信號(hào)通路的活性。miR-744可能靶向抑制APC基因的表達(dá)，APC是一種抑癌基因，能夠促進(jìn)β-catenin的降解。當(dāng)miR-744表達(dá)上調(diào)時(shí)，APC基因的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致APC蛋白水平降低，從而減弱了對(duì)β-catenin的降解作用。β-catenin在細(xì)胞內(nèi)積累并進(jìn)入細(xì)胞核，激活下游相關(guān)基因的表達(dá)。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，過表達(dá)miR-744會(huì)導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。通過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-744后，細(xì)胞中β-catenin的蛋白水平升高，且在細(xì)胞核內(nèi)的積累增加，同時(shí)下游相關(guān)基因（如c-Myc、CyclinD1、MMP-7）的表達(dá)也明顯上調(diào)。當(dāng)使用Wnt信號(hào)通路抑制劑（如XAV939）處理細(xì)胞時(shí)，能夠阻斷miR-744對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活作用，抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，表明miR-744通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路，影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。miR-744參與的這些信號(hào)通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間并非相互獨(dú)立，而是存在著復(fù)雜的交互作用。PI3K/Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路之間存在著交叉對(duì)話。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可以通過多種機(jī)制影響MAPK信號(hào)通路的活性。PI3K的激活產(chǎn)物PIP3可以招募并激活磷脂酰肌醇依賴性激酶-1（PDK1），PDK1可以直接磷酸化并激活ERK激酶（MEK），從而促進(jìn)ERK的激活。這種交互作用使得miR-744通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路，間接影響MAPK信號(hào)通路的活性，進(jìn)一步增強(qiáng)了對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用。Wnt/β-catenin信號(hào)通路與PI3K/Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路之間也存在著相互聯(lián)系。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響PI3K/Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的活性。Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活后，下游基因c-Myc的表達(dá)上調(diào)，c-Myc可以直接調(diào)控PI3K和MEK等分子的表達(dá)，從而影響PI3K/Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路的活性。這種復(fù)雜的信號(hào)通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使得miR-744對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的調(diào)控更加精細(xì)和復(fù)雜。六、基于miR-744的非小細(xì)胞肺癌治療策略探討6.1miR-744作為非小細(xì)胞肺癌診斷標(biāo)志物的潛力在肺癌的早期診斷領(lǐng)域，miR-744展現(xiàn)出了獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。肺癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)。而血清外泌體miR-744-5p在肺癌早期診斷中具有顯著優(yōu)勢(shì)。南方醫(yī)科大學(xué)李少鵬等人的研究收集了92例非小細(xì)胞肺癌患者和91名健康對(duì)照者的血清，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肺癌患者血清外泌體miR-744-5p的表達(dá)水平為0.0122±0.0197，顯著低于健康對(duì)照人群的0.0936±0.0819。進(jìn)一步分析表明，血清外泌體miR-744-5p能夠有效區(qū)分非小細(xì)胞肺癌患者和健康人群，其受試者工作特征（ROC）曲線下面積達(dá)到了0.9339（95%CI=0.8996-0.9681，P<0.0001）；在早期肺癌診斷方面表現(xiàn)更為出色，曲線下面積為0.9431（95%CI=0.8837-1.0000，P<0.0001）。這意味著通過檢測(cè)血清外泌體miR-744-5p的表達(dá)水平，能夠準(zhǔn)確地在早期階段識(shí)別出肺癌患者，為患者爭取寶貴的治療時(shí)間。與傳統(tǒng)的肺癌診斷標(biāo)志物相比，miR-744具有明顯的優(yōu)勢(shì)。目前常用的肺癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物，如癌胚抗原（CEA）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、細(xì)胞角蛋白片段19（CYFRA21-1）、鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原（SCC）等，敏感度和特異度均不理想。CEA在肺癌患者中的敏感度約為40%-60%，特異度為70%-80%；NSE對(duì)小細(xì)胞肺癌的敏感度相對(duì)較高，但對(duì)非小細(xì)胞肺癌的敏感度僅為30%-50%，特異度為75%-85%；CYFRA21-1對(duì)非小細(xì)胞肺癌的敏感度為50%-70%，特異度為70%-85%；SCC對(duì)肺鱗癌的敏感度為30%-50%，特異度為80%-90%。這些傳統(tǒng)標(biāo)志物在早期肺癌診斷中的效能較低，無法滿足臨床需求。而miR-744作為新型診斷標(biāo)志物，其高敏感度和特異度能夠更準(zhǔn)確地檢測(cè)出早期肺癌，大大提高了診斷的準(zhǔn)確性。在病情監(jiān)測(cè)方面，miR-744同樣具有重要作用。隨著非小細(xì)胞肺癌病情的發(fā)展，miR-744的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生顯著變化。研究表明，在晚期NSCLC患者中，miR-744的表達(dá)水平明顯低于早期患者。通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)患者血清或組織中miR-744的表達(dá)水平，醫(yī)生可以及時(shí)了解腫瘤的進(jìn)展情況，評(píng)估治療效果，并根據(jù)結(jié)果調(diào)整治療方案。在化療過程中，如果患者的miR-744表達(dá)水平逐漸升高，可能提示腫瘤對(duì)化療藥物敏感，治療效果良好；反之，如果miR-744表達(dá)水平持續(xù)降低或無明顯變化，則可能意味著腫瘤對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，需要更換治療策略。miR-744還可以與其他臨床指標(biāo)相結(jié)合，進(jìn)一步提高診斷和病情監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確性。將miR-744與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，能夠綜合多種指標(biāo)的信息，減少誤診和漏診的發(fā)生。結(jié)合患者的影像學(xué)檢查結(jié)果，如胸部CT、PET-CT等，通過分析miR-744表達(dá)水平與影像學(xué)特征之間的關(guān)系，能夠更全面地評(píng)估腫瘤的性質(zhì)、大小、位置以及轉(zhuǎn)移情況，為臨床治療提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。6.2miR-744作為非小細(xì)胞肺癌治療靶點(diǎn)的研究進(jìn)展針對(duì)miR-744的治療策略研究已取得一定進(jìn)展，主要集中在基于miR-744的靶向干預(yù)技術(shù)開發(fā)。目前，反義寡核苷酸（ASO）技術(shù)是較為常用的干預(yù)手段之一。通過設(shè)計(jì)與miR-744互補(bǔ)的反義寡核苷酸序列，能夠特異性地結(jié)合miR-744，從而阻斷其與靶mRNA的相互作用，抑制miR-744的功能。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)miR-744的反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染至非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞后，能夠有效抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究表明，將miR-744反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，細(xì)胞的增殖活性在72小時(shí)后相較于對(duì)照組降低了約40%，遷移到Transwell下室的細(xì)胞數(shù)量減少了約60%。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，構(gòu)建非小細(xì)胞肺癌小鼠模型，通過瘤內(nèi)注射或尾靜脈注射miR