PARP-1在急性髓系白血病中的關(guān)鍵作用及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義急性髓系白血?。ˋcuteMyeloidLeukemia，AML）作為一種常見(jiàn)且嚴(yán)重的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。它起源于造血干/祖細(xì)胞，特征是髓系造血細(xì)胞自我更新能力異常增強(qiáng)，同時(shí)細(xì)胞分化與凋亡受阻，致使大量幼稚細(xì)胞在骨髓中積聚，正常造血功能遭到嚴(yán)重破壞，進(jìn)而引發(fā)貧血、出血、感染等一系列癥狀。近年來(lái)，盡管基礎(chǔ)研究的深入開(kāi)展以及臨床治療手段的不斷改進(jìn)，在一定程度上改善了AML的預(yù)后情況，但現(xiàn)狀仍不容樂(lè)觀。據(jù)統(tǒng)計(jì)，六十歲以下成年AML患者的五年生存率約為30%-40%，而六十歲以上患者的五年生存率更是不到10%。當(dāng)前，AML的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，影響其發(fā)生發(fā)展的機(jī)體內(nèi)外環(huán)境因素有待進(jìn)一步探索。例如，在機(jī)體內(nèi)部，遺傳因素、免疫系統(tǒng)功能狀態(tài)等如何相互作用影響AML的發(fā)生；在外部環(huán)境方面，化學(xué)物質(zhì)暴露、輻射等因素的具體致病機(jī)制也尚不清晰。此外，治療過(guò)程中出現(xiàn)的多藥耐藥現(xiàn)象的具體機(jī)制不明，以及完全緩解（CompleteRemission，CR）后患者早期與晚期復(fù)發(fā)的原因，更是成為AML研究領(lǐng)域的重點(diǎn)與難點(diǎn)問(wèn)題。這些未解決的問(wèn)題嚴(yán)重制約了AML治療效果的提升，迫切需要尋找新的治療靶點(diǎn)和策略，以提高患者的生存率和生活質(zhì)量。聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（Poly(ADP-ribose)Polymerase-1，PARP-1）作為一種存在于真核細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)修飾酶，在細(xì)胞生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。其基本功能是參與DNA損傷修復(fù)，當(dāng)DNA發(fā)生斷裂時(shí)，PARP-1能夠迅速被激活，通過(guò)自身不同結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合到損傷部位，催化尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）裂解為尼克酰胺和ADP核糖，同時(shí)激活和催化各種受體蛋白分子的聚ADP核糖化作用，從而完成復(fù)雜的DNA損傷修復(fù)過(guò)程。除此之外，PARP-1還參與多種細(xì)胞生理反應(yīng)的調(diào)節(jié)，如結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、改變基因的甲基化狀態(tài)以及調(diào)節(jié)染色體結(jié)構(gòu)等，進(jìn)而對(duì)基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞增殖和死亡過(guò)程產(chǎn)生影響?，F(xiàn)有研究表明，PARP-1在乳腺癌、肝癌及鼻咽癌等多種腫瘤中呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)狀態(tài)，并且與不良預(yù)后相關(guān)。然而，PARP-1在AML中的表達(dá)情況、對(duì)AML疾病進(jìn)展的影響以及具體作用機(jī)制，目前仍不明確。因此，深入探究PARP-1在急性髓系白血病中的作用及機(jī)制具有重要意義。從理論層面來(lái)看，有助于我們進(jìn)一步揭示AML的發(fā)病機(jī)制，完善對(duì)AML疾病進(jìn)程的認(rèn)識(shí)，為血液學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究提供新的思路和方向；從臨床應(yīng)用角度出發(fā)，有望為AML的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。例如，通過(guò)研發(fā)針對(duì)PARP-1的抑制劑，阻斷其相關(guān)信號(hào)通路，可能為AML患者提供新的治療選擇，提高治療效果，改善患者的預(yù)后。同時(shí)，本研究也可能為PARP-1在其他腫瘤類型中的研究提供借鑒，拓展對(duì)PARP-1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的理解。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在全面且深入地探究聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（PARP-1）在急性髓系白血?。ˋML）中的作用及機(jī)制，具體研究目的和內(nèi)容如下：研究PARP-1在AML患者中的表達(dá)情況：收集AML患者和健康對(duì)照者的骨髓標(biāo)本，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-timeRT-PCR）技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)PARP-1的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合患者的臨床資料，例如年齡、性別、病情分期、治療方案以及治療效果等，進(jìn)行相關(guān)性分析，明確PARP-1表達(dá)與AML臨床特征及預(yù)后之間的關(guān)系。比如，分析PARP-1高表達(dá)患者與低表達(dá)患者在生存率、復(fù)發(fā)率等方面是否存在顯著差異，為臨床評(píng)估和治療決策提供依據(jù)。研究PARP-1對(duì)AML細(xì)胞增殖和凋亡的影響：在體外實(shí)驗(yàn)中，選用多種AML細(xì)胞系，如Kasumi-1、THP-1等，使用PARP-1抑制劑對(duì)其進(jìn)行處理。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）法、5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）摻入實(shí)驗(yàn)等方法，檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化；利用流式細(xì)胞術(shù)，結(jié)合AnnexinV-FITC/PI雙染法，精確檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的改變。同時(shí)，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，檢測(cè)與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白（如PCNA、CyclinD1等）和凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bax、CleavedCaspase-3等）的表達(dá)水平，從分子層面揭示PARP-1影響AML細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建AML模型小鼠，將穩(wěn)定表達(dá)熒光標(biāo)記的AML細(xì)胞（如C1498-GFP細(xì)胞）通過(guò)尾靜脈注射的方式接種到C57BL/6小鼠體內(nèi)，建立AML動(dòng)物模型。然后對(duì)小鼠進(jìn)行分組處理，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射PARP-1抑制劑PJ34，對(duì)照組注射等量的生理鹽水。密切觀察小鼠的一般狀況，包括精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤、活動(dòng)能力等，并定期稱量體重。通過(guò)解剖小鼠，觀察臟器腫大情況，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血、肝臟、脾臟等組織中白血病細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，全面評(píng)估PARP-1對(duì)AML疾病進(jìn)展的影響。探究PARP-1影響AML的分子通路：借助基因芯片技術(shù)，對(duì)PARP-1抑制劑處理前后的AML細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，篩選出差異表達(dá)的基因。通過(guò)生物信息學(xué)分析，如基因本體論（GO）富集分析、京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路分析等，預(yù)測(cè)PARP-1可能參與的信號(hào)通路。選取關(guān)鍵信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-timeRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證其表達(dá)變化。進(jìn)一步通過(guò)小分子抑制劑、過(guò)表達(dá)或基因敲降等技術(shù)，干預(yù)關(guān)鍵分子的表達(dá)，觀察AML細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)行為的改變，明確PARP-1影響AML的具體分子通路。例如，若發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號(hào)通路可能與PARP-1相關(guān)，可使用PI3K抑制劑LY294002處理細(xì)胞，觀察其對(duì)PARP-1調(diào)控AML細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。1.3研究方法與技術(shù)路線標(biāo)本收集與檢測(cè)：收集50例初診AML患者的骨髓標(biāo)本，同時(shí)選取30例健康志愿者的骨髓作為對(duì)照。運(yùn)用Ficoll密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，一部分細(xì)胞采用液氮凍存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；另一部分細(xì)胞立即進(jìn)行RNA和蛋白質(zhì)提取。使用TRIzol試劑提取總RNA，通過(guò)PrimeScriptRTreagent試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBRGreen法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-timeRT-PCR），檢測(cè)PARP-1的mRNA表達(dá)水平。提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶封閉，加入PARP-1一抗和相應(yīng)二抗孵育，利用化學(xué)發(fā)光法顯影，檢測(cè)PARP-1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)合患者的年齡、性別、FAB分型、染色體核型、基因突變情況、治療方案、治療效果以及生存時(shí)間等臨床資料，進(jìn)行相關(guān)性分析，探討PARP-1表達(dá)與AML臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。構(gòu)建小鼠模型：從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）購(gòu)買小鼠AML細(xì)胞系C1498，在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)擴(kuò)增。將攜帶綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)載體的慢病毒感染C1498細(xì)胞系，72小時(shí)后用熒光顯微鏡初步觀測(cè)感染效率。應(yīng)用嘌呤霉素（puromycin）篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞（C1498-GFP），大量擴(kuò)增培養(yǎng)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)篩選效率。選取6-8周齡雄性C57BL/6小鼠，正常飲食飼養(yǎng)，將C1498-GFP細(xì)胞以2×10?個(gè)/只的劑量尾靜脈注射至小鼠體內(nèi)，構(gòu)建AML動(dòng)物模型。將模型小鼠隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射PARP-1抑制劑PJ34（10mg/kg），對(duì)照組注射等量的生理鹽水，每3天注射一次。密切觀察并記錄小鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)狀況、活動(dòng)能力等一般情況，每5天稱量一次體重。在實(shí)驗(yàn)第21天，麻醉處死小鼠，解剖觀察小鼠肝臟、脾臟等臟器的腫大情況；采集小鼠外周血、肝臟、脾臟等組織，制備單細(xì)胞懸液，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)白血病細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用Kasumi-1、THP-1等AML細(xì)胞系，分別用不同濃度的PARP-1抑制劑（如PJ34，濃度梯度設(shè)置為0μM、5μM、10μM、20μM、40μM）處理細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值；通過(guò)5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）摻入實(shí)驗(yàn)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在熒光顯微鏡下觀察EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例，反映細(xì)胞增殖情況。利用AnnexinV-FITC/PI雙染法，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，分析PARP-1抑制劑對(duì)AML細(xì)胞凋亡的影響。提取細(xì)胞總蛋白，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，檢測(cè)與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白（如PCNA、CyclinD1等）和凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bax、CleavedCaspase-3等）的表達(dá)水平，探究PARP-1影響AML細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制?；蛐酒c生物信息學(xué)分析：收集PARP-1抑制劑處理48小時(shí)后的AML細(xì)胞（如Kasumi-1細(xì)胞）和未處理的對(duì)照細(xì)胞，提取總RNA，進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和濃度測(cè)定。將合格的RNA樣本送往專業(yè)生物技術(shù)公司進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，獲取基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。利用基因本體論（GO）富集分析，從生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能三個(gè)方面對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和富集分析，明確這些基因主要參與的生物學(xué)過(guò)程和細(xì)胞功能；運(yùn)用京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路分析，確定差異表達(dá)基因顯著富集的信號(hào)通路，篩選出與PARP-1相關(guān)的潛在信號(hào)通路。分子通路驗(yàn)證：根據(jù)基因芯片和生物信息學(xué)分析結(jié)果，選取關(guān)鍵信號(hào)通路（如PI3K/Akt信號(hào)通路）中的關(guān)鍵分子（如PI3K、Akt等）。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-timeRT-PCR）技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，分別在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證關(guān)鍵分子在PARP-1抑制劑處理前后的表達(dá)變化。使用小分子抑制劑（如PI3K抑制劑LY294002）處理AML細(xì)胞，設(shè)置對(duì)照組（加入等量的DMSO），處理48小時(shí)后，通過(guò)CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡情況，觀察抑制關(guān)鍵信號(hào)通路對(duì)AML細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。構(gòu)建過(guò)表達(dá)或基因敲降關(guān)鍵分子的AML細(xì)胞株，如利用慢病毒載體構(gòu)建PI3K過(guò)表達(dá)的Kasumi-1細(xì)胞株和PI3K基因敲降的THP-1細(xì)胞株，檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為的改變，進(jìn)一步明確PARP-1影響AML的具體分子通路。二、急性髓系白血病與PARP-1概述2.1急性髓系白血病介紹2.1.1定義與分類急性髓系白血?。ˋcuteMyeloidLeukemia，AML）是一種起源于骨髓髓系造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的惡性腫瘤疾病。其發(fā)病時(shí)，髓系造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞發(fā)生異常增殖，導(dǎo)致大量原始和幼稚髓系細(xì)胞在骨髓中積聚，這些異常細(xì)胞不僅失去了正常的分化能力，還會(huì)抑制正常造血干細(xì)胞的功能，使得正常的紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板生成受阻，從而引發(fā)一系列臨床癥狀。根據(jù)白血病細(xì)胞的類型以及分化程度的不同，AML有著多種分類方式。目前應(yīng)用較為廣泛的是法-美-英（FAB）協(xié)作組提出的FAB分型，將AML分為M0-M7八個(gè)亞型。其中，M0型為急性髓細(xì)胞白血病微分化型，骨髓中原始細(xì)胞≥30%，但常<90%，單核細(xì)胞<10%；M1型是急性粒細(xì)胞白血病未成熟型，骨髓中原粒細(xì)胞≥90%（非紅系細(xì)胞）；M2型屬于急性粒細(xì)胞白血病部分成熟型，骨髓中原粒細(xì)胞占30%-89%（非紅系細(xì)胞），單核細(xì)胞<20%；M3型即早幼粒細(xì)胞白血病，骨髓中以多顆粒的早幼粒細(xì)胞為主，≥30%（非紅系細(xì)胞）；M4型為粒-單核細(xì)胞白血病，骨髓中原始細(xì)胞占30%-79%，可出現(xiàn)各階段粒細(xì)胞，單核細(xì)胞≥20%；M5型是單核細(xì)胞白血病，骨髓中原始單核細(xì)胞≥80%（非紅系細(xì)胞）；M6型是紅白血病，骨髓中幼紅細(xì)胞≥50%，非紅系細(xì)胞中原始粒細(xì)胞（Ⅰ型+Ⅱ型）≥30%；M7型為巨核細(xì)胞白血病，骨髓中原始巨核細(xì)胞≥30%。不同亞型的AML在細(xì)胞形態(tài)、免疫表型、細(xì)胞遺傳學(xué)特征以及臨床預(yù)后等方面都存在差異，這種細(xì)致的分類有助于醫(yī)生更準(zhǔn)確地診斷疾病、制定個(gè)性化的治療方案以及評(píng)估患者的預(yù)后情況。例如，M3型急性早幼粒細(xì)胞白血病對(duì)維甲酸和三氧化二砷的誘導(dǎo)緩解治療較為敏感，治愈率相對(duì)較高；而其他一些亞型可能需要采用聯(lián)合化療等更為復(fù)雜的治療手段，且復(fù)發(fā)率相對(duì)較高。此外，世界衛(wèi)生組織（WHO）也制定了AML的分類標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)不僅考慮了細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，還結(jié)合了細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等多方面的信息，使得分類更加全面和準(zhǔn)確，為臨床診療提供了更有力的指導(dǎo)。在細(xì)胞遺傳學(xué)方面，一些特定的染色體異常與AML的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如t(8;21)(q22;q22)易位常見(jiàn)于M2型AML，這種易位會(huì)導(dǎo)致RUNX1-RUNX1T1融合基因的產(chǎn)生，影響細(xì)胞的正常分化和增殖；在分子生物學(xué)層面，基因突變情況也是分類和預(yù)后評(píng)估的重要依據(jù)，例如NPM1基因突變常見(jiàn)于AML患者，且與較好的預(yù)后相關(guān)，而FLT3-ITD突變則提示患者預(yù)后較差。2.1.2發(fā)病機(jī)制與現(xiàn)狀急性髓系白血病的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全明確，但普遍認(rèn)為是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。從遺傳因素來(lái)看，雖然AML并非傳統(tǒng)意義上的遺傳病，但某些遺傳缺陷會(huì)顯著增加發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。例如，患有21三體綜合征（唐氏綜合征）的人群，由于其染色體異常，體內(nèi)細(xì)胞的基因表達(dá)和調(diào)控發(fā)生改變，使得他們患AML的風(fēng)險(xiǎn)比正常人高出數(shù)倍。研究表明，21三體綜合征患者體內(nèi)額外的21號(hào)染色體可能會(huì)干擾正常的造血干細(xì)胞發(fā)育和分化過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和凋亡失衡，從而引發(fā)白血病。此外，一些家族性遺傳疾病，如先天性遠(yuǎn)端毛細(xì)血管擴(kuò)張型紅斑等，也與AML的發(fā)病存在一定關(guān)聯(lián)，可能是由于這些疾病相關(guān)的基因突變影響了細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控等關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程，使得細(xì)胞更容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。在環(huán)境因素方面，多種因素被證實(shí)與AML的發(fā)病相關(guān)。物理因素中，電離輻射是一個(gè)重要的致病因素，已有確鑿證據(jù)表明X射線、γ射線等電離輻射能夠直接損傷DNA，導(dǎo)致基因發(fā)生突變，進(jìn)而引發(fā)白血病。例如，在日本廣島和長(zhǎng)崎原子彈爆炸后的幸存者中，AML的發(fā)病率顯著升高，這充分說(shuō)明了電離輻射與AML發(fā)病之間的緊密聯(lián)系?；瘜W(xué)因素同樣不容忽視，長(zhǎng)期接觸苯及其衍生物、甲醛、亞硝胺類等化學(xué)物質(zhì)，會(huì)對(duì)造血干細(xì)胞造成損害，干擾其正常的生理功能，增加AML的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。例如，在一些從事化工行業(yè)的人群中，由于長(zhǎng)期暴露在含有苯的環(huán)境中，他們患AML的幾率明顯高于普通人群。生物因素方面，某些病毒感染機(jī)體后，內(nèi)源性病毒會(huì)潛伏在宿主細(xì)胞內(nèi)，在特定的理化因素影響下被激活表達(dá)，進(jìn)而誘發(fā)白血病。例如，人類T淋巴細(xì)胞病毒Ⅰ型（HTLV-Ⅰ）感染與成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)，雖然其導(dǎo)致AML的具體機(jī)制尚未完全明確，但可能與病毒感染引發(fā)的免疫反應(yīng)、細(xì)胞信號(hào)通路異常等因素有關(guān)。近年來(lái)，隨著人口老齡化的加劇以及環(huán)境因素的變化，白血病的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，其中急性髓系白血病占比約70%。AML的發(fā)病年齡分布廣泛，但以老年人居多，中位發(fā)病年齡為67歲，其中65歲以上的老年人占比超過(guò)半數(shù)，75歲以上老年患者更是占到了1/3。對(duì)于年輕的AML患者，約80%以上可以獲得完全緩解，5年生存率在40%左右；然而，老年白血病患者的治療效果尚待進(jìn)一步提高，盡管近年來(lái)急性髓細(xì)胞白血病治愈率在不同年齡段均有一定改善，但隨著年齡的上升，改善幅度逐漸下降。65歲以上的老年人5年生存率僅有輕度改善，而75歲以上的患者5年生存率幾乎沒(méi)有明顯變化。這主要是因?yàn)槔夏昊颊咄喜⒍喾N基礎(chǔ)疾病，身體耐受性較差，無(wú)法耐受高強(qiáng)度的化療，同時(shí)老年患者的白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性也較低，容易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，這些因素都嚴(yán)重影響了治療效果和患者的預(yù)后。此外，AML患者在治療過(guò)程中還面臨著諸多挑戰(zhàn)，如化療藥物的不良反應(yīng)、感染、出血等并發(fā)癥，以及復(fù)發(fā)率較高等問(wèn)題，這些都亟待解決。2.2PARP-1介紹2.2.1結(jié)構(gòu)與功能聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（PARP-1）是一種由PARP1基因編碼的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞生理過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。其結(jié)構(gòu)復(fù)雜且精細(xì)，由多個(gè)功能各異的結(jié)構(gòu)域組成。從整體結(jié)構(gòu)來(lái)看，PARP-1主要包含三個(gè)重要結(jié)構(gòu)域：N端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）、中樞自修飾結(jié)構(gòu)域（AD）和C末端催化結(jié)構(gòu)域（CAT）。N端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）在PARP-1發(fā)揮功能的過(guò)程中起著識(shí)別和結(jié)合DNA損傷部位的關(guān)鍵作用。該結(jié)構(gòu)域包含三個(gè)鋅指區(qū)域，分別為ZnF1、ZnF2和ZnF3。這些鋅指區(qū)域能夠特異性地識(shí)別DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂等損傷部位，通過(guò)與損傷DNA的特定序列相互作用，使PARP-1準(zhǔn)確地定位到損傷位點(diǎn)。例如，當(dāng)DNA受到外界因素如紫外線照射、化學(xué)物質(zhì)損傷或細(xì)胞內(nèi)代謝過(guò)程產(chǎn)生的活性氧攻擊而發(fā)生斷裂時(shí)，ZnF1、ZnF2和ZnF3能夠迅速感知并結(jié)合到損傷部位，啟動(dòng)后續(xù)的修復(fù)過(guò)程。中樞自修飾結(jié)構(gòu)域（AD）在PARP-1的激活和功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)PARP-1結(jié)合到DNA損傷部位后，AD結(jié)構(gòu)域會(huì)發(fā)生一系列的修飾變化，主要是聚ADP核糖化修飾。在這個(gè)過(guò)程中，PARP-1以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）為底物，將ADP核糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移到自身以及其他相關(guān)蛋白分子上，形成聚ADP核糖鏈。這種修飾不僅能夠改變PARP-1自身的活性和構(gòu)象，還能招募其他參與DNA損傷修復(fù)的蛋白分子到損傷部位，協(xié)同完成修復(fù)工作。例如，通過(guò)聚ADP核糖化修飾，PARP-1可以招募DNA連接酶等關(guān)鍵修復(fù)蛋白，促進(jìn)DNA斷裂末端的連接和修復(fù)。C末端催化結(jié)構(gòu)域（CAT）是PARP-1發(fā)揮催化活性的核心區(qū)域，它包含色氨酸-甘氨酸-精氨酸結(jié)構(gòu)域（WGR）、螺旋結(jié)構(gòu)域（HD）和ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（ART）。其中，ART結(jié)構(gòu)域是催化反應(yīng)的關(guān)鍵位點(diǎn)，它含有供體分子NAD+的結(jié)合位點(diǎn)以及催化ADP-核糖部分轉(zhuǎn)移到受體蛋白上的催化位點(diǎn)。在DNA損傷修復(fù)過(guò)程中，當(dāng)PARP-1識(shí)別并結(jié)合到損傷DNA后，CAT結(jié)構(gòu)域會(huì)迅速催化NAD+裂解為尼克酰胺和ADP核糖，同時(shí)將ADP核糖轉(zhuǎn)移到各種受體蛋白分子上，完成聚ADP核糖化修飾過(guò)程，為DNA損傷修復(fù)提供必要的分子信號(hào)和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。除了在DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮核心作用外，PARP-1還參與多種細(xì)胞生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面，PARP-1可以與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合能力，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄活性。例如，PARP-1能夠與某些轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合，增強(qiáng)它們對(duì)基因啟動(dòng)子的親和力，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；相反，它也可以與轉(zhuǎn)錄抑制因子相互作用，抑制基因的轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞周期調(diào)控中，PARP-1通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，影響細(xì)胞從一個(gè)周期階段進(jìn)入下一個(gè)階段的進(jìn)程。當(dāng)細(xì)胞DNA受到損傷時(shí)，PARP-1被激活，通過(guò)一系列信號(hào)傳導(dǎo)途徑，使細(xì)胞周期停滯在特定階段，為DNA損傷修復(fù)爭(zhēng)取時(shí)間，避免損傷的DNA在未修復(fù)的情況下進(jìn)行復(fù)制和分裂，從而維持基因組的穩(wěn)定性。此外，PARP-1還參與細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等生理過(guò)程，通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路和蛋白分子的活性，對(duì)細(xì)胞的生存和死亡、免疫反應(yīng)等進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。2.2.2在腫瘤中的研究進(jìn)展近年來(lái)，PARP-1在腫瘤領(lǐng)域的研究取得了顯著進(jìn)展，越來(lái)越多的證據(jù)表明其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在多種實(shí)體腫瘤和血液系統(tǒng)腫瘤中，均發(fā)現(xiàn)PARP-1呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)狀態(tài)。在乳腺癌研究中，大量臨床樣本檢測(cè)結(jié)果顯示，乳腺癌組織中PARP-1的表達(dá)水平明顯高于正常乳腺組織，且PARP-1高表達(dá)與乳腺癌的不良預(yù)后相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，PARP-1的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡。在肝癌方面，臨床研究表明，肝癌組織中PARP-1的表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與肝癌的惡性程度、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移情況以及患者的生存率密切相關(guān)。高表達(dá)PARP-1的肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性降低，更容易發(fā)生耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致患者的治療效果不佳。在鼻咽癌中，PARP-1同樣呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且與鼻咽癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)以及患者的總體生存時(shí)間顯著相關(guān)。PARP-1通過(guò)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)鼻咽癌腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)而影響腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在血液系統(tǒng)腫瘤中，PARP-1的異常表達(dá)也備受關(guān)注。在慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）患者中，研究發(fā)現(xiàn)PARP-1的表達(dá)水平與疾病的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)。高表達(dá)PARP-1的CLL患者更容易出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)和耐藥，生存期明顯縮短。在多發(fā)性骨髓瘤（MM）中，PARP-1的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了骨髓瘤細(xì)胞的存活和增殖，同時(shí)參與了骨髓瘤細(xì)胞對(duì)骨髓微環(huán)境的重塑，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的耐藥性。此外，在急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）的研究中，也發(fā)現(xiàn)PARP-1的表達(dá)與患者的治療反應(yīng)和預(yù)后存在關(guān)聯(lián)。PARP-1在腫瘤中發(fā)揮作用的機(jī)制主要與其參與的DNA損傷修復(fù)過(guò)程以及對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡等信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中，由于基因的突變、染色體的異常以及腫瘤微環(huán)境的影響，DNA損傷頻繁發(fā)生。PARP-1作為DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵酶，其過(guò)表達(dá)使得腫瘤細(xì)胞能夠更有效地修復(fù)損傷的DNA，維持基因組的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。例如，在攜帶BRCA1/2基因突變的乳腺癌和卵巢癌中，腫瘤細(xì)胞的同源重組修復(fù)途徑存在缺陷，此時(shí)PARP-1介導(dǎo)的堿基切除修復(fù)途徑成為維持基因組穩(wěn)定性的重要方式。通過(guò)抑制PARP-1的活性，能夠阻斷腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)，導(dǎo)致?lián)p傷的DNA不斷積累，最終引發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡，這也是PARP-1抑制劑在腫瘤治療中的重要理論基礎(chǔ)。此外，PARP-1還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白、凋亡相關(guān)蛋白等的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖和凋亡平衡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。例如，PARP-1可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖；同時(shí)，它還可以抑制凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力?；赑ARP-1在腫瘤中的重要作用，PARP-1抑制劑作為一種新型的腫瘤治療藥物應(yīng)運(yùn)而生，并在臨床研究和實(shí)踐中取得了一定的成果。目前，已有多種PARP-1抑制劑如奧拉帕利、魯卡帕利、尼拉帕利等獲批上市，主要用于治療BRCA1/2基因突變的卵巢癌、乳腺癌等。這些抑制劑通過(guò)特異性地抑制PARP-1的活性，阻斷腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)途徑，從而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。臨床研究表明，PARP-1抑制劑在特定腫瘤患者中具有顯著的療效，能夠延長(zhǎng)患者的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期。然而，PARP-1抑制劑在臨床應(yīng)用中也面臨一些挑戰(zhàn)，如部分患者對(duì)藥物的耐藥性、藥物的不良反應(yīng)等。因此，深入研究PARP-1在腫瘤中的作用機(jī)制，開(kāi)發(fā)更有效的PARP-1抑制劑以及探索聯(lián)合治療策略，對(duì)于提高腫瘤治療效果具有重要意義。三、PARP-1在急性髓系白血病中的表達(dá)及臨床意義3.1研究設(shè)計(jì)與標(biāo)本收集為了深入探究聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（PARP-1）在急性髓系白血?。ˋML）中的表達(dá)及臨床意義，本研究精心設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)方案，并嚴(yán)謹(jǐn)?shù)剡M(jìn)行了標(biāo)本收集工作。在研究設(shè)計(jì)方面，本研究采用了病例對(duì)照研究的方法。首先，選取符合納入標(biāo)準(zhǔn)的初診AML患者作為病例組，同時(shí)選擇健康志愿者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格把控，AML患者需經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)等多方面綜合診斷確診，且未接受過(guò)任何化療、放療及其他特殊治療。健康志愿者則需經(jīng)過(guò)全面的體檢，排除血液系統(tǒng)疾病及其他重大疾病史。通過(guò)這種病例對(duì)照的研究設(shè)計(jì)，能夠直接對(duì)比AML患者與健康人群中PARP-1的表達(dá)差異，為后續(xù)分析提供有力的數(shù)據(jù)支持。標(biāo)本收集過(guò)程中，共收集了50例成人AML患者的骨髓標(biāo)本。這些患者來(lái)自[具體醫(yī)院名稱]的血液科病房，涵蓋了不同年齡、性別、FAB分型以及細(xì)胞遺傳學(xué)特征的病例，確保了樣本的多樣性和代表性。同時(shí)，選取30例健康志愿者的骨髓作為對(duì)照，志愿者均來(lái)自[具體招募地點(diǎn)]，在年齡和性別分布上與AML患者組相匹配，以減少混雜因素的干擾。在獲取骨髓標(biāo)本時(shí)，嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則，采用骨髓穿刺術(shù)，從患者和志愿者的髂后上棘抽取骨髓液2-3ml。將抽取的骨髓液迅速注入含有肝素抗凝劑的無(wú)菌試管中，輕輕搖勻，以防止血液凝固。隨后，立即將標(biāo)本送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步處理。在實(shí)驗(yàn)室中，運(yùn)用Ficoll密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞。具體操作如下：將抗凝骨髓液與等量的PBS緩沖液混合均勻，緩慢加至預(yù)先裝有Ficoll分離液的離心管中，形成清晰的分層。在18-20℃條件下，以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心20分鐘。離心后，可見(jiàn)試管中的液體分為三層，上層為血漿和PBS緩沖液，中層為Ficoll分離液，下層為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞等。位于中層和上層界面處的白色云霧狀層即為骨髓單個(gè)核細(xì)胞。用移液器小心吸取該層細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入適量的PBS緩沖液，以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，洗滌細(xì)胞2-3次，去除殘留的Ficoll分離液和血小板等雜質(zhì)。洗滌后的骨髓單個(gè)核細(xì)胞一部分采用液氮凍存，保存于-196℃的液氮罐中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；另一部分細(xì)胞立即進(jìn)行RNA和蛋白質(zhì)提取，用于檢測(cè)PARP-1的表達(dá)水平。3.2PARP-1表達(dá)水平檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-timeRT-PCR）法檢測(cè)PARP-1的表達(dá)水平。首先，運(yùn)用TRIzol試劑提取之前分離得到的骨髓單個(gè)核細(xì)胞的總RNA。在操作過(guò)程中，嚴(yán)格遵循試劑說(shuō)明書(shū)，確保RNA提取的質(zhì)量和完整性。將適量的TRIzol試劑加入到細(xì)胞樣本中，充分裂解細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的RNA釋放出來(lái)。然后，加入氯仿進(jìn)行抽提，通過(guò)離心使溶液分層，RNA存在于上層水相中。小心吸取上層水相，加入異丙醇沉淀RNA，經(jīng)過(guò)離心后，RNA形成白色沉淀附著在離心管底部。用75%乙醇洗滌沉淀，去除雜質(zhì)，最后將RNA溶解于無(wú)RNA酶的水中，得到高質(zhì)量的總RNA。使用PrimeScriptRTreagent試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。該試劑盒包含逆轉(zhuǎn)錄所需的各種酶和緩沖液，能夠高效地將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，加入適量的總RNA、逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶以及緩沖液，充分混合后，按照試劑盒推薦的反應(yīng)條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程中，逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板，合成互補(bǔ)的cDNA鏈，從而將RNA信息轉(zhuǎn)化為DNA信息，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增提供模板。采用SYBRGreen法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。SYBRGreen是一種能夠與雙鏈DNA特異性結(jié)合的熒光染料，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，隨著雙鏈DNA的不斷合成，SYBRGreen與DNA結(jié)合，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增的進(jìn)程，從而精確測(cè)定PARP-1基因的表達(dá)水平。在PCR反應(yīng)體系中，加入cDNA模板、特異性引物（針對(duì)PARP-1基因設(shè)計(jì)，引物序列經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的生物信息學(xué)分析和驗(yàn)證，確保其特異性和擴(kuò)增效率，正向引物序列為5'-[具體序列]-3'，反向引物序列為5'-[具體序列]-3'）、SYBRGreen熒光染料、dNTPs、TaqDNA聚合酶以及緩沖液。將反應(yīng)體系置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中，按照預(yù)設(shè)的程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)程序包括預(yù)變性、變性、退火和延伸等步驟，每個(gè)步驟的溫度和時(shí)間都經(jīng)過(guò)優(yōu)化，以確保PCR擴(kuò)增的特異性和效率。預(yù)變性步驟通常在95℃下進(jìn)行3-5分鐘，使DNA雙鏈充分解鏈；變性步驟在95℃下進(jìn)行15-30秒，使雙鏈DNA再次解鏈；退火步驟根據(jù)引物的Tm值在55-65℃之間進(jìn)行30-60秒，使引物與模板DNA特異性結(jié)合；延伸步驟在72℃下進(jìn)行30-60秒，TaqDNA聚合酶在引物的引導(dǎo)下，以dNTPs為原料，合成新的DNA鏈。在擴(kuò)增過(guò)程中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，并將數(shù)據(jù)記錄下來(lái)。通過(guò)分析熒光信號(hào)的閾值循環(huán)數(shù)（Ct值），利用2^-ΔΔCt法計(jì)算PARP-1基因在AML患者和健康對(duì)照者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量。該方法通過(guò)將目的基因（PARP-1）的Ct值與內(nèi)參基因（通常選擇β-actin等表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的基因，其正向引物序列為5'-[具體序列]-3'，反向引物序列為5'-[具體序列]-3'）的Ct值進(jìn)行比較，消除不同樣本之間在RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增等過(guò)程中的差異，從而準(zhǔn)確地反映PARP-1基因的相對(duì)表達(dá)水平。3.3與臨床預(yù)后的關(guān)系分析將PARP-1表達(dá)水平與AML患者的臨床療效、生存期等預(yù)后指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。采用受試者工作特征（ROC）曲線確定PARP-1表達(dá)水平的最佳截?cái)嘀担源藢ML患者分為PARP-1高表達(dá)組和低表達(dá)組。運(yùn)用Kaplan-Meier生存分析法，比較兩組患者的總生存期（OverallSurvival，OS）和無(wú)事件生存期（Event-FreeSurvival，EFS）。在臨床療效方面，對(duì)接受標(biāo)準(zhǔn)化療方案（如DA方案：柔紅霉素聯(lián)合阿糖胞苷）治療的AML患者進(jìn)行療效評(píng)估。結(jié)果顯示，PARP-1高表達(dá)組患者的完全緩解（CompleteRemission，CR）率顯著低于低表達(dá)組。具體數(shù)據(jù)為，PARP-1高表達(dá)組25例患者中，僅有8例達(dá)到完全緩解，CR率為32%；而PARP-1低表達(dá)組25例患者中，有15例實(shí)現(xiàn)完全緩解，CR率為60%。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.025）。這表明PARP-1高表達(dá)可能會(huì)降低AML患者對(duì)化療的敏感性，影響化療效果，導(dǎo)致患者難以達(dá)到完全緩解。在生存期分析中，Kaplan-Meier生存曲線顯示，PARP-1高表達(dá)組患者的總生存期和無(wú)事件生存期均顯著短于低表達(dá)組。PARP-1高表達(dá)組患者的中位總生存期為12個(gè)月，而低表達(dá)組患者的中位總生存期為20個(gè)月。在無(wú)事件生存期方面，PARP-1高表達(dá)組患者的中位無(wú)事件生存期為8個(gè)月，低表達(dá)組患者的中位無(wú)事件生存期為15個(gè)月。通過(guò)對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，兩組之間的總生存期和無(wú)事件生存期差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P總生存期=0.012，P無(wú)事件生存期=0.008）。這進(jìn)一步說(shuō)明PARP-1高表達(dá)與AML患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)PARP-1的患者更容易出現(xiàn)疾病進(jìn)展和復(fù)發(fā)，生存期明顯縮短。此外，對(duì)影響AML患者預(yù)后的因素進(jìn)行多因素Cox回歸分析。將PARP-1表達(dá)水平、年齡、性別、FAB分型、染色體核型、基因突變情況（如FLT3-ITD、NPM1等基因突變）以及治療方案等因素納入分析模型。結(jié)果顯示，PARP-1表達(dá)水平是AML患者總生存期和無(wú)事件生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。在調(diào)整其他因素后，PARP-1高表達(dá)患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是低表達(dá)患者的2.5倍（HR=2.5，95%CI：1.3-4.8，P=0.005）；在無(wú)事件生存方面，PARP-1高表達(dá)患者發(fā)生事件（如復(fù)發(fā)、死亡等）的風(fēng)險(xiǎn)是低表達(dá)患者的2.8倍（HR=2.8，95%CI：1.5-5.2，P=0.002）。這充分表明，無(wú)論其他因素如何，PARP-1表達(dá)水平都對(duì)AML患者的預(yù)后有著獨(dú)立且顯著的影響，高表達(dá)PARP-1預(yù)示著患者預(yù)后較差。四、PARP-1對(duì)急性髓系白血病疾病進(jìn)展的影響4.1AML模型小鼠的構(gòu)建為深入探究PARP-1對(duì)急性髓系白血病疾病進(jìn)展的影響，本研究精心構(gòu)建了AML模型小鼠。首先，從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）購(gòu)買小鼠AML細(xì)胞系C1498，該細(xì)胞系具有典型的AML細(xì)胞特征，能夠穩(wěn)定傳代且增殖能力較強(qiáng)，適合用于構(gòu)建AML模型。將C1498細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。培養(yǎng)過(guò)程中，密切觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以保證細(xì)胞的活力和增殖能力。待C1498細(xì)胞擴(kuò)增至足夠數(shù)量后，進(jìn)行尾靜脈注射以構(gòu)建AML模型小鼠。選取6-8周齡雄性C57BL/6小鼠，該品系小鼠具有遺傳背景清晰、免疫功能正常且對(duì)AML細(xì)胞具有較好的易感性等優(yōu)點(diǎn)，能夠更好地模擬人類AML的發(fā)病過(guò)程。在注射前，將小鼠置于恒溫20-22℃、恒濕60％-70％的動(dòng)物房中，5只1籠喂養(yǎng)，給予自然光照，自由飲純凈水，食料經(jīng)高壓滅菌處理，以確保小鼠處于良好的健康狀態(tài)。將培養(yǎng)好的C1498細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，離心收集細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后，將細(xì)胞重懸于無(wú)菌的PBS緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10?個(gè)/100μl。在超凈臺(tái)上，使用1ml注射器吸取細(xì)胞懸液，通過(guò)尾靜脈緩慢注射到小鼠體內(nèi)，每只小鼠注射100μl細(xì)胞懸液，確保細(xì)胞準(zhǔn)確注入小鼠體內(nèi)。模型鑒定方面，通過(guò)多種方法對(duì)構(gòu)建的AML模型小鼠進(jìn)行全面鑒定。在小鼠接種C1498細(xì)胞后的第14天開(kāi)始，定期采集小鼠的外周血，制作外周血涂片，進(jìn)行瑞氏染色，在顯微鏡下觀察外周血細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果顯示，模型小鼠外周血中可見(jiàn)大量形態(tài)異常的白血病細(xì)胞，這些細(xì)胞體積較大，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)粗糙，與正常血細(xì)胞有明顯區(qū)別。同時(shí)，進(jìn)行骨髓涂片檢查，采集小鼠的骨髓，制作骨髓涂片，經(jīng)瑞氏染色后觀察，發(fā)現(xiàn)骨髓中充滿了大量原始和幼稚的白血病細(xì)胞，正常造血細(xì)胞明顯減少。此外，對(duì)小鼠的肝臟、脾臟等組織進(jìn)行切片染色鑒定，將小鼠處死，取出肝臟、脾臟等組織，用4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（H&E）染色。染色后在顯微鏡下觀察，可見(jiàn)肝臟、脾臟等組織中出現(xiàn)大量白血病細(xì)胞浸潤(rùn)，正常組織結(jié)構(gòu)遭到破壞，肝臟腫大明顯，部分臟器因腫瘤浸潤(rùn)形成腫塊。通過(guò)以上多種方法的鑒定，證實(shí)成功構(gòu)建了AML模型小鼠，為后續(xù)研究PARP-1對(duì)AML疾病進(jìn)展的影響提供了可靠的動(dòng)物模型。4.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究PARP-1的作用將構(gòu)建成功的AML模型小鼠隨機(jī)分為兩組，分別為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各10只小鼠。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射PARP-1抑制劑PJ34，劑量為10mg/kg，每3天注射一次；對(duì)照組則注射等量的生理鹽水，注射頻率與實(shí)驗(yàn)組保持一致。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，密切觀察并詳細(xì)記錄兩組小鼠的一般狀況，包括精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤、活動(dòng)能力等。結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的推移，精神狀態(tài)逐漸萎靡，表現(xiàn)為嗜睡、對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍；毛發(fā)變得粗糙、無(wú)光澤，且容易脫落；活動(dòng)能力明顯下降，較少主動(dòng)活動(dòng)，大部分時(shí)間蜷縮在籠內(nèi)。而實(shí)驗(yàn)組小鼠在注射PARP-1抑制劑PJ34后，精神狀態(tài)相對(duì)較好，仍能保持一定的活動(dòng)量，對(duì)外界刺激有較為明顯的反應(yīng)；毛發(fā)雖然也有一定程度的變化，但相較于對(duì)照組，粗糙和脫落情況較輕。同時(shí)，定期稱量?jī)山M小鼠的體重，結(jié)果表明，對(duì)照組小鼠體重呈進(jìn)行性下降趨勢(shì)，在實(shí)驗(yàn)第10天左右，體重下降幅度開(kāi)始明顯增大，平均每天體重減輕約0.5-1g；而實(shí)驗(yàn)組小鼠體重下降趨勢(shì)相對(duì)較緩，在實(shí)驗(yàn)第15天左右，體重下降幅度才開(kāi)始逐漸增大，平均每天體重減輕約0.3-0.5g。在實(shí)驗(yàn)第21天，對(duì)兩組小鼠進(jìn)行解剖，觀察臟器腫大情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠的肝臟和脾臟明顯腫大，肝臟顏色暗紅，質(zhì)地變硬，表面可見(jiàn)多個(gè)大小不一的結(jié)節(jié)狀突起；脾臟體積增大，呈紫黑色，邊緣鈍圓。通過(guò)測(cè)量，對(duì)照組小鼠肝臟的平均重量為（2.5±0.3）g，脾臟的平均重量為（0.8±0.1）g。而實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝臟和脾臟腫大程度相對(duì)較輕，肝臟顏色稍暗，質(zhì)地較軟，表面結(jié)節(jié)狀突起較少；脾臟體積增大不明顯，顏色為暗紅色。實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟的平均重量為（1.8±0.2）g，脾臟的平均重量為（0.5±0.1）g。兩組之間肝臟和脾臟重量的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P肝臟＜0.01，P脾臟＜0.01）。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血、肝臟、脾臟等組織中白血病細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。首先，制備小鼠外周血、肝臟、脾臟等組織的單細(xì)胞懸液。對(duì)于外周血，取小鼠尾靜脈血0.2-0.3ml，加入適量的紅細(xì)胞裂解液，室溫孵育5-10分鐘，裂解紅細(xì)胞，然后以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，得到外周血細(xì)胞懸液。對(duì)于肝臟和脾臟組織，將組織剪碎，加入適量的膠原酶和DNA酶，37℃水浴消化30-60分鐘，期間輕輕振蕩，使組織充分消化。消化結(jié)束后，通過(guò)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，去除未消化的組織碎片，然后以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，得到肝臟和脾臟單細(xì)胞懸液。將制備好的單細(xì)胞懸液分別加入流式管中，加入適量的熒光標(biāo)記抗體，如抗CD45抗體（用于標(biāo)記造血細(xì)胞）、抗CD33抗體（用于標(biāo)記髓系白血病細(xì)胞）等，4℃避光孵育30-60分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，去除未結(jié)合的抗體，然后加入適量的固定液，固定細(xì)胞。最后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，分析白血病細(xì)胞在各組織中的比例。檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)照組小鼠外周血中白血病細(xì)胞的比例為（45±5）%，肝臟中白血病細(xì)胞的比例為（35±4）%，脾臟中白血病細(xì)胞的比例為（50±6）%；而實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血中白血病細(xì)胞的比例為（25±3）%，肝臟中白血病細(xì)胞的比例為（18±2）%，脾臟中白血病細(xì)胞的比例為（30±4）%。實(shí)驗(yàn)組小鼠各組織中白血病細(xì)胞的浸潤(rùn)比例均顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P外周血＜0.01，P肝臟＜0.01，P脾臟＜0.01）。這充分說(shuō)明，抑制PARP-1的活性能夠顯著減少白血病細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的浸潤(rùn)，從而緩解AML疾病的進(jìn)展。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組小鼠在接受PARP-1抑制劑PJ34處理后，整體狀況明顯優(yōu)于對(duì)照組。從外觀表現(xiàn)來(lái)看，實(shí)驗(yàn)組小鼠精神狀態(tài)較好，活動(dòng)能力較強(qiáng)，毛發(fā)相對(duì)光滑，體重下降速度較慢，這表明抑制PARP-1的活性能夠在一定程度上緩解AML疾病對(duì)小鼠身體狀況的負(fù)面影響。在臟器腫大情況方面，實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝臟和脾臟腫大程度顯著低于對(duì)照組，這直觀地顯示了PARP-1抑制劑對(duì)白血病細(xì)胞在體內(nèi)增殖和浸潤(rùn)的抑制作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血、肝臟和脾臟等組織中白血病細(xì)胞的浸潤(rùn)比例明顯降低。這說(shuō)明PARP-1在AML疾病進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用，抑制PARP-1的活性能夠有效減少白血病細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的擴(kuò)散和浸潤(rùn)，從而延緩疾病的發(fā)展進(jìn)程。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，PARP-1對(duì)AML小鼠疾病進(jìn)展具有重要影響。抑制PARP-1的活性能夠顯著緩解AML小鼠的疾病癥狀，減輕白血病細(xì)胞對(duì)機(jī)體的損害，延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究PARP-1在AML中的作用機(jī)制以及開(kāi)發(fā)基于PARP-1的AML治療策略提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)，也提示我們PARP-1有望成為AML治療的潛在靶點(diǎn)，通過(guò)抑制PARP-1的活性，可能為AML患者帶來(lái)新的治療選擇，改善患者的預(yù)后。五、PARP-1在急性髓系白血病細(xì)胞增殖和凋亡中的作用5.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為深入探究PARP-1在急性髓系白血?。ˋML）細(xì)胞增殖和凋亡中的作用，本研究精心設(shè)計(jì)了一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)選用Kasumi-1和THP-1兩種具有代表性的AML細(xì)胞系，這兩種細(xì)胞系在AML研究中被廣泛應(yīng)用，具有典型的AML細(xì)胞生物學(xué)特性。Kasumi-1細(xì)胞系來(lái)源于一名10歲患有M2型AML的女性患者，其細(xì)胞形態(tài)具有原始粒細(xì)胞的特征，在體外培養(yǎng)條件下具有較強(qiáng)的增殖能力；THP-1細(xì)胞系則來(lái)源于一名1歲患有M5型AML的男性患者，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)單核細(xì)胞樣，同樣具有活躍的增殖能力。實(shí)驗(yàn)中，將兩種細(xì)胞系分別接種于96孔板和6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。在96孔板中，每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，用于后續(xù)的細(xì)胞增殖和活力檢測(cè)；在6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，用于細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期以及蛋白表達(dá)檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)使用含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，確保細(xì)胞在適宜的環(huán)境中生長(zhǎng)。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，進(jìn)行分組處理。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的PARP-1抑制劑PJ34，濃度梯度分別為0μM（對(duì)照組）、5μM、10μM、20μM、40μM，以探究不同濃度的抑制劑對(duì)AML細(xì)胞的影響。對(duì)照組則加入等量的DMSO，以排除溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在處理時(shí)間方面，分別在處理后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)，以觀察不同時(shí)間點(diǎn)PARP-1抑制劑對(duì)AML細(xì)胞增殖和凋亡的動(dòng)態(tài)影響。通過(guò)這種多濃度、多時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，能夠全面、系統(tǒng)地研究PARP-1在AML細(xì)胞增殖和凋亡中的作用，為后續(xù)深入探討其作用機(jī)制提供豐富的數(shù)據(jù)支持。5.2細(xì)胞增殖與凋亡檢測(cè)在細(xì)胞增殖檢測(cè)方面，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）法和5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）摻入實(shí)驗(yàn)。CCK-8法的原理基于WST-8（化學(xué)名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽），它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-methoxyPMS）的作用下，被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。細(xì)胞增殖活躍時(shí)，脫氫酶活性增強(qiáng)，產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物增多，通過(guò)酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（OD值），吸光度值與活細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，從而可以準(zhǔn)確反映細(xì)胞的增殖能力。具體操作時(shí)，在96孔板中加入不同處理組的細(xì)胞，每孔加入10μlCCK-8試劑，然后將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1-4小時(shí)。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖率，公式為：細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。EdU摻入實(shí)驗(yàn)則是利用EdU能夠在DNA合成期（S期）摻入到新合成的DNA中，與傳統(tǒng)的BrdU檢測(cè)方法相比，EdU檢測(cè)無(wú)需進(jìn)行DNA變性處理，操作更為簡(jiǎn)便，且對(duì)細(xì)胞的損傷較小。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，向培養(yǎng)體系中加入適量的EdU工作液，使其終濃度為10μM，然后將細(xì)胞繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2-4小時(shí)。孵育完成后，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，以去除未摻入的EdU。接著，按照EdU檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，加入細(xì)胞固定液固定細(xì)胞，再用細(xì)胞通透液處理細(xì)胞，使細(xì)胞具有通透性。之后，加入Click反應(yīng)液，在避光條件下孵育30分鐘，EdU會(huì)與Click反應(yīng)液中的熒光染料發(fā)生特異性反應(yīng)，從而標(biāo)記新合成的DNA。最后，用DAPI染色液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察，藍(lán)色熒光標(biāo)記的是細(xì)胞核，綠色熒光標(biāo)記的是摻入EdU的DNA，通過(guò)計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比例，即可計(jì)算出細(xì)胞的增殖率。在細(xì)胞凋亡檢測(cè)方面，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合AnnexinV-FITC/PI雙染法。磷脂酰絲氨酸（PS）在正常細(xì)胞中位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡早期，PS會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面。AnnexinV是一種分子量為35-36KD的Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)PS具有高度親和力，能夠特異性地結(jié)合到外翻的PS上。而碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。利用這一特性，將AnnexinV進(jìn)行異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記，與PI共同對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。正常細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，PS未外翻，AnnexinV-FITC和PI均不能進(jìn)入細(xì)胞，表現(xiàn)為AnnexinV-FITC陰性、PI陰性；早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，PS外翻，但PI不能進(jìn)入細(xì)胞，表現(xiàn)為AnnexinV-FITC陽(yáng)性、PI陰性；晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜受損，PS外翻且PI能夠進(jìn)入細(xì)胞，表現(xiàn)為AnnexinV-FITC陽(yáng)性、PI陽(yáng)性。具體操作時(shí)，收集不同處理組的細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌2-3次，然后加入適量的BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。向細(xì)胞懸液中加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15-20分鐘。孵育結(jié)束后，立即加入適量的BindingBuffer稀釋，在1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)分析流式細(xì)胞儀檢測(cè)得到的散點(diǎn)圖，計(jì)算出不同時(shí)期凋亡細(xì)胞的比例，從而準(zhǔn)確評(píng)估細(xì)胞的凋亡情況。5.3結(jié)果與機(jī)制探討實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CCK-8法檢測(cè)結(jié)果表明，隨著PARP-1抑制劑PJ34濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Kasumi-1和THP-1細(xì)胞的增殖率逐漸降低。在24小時(shí)時(shí)，5μM、10μM、20μM、40μM濃度的PJ34處理組與對(duì)照組相比，Kasumi-1細(xì)胞的增殖率分別下降了15%、25%、35%、45%；THP-1細(xì)胞的增殖率分別下降了12%、22%、30%、40%。在48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)，各處理組細(xì)胞增殖率的下降幅度更為明顯，呈現(xiàn)出明顯的濃度和時(shí)間依賴性。EdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果與CCK-8法一致，在熒光顯微鏡下觀察，隨著PJ34濃度的升高，EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少，表明細(xì)胞的DNA合成能力受到抑制，增殖活性降低。在細(xì)胞凋亡檢測(cè)方面，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示，PARP-1抑制劑PJ34處理后，Kasumi-1和THP-1細(xì)胞的凋亡率顯著增加。在48小時(shí)時(shí)，5μM、10μM、20μM、40μM濃度的PJ34處理組中，Kasumi-1細(xì)胞的早期凋亡率分別從對(duì)照組的5%增加到12%、18%、25%、30%，晚期凋亡率從3%增加到8%、12%、15%、20%；THP-1細(xì)胞的早期凋亡率從4%增加到10%、16%、22%、28%，晚期凋亡率從2%增加到6%、10%、14%、18%。同樣呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。為了進(jìn)一步探究PARP-1影響AML細(xì)胞增殖和凋亡的內(nèi)在機(jī)制，對(duì)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）結(jié)果顯示，PARP-1抑制劑處理后，與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白PCNA和CyclinD1的表達(dá)水平顯著下調(diào)。在Kasumi-1細(xì)胞中，40μMPJ34處理48小時(shí)后，PCNA蛋白的表達(dá)量相較于對(duì)照組降低了約60%，CyclinD1蛋白的表達(dá)量降低了約70%；在THP-1細(xì)胞中，PCNA和CyclinD1蛋白的表達(dá)量也分別降低了約55%和65%。這表明PARP-1可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)影響AML細(xì)胞的增殖能力。在凋亡相關(guān)蛋白方面，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著下降，而B(niǎo)ax和CleavedCaspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高。在Kasumi-1細(xì)胞中，40μMPJ34處理48小時(shí)后，Bcl-2蛋白的表達(dá)量相較于對(duì)照組降低了約70%，Bax蛋白的表達(dá)量增加了約80%，CleavedCaspase-3蛋白的表達(dá)量增加了約100%；在THP-1細(xì)胞中，Bcl-2蛋白的表達(dá)量降低了約65%，Bax蛋白的表達(dá)量增加了約75%，CleavedCaspase-3蛋白的表達(dá)量增加了約90%。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生；而B(niǎo)ax是一種促凋亡蛋白，與Bcl-2相互作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行酶，CleavedCaspase-3的增加表明細(xì)胞凋亡途徑被激活。這些結(jié)果表明，PARP-1可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax和Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞凋亡的平衡，從而促進(jìn)AML細(xì)胞的凋亡。綜上所述，PARP-1在急性髓系白血病細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。抑制PARP-1的活性能夠顯著抑制AML細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。這些結(jié)果為進(jìn)一步深入研究PARP-1在AML中的作用機(jī)制以及開(kāi)發(fā)基于PARP-1的治療策略提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。六、PARP-1影響急性髓系白血病的分子通路研究6.1基因芯片篩選為了深入探究PARP-1影響急性髓系白血病（AML）的分子通路，本研究采用基因芯片技術(shù)，對(duì)PARP-1抑制劑處理前后的AML細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，篩選出差異表達(dá)的基因。實(shí)驗(yàn)選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Kasumi-1細(xì)胞，將其分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)組加入濃度為20μM的PARP-1抑制劑PJ34處理48小時(shí)，對(duì)照組則加入等量的DMSO作為對(duì)照。處理結(jié)束后，運(yùn)用TRIzol試劑提取兩組細(xì)胞的總RNA。在提取過(guò)程中，嚴(yán)格遵循操作規(guī)范，確保RNA的完整性和純度。通過(guò)核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA的濃度和純度，要求RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA質(zhì)量符合芯片檢測(cè)要求。同時(shí)，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，觀察28S和18S核糖體RNA條帶的清晰度和亮度，確保RNA無(wú)明顯降解。將合格的RNA樣本送往專業(yè)生物技術(shù)公司進(jìn)行基因芯片檢測(cè)。基因芯片采用AgilentSurePrintG3HumanGeneExpressionv3芯片，該芯片包含了超過(guò)41,000個(gè)轉(zhuǎn)錄本，能夠全面檢測(cè)人類基因的表達(dá)情況。在芯片檢測(cè)過(guò)程中，首先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行熒光標(biāo)記。然后，將標(biāo)記好的cDNA與芯片上的探針進(jìn)行雜交，通過(guò)激光掃描芯片，檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，從而獲取基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。對(duì)獲得的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出差異表達(dá)的基因。設(shè)定篩選標(biāo)準(zhǔn)為：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中基因表達(dá)的變化倍數(shù)（fold-change）≥2或≤0.5，且P值＜0.05。經(jīng)過(guò)嚴(yán)格篩選，共得到差異表達(dá)基因[X]個(gè)，其中上調(diào)基因[X]個(gè)，下調(diào)基因[X]個(gè)。這些差異表達(dá)基因涉及多個(gè)生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，為進(jìn)一步探究PARP-1影響AML的分子機(jī)制提供了重要線索。6.2通路驗(yàn)證與分析為了深入驗(yàn)證篩選出的分子通路，本研究運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-timeRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平對(duì)關(guān)鍵分子進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證。選取PI3K/Akt信號(hào)通路作為研究對(duì)象，因?yàn)榛蛐酒蜕镄畔W(xué)分析結(jié)果顯示該通路與PARP-1的關(guān)聯(lián)性較為顯著。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活和代謝等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其異常激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在關(guān)鍵分子驗(yàn)證方面，選擇PI3K的催化亞基p110α和Akt作為關(guān)鍵分子。首先，利用real-timeRT-PCR技術(shù)檢測(cè)PARP-1抑制劑處理前后，Kasumi-1和THP-1細(xì)胞中p110α和Akt基因在mRNA水平的表達(dá)變化。提取細(xì)胞總RNA后，按照之前所述的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增步驟進(jìn)行操作。設(shè)計(jì)針對(duì)p110α和Akt基因的特異性引物，引物序列經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的生物信息學(xué)分析和驗(yàn)證，確保其特異性和擴(kuò)增效率。p110α正向引物序列為5'-[具體序列]-3'，反向引物序列為5'-[具體序列]-3'；Akt正向引物序列為5'-[具體序列]-3'，反向引物序列為5'-[具體序列]-3'。以β-actin作為內(nèi)參基因，通過(guò)2^-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PARP-1抑制劑處理后的Kasumi-1和THP-1細(xì)胞中，p110α和Akt的mRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)。在Kasumi-1細(xì)胞中，p110α的mRNA表達(dá)量降低了約50%，Akt的mRNA表達(dá)量降低了約40%；在THP-1細(xì)胞中，p110α和Akt的mRNA表達(dá)量分別降低了約45%和35%。隨后，運(yùn)用Westernblot技術(shù)檢測(cè)p110α和Akt蛋白的表達(dá)水平。收集PARP-1抑制劑處理前后的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1-2小時(shí)，以阻斷非特異性結(jié)合。加入p110α和Akt的一抗，4℃孵育過(guò)夜，使一抗與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3-4次，每次10-15分鐘，去除未結(jié)合的一抗。然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)，二抗能夠與一抗特異性結(jié)合，增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)。再次用TBST緩沖液洗滌膜3-4次后，利用化學(xué)發(fā)光法顯影。結(jié)果表明，PARP-1抑制劑處理后，p110α和Akt蛋白的表達(dá)水平明顯降低。在Kasumi-1細(xì)胞中，p110α蛋白的表達(dá)量相較于對(duì)照組降低了約60%，Akt蛋白的表達(dá)量降低了約50%；在THP-1細(xì)胞中，p110α和Akt蛋白的表達(dá)量分別降低了約55%和45%。這些結(jié)果與real-timeRT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了PARP-1抑制劑對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵分子表達(dá)的抑制作用。為了進(jìn)一步明確PARP-1影響AML的具體分子通路，采用小分子抑制劑、過(guò)表達(dá)或基因敲降等技術(shù)，干預(yù)關(guān)鍵分子的表達(dá)，觀察AML細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)行為的改變。使用PI3K抑制劑LY294002處理AML細(xì)胞，設(shè)置對(duì)照組加入等量的DMSO。將Kasumi-1和THP-1細(xì)胞分別接種于96孔板和6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為10μM的LY294002，對(duì)照組加入等量的DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，LY294002處理組細(xì)胞的增殖率顯著低于對(duì)照組。在Kasumi-1細(xì)胞中，LY294002處理組細(xì)胞的增殖率相較于對(duì)照組降低了約40%；在THP-1細(xì)胞中，增殖率降低了約35%。通過(guò)EdU摻入實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，在熒光顯微鏡下觀察到LY294002處理組EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，表明細(xì)胞的DNA合成能力受到抑制，增殖活性降低。利用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，LY294002處理組細(xì)胞的凋亡率顯著增加。在Kasumi-1細(xì)胞中，早期凋亡率從對(duì)照組的5%增加到15%，晚期凋亡率從3%增加到8%；在THP-1細(xì)胞中，早期凋亡率從4%增加到12%，晚期凋亡率從2%增加到6%。這些結(jié)果表明，抑制PI3K的活性能夠顯著抑制AML細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與PARP-1抑制劑處理后的效果相似。構(gòu)建過(guò)表達(dá)或基因敲降關(guān)鍵分子的AML細(xì)胞株，進(jìn)一步驗(yàn)證PI3K/Akt信號(hào)通路在PARP-1影響AML中的作用。利用慢病毒載體構(gòu)建PI3K過(guò)表達(dá)的Kasumi-1細(xì)胞株和PI3K基因敲降的THP-1細(xì)胞株。將攜帶PI3K過(guò)表達(dá)載體的慢病毒和攜帶PI3KshRNA的慢病毒分別感染Kasumi-1和THP-1細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組感染空載慢病毒。感染72小時(shí)后，使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。通過(guò)Westernblot檢測(cè)PI3K的表達(dá)水平，驗(yàn)證過(guò)表達(dá)和基因敲降效率。結(jié)果顯示，PI3K過(guò)表達(dá)的Kasumi-1細(xì)胞株中PI3K蛋白表達(dá)量顯著增加，而PI3K基因敲降的THP-1細(xì)胞株中PI3K蛋白表達(dá)量明顯降低。對(duì)構(gòu)建好的細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞增殖和凋亡檢測(cè)，結(jié)果表明，PI3K過(guò)表達(dá)能夠部分逆轉(zhuǎn)PARP-1抑制劑對(duì)Kasumi-1細(xì)胞增殖的抑制作用和對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。與PARP-1抑制劑處理組相比，PI3K過(guò)表達(dá)+PARP-1抑制劑處理組細(xì)胞的增殖率有所增加，凋亡率有所降低。相反，在PI3K基因敲降的THP-1細(xì)胞中，PARP-1抑制劑對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用和對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用更為顯著。這些結(jié)果充分表明，PI3K/Akt信號(hào)通路是PARP-1影響AML細(xì)胞增殖和凋亡的重要分子通路，PARP-1可能通過(guò)調(diào)控該信號(hào)通路，影響AML的發(fā)生發(fā)展。6.3關(guān)鍵分子的作用研究為進(jìn)一步明確關(guān)鍵分子在PARP-1影響急性髓系白血病過(guò)程中的具體作用，本研究對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子p110α和Akt進(jìn)行了深入研究。利用慢病毒載體構(gòu)建PI3K過(guò)表達(dá)的Kasumi-1細(xì)胞株和PI3K基因敲降的THP-1細(xì)胞株，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)驗(yàn)證過(guò)表達(dá)和基因敲降效率。結(jié)果顯示，PI3K過(guò)表達(dá)的Kasumi-1細(xì)胞株中p110α蛋白表達(dá)量相較于對(duì)照組顯著增加，約為對(duì)照組的2.5倍；而PI3K基因敲降的THP-1細(xì)胞株中p110α蛋白表達(dá)量明顯降低，僅為對(duì)照組的30%。對(duì)構(gòu)建好的細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞增殖和凋亡檢測(cè)。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力結(jié)果表明，PI3K過(guò)表達(dá)能夠部分逆轉(zhuǎn)PARP-1抑制劑對(duì)Kasumi-1細(xì)胞增殖的抑制作用。與PARP-1抑制劑處理組相比，PI3K過(guò)表達(dá)+PARP-1抑制劑處理組細(xì)胞的增殖率有所增加，從PARP-1抑制劑處理組的30%增加到50%。EdU摻入實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果，在熒光顯微鏡下觀察到PI3K過(guò)表達(dá)+PARP-1抑制劑處理組EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于PARP-1抑制劑處理組。相反，在PI3K基因敲降的THP-1細(xì)胞中，PARP-1抑制劑對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用更為顯著。PI3K基因敲降+PARP-1抑制劑處理組細(xì)胞的增殖率相較于PARP-1抑制劑處理組進(jìn)一步降低，從35%降低到20%。在細(xì)胞凋亡檢測(cè)方面，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示，PI3K過(guò)表達(dá)能夠部分抑制PARP-1抑制劑對(duì)Kasumi-1細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。與PARP-1抑制劑處理組相比，PI3K過(guò)表達(dá)+PARP-1抑制劑處理組細(xì)胞的凋亡率有所降低，早期凋亡率從25%降低到15%，晚期凋亡率從15%降低到10%。而在PI3K基因敲降的THP-1細(xì)胞中，PARP-1抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用更為明顯。PI3K基因敲降+PARP-1抑制劑處理組細(xì)胞的早期凋亡率從22%增加到30%，晚期凋亡率從12%增加到18%。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活能夠調(diào)節(jié)下游與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。在PI3K過(guò)表達(dá)的Kasumi-1細(xì)胞中，與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白PCNA和CyclinD1的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)水平升高，Bax和CleavedCaspase-3的表達(dá)水平降低。相反，在PI3K基因敲降的THP-1細(xì)胞中，PCNA和CyclinD1的表達(dá)水平顯著下調(diào)，Bcl-2的表達(dá)水平降低，Bax和CleavedCaspase-3的表達(dá)水平升高。綜上所述，PI3K/Akt信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子p110α和Akt在PARP-1影響急性髓系白血病細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。PARP-1可能通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的活性，下調(diào)關(guān)鍵分子的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，