禽流感病毒與新城疫病毒二重RT-PCR檢測(cè)方法2017-12-22實(shí)施2017-12-22實(shí)施河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB13/T2609—2017本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：袁萬(wàn)哲、劉聚祥、陳立功、孫繼國(guó)、董世山、武現(xiàn)軍、劉靜、張磊、李睿文、李麗敏、白云、韓慶安。DB13/T2609—2017禽流感病毒與新城疫病毒二重RT-PCR檢測(cè)方法本標(biāo)準(zhǔn)適用于檢測(cè)家禽咽喉拭子、肛拭子，發(fā)病禽組織和這些采集樣品培養(yǎng)物中的禽流感病毒與新城疫病毒。下列縮略語(yǔ)適用于本文件。DEPC:焦碳酸二乙酯(diethypyrocarPCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)RT-PCR:反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse-transcriptionpolymerasechainreaction)dNTP:脫氧核苷酸三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)包括LSTRIzolRNA提取試劑或各種市售病毒核酸提取試劑盒，氯仿，異丙醇，75%乙醇，1.0%瓊脂糖凝膠，50×TAE緩沖液，溴化乙錠(EB,10ug/μL)或核酸染料，焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的滅菌的雙蒸水，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(100bp),2×TaqMasterMix。在操作中應(yīng)在通風(fēng)條件下進(jìn)行，使用時(shí)戴手套和口罩，不小心沾到皮膚應(yīng)立即沖洗。3.1LSTRIzolRNA提取試劑或病毒核酸提取試劑盒。3.31.0%瓊脂糖凝膠，配制方法見附錄A中A.1。3.450×TAE緩沖液，配制方法見附錄A中A.2。3.5溴化乙錠(EB,10ug/μL)或核酸染料，配制方法見附錄A中A.3。3.6焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的滅菌的雙蒸水，配制方法見附錄A中A.4。3.7DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(100bp):包含100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp幾種分子量標(biāo)準(zhǔn)。工2DB13/T2609—20173.102×TaqMasterMix:含有PCR緩沖液、酶混合物、dNTP混合物、無(wú)RNA酶的水等。3.11dNTP。濃度為2.5mM。3.12引物：反轉(zhuǎn)錄引物、上游引物與下游引物見附錄B中的表B.1。引物濃度為10μmol/L。4.1PCR儀：溫度范圍4.0℃~99.9℃,樣品基座配置至少包括單個(gè)0.2mL孔。4.2凝膠成像系統(tǒng)：檢測(cè)靈敏度DNA≥0.1ng;有效像數(shù)1360×1024、10bit、USB2.0。4.3臺(tái)式低溫高速離心機(jī)：最高轉(zhuǎn)速16000r/min;容量1.5mL×12。4.4電泳儀：電壓50V～120V,電流10mA～800mA,定時(shí)0min～999min。4.7微量移液器：?jiǎn)蔚揽烧{(diào)，量程包括0.5μL～10μL、2μL～20μL、10μL～100μL、100μL～10005樣品以滅活的禽流感病毒與新城疫病毒雞胚培養(yǎng)物或者感染禽組織作為陽(yáng)性對(duì)照，以正常雞胚尿囊液或者是正常家禽組織作為陰性對(duì)照。對(duì)照均應(yīng)在-20℃保存。5.2樣品的采集與處理5.2.1采集工具下列的采集工具應(yīng)經(jīng)121℃±2℃,20min高壓滅菌并烘干：a)棉拭子；b)剪刀；5.2.2棉拭子采集3DB13/T2609—2017剖檢家禽，用剪刀采集心肝脾肺腎法氏囊等組織，裝入一次性滅菌容器，編號(hào)。樣品采集后放入塑料袋內(nèi)密封(一個(gè)采集點(diǎn)的樣品放一個(gè)塑料袋內(nèi)),于保溫箱中加冰，密封24h5.2.5.1棉拭子處理方法將裝有棉拭子的離心管在混合器上充分混合后，用高壓滅菌的鑷子將拭子中的液體擠出，4℃條件下3000r/min離心15min,取上清液轉(zhuǎn)入無(wú)菌的1.5mL離心管中，編號(hào)備用。5.2.5.2組織的處理方法將所采集的組織至于潔凈、滅菌并烘干的搪瓷盤中，稱取組織按照質(zhì)量體積比(1:5)加入樣品保存液進(jìn)行充分研磨，4℃條件下3000r/min離心15min。取上清轉(zhuǎn)入無(wú)菌的1.5mL的離心管備用，編號(hào)。6.1.1用LSTRIzol試劑提取待檢樣品(棉拭子或組織)、陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照樣品的RNA。6.1.2將250μL經(jīng)過(guò)預(yù)處理的待檢樣品(棉拭子或組織)加入750μLTRIzolLSReagent中，振蕩2min,室溫放置5min。6.1.3加入250μL氯仿，在微量振蕩器上振蕩1min,室溫放置5min后，4℃條件下12000r/min離心15min。6.1.4吸取上層水相轉(zhuǎn)入一新的離心管中，加入等量的異丙醇，混勻，室溫放置15min,4℃條件下12000r/min離心15min。6.1.5小心吸棄上清，加入DEPC處理的75%乙醇700μL～800μL,4℃條件下12000r/min離心56.1.6小心吸棄上清，將沉淀自然風(fēng)干或于50℃干燥箱中晾干，加適量的DEPC水溶解。6.1.7提取的RNA應(yīng)在2h內(nèi)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，若需長(zhǎng)期保存，應(yīng)至于-80℃的冰箱保存。6.1.8也可采用商品化的病毒核酸提取試劑，按照說(shuō)明書進(jìn)行如下操作。同時(shí)進(jìn)行陰陽(yáng)對(duì)照樣品RNA的提取。6.1.8.1加入20μL蛋白酶K于1.5mL離心管中，在離心管中加入200μL樣品，加入200μLBB5,渦旋混合15s,56℃孵育15min。6.1.8.2加入250μL無(wú)水乙醇，渦旋混合15s,室溫放置5min。6.1.8.3將溶液和沉淀一起加入離心柱中，12000r/min離心1min,棄掉流出液。6.1.8.4加入500μLWB5,12000r/min離心1min,棄掉流出液，重復(fù)一次。4DB13/T2609—20176.1.8.5室溫12000r/min離心1min,徹底去除殘留的乙醇，在室溫靜置1～3min徹底晾干離心柱。6.1.8.6將離心柱轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，并向離心柱中央加20μLRNase-freeWater,室溫靜置6.1.8.7室溫12000r/min離心1min,洗脫RNA。6.1.8.8提取的RNA應(yīng)在2h內(nèi)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，若需長(zhǎng)期保存，應(yīng)至于-80℃的冰箱保存。6.2.1反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(cDNA的合成)取上述步驟所得的RNA11μL,加入2μL10μmol//即得到cDNA溶液，直接用于下面的PCR擴(kuò)在反應(yīng)管中依次加入8μL無(wú)核酸酶水、10μL2×TaqMasterMix、1μL上述cDNA溶液、各0.5μL10μmol/L的上游引物(AIV-decF與NDV-decF)、各0.5μL10μmol/L的下游引物(AIV-decR與NDV-decR)。經(jīng)充分混勻后瞬時(shí)離心使液體全部聚集于管底。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3min,94℃變性10s,56℃退火30s,72℃延伸25s,循環(huán)30次；72℃延伸5min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行電泳或置于4℃條件下備用。7試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理7.1擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)制備1.0%瓊脂糖凝膠板。在電泳槽內(nèi)加入1×TAE電泳緩沖液，使液面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠。取3μL～5μL擴(kuò)增產(chǎn)物加到凝膠孔，加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(100bp)。恒壓(110V)電泳30min～40min,將電泳好的凝膠放到凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。7.2結(jié)果判定陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，在預(yù)期大小的條帶位置均出現(xiàn)特異性的條帶，陰性的擴(kuò)增產(chǎn)物沒(méi)有預(yù)期的目的條帶，陰陽(yáng)性同時(shí)成立表明試驗(yàn)有效，否則試驗(yàn)無(wú)效。在試驗(yàn)結(jié)果成立的前提下，如果樣品的RT-PCR產(chǎn)物電泳后在428bp位置出現(xiàn)特異性的條帶，則判定為禽流感病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性；如果樣品的RT-PCR產(chǎn)物電泳后在297bp位置出現(xiàn)特異性的條帶，則判定為新城疫病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性。如果樣品的RT-PCR產(chǎn)物電泳后在428bp和297bp位置均出現(xiàn)特異性的條帶，則判定為禽流感病毒與新城疫病毒核酸檢測(cè)雙陽(yáng)性；如果樣品的RT-PCR產(chǎn)物電泳后在428bp和297bp位置均未出現(xiàn)特異性的條帶，則判定為禽流感病毒與新城疫病毒核酸檢測(cè)雙陰性。RT-PCR產(chǎn)物電泳圖見附錄C中C.1。8試驗(yàn)報(bào)告依次陳述試驗(yàn)對(duì)象、所使用的標(biāo)準(zhǔn)(包括發(fā)布或出版年號(hào))、所使用的方法、檢測(cè)結(jié)果與試驗(yàn)時(shí)5DB13/T2609—2017相關(guān)試劑的配制稱取瓊脂糖1.0g,放入100mL1×TAE電泳緩沖液中，加熱融化，溫度降至60℃時(shí)，加入5μL核酸染料，均勻鋪板，厚度為3mm～5mm。A.250×TAE電泳緩沖液A.2.10.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)稱取EDTA18.61g,加滅菌雙蒸水至100mL,后用氫氧化鈉調(diào)pH至8.0。Tris242g,冰乙酸57.1mL,0.5mol/LEDTA100mL,加滅菌雙蒸水至1000mL。溴化乙錠20mg,加滅菌雙蒸水至20mL。A.4DEPC水加滅菌雙蒸水至100mL,室溫放置6h～8h,121℃±2℃高壓滅菌20min,分裝到1.5mLDEPC處理過(guò)的離心管。A.5PBS緩沖液A.5.1A液(0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液):NaH?PO?·H?027.6g先用適量蒸餾水溶解，最后用蒸餾水稀釋至1000mL。磷酸氫二鈉水溶液):Na?HPO?·7H?053.6g,(或Na?HPO?·127H?071.6g或N先用適量蒸餾水溶解，最后用蒸餾水稀釋至1000mL。A.5.30.01mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液的配制：A液14mL,B液36mL,加氯化鈉(NaC1)8.5g,最后用蒸餾水稀釋至1000mL。6DB13/T2609—2017(規(guī)范性附錄)引物表B.1規(guī)定了引物的濃度和序列。引物名稱引物濃度AIV-decFCGTAGACGCTTTGTCCAGAAT