成藥性抗體開發(fā)：從抗原設(shè)計到功能活性評價的全流程解析任為抗體開發(fā)首席科學家北京義翹神州科技股份有限公司功能活性親和力檢測表位分析生物安全檢測高通量/大規(guī)模生產(chǎn)穩(wěn)定株開發(fā)人源化改造親和力成熟蛋白免疫RNA免疫DNA免疫細胞免疫雜交瘤技術(shù)噬菌體技術(shù)流式分選技術(shù)Beacon?技術(shù)抗原制備及免疫抗體制備及篩選抗體工程化及生產(chǎn)抗體功能評價綜合性抗體開發(fā)平臺抗原制備和動物免疫01HEK293/CHO膜蛋白InsectE.coli8,000+高質(zhì)量現(xiàn)貨蛋白85%真核細胞表達100%自主研發(fā)2,000多種生物活性檢測和分析方法CRO定制服務(wù)數(shù)量>15,000個覆蓋常見藥物靶點>80%好的抗原是成功的一半重組蛋白類免疫原高純度、高活性、高親和力重組蛋白，支持高質(zhì)量抗體的研發(fā)親和力HumanTROP-2(Cat:10428-H08H)KD:1.64nM活性EC50:1.6-4.8ng/mLHumanGSK3β(Cat:10044-H07B)SEC-HPLC純度>90%Claudin6(跨膜蛋白)KD:0.536nMEC50:5.4ng/mLCynoTROP-2(Cat:90893-C08H)親和力活性親和力活性EC50:1.3-3.9ng/mLKD:1.53nMEC50:0.8ng/mLMouseTROP-2Claudin18(跨膜蛋白)活性純度活性EC50:0.15-0.35μg/mL活性重組蛋白類免疫原免疫效價好，更易獲得與天然構(gòu)象蛋白結(jié)合的抗體mRNA免疫支持膜蛋白抗體開發(fā)序列設(shè)計mRNA合成LNP包封動物免疫抗體篩選僅需提供蛋白序列；RNA-LNP方式遞送，免疫應(yīng)答效果好;整體開發(fā)周期短、成本優(yōu)勢；適用于各類型單抗篩選平臺。mRNA-LNP免疫案例——GPRC5D靶點雜交瘤融合篩選獲得38株陽性克隆，其中含25株流式優(yōu)勢抗體mRNA免疫17000+不同類型抗原的免疫經(jīng)驗佐劑儲備庫弗氏佐劑、鋁佐劑、MF59、QS21Titermax、Mn、MPL

多種屬及品系可選小鼠（BALB/c，C57BL/6,SJL）【兔、羊駝、山羊、雞等】動物數(shù)量根據(jù)項目難度綜合評估、靈活選擇免疫劑量根據(jù)免疫原性、抗原類型、親和力要求調(diào)整免疫途徑皮內(nèi)、皮下、腹腔、靜脈、淋巴結(jié)、脾內(nèi)免疫周期滿足不同時效項目要求常規(guī)（7~12周）、快速（3周、5周）免疫方案設(shè)計動物免疫抗體開發(fā)和技術(shù)優(yōu)化02雜交瘤噬菌體展示文庫B細胞流式高質(zhì)量的候選抗體：數(shù)百個苗頭分子親和力達到nM-pM水平適用于不同應(yīng)用場景成藥性抗體制備技術(shù)平臺B細胞Beacon?抗體制備技術(shù)平臺介紹高效的抗體開發(fā)技術(shù)平臺：最全面的技術(shù)路線多種早期介入篩選方案分步的抗體開發(fā)技術(shù)優(yōu)化YYYYYYYYYYYYYYYYYSplenocytesMyelomaHybridomacellsScreeningAmplification&purification雜交瘤抗體開發(fā)技術(shù)技術(shù)路線成熟，成本優(yōu)勢；電融合技術(shù)大幅提升融合效率；上清介入多功能篩選，提高成功率；自主開發(fā)鼠單抗數(shù)量>20,000種700+技術(shù)服務(wù)項目經(jīng)驗雜交瘤技術(shù)活性蛋白免疫細胞活性等多功能介入篩選13株亞克隆細胞穩(wěn)定株102株主克隆ELISA競爭抑制陽性(抽檢20株，6株細胞活性陽性）重組蛋白（細胞生物活性檢測EC502~8ng/mL）15株亞克隆ELISA競爭陽性40株細胞2~3輪有限稀釋835孔主克隆ELISA結(jié)合陽性融合后細胞接種42塊96孔細胞培養(yǎng)板10只小鼠高效價，挑選1只進行融合Balb/c、C57BL/6小鼠各免疫5只抗體親和力達到E-10級別IL15中和抗體開發(fā)案例雜交瘤技術(shù)雜交瘤融合&主克隆篩選陽性克隆有限稀釋提基因質(zhì)控交付：細胞株、抗體、序列亞克隆篩選表達純化生產(chǎn)純化周期節(jié)省20-30天20-30天14天7天7天新路線傳統(tǒng)路線技術(shù)路線對比新一代雜交瘤技術(shù)與主克隆陽性率一致性統(tǒng)計：38/44，86%新一代雜交瘤技術(shù)主克隆陽性44株獲得40株提基因序列去重表達33株結(jié)合/競爭與主克隆一致31株質(zhì)控4株細胞未獲得序列7株細胞是重復序列均是陽性細胞2株細胞是結(jié)合陰性新一代雜交瘤平臺案例周期更短直接交付序列通量更高成功率更高比原有雜交瘤周期節(jié)省20-30天提基因替代有限稀釋，一次提取上百個克隆省去雜交瘤篩選后再提基因步驟，避免基因傳代丟失、污染等風險挽救亞克隆轉(zhuǎn)陰或與主克隆結(jié)果不一致的細胞克隆新一代雜交瘤技術(shù)平臺優(yōu)勢更好面向工業(yè)客戶藥篩客戶新一代雜交瘤技術(shù)篩選方法多樣：固相、液相、細胞篩選；篩選策略靈活：差減、競爭、交叉、夾心；克隆上清介入評價：流式、ELISA、交叉。3,000+株單抗產(chǎn)品；支持多種應(yīng)用：FACS、WB、IHC、IF抗體；保證高親和力、特異性抗體；新冠中和抗體親和力達E-12M，銷售總量＞800mg。建庫淘篩產(chǎn)品服務(wù)豐富的CRO服務(wù)經(jīng)驗：500+服務(wù)；5~6周完成建庫、篩選和分子構(gòu)建；提供多種抗體服務(wù)：抗獨特型抗體、中和抗體、納米抗體、

抗體親和力成熟。天然庫和免疫庫，多種免疫方案；多種屬：小鼠、兔子、羊駝、人；免疫庫的庫容高達109以上，序列插入正確率高達100%。噬菌體展示技術(shù)噬菌體展示技術(shù)篩選CAR-T靶點案例與天然構(gòu)象結(jié)合最好用蛋白+細胞免疫，噬菌體平臺更適合scFv(CAR)篩選Nalm-6cellsJurkatcellsHEK293cellsscFv-1scFv-2scFv-3部分scFv鑒定結(jié)果噬菌體展示技術(shù)蛋白+細胞免疫細胞淘洗ELSIA陽性127株Nalm-6強陽性48株與293過表達和Nalm-6均結(jié)合，與jurkat不結(jié)合篩選要點PD-L1納米抗體篩選親和力檢測

SampleIDIC50(μg/mL）EC50(μg/mL）Benchmark10.144260.38Benchmark20.14190.33Nh3940.083440.23Nh4840.107230.51SampleIDKD(M)Kon(1/MS)Koff(1/S)Benchmark16.60E-096.96E+044.59E-04Benchmark26.37E-101.82E+051.16E-04Nh3941.44E-091.01E+051.45E-04Nh4843.42E-091.75E+055.98E-04Benchmark1Benchmark2Nh394Nh484噬菌體展示技術(shù)活性檢測

競爭活性

細胞活性Splenocytes&PBMCSingleBCellSortingRT-PCR&InsertVectorExpressionFunctionAssayBCellCulture流式分選單B細胞技術(shù)VH/VL配對成功率達業(yè)內(nèi)領(lǐng)先水平兔單B細胞培養(yǎng)陽性率高天然抗體序列抗體多樣性好可進行全人源抗體篩選Starkie,D.O.,etal.PLoSONE,2016,11(3):e0152282.Wilson,J.R.,Virology,2014,458-459:114–124.SeeberS.,etal.PLoSONE,2014,9(2):e86184.Chen,Y.,etal.EmergingMicrobes&Infections,2021,10(1),1390–1403.流式分選單B細胞技術(shù)BCellLysis成藥性抗體開發(fā)案例流式分選單B細胞技術(shù)靶點蛋白與多個因子相互作用并參與三個不同信號通路調(diào)控，篩選難度大篩選目標通路1通路2通路3靶點蛋白靶點蛋白靶點蛋白因子A因子C因子D因子E因子F因子B人猴交叉三個信號通路上同時阻斷六個細胞因子與靶點蛋白結(jié)合的抗體阻斷活性好于對照藥物20技術(shù)路線免疫原制備對照抗體表達純化、細胞系制備、細胞活性方法建立血清效價檢測（ELISA、FACS、競爭活性）流式單B分選分選階段：熒光標記抗原結(jié)合；培養(yǎng)上清：抗原/細胞結(jié)合、種屬交叉檢測質(zhì)控階段：抗原結(jié)合、細胞結(jié)合、細胞活性、親和力檢測兔子免疫

常規(guī)免疫淋巴結(jié)鋁佐劑人鼠猴混合免疫人鼠交叉免疫人鼠猴交叉長周期免疫血清效價>62.5萬√√√√√√兔子免疫IgGFSC抗原抗原IgMSSC同時開展>6種免疫方案，有效增加抗體的多樣性多只動物效價良好，可滿足分選要求分選陽性細胞比例流式分選單B細胞技術(shù)成藥性抗體開發(fā)案例免疫原再刺激注：紅色箭頭指陽性對照抗體免疫原再刺激親和力檢測Ligandka(1/Ms)kd(1/s)KD(M)Chi2(RU2)U-value對照抗體9.631E+055.337E-055.542E-110.06991R04018.083E+051.022E-041.265E-100.1211R03897.810E+057.231E-059.259E-110.08241R03711.095E+065.356E-054.893E-110.161R03668.800E+053.043E-053.458E-110.05272R03221.77E+069.31E-055.27E-110.05251對照抗體R0401R0389R0371R0366R0322流式分選單B細胞技術(shù)與人細胞結(jié)合與猴細胞結(jié)合成藥性抗體開發(fā)案例注：紅色箭頭指陽性對照抗體流式分選單B細胞技術(shù)成藥性抗體開發(fā)案例SampleIC50(ng/mL)R0322/R037121R036616R038939R040139對照抗體

24SampleIC50(ng/mL)R0322/R037154R036619R038981R040174對照抗體

37SampleIC50(ng/mL)R04151106R0411562R0408/R0389157R0366186對照抗體

459成功篩選到在三個信號通路上活性均不低于對照抗體、且親和力好的單抗分子SampleIC50(ng/mL)R032230R037145R036624R038958R040173對照抗體

27SampleIC50(ng/mL)R03229R037124R036612R038928R040153對照抗體

18SampleIC50(ng/mL)R032212R037131R036626R038966R040168對照抗體

21信號通路1因子A與靶蛋白的阻斷活性信號通路1因子B與靶蛋白的阻斷活性信號通路2因子C與靶蛋白的阻斷活性信號通路3因子D與靶蛋白的阻斷活性信號通路3因子E與靶蛋白的阻斷活性信號通路3因子F與靶蛋白的阻斷活性23Beacon?光導單B細胞克隆技術(shù)ImmunizationandASCEnrichmentNanopenLoadOEPGravityIn-ChannelFluorescent”Bloom”AssayOEPNanopenExportVH/VLrecovery,cloning,expression30-60minutes30-60minutes3-4minutesperNanopenImportExport天然抗體序列；抗體多樣性好；實驗周期短，節(jié)省研發(fā)時間；高效篩選，1天內(nèi)可完成高達5種功能檢測；非競爭競爭非競爭競爭通過技術(shù)優(yōu)化，有效提高beacon?競爭檢測靈敏度競爭方法優(yōu)化Beacon?光導單B細胞克隆技術(shù)GPRC5D-NanoDisc蛋白篩選抗體GPRC5D結(jié)構(gòu)VLP平臺Nanodisc平臺Beacon?光導單B細胞克隆技術(shù)VLP平臺Nanodisc平臺EC50:3-10ng/mLEC50:20.6ng/mLEC50(ng/mL)M0165M0173對照抗體GPRC5D-VLP1.682.736.88GPRC5D-Disc2.233.535.33細胞結(jié)合1.5472.1682.835ADCC0.550.831.51.在與GPRC5D-VLP和GPRC5D-Disc的結(jié)合檢測上，M0165和M0173結(jié)合活性均優(yōu)于對照抗體2.M0165和M0173細胞結(jié)合和ADCC殺傷活性均優(yōu)于對照抗體IDkon(1/Ms)kdis(1/s)KD(M)對照抗體4.91E+055.24E-041.07E-09M01651.98E+062.85E-041.44E-10R01734.03E+054.15E-041.03E-093.M0173親和力與對照抗體親和力水平相當，M0165親和力比對照抗體約高10倍細胞結(jié)合ADCCBeacon?光導單B細胞克隆技術(shù)GPRC5D-VLP結(jié)合GPRC5D-Disc結(jié)合生物活性(EC50)親和力檢測抗體生產(chǎn)和工程化改造03優(yōu)勢：方法成熟，臨床療效良好問題：仍有親和力降低或潛在的免疫原性抗體人源化方法

–CDR移植CDR移植FR替換核心氨基酸保留CDR親本抗體FR人源抗體FR核心氨基酸抗體人源化TargetIDConc.(mg/L)HumannessSars-Cov2-SpikeMM57-C1-mAb249.5/MM57-C2-chAb141/MM57-436597%MM57-624897.4%MM57-1316596.10%MM57-1419097%MM57-1519897.4%MM57-1810097%MM57-2510697.8%MM57-3017397.8%MM57-3418497.8%MM57-3826797.8%mAb_humanized_VLmAb_humanized_VH抗體人源化鼠抗人源化案例表達量和同源性MM57-C1-mAb:親本鼠抗；MM57-C2-chAb:人鼠嵌合抗體。mAb_VLmAb_VHTargetIDInhibition(%)IC50(μg/ml)(Pseudovirus)Sars-Cov2-SpikeMM57-C1-mAb87%0.548MM57-C2-chAb85%0.341MM57-487%0.268MM57-685%0.685MM57-1381%<0.1MM57-1480%0.41MM57-1581%0.375MM57-1876%0.148MM57-2572%0.458MM57-3074%0.784MM57-3474%0.307MM57-3875%0.438鼠抗人源化案例抗體人源化中和活性檢測MM57-C1-mAb:親本鼠抗；MM57-C2-chAb:人鼠嵌合抗體。TargetIDKD(M)Kon(1/Ms)Koff(1/s)Sars-Cov2-SpikeMM57-C1-mAb1.74E-103.30E+055.74E-05MM57-C2-chAb2.51E-112.79E+056.99E-06MM57-47.52E-122.01E+051.51E-06MM57-6<1.0E-121.91E+05<1.0E-07MM57-13<1.0E-121.91E+05<1.0E-07MM57-14<1.0E-121.89E+05<1.0E-07MM57-154.31E-112.16E+059.30E-06MM57-182.83E-111.73E+054.89E-06MM57-254.85E-112.17E+051.05E-05MM57-301.38E-101.92E+052.65E-05MM57-349.54E-112.07E+051.98E-05MM57-388.53E-111.98E+051.69E-05抗體人源化鼠抗人源化案例親和力檢測MM57-C1-mAb親本鼠抗MM57-C2-chAb嵌合抗體MM57-4MM57-6MM57-13MM57-14MM57-15MM57-18MM57-25MM57-34MM57-38MM57-30納米抗體人源化案例ELISAEC50FACSEC50抗體人源化結(jié)合活性和細胞活性檢測納米抗體親和力成熟······GSTSSEDAMG······AISWTHNMEPYYAD······YSSPLIEYGY······VHH“l(fā)ying”ratherthan“onto”theepitopeVHHresidueswithin5AfromtheantigenarehighlightedResiduesthatareclosetotheantigenbutnotyetestablishedinteractionshavethepotentialtoincreasebindingaffinity.要求：親和力提升5~10倍抗體親和力成熟CDR-H126

G27

S28T29S30S31E32D33A34M35G-

PTAINDRKEQASFNHGWKQ-AE----ACDR-H250A51I52S52AW52BT53H54N55M56E57P58Y59Y60A61D---INDHYSPTAEQEQFLNHYQ----S

-CDR-H394Y95S96S97P98L99I100E100AY101G102Y---ARKESTDEAVGQ----······GSTSSEDAMG······AISWTHNMEPYYAD······YSSPLIEYGY

······組合突變建庫抗體親和力成熟親和力檢測結(jié)果IDKD(M)byBLI(HEK293)AffinityincreaseSAF51-N0631.22E-099.7foldSAF51-N0832.00E-095.9foldSAF51-N0532.11E-095.6foldSAF51-N0942.46E-094.8foldSAF51-C22.52E-094.7foldSAF51-N0932.61E-094.5foldSAF51-N0452.98E-094.0foldSAF51-N0883.29E-093.6foldSAF51-N2394.01E-092.9foldSAF51-N0234.54E-092.6foldSAF51-N2694.50E-092.6foldWT1.18E-08-抗體親和力成熟哺乳動物細胞高通量瞬轉(zhuǎn)表達抗體抗體序列引物載體構(gòu)建293/CHO瞬時表達抗體純度>90%放大生產(chǎn)新冠康復病人B細胞測序表達>1000抗體14株中和抗體結(jié)構(gòu)解析動物實驗活性驗證GeniRobot“全自動分子構(gòu)建平臺”親和純化中和活性驗證放大生產(chǎn)自主研發(fā)的無血清培養(yǎng)基高通量：每周>1000個抗體/項目的生產(chǎn)覆蓋不同規(guī)模：0.1mg-千克級抗體生產(chǎn)高通量瞬轉(zhuǎn)表達抗體構(gòu)建和表達技術(shù)優(yōu)化線性表達框制備96孔板培養(yǎng)抗體表達上清活性檢測不需要質(zhì)粒構(gòu)建、測序、質(zhì)粒提取可保持所表達抗體的功能活性2天快速完成線性框制備工作高通量的抗體表達初篩成功合成細胞無法表達的抗體片段活性與細胞表達相當3個小時完成VHH&scFv合成高通量的抗體表達初篩抗體構(gòu)建和表達線性表達框制備抗體無細胞表