?2008

Waters

Corporation高效液相色譜原理及其應用?2008

Waters

Corporation

2什么是色譜色譜法(Chromatography)溯源100多年前俄國植物學家Tswett(茨維特)分離植物色素時采用的實驗方法(цвет)他將植物色素的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,結果色素中各組份互相分離形成各種不同顏色的譜帶Tswett用希臘語chroma(色)和graphos(譜)描述他 的實驗方法，即現(xiàn)在的Chromatography(色譜法)?2008

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Corporation

3從Tswett

的實驗談起一根長玻璃管填充碳酸鈣的 顆粒 將碾碎之植物葉片的提取液灌入柱中 隨著石油醚提取液向下流過柱子，現(xiàn)出展寬的色帶分離出不同的化合物Chromato

--

顏色Graphy

--

像注:Tswett：俄文的意思是顏色什么是色譜??2008

Waters

Corporation

4色譜法的簡稱(又叫色層法,層析法),其本質是一種分離分析方法常見的分離方法—蒸餾—離心—電泳—過濾—超濾色譜目前最有效的分離方法色譜法的分類?2008

Waters

Corporation

5按流動相的物態(tài)分:—氣相色譜(Gas

Chromatography,

GC)用氣體作為流動相(又叫載氣)—液相色譜(Liquid

Chromatography,LC)用液體作為流動相(又叫洗脫劑)按固定相的形態(tài)分:—平面色譜紙色譜薄層色譜—柱色譜液相色譜和氣相色譜色譜液相色譜柱色譜紙色譜

薄層色譜高效液相色譜

HPLC氣相色譜?2008

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Corporation

6色譜法原理分離是一個物理過程。?2008

Waters

Corporation

7固定相(Stationary

Phase)流動相(Mobile

Phase)進樣(Injection)洗脫(Elution)相互作用(Interaction)高效液相色譜法—HPLC(High

Performance

LiquidChromatography

)—是一種區(qū)別于經典液相色譜,基于儀器方法的高效能分離手段:高性能色譜柱,高精度輸液泵,高靈敏度檢測器…—廣泛應用于各個領域:醫(yī)藥,環(huán)保,石化,生命科學,食品工業(yè),農業(yè)…—無論在技術上,理論上,還是在應用上仍有較大的發(fā)展空間?2008

Waters

Corporation

8什么是HPLC?超高效液相色譜—UPLC(Ultra

Performance

LiquidChromatography

)—是區(qū)別于HPLC的液相色譜新領域—基于小顆粒填料和LC原理的一種創(chuàng)新技術—實現(xiàn)超高分離度、靈敏度、分析速度—是Waters公司對液相色譜的新貢獻(2004年3月正式推出)?2008

Waters

Corporation

9什么是UPLC?HPLC的流程溶劑(流動相)泵進樣器色譜柱(固定相)檢測器廢液數據系統(tǒng)?2008

Waters

Corporation

10?2008

Waters

Corporation

11HPLC的圖形結果色譜 (Chromatogram)

:色譜柱流出物通過檢測器時所產生的響應信號對時間的曲線

,其縱坐標為信號強度,橫坐標為時間基線↓時間(分)峰高?2008

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Corporation

12←色譜峰峰寬響應值高效液相色譜儀器組成色譜泵進樣器檢測器數據處理色譜柱?2008

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13HPLC的系統(tǒng)組成-硬件?2008

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14流路系統(tǒng):—泵(515,1515,1525,600,616,626…)—進樣器(7725i,717Plus…)—色譜柱(Symmetry

C18,NovaPak

C18,…)—檢測器(2489,2998,2475,2414,2424,SQD…)—2695/2795分離單元(溶劑管理與樣品管理集成為一體)HPLC的系統(tǒng)組成-軟件?2008

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15數據系統(tǒng):—積分儀(746)—工作站(PC800)—數據管理系統(tǒng)(基于Oracle關系型數據庫和Windows

2000/XP操作平臺)BreezeMillennium32Empower—Masslynx4.1軟件平臺(用于液質聯(lián)用系統(tǒng))典型的HPLC系統(tǒng)(1)?2008

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16Alliance

系統(tǒng):—2690/5分離單元—色譜柱(SunFire

C18)—2998(2489)檢測器—Empower

色譜管理系統(tǒng)典型的的HPLC系統(tǒng)(2)1525-717(7725i)-2487-Breeze系統(tǒng)?2008

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17典型的HPLC系統(tǒng)(3)液質聯(lián)用系統(tǒng):2695-2996-ZQ4000-Masslynx4.0?2008

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18液相色譜的分析流程(1)?2008

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Corporation

19樣品制備—沉淀蛋白—固相提取—用流動相溶樣開發(fā)方法—準備標準對照物—色譜柱的選用—流動相的選用—檢測器的選用液相色譜的分析流程(2)?2008

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20儀器設備的準備—儀器平衡—色譜柱的平衡—用Empower軟件控制系統(tǒng)數據采集數據處理提交報告液相色譜的應用（1）?2008

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Corporation

21“分析型液相色譜”目的:得到數據-定性及定量分析—靈敏度的要求—樣品的復雜性—樣品量的要求—精度及準確度的要求—容易使用液相色譜的應用（2）?2008

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Corporation

22“制備型液相色譜”目的:得到純品-分離及純化—化合物的穩(wěn)定性—樣品的復雜性—制備量的要求—純度的要求，及純度的鑒定—方法的安全性液相色譜的應用實例?2008

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Corporation

23在食品安全檢測中的應用—乳制品中的三聚氰胺檢測—山梨酸,苯甲酸,等食品添加劑的檢測在食品營養(yǎng)標簽檢測中的應用—氨基酸的檢測—維生素的檢測在其它行業(yè)中的應用水溶維生素的分析

色譜柱Atlantis

dC18Compounds:

L-ascorbic

acidNicotinic

acidThiaminePyridoxalPyridoxineFolicacidCaffeineRiboflavinUSP

Tailing

1.121.271.201.131.041.101.101.141.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

10.00

11.00

12.00

13.00

14.00

15.00Time

(Min)12345876V0

=

1.37

minConditionsColumn:

AtlantisTM

dC18

4.6

x

150

mm,

5

μmMobile

Phase

A:

0.1%

TFAMobile

Phase

B:ACNFlow

Rate:

1.4

mL/min?2008

Waters

Corporation

24ProfileGradient:

Time(min)0.04.06.015.0%A

%B100

097

385

1580

20Injection

Volume:

10

μLTemperature:

30

oCDetection:

UV

@

260

nmNo

ion-pairing

agent

necessary!!ConditionsColumn:Mobile

PhaseA:Mobile

PhaseB:Flow

Rate:Gradient:AtlantisTM

dC18

4.6

x

150

mm,

5

μm0.1%

TFA

in

H2O0.1%

TFA

in

ACN1.4

mL/minTime

Profile(min)%A%B0.010005.09736.0851510.0802012.0010025.00100Injection

Volume:Temperature:10

μL30

oCDetection:Instrument:UV

@

268

nmAlliance?

2695,

2996PDA一根色譜柱同時分析水溶性和脂溶性維生素Compounds:

Concentration

(μg/mL)L-ascorbic

acid

(vitamin

C)Nicotinic

acid

(niacin)Thiamine

(vitamin

B1)PyridoxalPyridoxineFolic

acid

(vitaminB11)CaffeineRiboflavin

(vitamin

B2)Retinol

(vitamin

A)10.

Tocopherol

(vitamin

E)11.

Ergocalciferol

(vitamin

D2)19.69.819.639.239.223.59.83.919.639.29.8Grumbach,

Diehl2.004.006.008.0010.0012.00Minutes14.0016.0018.0020.0022.0024.00123458760V

=

1.37

min10911Excellent

retentionfor

water-solublevitaminsNot

overly

retentive

for

fat-soluble

vitamins?2008

Waters

Corporation

25氨基酸標樣色譜圖AM

Q?2008

Waters

Corporation

26As

pS

e

rG

luG

lyH

isNH

3A

rgTh

rA

laP

roCysV

a

lTyrM

e

tLy

sIL

eLeuP

h

e8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

20.00

22.00

24.00

26.00

28.00

30.00

32.00

34.00

36.00

38.00MinutesAccQ·Tag

氨基酸分析的重現(xiàn)性20.0Minutes0100200mV10.030.0AspAMQSerGlyHisNH2AlaProCysTyrValMetLysIleLeuPheGluArg

ThrN＝10Amino

Std

DevAcid

(seconds)AMQ

1.3Asp

1.8Ser

1.5Glu

1.8Gly

1.7His

2.0NH3

1.8Arg

0.8Thr

0.7Ala

0.7Pro

0.9Cys

1.1Tyr

1.0Val

1.0Met

1.0Lys

0.8Ile

0.8Leu

0.9Phe

1.3?2008

Waters

Corporation

27草酸蘋果酸戊酮二酸乙酸檸檬酸琥珀酸富馬酸Atlantis

d18

4.6x250mm0.1Mol/L

磷酸二氫鉀檢測器波長：UV215nm,流速：1ml/min;進樣量：5μl柱溫：40℃啤酒中的有機酸分析?2008

Waters

Corporation

28草酸蘋果酸戊酮二酸檸檬酸富馬酸琥珀酸Atlantis

d18

3.9x150mm0.1Mol/L

磷酸二氫鉀檢測器波長：UV215nm,流速：0.8ml/min;進樣量：5μl柱溫：40℃啤酒中的有機酸分析?2008

Waters

Corporation

292695+2487+empower215%甲醇：85%0.02mol乙酸胺，

Flow=1ml/min,Temp=35C,UV=230nm.Atlantis

T3

4.6X150mm?2008

Waters

Corporation

30苯甲酸，糖精鈉和山梨酸分析?2008

Waters

Corporation苯甲酸山梨酸液相分析Waters2695

液相系統(tǒng)

2996

二極管陣列檢測器檢測波長230mm色譜柱:Symetry

Shield

IS4.6X20

3.5um流動相:20mmol

乙酸胺溶液流速:0.8ml?2008

Waters

Corporation

32乳制品中三聚氰胺的檢測巧克力早餐奶巧克力早餐奶加標香草冰淇淋香草冰淇淋加標HPLC液相色譜條件?2008

Waters

Corporation

33儀器配置：2695/2489

E2色譜柱：Symmetry

C8

Column，4.6x 250mm,

5μm

,P/N:WAT054270流動相：離子對試劑pH2.4(辛烷磺酸鈉+檸檬酸)/乙腈=90/10流速:柱溫:進樣量:1.0ml/min40℃20ul檢測波長:240nm樣品處理方法：?2008

Waters

Corporation

34樣品名稱:Sample

1

蒙牛巧克力早餐奶Sample

2

蒙牛香草味冰淇淋樣品前處理:1.平行稱取樣品3份各2.00g(約2mL)分別置于50

mL具塞塑料離心管中，其中2份樣品分別各加入40uL濃度為100ppm

標準溶液,將3份酸奶各加入25

mL1％三氯乙酸和乙腈的混液（體積比1：

1），渦旋2min，并超聲提取10

min，以4000

r/min離心10

min;取上清液5mL進行SPE凈化樣品處理方法：離子對溶液

/

乙腈

=

90

/

10

1mL，溶解殘渣2.

OasisMCX凈化過程(固相提取小柱:Waters

Oasis?

MCX

3cc(60mg）)活化/平衡3

mL

甲醇 5

mL

水上樣加入6mL上清液清洗3

mL

水 3mL

甲醇洗脫6mL

5%氨水甲醇溶液50℃氮氣吹干溶劑?2008

Waters

Corporation

35SPE流程?2008

Waters

Corporation

36SPE提取裝置?2008

Waters

Corporation

37標準品校正曲線(0.5,

1.0,

2.0,

5.0,

10.0ppm)R^2

:

0.999996?2008

Waters

Corporation

38R:

0.999998樣品測試結果?2008

Waters

Corporation

39UPLC-UV檢測液態(tài)奶,奶粉中三聚氰胺?2008

Waters

Corporation

40UPLC儀器條件儀器配置：UPLC,TUV或PDA檢測器(以下數據使用的是PDA檢測器)流動相：10mM

庚烷磺酸鈉,檸檬酸/乙腈=86/14流速:

0.5mL/min柱溫：

40℃進樣量：2ul

(PLUNO)檢測波長：240nm色譜柱：Acquity

UPLC

BEH

C8色譜柱，2.1x100mm,

1.7μm1Mg/kg標品色譜圖三聚氰胺-1.082AU0.0140.0120.0100.0080.0060.0040.0020.000-0.002分鐘0.000.200.400.600.801.001.201.401.601.80?2008

Waters

Corporation

41陽性樣品色譜圖三聚氰胺-1.083AU0.000.020.040.060.000.200.400.600.801.00分鐘1.201.401.601.802.00Melamine-1.083AU0.000.050.100.150.200.25分鐘0.000.200.400.600.801.001.201.40某液態(tài)奶陽性樣品?2008

Waters

Corporation

42某奶粉較高濃度陽性樣品B

F

D

G

E

.

2

H

2O

-

1

-

1.

898BF

D

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.

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2

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4

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2GHE2.O2

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9-

36

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24

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HCl

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