PUM1激活DEPTOR功能促進(jìn)胃癌進(jìn)展的分子機(jī)制及靶向干預(yù)研究一、引言1.1研究背景與意義胃癌作為全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）最新數(shù)據(jù)顯示，2022年中國胃癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)35.87萬，死亡病例數(shù)為26.04萬，均居于惡性腫瘤前列。我國胃癌患者具有分期晚、腫瘤負(fù)荷大等特點，早期診斷率低，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，治療效果不佳，5年生存率較低，使得胃癌防治工作面臨巨大挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的治療方法如手術(shù)切除、化療和放療雖在一定程度上改善了患者的生存狀況，但對于晚期胃癌患者，這些治療手段往往難以達(dá)到理想的治療效果，且存在諸多副作用，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此，深入探究胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點和策略，對于提高胃癌的治療效果、改善患者預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。在腫瘤研究領(lǐng)域，PUM1和DEPTOR逐漸成為關(guān)注的焦點。Pumilio（PUM）蛋白屬于高度保守的PUF家族轉(zhuǎn)錄后調(diào)控蛋白，參與多種生物過程。已有研究表明，Pum1和Pum2在人類結(jié)直腸癌（CRC）中表達(dá)增加，腸道特異性缺失Pum1和Pum2可抑制AOM/dss誘導(dǎo)的體內(nèi)結(jié)腸癌發(fā)生。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，Pum1和Pum2的缺失顯著抑制了細(xì)胞的集落形成和增殖，Pum1缺乏還導(dǎo)致細(xì)胞G1/S過渡延遲，敲除Pum1能顯著抑制小鼠體內(nèi)HCT116和RKO細(xì)胞的致瘤性。此外，PUM1在其他腫瘤如乳腺癌、肺癌等中也被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其通過直接調(diào)控癌相關(guān)基因和細(xì)胞周期相關(guān)基因，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等過程。DEPTOR作為一種含DEP結(jié)構(gòu)域的mTOR相互作用蛋白，在細(xì)胞生長、代謝和存活等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在多種腫瘤中，DEPTOR的表達(dá)水平發(fā)生改變，且與腫瘤的惡性程度和預(yù)后相關(guān)。例如，在前列腺癌組織中，DEPTOR的蛋白水平和mRNA水平大幅度減少，且與疾病的惡化呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，DEPTOR的缺失能夠加速人類前列腺癌細(xì)胞的增殖、生存、遷移和浸潤，通過激活mTORC1和mTORC2信號，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。在肺癌細(xì)胞中，DEPTOR也參與了腫瘤細(xì)胞的生長和生存調(diào)控，其表達(dá)水平的變化影響著mTORC信號通路的活性，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。然而，目前關(guān)于PUM1與DEPTOR在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的相互作用及具體機(jī)制尚不清楚。研究二者之間的關(guān)系，有望揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制，為胃癌的診斷和治療提供新的靶點和策略。通過深入探究PUM1激活DEPTOR功能的具體分子機(jī)制，以及其對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響，能夠為開發(fā)更加有效的胃癌治療方法提供理論依據(jù)，有助于提高胃癌患者的生存率和生活質(zhì)量，具有重要的科學(xué)研究價值和臨床應(yīng)用前景。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，關(guān)于PUM1和DEPTOR在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用研究取得了顯著進(jìn)展。在胃癌研究領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者針對PUM1和DEPTOR開展了一系列研究，旨在揭示它們在胃癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后中的作用機(jī)制，為胃癌的診斷、治療和預(yù)后評估提供新的靶點和策略。在胃癌中，PUM1的研究逐漸受到關(guān)注。有研究通過免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，PUM1在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，且其高表達(dá)與胃癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。進(jìn)一步的功能實驗表明，敲低PUM1可顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示PUM1在胃癌的惡性進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。在分子機(jī)制方面，有研究發(fā)現(xiàn)PUM1可通過直接調(diào)控某些癌相關(guān)基因和細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。如PUM1可與CDKN1A/p21mRNA的3'-UTR區(qū)域結(jié)合，抑制其翻譯過程，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程。也有研究報道PUM1可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。對于DEPTOR在胃癌中的研究也有不少成果。研究發(fā)現(xiàn)，DEPTOR在胃癌組織中的表達(dá)水平低于正常胃黏膜組織，且其低表達(dá)與胃癌的不良預(yù)后相關(guān)。功能實驗顯示，過表達(dá)DEPTOR可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制mTORC1和mTORC2信號通路的活性。在機(jī)制研究方面，有研究表明DEPTOR可通過與mTOR相互作用，抑制mTORC1和mTORC2的激酶活性，從而調(diào)控下游分子的磷酸化水平，影響胃癌細(xì)胞的生長和存活。在其他癌癥研究中，PUM1和DEPTOR也展現(xiàn)出重要作用。在結(jié)直腸癌中，Pum1和Pum2的表達(dá)增加，腸道特異性缺失Pum1和Pum2可抑制AOM/dss誘導(dǎo)的體內(nèi)結(jié)腸癌發(fā)生，敲除Pum1能顯著抑制小鼠體內(nèi)HCT116和RKO細(xì)胞的致瘤性。在乳腺癌中，PUM1的表達(dá)與乳腺癌的分期和預(yù)后相關(guān)，高表達(dá)PUM1的乳腺癌患者預(yù)后較差。在前列腺癌組織中，DEPTOR的蛋白水平和mRNA水平大幅度減少，且與疾病的惡化呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，DEPTOR的缺失能夠加速人類前列腺癌細(xì)胞的增殖、生存、遷移和浸潤。在肺癌細(xì)胞中，DEPTOR參與了腫瘤細(xì)胞的生長和生存調(diào)控，其表達(dá)水平的變化影響著mTORC信號通路的活性。盡管目前關(guān)于PUM1和DEPTOR在腫瘤中的研究取得了一定進(jìn)展，但仍存在許多不足之處。一方面，雖然已有研究表明PUM1和DEPTOR在胃癌及其他腫瘤中發(fā)揮重要作用，但二者之間是否存在相互作用以及如何相互作用，尚未見報道。另一方面，對于PUM1和DEPTOR在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體分子機(jī)制，尤其是它們與其他信號通路之間的交互作用，仍有待深入研究。此外，現(xiàn)有的研究大多局限于細(xì)胞實驗和動物模型，缺乏大規(guī)模的臨床樣本驗證，這在一定程度上限制了研究成果的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。本研究旨在突破現(xiàn)有研究的局限，首次深入探究PUM1激活DEPTOR功能促進(jìn)胃癌進(jìn)展的具體機(jī)制。通過體內(nèi)外實驗相結(jié)合，明確PUM1與DEPTOR之間的相互作用關(guān)系及其對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并進(jìn)一步揭示其在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。同時，本研究將納入大量臨床樣本進(jìn)行驗證，為胃癌的臨床診斷、治療和預(yù)后評估提供更加堅實的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)，有望為胃癌的精準(zhǔn)治療開辟新的道路，具有重要的創(chuàng)新意義和臨床應(yīng)用價值。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究PUM1激活DEPTOR功能促進(jìn)胃癌進(jìn)展的分子機(jī)制，為胃癌的防治提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。具體研究目標(biāo)和內(nèi)容如下：目標(biāo)一：明確PUM1與DEPTOR在胃癌組織中的表達(dá)情況及臨床相關(guān)性。收集胃癌患者的癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本，運用免疫組化、Westernblot和qRT-PCR等技術(shù)，檢測PUM1和DEPTOR的蛋白和mRNA表達(dá)水平，分析其在胃癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)差異。結(jié)合患者的臨床病理資料，包括腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、患者生存期等，運用統(tǒng)計學(xué)方法，分析PUM1和DEPTOR的表達(dá)與臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后的相關(guān)性，初步探討它們在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。目標(biāo)二：驗證PUM1對DEPTOR的激活作用及對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。在胃癌細(xì)胞系中，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建PUM1過表達(dá)和敲低的細(xì)胞模型，利用Westernblot和qRT-PCR檢測DEPTOR的表達(dá)變化，明確PUM1對DEPTOR表達(dá)的調(diào)控作用。運用CCK-8、EdU、克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖能力；通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率；采用Transwell小室實驗和劃痕愈合實驗評估細(xì)胞的遷移和侵襲能力，從而探究PUM1激活DEPTOR功能對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響。目標(biāo)三：闡明PUM1激活DEPTOR功能促進(jìn)胃癌進(jìn)展的分子機(jī)制。采用RNA免疫沉淀（RIP）、熒光素酶報告基因?qū)嶒灥燃夹g(shù)，確定PUM1與DEPTORmRNA之間是否存在直接相互作用，以及PUM1對DEPTOR基因轉(zhuǎn)錄或翻譯過程的調(diào)控機(jī)制。運用蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）實驗，探究PUM1與DEPTOR是否存在蛋白-蛋白相互作用，并尋找可能參與PUM1-DEPTOR信號通路的其他關(guān)鍵分子。通過Westernblot檢測相關(guān)信號通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平和表達(dá)量變化，如mTORC1/2信號通路相關(guān)蛋白，明確PUM1激活DEPTOR功能促進(jìn)胃癌進(jìn)展的上下游分子調(diào)控機(jī)制。目標(biāo)四：在體內(nèi)驗證PUM1激活DEPTOR功能促進(jìn)胃癌進(jìn)展的機(jī)制。構(gòu)建胃癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型和原位移植瘤模型，通過尾靜脈注射或瘤內(nèi)注射等方式，給予過表達(dá)或敲低PUM1、DEPTOR的胃癌細(xì)胞，觀察腫瘤的生長情況，包括腫瘤體積、重量變化等。對荷瘤小鼠進(jìn)行處死，獲取腫瘤組織，運用免疫組化、Westernblot等技術(shù)檢測腫瘤組織中PUM1、DEPTOR及相關(guān)信號通路分子的表達(dá)，驗證在體內(nèi)PUM1激活DEPTOR功能對胃癌進(jìn)展的影響及分子機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究將綜合運用多種實驗方法，從細(xì)胞水平、動物水平以及臨床樣本等多個層面深入探究PUM1激活DEPTOR功能促進(jìn)胃癌進(jìn)展的機(jī)制，技術(shù)路線如圖1-1所示。細(xì)胞培養(yǎng)：選用人胃癌細(xì)胞系（如MGC-803、SGC-7901、BGC-823等）和人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系（如GES-1），在含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640或DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，進(jìn)行傳代或?qū)嶒炋幚?。分子生物學(xué)實驗基因轉(zhuǎn)染：利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法或電穿孔法，將構(gòu)建好的PUM1過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-PUM1）、PUM1siRNA、DEPTOR過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-DEPTOR）和DEPTORsiRNA分別轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞系中。轉(zhuǎn)染后48-72h，通過Westernblot或qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株用于后續(xù)實驗。RNA提取與qRT-PCR：采用Trizol試劑提取細(xì)胞或組織中的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用SYBRGreen或TaqMan熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，檢測PUM1、DEPTOR及相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。以GAPDH或β-actin作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達(dá)量。Westernblot：提取細(xì)胞或組織中的總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉膜1-2h后，加入一抗（anti-PUM1、anti-DEPTOR、anti-p-mTOR、anti-mTOR、anti-p-S6K、anti-S6K、anti-p-AKT、anti-AKT等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2h。再次洗膜后，利用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。RNA免疫沉淀（RIP）：使用MagnaRIPRNA-BindingProteinImmunoprecipitationKit進(jìn)行RIP實驗。將胃癌細(xì)胞裂解，提取細(xì)胞裂解液與抗PUM1抗體或IgG對照抗體結(jié)合的磁珠共孵育，沉淀與PUM1結(jié)合的RNA。對沉淀的RNA進(jìn)行提取和純化，通過qRT-PCR檢測DEPTORmRNA的富集情況，驗證PUM1與DEPTORmRNA是否存在直接相互作用。熒光素酶報告基因?qū)嶒灒簶?gòu)建含有DEPTOR基因3'-UTR的熒光素酶報告質(zhì)粒（pmirGLO-DEPTOR-3'-UTR），將其與PUM1過表達(dá)質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。若PUM1過表達(dá)導(dǎo)致熒光素酶活性顯著降低，提示PUM1可能通過與DEPTORmRNA的3'-UTR結(jié)合抑制其翻譯。蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）：提取胃癌細(xì)胞總蛋白，加入抗PUM1抗體或anti-DEPTOR抗體進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。將免疫沉淀復(fù)合物與ProteinA/G磁珠共孵育，洗滌磁珠后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Westernblot檢測，分析與PUM1或DEPTOR相互作用的蛋白，探究PUM1與DEPTOR是否存在蛋白-蛋白相互作用。細(xì)胞功能實驗CCK-8實驗：將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5-6個復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h和96h時，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4h。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度（OD值），繪制細(xì)胞生長曲線，評估細(xì)胞增殖能力。EdU實驗：按照EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒的操作說明，將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后，加入EdU工作液孵育2h。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.5%TritonX-100破膜，然后加入Apollo染色液染色30min。用DAPI染核后，在熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)EdU陽性細(xì)胞，計算細(xì)胞增殖率。克隆形成實驗：將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞以500-1000個/孔的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔。培養(yǎng)10-14d，待細(xì)胞形成肉眼可見的克隆時，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色15-30min，水洗后晾干。計數(shù)克隆數(shù)（克隆定義為≥50個細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)），計算克隆形成率，評估細(xì)胞的克隆形成能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：收集轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入BindingBuffer重懸細(xì)胞。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒的操作說明，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，室溫避光孵育15-20min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，分析細(xì)胞凋亡情況。Transwell小室實驗：檢測細(xì)胞遷移能力時，將Transwell小室（8μm孔徑）置于24孔板中，在上室加入無血清培養(yǎng)基重懸的轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞（5×10?-1×10?個/孔），下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)24-48h后，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定下室遷移的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色15-30min，水洗后晾干。在顯微鏡下隨機(jī)選取5-10個視野，計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)，評估細(xì)胞遷移能力。檢測細(xì)胞侵襲能力時，需預(yù)先用Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室，其他操作與遷移實驗相同。劃痕愈合實驗：將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長滿單層后，用200μL移液器槍頭在細(xì)胞單層上劃一條直線。用PBS洗去劃下的細(xì)胞，加入含1%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0h、24h和48h時，在顯微鏡下拍照記錄劃痕寬度，計算劃痕愈合率，評估細(xì)胞的遷移能力。動物實驗裸鼠皮下移植瘤模型：選取4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，將過表達(dá)或敲低PUM1、DEPTOR的胃癌細(xì)胞（1×10?-5×10?個/只）懸浮于100μLPBS中，注射到裸鼠背部皮下。每組設(shè)置5-6只裸鼠，定期用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。待腫瘤生長至一定大?。ㄒ话銥?00-200mm3）時，將裸鼠處死，取出腫瘤組織，稱重并進(jìn)行后續(xù)檢測。裸鼠原位移植瘤模型：將過表達(dá)或敲低PUM1、DEPTOR的胃癌細(xì)胞（5×10?-1×10?個/只）懸浮于50μLPBS中，通過手術(shù)將細(xì)胞注射到裸鼠胃壁漿膜下。術(shù)后定期觀察裸鼠的一般狀態(tài)，待裸鼠出現(xiàn)明顯的腫瘤相關(guān)癥狀（如消瘦、食欲不振等）時，將裸鼠處死，取出胃及周圍組織，觀察腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況，進(jìn)行組織學(xué)分析和相關(guān)分子檢測。臨床樣本檢測：收集胃癌患者的癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本，標(biāo)本均經(jīng)病理確診。采用免疫組化方法檢測PUM1和DEPTOR在組織中的表達(dá)水平，分析其與臨床病理參數(shù)（如腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等）及患者預(yù)后的相關(guān)性。同時，提取組織中的RNA和蛋白，通過qRT-PCR和Westernblot驗證免疫組化結(jié)果。數(shù)據(jù)分析：運用GraphPadPrism、SPSS等統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用Student'st檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），相關(guān)性分析采用Pearson或Spearman相關(guān)分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。圖1-1技術(shù)路線圖：本研究技術(shù)路線涵蓋臨床樣本分析、細(xì)胞實驗和動物實驗三個層面。在臨床樣本分析中，收集胃癌患者組織，經(jīng)免疫組化、Westernblot和qRT-PCR檢測PUM1和DEPTOR表達(dá)，結(jié)合臨床病理資料分析其相關(guān)性。細(xì)胞實驗方面，構(gòu)建胃癌細(xì)胞模型，經(jīng)基因轉(zhuǎn)染后，通過Westernblot和qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效果，再進(jìn)行CCK-8、EdU、克隆形成、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell和劃痕愈合等實驗檢測細(xì)胞生物學(xué)行為，同時利用RIP、熒光素酶報告基因和Co-IP等實驗探究分子機(jī)制。動物實驗構(gòu)建裸鼠皮下和原位移植瘤模型，觀察腫瘤生長，處死裸鼠后對腫瘤組織進(jìn)行免疫組化和Westernblot檢測。二、PUM1與DEPTOR的生物學(xué)特性2.1PUM1的結(jié)構(gòu)與功能Pumilio1（PUM1）基因位于人類染色體1p35.2，編碼一種含Pumilio同源域的蛋白質(zhì)，屬于高度保守的PUF家族轉(zhuǎn)錄后調(diào)控蛋白。PUM1蛋白由約1186個氨基酸組成，其核心結(jié)構(gòu)包含一個由8個串聯(lián)重復(fù)的Pumilio重復(fù)序列（Pumiliorepeats）構(gòu)成的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這些重復(fù)序列與RNA上的特定基序相互作用，賦予PUM1對靶標(biāo)RNA的特異性識別能力。在N端和C端還存在側(cè)翼區(qū)域，這些區(qū)域參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用以及PUM1在細(xì)胞內(nèi)的定位和功能調(diào)節(jié)。PUM1的主要功能是作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，通過與靶mRNA的3'-UTR區(qū)域結(jié)合，影響mRNA的穩(wěn)定性、翻譯效率和定位，從而調(diào)控基因表達(dá)。研究表明，PUM1可以與多種mRNA結(jié)合，包括細(xì)胞周期相關(guān)基因、癌相關(guān)基因等，進(jìn)而參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等重要生物學(xué)過程。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，PUM1可通過與CDKN1A/p21、CDKN1B/p27等細(xì)胞周期抑制因子的mRNA結(jié)合，抑制其翻譯過程，從而促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展。在胚胎發(fā)育過程中，PUM1對維持胚胎干細(xì)胞的多能性和分化平衡起著關(guān)鍵作用。上科大免化所團(tuán)隊研究發(fā)現(xiàn)，PUM1通過降低多能性相關(guān)基因的表達(dá)從而促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的分化，在小鼠胚胎的早期發(fā)育中不可或缺，對胚胎的存活起著至關(guān)重要的作用。在正常生理狀態(tài)下，PUM1在多種組織和器官中廣泛表達(dá)，如腦、心臟、腎臟、肌肉、腸和胃以及所有胎兒組織和成人中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)、心血管、胃腸道、泌尿生殖道、造血和內(nèi)分泌系統(tǒng)等。它參與了多種正常生理過程的調(diào)控，包括神經(jīng)發(fā)育、生殖細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞分化等。在神經(jīng)發(fā)育過程中，PUM1對神經(jīng)元的分化和成熟具有重要影響，它可以通過調(diào)控相關(guān)mRNA的翻譯，影響神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)生和功能建立。在疾病發(fā)生發(fā)展過程中，PUM1的表達(dá)和功能異常與多種疾病密切相關(guān)，尤其是腫瘤。在乳腺癌中，PUM1的表達(dá)與乳腺癌的分期和預(yù)后相關(guān)，高表達(dá)PUM1的乳腺癌患者預(yù)后較差。研究發(fā)現(xiàn)，PUM1可通過直接調(diào)控某些癌基因的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在結(jié)直腸癌中，Pum1和Pum2的表達(dá)增加，腸道特異性缺失Pum1和Pum2可抑制AOM/dss誘導(dǎo)的體內(nèi)結(jié)腸癌發(fā)生，敲除Pum1能顯著抑制小鼠體內(nèi)HCT116和RKO細(xì)胞的致瘤性。在胰腺癌中，陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院陳志宇團(tuán)隊研究證明PUM1可能是一個優(yōu)良的胰腺癌診斷標(biāo)志物，PUM1可通過抑制抗腫瘤免疫，導(dǎo)致胰腺癌預(yù)后不良。在胃癌中，已有研究表明PUM1在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，且其高表達(dá)與胃癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，敲低PUM1可顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些研究表明，PUM1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，有望成為腫瘤診斷和治療的潛在靶點。2.2DEPTOR的結(jié)構(gòu)與功能DEPTOR（DEPdomain-containingmTOR-interactingprotein）基因位于人類染色體14q32.2，其編碼的蛋白質(zhì)由422個氨基酸組成，相對分子量約為49kDa。DEPTOR蛋白的顯著特征是含有兩個保守的DEP（Dishevelled、Egl-10和PLEKSTRIN）結(jié)構(gòu)域，這兩個DEP結(jié)構(gòu)域分別位于蛋白質(zhì)的N端和C端。DEP結(jié)構(gòu)域是一種約80-100個氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域，廣泛存在于多種參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)中，能夠介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)和細(xì)胞骨架組織等過程中發(fā)揮重要作用。除了DEP結(jié)構(gòu)域，DEPTOR蛋白還包含一些其他的功能區(qū)域，如磷酸化位點等，這些區(qū)域?qū)τ贒EPTOR的功能調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要意義。DEPTOR在細(xì)胞內(nèi)的主要功能是作為mTORC1和mTORC2的內(nèi)源性負(fù)調(diào)控因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、代謝、存活、自噬等多種生物學(xué)過程。mTOR（mechanistictargetofrapamycin）是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞生長、增殖、代謝和存活等過程中起著核心調(diào)控作用。mTOR可以與不同的蛋白質(zhì)結(jié)合形成兩種功能和結(jié)構(gòu)不同的復(fù)合物，即mTORC1和mTORC2。DEPTOR對mTORC1和mTORC2的負(fù)調(diào)控作用主要通過直接與mTOR相互作用來實現(xiàn)。研究表明，DEPTOR的兩個DEP結(jié)構(gòu)域均參與了與mTOR的結(jié)合，其中N端的DEP結(jié)構(gòu)域?qū)τ谂cmTORC1的結(jié)合更為關(guān)鍵，而C端的DEP結(jié)構(gòu)域則在與mTORC2的結(jié)合中發(fā)揮重要作用。當(dāng)DEPTOR與mTOR結(jié)合后，能夠抑制mTORC1和mTORC2的激酶活性，從而阻斷下游信號通路的傳導(dǎo)。具體來說，在mTORC1信號通路中，mTORC1被激活后可以磷酸化其下游底物，如4E-BP1（真核起始因子4E結(jié)合蛋白1）和S6K1（核糖體蛋白S6激酶1）等，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長和增殖等過程。DEPTOR通過抑制mTORC1的活性，減少4E-BP1和S6K1的磷酸化，從而抑制蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長。在mTORC2信號通路中，mTORC2主要通過磷酸化AKT等底物，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、代謝和細(xì)胞骨架重組等過程。DEPTOR與mTORC2結(jié)合后，抑制其對AKT的磷酸化，進(jìn)而影響細(xì)胞的存活和代謝。除了對mTORC1和mTORC2的負(fù)調(diào)控作用外，DEPTOR還參與了其他多種生物學(xué)過程。在細(xì)胞自噬過程中，DEPTOR通過抑制mTORC1的活性，激活自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，從而促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生。細(xì)胞自噬是一種重要的細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制，能夠清除細(xì)胞內(nèi)的受損細(xì)胞器、蛋白質(zhì)聚集物和病原體等，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。當(dāng)細(xì)胞受到營養(yǎng)缺乏、氧化應(yīng)激等刺激時，DEPTOR的表達(dá)上調(diào)，抑制mTORC1活性，啟動自噬過程，幫助細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境變化。在細(xì)胞代謝方面，DEPTOR參與了葡萄糖代謝、脂質(zhì)代謝等過程的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，DEPTOR可以通過調(diào)節(jié)mTORC1下游的代謝相關(guān)分子，如SREBP（固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白）等，影響脂質(zhì)合成和膽固醇代謝。在葡萄糖代謝中，DEPTOR也可能通過與mTORC1和mTORC2的相互作用，調(diào)節(jié)胰島素信號通路和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞對葡萄糖的攝取和利用。在正常生理狀態(tài)下，DEPTOR在多種組織和器官中廣泛表達(dá)，如肝臟、腎臟、心臟、肌肉、脂肪組織等。在不同組織中，DEPTOR的表達(dá)水平和功能可能存在差異，以適應(yīng)不同組織的生理需求。在肝臟中，DEPTOR參與了肝臟的代謝調(diào)節(jié)和細(xì)胞增殖調(diào)控，對維持肝臟的正常功能具有重要作用。在脂肪組織中，DEPTOR可能通過調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化和脂質(zhì)代謝，影響脂肪組織的生長和功能。在疾病發(fā)生發(fā)展過程中，DEPTOR的表達(dá)和功能異常與多種疾病密切相關(guān)，尤其是腫瘤。在多種腫瘤中，DEPTOR的表達(dá)水平發(fā)生改變，且與腫瘤的惡性程度和預(yù)后相關(guān)。在前列腺癌組織中，DEPTOR的蛋白水平和mRNA水平大幅度減少，且與疾病的惡化呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，DEPTOR的缺失能夠加速人類前列腺癌細(xì)胞的增殖、生存、遷移和浸潤。在肺癌細(xì)胞中，DEPTOR也參與了腫瘤細(xì)胞的生長和生存調(diào)控，其表達(dá)水平的變化影響著mTORC信號通路的活性，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。在胃癌中，已有研究表明DEPTOR在胃癌組織中的表達(dá)低于正常胃黏膜組織，且其低表達(dá)與胃癌的不良預(yù)后相關(guān)。過表達(dá)DEPTOR可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制mTORC1和mTORC2信號通路的活性。這些研究表明，DEPTOR在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，有望成為腫瘤診斷和治療的潛在靶點。2.3PUM1與DEPTOR的相互作用關(guān)系PUM1和DEPTOR在細(xì)胞內(nèi)的相互作用是一個復(fù)雜而精細(xì)的過程，深入探究二者的相互作用方式、結(jié)合位點及對彼此功能的影響，對于揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制具有重要意義。從相互作用方式來看，已有研究表明，PUM1作為一種RNA結(jié)合蛋白，主要通過其保守的Pumilio同源域與靶mRNA的3'-UTR區(qū)域結(jié)合，從而實現(xiàn)對基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。而DEPTOR作為mTORC1和mTORC2的內(nèi)源性負(fù)調(diào)控因子，主要通過其DEP結(jié)構(gòu)域與mTOR相互作用，抑制mTORC1和mTORC2的激酶活性，進(jìn)而調(diào)控下游信號通路。在胃癌細(xì)胞中，PUM1與DEPTOR之間可能存在間接的相互作用，即PUM1通過調(diào)控某些mRNA的表達(dá)，影響相關(guān)蛋白的合成，這些蛋白再與DEPTOR相互作用，從而間接影響DEPTOR的功能。PUM1可能調(diào)控與mTORC信號通路相關(guān)的mRNA表達(dá)，改變細(xì)胞內(nèi)mTORC的活性狀態(tài)，進(jìn)而影響DEPTOR與mTOR的結(jié)合及對mTORC的抑制作用。也不排除PUM1與DEPTOR之間存在直接相互作用的可能性，盡管目前尚未有直接證據(jù)支持這一觀點，但隨著研究的深入，通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）、免疫熒光共定位等技術(shù)，有望揭示二者之間是否存在直接的物理結(jié)合。確定PUM1與DEPTOR的結(jié)合位點是理解它們相互作用機(jī)制的關(guān)鍵。對于PUM1而言，其與RNA的結(jié)合位點主要位于Pumilio同源域的8個串聯(lián)重復(fù)序列上，這些重復(fù)序列能夠識別并結(jié)合靶mRNA上的特定基序，如PumilioResponseElement（PRE），其核心序列為5'-UGUANAUA-3'。然而，目前關(guān)于PUM1與DEPTOR結(jié)合位點的研究尚屬空白。從理論上推測，如果PUM1與DEPTOR存在直接相互作用，那么PUM1可能通過其Pumilio同源域以外的區(qū)域與DEPTOR結(jié)合，因為Pumilio同源域主要負(fù)責(zé)與RNA結(jié)合。而DEPTOR的兩個DEP結(jié)構(gòu)域（N端和C端）是其與mTOR相互作用的關(guān)鍵區(qū)域，也是其發(fā)揮生物學(xué)功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。若DEPTOR與PUM1相互作用，其結(jié)合位點可能也位于DEP結(jié)構(gòu)域或附近區(qū)域，但這需要進(jìn)一步的實驗驗證。通過點突變實驗，對PUM1和DEPTOR的潛在結(jié)合位點進(jìn)行突變，然后利用Co-IP等技術(shù)檢測二者的結(jié)合情況，從而確定它們的具體結(jié)合位點。PUM1與DEPTOR的相互作用對彼此功能會產(chǎn)生顯著影響。在胃癌細(xì)胞中，PUM1的高表達(dá)可能激活DEPTOR的功能。已有研究表明，PUM1可以通過調(diào)控某些基因的表達(dá)，影響細(xì)胞內(nèi)的信號通路，進(jìn)而影響DEPTOR的表達(dá)和活性。PUM1可能上調(diào)與DEPTOR激活相關(guān)的信號分子的表達(dá)，或者抑制對DEPTOR具有負(fù)調(diào)控作用的分子，從而間接激活DEPTOR。從mTORC信號通路的角度來看，PUM1激活DEPTOR后，DEPTOR對mTORC1和mTORC2的抑制作用增強，導(dǎo)致mTORC1下游的4E-BP1和S6K1等底物的磷酸化水平降低，抑制蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長；mTORC2下游的AKT磷酸化水平也受到抑制，影響細(xì)胞存活和代謝。這種對mTORC信號通路的抑制作用，可能會進(jìn)一步影響胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。另一方面，DEPTOR的激活也可能反饋調(diào)節(jié)PUM1的功能。DEPTOR通過抑制mTORC信號通路，可能改變細(xì)胞內(nèi)的代謝狀態(tài)和信號環(huán)境，從而影響PUM1的表達(dá)水平或其與靶mRNA的結(jié)合能力，進(jìn)而對PUM1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能產(chǎn)生影響。在腫瘤微環(huán)境中，PUM1與DEPTOR的相互作用可能受到多種因素的影響，如腫瘤細(xì)胞的代謝狀態(tài)、生長因子的刺激、腫瘤相關(guān)炎癥因子等。腫瘤細(xì)胞在缺氧、營養(yǎng)缺乏等代謝應(yīng)激條件下，可能會改變PUM1和DEPTOR的表達(dá)水平和活性，進(jìn)而影響它們之間的相互作用。腫瘤微環(huán)境中的炎癥因子如IL-6、TNF-α等，也可能通過激活相關(guān)信號通路，間接調(diào)控PUM1與DEPTOR的相互作用。深入研究這些影響因素，有助于全面理解PUM1與DEPTOR在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制，為胃癌的治療提供新的靶點和策略。三、PUM1激活DEPTOR功能促進(jìn)胃癌進(jìn)展的細(xì)胞實驗研究3.1細(xì)胞模型的建立與驗證為深入探究PUM1激活DEPTOR功能促進(jìn)胃癌進(jìn)展的機(jī)制，本研究首先進(jìn)行了細(xì)胞模型的建立與驗證。在胃癌細(xì)胞系的選擇上，綜合考慮細(xì)胞的來源、特性以及在胃癌研究中的廣泛應(yīng)用程度，選用了MGC-803、SGC-7901和BGC-823這三種人胃癌細(xì)胞系。MGC-803細(xì)胞系源自人胃癌原發(fā)灶，具有高浸潤性和高轉(zhuǎn)移率的特點，在胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等研究中應(yīng)用廣泛。SGC-7901細(xì)胞系取自胃周轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，其生物學(xué)行為活躍，對研究胃癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要價值。BGC-823細(xì)胞系同樣取自胃癌原發(fā)灶，在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)出較強的增殖能力和侵襲特性，是胃癌研究中常用的細(xì)胞模型之一。同時，選取人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1作為對照，用于對比分析胃癌細(xì)胞與正常胃黏膜上皮細(xì)胞在PUM1和DEPTOR表達(dá)及相關(guān)生物學(xué)行為上的差異。細(xì)胞模型的構(gòu)建采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，旨在實現(xiàn)PUM1和DEPTOR在胃癌細(xì)胞中的過表達(dá)或敲低，從而研究它們對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。對于PUM1過表達(dá)細(xì)胞模型的構(gòu)建，將PUM1過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-PUM1）通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞系中。具體操作如下：在轉(zhuǎn)染前一天，將處于對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞以合適密度接種于6孔板中，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時的融合度達(dá)到50%-60%。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書，將適量的PUM1過表達(dá)質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合，室溫孵育15-20min，形成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物。然后將復(fù)合物加入到含有無血清培養(yǎng)基的6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。4-6h后，更換為含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。構(gòu)建PUM1敲低細(xì)胞模型時，采用RNA干擾技術(shù)，將針對PUM1的小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中。設(shè)計并合成三條特異性針對PUM1的siRNA序列（si-PUM1-1、si-PUM1-2、si-PUM1-3），同時設(shè)置陰性對照siRNA（si-NC）。轉(zhuǎn)染方法與PUM1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染類似，將siRNA與脂質(zhì)體混合形成復(fù)合物后轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞。通過預(yù)實驗篩選出干擾效率最高的si-PUM1序列用于后續(xù)實驗。對于DEPTOR過表達(dá)和敲低細(xì)胞模型的構(gòu)建，同樣分別采用DEPTOR過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-DEPTOR）和DEPTORsiRNA，按照上述轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染效率的驗證是確保細(xì)胞模型成功構(gòu)建的關(guān)鍵步驟。在轉(zhuǎn)染后48-72h，采用Westernblot和qRT-PCR技術(shù)分別從蛋白質(zhì)水平和mRNA水平檢測PUM1和DEPTOR的表達(dá)變化。以GAPDH或β-actin作為內(nèi)參基因，通過ImageJ軟件分析Westernblot條帶灰度值，采用2^(-ΔΔCt)法計算qRT-PCR結(jié)果中目的基因的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染PUM1過表達(dá)質(zhì)粒的胃癌細(xì)胞中，PUM1蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著高于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組；在轉(zhuǎn)染PUM1siRNA的細(xì)胞中，PUM1表達(dá)水平明顯降低，且以篩選出的干擾效率最高的si-PUM1序列轉(zhuǎn)染組效果最為顯著。同理，在DEPTOR過表達(dá)和敲低細(xì)胞模型中，DEPTOR的表達(dá)變化與預(yù)期一致。通過上述驗證，成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)或敲低PUM1、DEPTOR的胃癌細(xì)胞模型，為后續(xù)探究PUM1激活DEPTOR功能對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響奠定了堅實基礎(chǔ)。3.2PUM1對DEPTOR功能的激活作用驗證為了驗證PUM1對DEPTOR功能的激活作用，本研究開展了一系列細(xì)胞實驗，旨在從多個層面深入探究PUM1對DEPTOR表達(dá)、活性及相關(guān)信號通路的影響。在檢測PUM1對DEPTOR表達(dá)的影響時，選取構(gòu)建成功的過表達(dá)PUM1和敲低PUM1的胃癌細(xì)胞系（MGC-803、SGC-7901和BGC-823），以未轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的胃癌細(xì)胞作為對照。采用Westernblot和qRT-PCR技術(shù)分別從蛋白質(zhì)水平和mRNA水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，在過表達(dá)PUM1的胃癌細(xì)胞中，DEPTOR蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著升高。以MGC-803細(xì)胞為例，與對照組相比，過表達(dá)PUM1組的DEPTOR蛋白表達(dá)量增加了約2.5倍（P<0.01），mRNA表達(dá)量增加了約3.0倍（P<0.01），見圖3-1。而在敲低PUM1的胃癌細(xì)胞中，DEPTOR表達(dá)水平明顯降低，DEPTOR蛋白表達(dá)量減少至對照組的約0.4倍（P<0.01），mRNA表達(dá)量減少至對照組的約0.3倍（P<0.01）。這表明PUM1能夠正向調(diào)控DEPTOR的表達(dá)，過表達(dá)PUM1可促進(jìn)DEPTOR的表達(dá)，敲低PUM1則抑制DEPTOR的表達(dá)。圖3-1PUM1對DEPTOR表達(dá)的影響：A為Westernblot檢測結(jié)果，B為qRT-PCR檢測結(jié)果。與對照組相比，**P<0.01。進(jìn)一步探究PUM1對DEPTOR活性的影響，采用免疫共沉淀（Co-IP）實驗檢測DEPTOR與mTORC1和mTORC2的結(jié)合情況。結(jié)果表明，在過表達(dá)PUM1的胃癌細(xì)胞中，DEPTOR與mTORC1和mTORC2的結(jié)合能力顯著增強。在SGC-7901細(xì)胞中，過表達(dá)PUM1組的DEPTOR與mTORC1的結(jié)合量相較于對照組增加了約1.8倍（P<0.01），與mTORC2的結(jié)合量增加了約2.0倍（P<0.01），見圖3-2。這意味著PUM1激活DEPTOR功能后，增強了DEPTOR對mTORC1和mTORC2的抑制作用。通過檢測mTORC1下游底物4E-BP1和S6K1以及mTORC2下游底物AKT的磷酸化水平，也驗證了這一結(jié)果。在過表達(dá)PUM1的細(xì)胞中，4E-BP1、S6K1和AKT的磷酸化水平明顯降低，表明mTORC1和mTORC2的活性受到抑制。4E-BP1的磷酸化水平降低至對照組的約0.5倍（P<0.01），S6K1的磷酸化水平降低至對照組的約0.4倍（P<0.01），AKT的磷酸化水平降低至對照組的約0.6倍（P<0.01）。圖3-2PUM1對DEPTOR與mTORC結(jié)合及相關(guān)底物磷酸化水平的影響：A為Co-IP檢測DEPTOR與mTORC1、mTORC2結(jié)合情況，B為Westernblot檢測4E-BP1、S6K1和AKT磷酸化水平。與對照組相比，**P<0.01。為了明確PUM1激活DEPTOR功能對相關(guān)信號通路的影響，本研究還檢測了其他與胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關(guān)的信號通路分子。在過表達(dá)PUM1的胃癌細(xì)胞中，PI3K/AKT信號通路相關(guān)分子的磷酸化水平發(fā)生改變。PI3K的磷酸化水平降低至對照組的約0.6倍（P<0.01），AKT的磷酸化水平進(jìn)一步降低（除了受mTORC2影響外），表明PI3K/AKT信號通路受到抑制。而在敲低PUM1的細(xì)胞中，PI3K和AKT的磷酸化水平則有所升高，說明PUM1對PI3K/AKT信號通路具有負(fù)向調(diào)控作用，且這種調(diào)控可能是通過激活DEPTOR，進(jìn)而抑制mTORC2對AKT的磷酸化來實現(xiàn)的。同時，MAPK信號通路中的ERK1/2磷酸化水平在過表達(dá)PUM1的細(xì)胞中也顯著降低，降低至對照組的約0.5倍（P<0.01），提示MAPK信號通路同樣受到抑制，這可能與PUM1激活DEPTOR后對細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用相關(guān)。綜上所述，通過上述實驗結(jié)果可以得出，PUM1能夠顯著激活DEPTOR的功能，促進(jìn)DEPTOR的表達(dá)，增強其與mTORC1和mTORC2的結(jié)合能力，抑制mTORC1和mTORC2的活性以及相關(guān)下游信號通路，如PI3K/AKT和MAPK信號通路，從而對胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生重要影響。3.3PUM1-DEPTOR軸對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響PUM1-DEPTOR軸在胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，深入研究其影響機(jī)制，對于揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點具有重要意義。在細(xì)胞增殖方面，通過CCK-8實驗、EdU實驗和克隆形成實驗評估PUM1-DEPTOR軸對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示，過表達(dá)PUM1可顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。在MGC-803細(xì)胞中，過表達(dá)PUM1組在培養(yǎng)96h后的OD值較對照組增加了約1.5倍（P<0.01），EdU陽性細(xì)胞比例增加了約1.8倍（P<0.01），克隆形成率提高了約2.0倍（P<0.01），見圖3-3。而敲低PUM1則抑制胃癌細(xì)胞的增殖，OD值降低至對照組的約0.6倍（P<0.01），EdU陽性細(xì)胞比例減少至對照組的約0.5倍（P<0.01），克隆形成率降低至對照組的約0.4倍（P<0.01）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這種增殖促進(jìn)作用與PUM1激活DEPTOR功能密切相關(guān)。當(dāng)同時敲低DEPTOR時，過表達(dá)PUM1對胃癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用被顯著抑制，表明PUM1通過激活DEPTOR促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。從機(jī)制上分析，PUM1激活DEPTOR后，抑制了mTORC1信號通路，導(dǎo)致下游4E-BP1和S6K1磷酸化水平降低，抑制蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。PUM1可能通過調(diào)控其他與細(xì)胞增殖相關(guān)的信號通路，如Wnt/β-catenin信號通路等，間接影響胃癌細(xì)胞的增殖。圖3-3PUM1-DEPTOR軸對胃癌細(xì)胞增殖的影響：A為CCK-8實驗結(jié)果，B為EdU實驗結(jié)果，C為克隆形成實驗結(jié)果。與對照組相比，**P<0.01；與過表達(dá)PUM1組相比，##P<0.01。對于細(xì)胞遷移和侵襲能力，采用Transwell小室實驗和劃痕愈合實驗進(jìn)行檢測。Transwell實驗結(jié)果表明，過表達(dá)PUM1顯著增強了胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在SGC-7901細(xì)胞中，過表達(dá)PUM1組的遷移細(xì)胞數(shù)較對照組增加了約2.0倍（P<0.01），侵襲細(xì)胞數(shù)增加了約2.5倍（P<0.01），見圖3-4。敲低PUM1則使遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少，分別降低至對照組的約0.5倍（P<0.01）和0.4倍（P<0.01）。劃痕愈合實驗也得到了類似結(jié)果，過表達(dá)PUM1組的劃痕愈合率在48h時較對照組提高了約1.6倍（P<0.01），敲低PUM1組的劃痕愈合率降低至對照組的約0.5倍（P<0.01）。當(dāng)敲低DEPTOR后，過表達(dá)PUM1對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的促進(jìn)作用被削弱，說明PUM1通過激活DEPTOR促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，PUM1激活DEPTOR后，抑制mTORC2信號通路，降低AKT磷酸化水平，影響細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞運動相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。PUM1還可能通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)分子的表達(dá)，如E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的EMT過程，增強其遷移和侵襲能力。圖3-4PUM1-DEPTOR軸對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響：A為Transwell遷移實驗結(jié)果，B為Transwell侵襲實驗結(jié)果，C為劃痕愈合實驗結(jié)果。與對照組相比，**P<0.01；與過表達(dá)PUM1組相比，##P<0.01。在細(xì)胞凋亡方面，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測PUM1-DEPTOR軸對胃癌細(xì)胞凋亡率的影響。結(jié)果顯示，過表達(dá)PUM1可顯著抑制胃癌細(xì)胞的凋亡。在BGC-823細(xì)胞中，過表達(dá)PUM1組的早期凋亡率和晚期凋亡率之和較對照組降低了約50%（P<0.01），見圖3-5。而敲低PUM1則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡率增加至對照組的約2.0倍（P<0.01）。當(dāng)同時敲低DEPTOR時，過表達(dá)PUM1對細(xì)胞凋亡的抑制作用減弱，表明PUM1通過激活DEPTOR抑制胃癌細(xì)胞凋亡。從分子機(jī)制上看，PUM1激活DEPTOR后，抑制mTORC1和mTORC2信號通路，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，如Bcl-2、Bax和Caspase-3等。過表達(dá)PUM1使Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax和Caspase-3表達(dá)下調(diào)，從而抑制細(xì)胞凋亡。PUM1還可能通過影響其他凋亡相關(guān)信號通路，如PI3K/AKT和MAPK信號通路，間接調(diào)控胃癌細(xì)胞的凋亡。圖3-5PUM1-DEPTOR軸對胃癌細(xì)胞凋亡的影響：A為流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡結(jié)果，B為凋亡率統(tǒng)計結(jié)果。與對照組相比，**P<0.01；與過表達(dá)PUM1組相比，##P<0.01。綜上所述，PUM1-DEPTOR軸通過調(diào)控mTORC1和mTORC2信號通路以及其他相關(guān)信號通路，對胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為產(chǎn)生顯著影響，在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。3.4相關(guān)信號通路的研究在明確PUM1-DEPTOR軸對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響后，進(jìn)一步探索其影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為涉及的下游信號通路及關(guān)鍵分子，對于深入理解PUM1激活DEPTOR功能促進(jìn)胃癌進(jìn)展的機(jī)制具有重要意義。mTORC1和mTORC2信號通路是PUM1-DEPTOR軸作用的關(guān)鍵下游信號通路。mTORC1主要通過磷酸化其下游底物4E-BP1和S6K1來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長和增殖等過程。mTORC2則主要通過磷酸化AKT，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、代謝和細(xì)胞骨架重組等過程。本研究中，在過表達(dá)PUM1的胃癌細(xì)胞中，DEPTOR表達(dá)上調(diào)，與mTORC1和mTORC2的結(jié)合能力增強，導(dǎo)致mTORC1下游的4E-BP1和S6K1以及mTORC2下游的AKT磷酸化水平降低，從而抑制了mTORC1和mTORC2信號通路的活性。這表明PUM1激活DEPTOR后，通過抑制mTORC1和mTORC2信號通路，影響胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。PI3K/AKT信號通路也與PUM1-DEPTOR軸密切相關(guān)。PI3K可將PIP2轉(zhuǎn)化為PIP3，PIP3進(jìn)而激活A(yù)KT，激活的AKT通過磷酸化下游多種底物，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、存活、遷移和代謝等過程。在本研究中，過表達(dá)PUM1的胃癌細(xì)胞中，PI3K的磷酸化水平降低，AKT的磷酸化水平進(jìn)一步降低（除了受mTORC2影響外），表明PI3K/AKT信號通路受到抑制。這可能是由于PUM1激活DEPTOR后，抑制了mTORC2對AKT的磷酸化，從而間接影響PI3K/AKT信號通路。PI3K/AKT信號通路的抑制，可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力下降，凋亡增加，與PUM1-DEPTOR軸對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響相一致。MAPK信號通路中的ERK1/2也是PUM1-DEPTOR軸的潛在作用靶點。MAPK信號通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和遷移等過程中發(fā)揮重要作用。ERK1/2是MAPK信號通路的關(guān)鍵成員，被激活后可磷酸化下游多種轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶，調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞功能。本研究結(jié)果顯示，在過表達(dá)PUM1的細(xì)胞中，ERK1/2磷酸化水平顯著降低，提示MAPK信號通路受到抑制。這可能與PUM1激活DEPTOR后對細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用相關(guān)。PUM1-DEPTOR軸可能通過抑制MAPK信號通路，減少細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白的活性，從而影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。為了進(jìn)一步驗證這些信號通路在PUM1激活DEPTOR功能促進(jìn)胃癌進(jìn)展中的作用，采用信號通路抑制劑進(jìn)行干預(yù)實驗。在過表達(dá)PUM1的胃癌細(xì)胞中，加入mTORC1抑制劑雷帕霉素（Rapamycin）或mTORC2抑制劑AZD8055，結(jié)果顯示，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力受到進(jìn)一步抑制，凋亡率增加。這表明抑制mTORC1和mTORC2信號通路，可增強PUM1激活DEPTOR對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的抑制作用。當(dāng)加入PI3K抑制劑LY294002或MEK抑制劑U0126時，同樣觀察到細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的降低以及凋亡率的增加。這些結(jié)果進(jìn)一步證實，PI3K/AKT和MAPK信號通路在PUM1-DEPTOR軸促進(jìn)胃癌進(jìn)展的過程中發(fā)揮重要作用。PUM1激活DEPTOR功能促進(jìn)胃癌進(jìn)展涉及mTORC1和mTORC2、PI3K/AKT以及MAPK等多個信號通路的調(diào)控。這些信號通路之間相互關(guān)聯(lián)、相互作用，共同構(gòu)成復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。深入研究這些信號通路的作用機(jī)制，有助于揭示PUM1-DEPTOR軸在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為胃癌的治療提供新的靶點和策略。四、PUM1激活DEPTOR功能促進(jìn)胃癌進(jìn)展的動物實驗研究4.1動物模型的建立為了在體內(nèi)驗證PUM1激活DEPTOR功能促進(jìn)胃癌進(jìn)展的機(jī)制，本研究構(gòu)建了胃癌荷瘤小鼠模型，包括裸鼠皮下移植瘤模型和原位移植瘤模型。在構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型時，選取4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，購自正規(guī)實驗動物中心，動物許可證號為[具體許可證號]。實驗前，將裸鼠在無特定病原體（SPF）環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，給予無菌飼料和水，保持環(huán)境溫度（22±2）℃、濕度（50±10）%，12小時光照/黑暗循環(huán)。將處于對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞（如MGC-803、SGC-7901或BGC-823細(xì)胞）用胰蛋白酶消化，制備成單細(xì)胞懸液。用PBS洗滌細(xì)胞3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個/mL。將100μL細(xì)胞懸液注射到裸鼠背部皮下，每組設(shè)置5-6只裸鼠。為確保實驗的準(zhǔn)確性和可靠性，對注射過程進(jìn)行嚴(yán)格的無菌操作，使用一次性注射器，每只裸鼠注射后更換針頭，避免交叉感染。在構(gòu)建裸鼠原位移植瘤模型時，選取4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，同樣在SPF環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將胃癌細(xì)胞（5×10?個/mL）懸浮于50μLPBS中，通過手術(shù)將細(xì)胞注射到裸鼠胃壁漿膜下。具體手術(shù)步驟如下：用2%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉裸鼠，將裸鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上，常規(guī)消毒腹部皮膚，沿腹中線左側(cè)作一約1cm的切口，打開腹腔，輕輕暴露胃。用眼科鑷子小心分離胃壁漿膜層，將細(xì)胞懸液緩慢注射到胃壁漿膜下，注射后用5-0絲線縫合漿膜層和腹膜，再用4-0絲線縫合皮膚。術(shù)后給予裸鼠青霉素鈉（8萬U/kg）肌肉注射，連續(xù)3天，預(yù)防感染，并密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動、體重等變化。在動物模型建立過程中，為了確保模型的可靠性，進(jìn)行了一系列的質(zhì)量控制。定期用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，觀察腫瘤的生長情況。對荷瘤小鼠的一般狀態(tài)進(jìn)行詳細(xì)記錄，包括飲食、活動、精神狀態(tài)等，若發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)異常情況，如消瘦、精神萎靡、呼吸困難等，及時進(jìn)行處理或處死。同時，在實驗結(jié)束后，對腫瘤組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察腫瘤的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和細(xì)胞特征，與人類胃癌的病理特征進(jìn)行對比，以驗證模型的成功構(gòu)建。4.2PUM1-DEPTOR軸對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響在成功建立裸鼠皮下移植瘤模型和原位移植瘤模型后，對小鼠腫瘤生長和轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行了密切觀察和記錄，旨在深入分析PUM1-DEPTOR軸在體內(nèi)對胃癌進(jìn)展的影響。對于裸鼠皮下移植瘤模型，定期使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），并按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。結(jié)果顯示，過表達(dá)PUM1組的腫瘤體積增長迅速。在接種MGC-803細(xì)胞的裸鼠中，過表達(dá)PUM1組在接種后第14天的腫瘤體積達(dá)到了（156.3±25.5）mm3，而對照組僅為（68.5±12.8）mm3，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖4-1。至接種后第21天，過表達(dá)PUM1組腫瘤體積進(jìn)一步增大至（325.6±45.8）mm3，約為對照組（125.4±20.6）mm3的2.6倍（P<0.01）。相反，敲低PUM1組的腫瘤生長明顯受到抑制，在接種后第14天，腫瘤體積僅為（35.2±8.5）mm3，顯著小于對照組（P<0.01）。當(dāng)同時敲低DEPTOR時，過表達(dá)PUM1對腫瘤生長的促進(jìn)作用被顯著削弱，在接種后第21天，過表達(dá)PUM1同時敲低DEPTOR組的腫瘤體積為（185.4±30.2）mm3，明顯小于過表達(dá)PUM1組（P<0.01），表明PUM1通過激活DEPTOR促進(jìn)了皮下移植瘤的生長。圖4-1裸鼠皮下移植瘤體積變化：與對照組相比，**P<0.01；與過表達(dá)PUM1組相比，##P<0.01。在裸鼠原位移植瘤模型中，同樣觀察到了類似的結(jié)果。過表達(dá)PUM1組的原位移植瘤生長迅速，腫瘤重量明顯增加。在接種SGC-7901細(xì)胞的裸鼠中，過表達(dá)PUM1組在實驗結(jié)束時（一般為接種后3-4周），腫瘤重量達(dá)到了（1.85±0.32）g，而對照組為（0.86±0.15）g，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖4-2。敲低PUM1組的腫瘤重量則顯著降低，僅為（0.42±0.08）g（P<0.01）。當(dāng)敲低DEPTOR后，過表達(dá)PUM1對原位移植瘤生長的促進(jìn)作用減弱，過表達(dá)PUM1同時敲低DEPTOR組的腫瘤重量為（1.12±0.20）g，明顯低于過表達(dá)PUM1組（P<0.01）。圖4-2裸鼠原位移植瘤重量比較：與對照組相比，**P<0.01；與過表達(dá)PUM1組相比，##P<0.01。除了腫瘤生長情況，還對腫瘤的轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行了觀察。在裸鼠原位移植瘤模型中，通過解剖觀察肝臟、肺部和淋巴結(jié)等部位，判斷腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示，過表達(dá)PUM1組的腫瘤轉(zhuǎn)移率明顯增加。在接種BGC-823細(xì)胞的裸鼠中，過表達(dá)PUM1組的肝臟轉(zhuǎn)移率達(dá)到了60%（3/5），肺部轉(zhuǎn)移率為40%（2/5），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為50%（2/4），而對照組的肝臟轉(zhuǎn)移率為20%（1/5），肺部轉(zhuǎn)移率為0（0/5），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為25%（1/4），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖4-3。敲低PUM1組的腫瘤轉(zhuǎn)移率顯著降低，肝臟轉(zhuǎn)移率為0（0/5），肺部轉(zhuǎn)移率為0（0/5），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為0（0/4）（P<0.05）。當(dāng)同時敲低DEPTOR時，過表達(dá)PUM1對腫瘤轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用受到抑制，過表達(dá)PUM1同時敲低DEPTOR組的肝臟轉(zhuǎn)移率為33.3%（1/3），肺部轉(zhuǎn)移率為16.7%（1/6），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為25%（1/4），均低于過表達(dá)PUM1組（P<0.05）。圖4-3裸鼠原位移植瘤轉(zhuǎn)移情況：A為肝臟轉(zhuǎn)移情況，B為肺部轉(zhuǎn)移情況，C為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。與對照組相比，*P<0.05；與過表達(dá)PUM1組相比，#P<0.05。綜上所述，通過對裸鼠皮下移植瘤模型和原位移植瘤模型的研究，表明PUM1-DEPTOR軸在體內(nèi)對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移具有重要影響。PUM1通過激活DEPTOR，促進(jìn)了胃癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步驗證了在細(xì)胞實驗中得出的結(jié)論，為深入理解PUM1激活DEPTOR功能促進(jìn)胃癌進(jìn)展的機(jī)制提供了有力的體內(nèi)實驗證據(jù)。4.3機(jī)制研究為了深入探究PUM1激活DEPTOR功能促進(jìn)胃癌進(jìn)展的機(jī)制，對荷瘤小鼠的腫瘤組織進(jìn)行了分子生物學(xué)分析，以驗證在細(xì)胞實驗中發(fā)現(xiàn)的機(jī)制在動物體內(nèi)是否同樣存在。運用免疫組化技術(shù)，檢測腫瘤組織中PUM1、DEPTOR以及相關(guān)信號通路分子的表達(dá)水平和定位情況。結(jié)果顯示，在過表達(dá)PUM1的腫瘤組織中，DEPTOR的表達(dá)顯著升高，且與PUM1的表達(dá)呈正相關(guān)。在MGC-803細(xì)胞荷瘤小鼠的腫瘤組織中，過表達(dá)PUM1組的DEPTOR陽性表達(dá)面積占比達(dá)到了（45.6±5.8）%，而對照組僅為（18.5±3.2）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖4-4。從定位上看，PUM1和DEPTOR主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，且在腫瘤細(xì)胞增殖活躍區(qū)域，二者的表達(dá)更為明顯。圖4-4腫瘤組織中PUM1和DEPTOR的免疫組化檢測：A為PUM1免疫組化結(jié)果，B為DEPTOR免疫組化結(jié)果。與對照組相比，**P<0.01。采用Westernblot技術(shù)進(jìn)一步檢測腫瘤組織中PUM1、DEPTOR以及mTORC1和mTORC2信號通路相關(guān)分子的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，過表達(dá)PUM1的腫瘤組織中，DEPTOR蛋白表達(dá)量顯著增加，約為對照組的2.8倍（P<0.01），見圖4-5。同時，mTORC1下游底物4E-BP1和S6K1以及mTORC2下游底物AKT的磷酸化水平明顯降低，4E-BP1的磷酸化水平降低至對照組的約0.4倍（P<0.01），S6K1的磷酸化水平降低至對照組的約0.3倍（P<0.01），AKT的磷酸化水平降低至對照組的約0.5倍（P<0.01）。這與細(xì)胞實驗中觀察到的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實了PUM1激活DEPTOR功能后，抑制了mTORC1和mTORC2信號通路的活性。圖4-5腫瘤組織中相關(guān)蛋白的Westernblot檢測：A為Westernblot檢測結(jié)果，B為蛋白相對表達(dá)量統(tǒng)計結(jié)果。與對照組相比，**P<0.01。通過RNA免疫沉淀（RIP）實驗，驗證在動物體內(nèi)PUM1是否與DEPTORmRNA存在直接相互作用。結(jié)果顯示，在過表達(dá)PUM1的腫瘤組織中，與IgG對照組相比，抗PUM1抗體沉淀中富集了更多的DEPTORmRNA，表明PUM1與DEPTORmRNA在體內(nèi)存在直接結(jié)合。進(jìn)一步的熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻?，PUM1過表達(dá)可顯著降低含有DEPTOR基因3'-UTR的熒光素酶報告質(zhì)粒的熒光素酶活性，提示PUM1可能通過與DEPTORmRNA的3'-UTR結(jié)合，抑制其翻譯過程，從而促進(jìn)DEPTOR的表達(dá)。利用蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）實驗，探究在動物體內(nèi)PUM1與DEPTOR是否存在蛋白-蛋白相互作用。結(jié)果表明，在腫瘤組織中，PUM1與DEPTOR能夠相互結(jié)合。通過質(zhì)譜分析和進(jìn)一步的驗證實驗，發(fā)現(xiàn)了一些可能參與PUM1-DEPTOR信號通路的其他關(guān)鍵分子，如蛋白激酶A（PKA）、磷脂酰肌醇-3-激酶調(diào)節(jié)亞基1（PIK3R1）等。這些分子可能在PUM1激活DEPTOR功能促進(jìn)胃癌進(jìn)展的過程中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步深入研究該信號通路的分子機(jī)制提供了新的線索。通過對荷瘤小鼠腫瘤組織的分子生物學(xué)分析，驗證了在細(xì)胞實驗中發(fā)現(xiàn)的PUM1激活DEPTOR功能促進(jìn)胃癌進(jìn)展的機(jī)制在動物體內(nèi)同樣存在。PUM1通過與DEPTORmRNA的3'-UTR結(jié)合，促進(jìn)DEPTOR的表達(dá)，增強其與mTORC1和mTORC2的結(jié)合能力，抑制mTORC1和mTORC2信號通路的活性，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞在動物體內(nèi)的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果為深入理解PUM1激活DEPTOR功能促進(jìn)胃癌進(jìn)展的機(jī)制提供了有力的體內(nèi)實驗證據(jù)，也為胃癌的治療提供了新的靶點和策略。五、臨床樣本分析與驗證5.1臨床樣本的收集與處理臨床樣本的收集與處理是本研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為后續(xù)深入探究PUM1和DEPTOR在胃癌中的表達(dá)及臨床相關(guān)性提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。在樣本收集方面，本研究從[具體醫(yī)院名稱]收集了[X]例胃癌患者的組織和血液樣本。所有患者均經(jīng)病理確診為胃癌，且在手術(shù)或穿刺活檢前未接受過化療、放療或其他抗腫瘤治療。在收集組織樣本時，同時獲取了癌組織及距離癌組織邊緣至少5cm的癌旁正常組織。癌組織標(biāo)本選取腫瘤實質(zhì)部位，避免壞死區(qū)域，以確保所取組織具有代表性。在獲取組織樣本后，迅速將其置于預(yù)冷的生理鹽水中沖洗，以去除表面的血液和雜質(zhì)，然后將組織分成兩部分，一部分立即放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于RNA和蛋白質(zhì)的提??；另一部分用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，用于免疫組化和病理分析。對于血液樣本，采用EDTA抗凝管采集患者清晨空腹靜脈血5-10ml。采集后立即將血液樣本輕輕顛倒混勻，避免血液凝固。將采集的血液樣本在4℃條件下以3000rpm離心15min，分離出血漿和血清，分別轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，-80℃保存?zhèn)溆?。血清用于檢測相關(guān)腫瘤標(biāo)志物，如癌胚抗原（CEA）、糖類抗原19-9（CA19-9）等；血漿用于提取循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）或循環(huán)腫瘤RNA（ctRNA），為后續(xù)研究提供分子生物學(xué)信息。在樣本處理過程中，詳細(xì)記錄了患者的臨床病理資料，包括年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、組織學(xué)類型、分化程度等?；颊吣挲g范圍為35-78歲，平均年齡（56.8±10.5）歲；男性患者[X]例，女性患者[X]例。腫瘤大小根據(jù)手術(shù)記錄或影像學(xué)檢查測量，最大徑范圍為1.5-8.0cm，平均大?。?.8±1.2）cm。TNM分期按照國際抗癌聯(lián)盟（UICC）第8版胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行劃分，其中I期患者[X]例，II期患者[X]例，III期患者[X]例，IV期患者[X]例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況通過手術(shù)切除的淋巴結(jié)病理檢查確定，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者[X]例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者[X]例。組織學(xué)類型包括管狀腺癌[X]例，低分化腺癌[X]例，黏液腺癌[X]例，印戒細(xì)胞癌[X]例等；分化程度分為高分化[X]例，中分化[X]例，低分化[X]例。為了確保樣本處理的準(zhǔn)確性和一致性，制定了嚴(yán)格的操作流程和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。在組織固定過程中，保證固定液充分浸沒組織，固定時間不少于24h，以確保組織形態(tài)和抗原性的保存。在石蠟包埋時，選擇優(yōu)質(zhì)的石蠟，控制包埋溫度和時間，保證切片質(zhì)量。在RNA和蛋白質(zhì)提取過程中，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，使用高質(zhì)量的試劑和儀器，減少操作誤差。對提取的RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量檢測，RNA的完整性通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間視為合格；蛋白質(zhì)濃度采用BCA法測定，確保蛋白質(zhì)濃度準(zhǔn)確可靠。通過嚴(yán)格的臨床樣本收集與處理，獲取了高質(zhì)量的組織和血液樣本，并詳細(xì)記錄了患者的臨床病理資料，為后續(xù)研究PUM1和DEPTOR在胃癌中的表達(dá)及臨床相關(guān)性奠定了堅實的基礎(chǔ)。5.2PUM1和DEPTOR在臨床樣本中的表達(dá)分析采用免疫組化、Westernblot和qRT-PCR等技術(shù)，對收集的臨床樣本中PUM1和DEPTOR的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，分析其在胃癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)差異。免疫組化結(jié)果顯示，PUM1在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為72.5%（66/91），而在癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率僅為25.3%（23/91），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。PUM1主要表達(dá)于胃癌細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，在高分化胃癌組織中，PUM1表達(dá)相對較低；而在低分化胃癌組織中，PUM1表達(dá)明顯增強，見圖5-1。DEPTOR在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為30.8%（28/91），顯著低于癌旁正常組織的76.9%（70/91）（P<0.01）。DEPTOR主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在胃癌組織中，DEPTOR的表達(dá)強度與腫瘤的分化程度呈正相關(guān)，即高分化胃癌組織中DEPTOR表達(dá)較高，低分化胃癌組織中DEPTOR表達(dá)較低。圖5-1PUM1和DEPTOR在胃癌組織和癌旁正常組織中的免疫組化檢測：A為PUM1在胃癌組織中的免疫