Treg細胞在小鼠過敏性哮喘中的免疫調(diào)節(jié)機制與治療潛能探究一、引言1.1研究背景與意義過敏性哮喘作為一種常見的慢性炎癥性氣道疾病，影響著全球大量人口，給患者的生活質(zhì)量和健康帶來了嚴重影響。近年來，隨著環(huán)境變化、生活方式改變等因素，其發(fā)病率呈上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計，全球約有3億人患有哮喘，預計到2025年，這一數(shù)字將增長至4億。在中國，哮喘的患病率也不容樂觀，且兒童哮喘患者數(shù)量逐漸增多，嚴重威脅著兒童的生長發(fā)育和身心健康。例如，一項針對中國部分地區(qū)兒童哮喘流行病學調(diào)查顯示，兒童哮喘患病率已達3%-5%，且發(fā)病率仍在逐年上升。小鼠過敏性哮喘模型在研究哮喘發(fā)病機制和治療方法中具有重要作用。小鼠與人類在生理、免疫等方面有一定的相似性，通過建立小鼠過敏性哮喘模型，可以模擬人類哮喘的發(fā)病過程，深入研究哮喘的發(fā)病機制，為臨床治療提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。利用小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，哮喘的發(fā)病與免疫系統(tǒng)的異常激活密切相關(guān)，多種免疫細胞和細胞因子參與其中。調(diào)節(jié)性T細胞（Treg細胞）作為免疫系統(tǒng)中的重要調(diào)節(jié)細胞，在維持免疫平衡、抑制過度免疫反應中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Treg細胞具有免疫無能性和免疫抑制性，能夠調(diào)節(jié)機體對非病原體抗原如過敏原的耐受性，并參與調(diào)節(jié)抗原引起的免疫炎癥反應。越來越多的證據(jù)表明，Treg細胞在小鼠過敏性哮喘中發(fā)揮著重要的作用，其數(shù)量和功能的異常與哮喘的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在過敏性哮喘患者的外周血中，Treg細胞的數(shù)量及功能均有不同程度的降低，提示Treg細胞可能是治療過敏性哮喘的潛在靶點。研究Treg細胞在小鼠過敏性哮喘中的作用機制，有助于深入了解哮喘的發(fā)病機制，為臨床治療提供新思路和方法。通過揭示Treg細胞在哮喘發(fā)病過程中的具體作用機制，可以為開發(fā)新型的哮喘治療藥物和治療策略提供理論支持。如果能夠明確Treg細胞如何通過釋放細胞因子來抑制炎癥反應，就可以研發(fā)相應的藥物來增強Treg細胞的功能，從而達到治療哮喘的目的。這對于改善哮喘患者的生活質(zhì)量、降低哮喘的發(fā)病率和死亡率具有重要的意義，也將為哮喘的精準治療和個性化治療奠定基礎(chǔ)。1.2研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入剖析Treg細胞在小鼠過敏性哮喘中的作用機制，具體包括以下幾個方面：通過實驗監(jiān)測小鼠過敏性哮喘模型中Treg細胞數(shù)量、功能及相關(guān)細胞因子表達的動態(tài)變化，明確Treg細胞在哮喘發(fā)病不同階段的作用；從細胞和分子層面，探究Treg細胞抑制免疫反應、調(diào)節(jié)炎癥微環(huán)境的具體信號通路和分子機制；基于研究結(jié)果，為過敏性哮喘的臨床治療提供潛在的干預靶點和治療策略，為開發(fā)新型治療藥物奠定理論基礎(chǔ)。在研究角度上，本研究不僅關(guān)注Treg細胞整體在小鼠過敏性哮喘中的作用，還深入探究其亞群在哮喘發(fā)病機制中的特異性功能，從多維度揭示Treg細胞與哮喘的關(guān)聯(lián)，為哮喘發(fā)病機制的研究提供更全面的視角。在研究方法上，本研究綜合運用多種先進技術(shù)，如單細胞測序技術(shù)深入分析Treg細胞的異質(zhì)性，基因編輯技術(shù)精確調(diào)控Treg細胞相關(guān)基因表達以明確其功能，代謝組學技術(shù)研究Treg細胞在哮喘中的代謝特征及與免疫功能的關(guān)聯(lián)，這些多技術(shù)聯(lián)用的方法能夠更精準、深入地解析Treg細胞在小鼠過敏性哮喘中的作用機制，為哮喘的治療研究提供更可靠的依據(jù)。二、Treg細胞與小鼠過敏性哮喘概述2.1Treg細胞的特性與功能2.1.1Treg細胞的定義與分類調(diào)節(jié)性T細胞（Treg細胞）是一類在免疫系統(tǒng)中具有關(guān)鍵調(diào)控作用的T細胞亞群。1995年，日本生物學家坂口志文教授發(fā)現(xiàn)成年小鼠外周血中存在一種特殊的CD4+T細胞亞群，去除該亞群會誘發(fā)小鼠自身免疫性疾病，回輸則可阻止疾病發(fā)生，由此將其命名為調(diào)節(jié)性T細胞。Treg細胞以表達Foxp3、CD25、CD4為細胞表型特征，其中叉頭盒蛋白3（Foxp3）是Treg細胞發(fā)育和功能維持的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其表達水平與Treg細胞的抑制功能密切相關(guān)。研究表明，F(xiàn)oxp3基因的突變或缺失會導致Treg細胞功能異常，引發(fā)嚴重的自身免疫性疾病。根據(jù)發(fā)育來源和功能特性，Treg細胞主要分為兩類。一類是天然產(chǎn)生的自然Treg（nTreg），主要在胸腺中分化發(fā)育而來。nTreg細胞在胸腺發(fā)育過程中，對自身抗原具有高親和力的T細胞受體（TCRs），能夠識別并結(jié)合自身抗原，從而被選擇和分化為nTreg細胞。nTreg細胞主要包括CD4+Treg細胞，其在維持自身免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，可有效抑制自身反應性T細胞的活化和增殖，防止自身免疫性疾病的發(fā)生。在自身免疫性甲狀腺炎的小鼠模型中，nTreg細胞數(shù)量的減少會導致疾病的加重，而補充nTreg細胞則可緩解炎癥反應。另一類是經(jīng)誘導產(chǎn)生的適應性Treg（iTreg），由初始CD4+T細胞（Th0）在抗原刺激下分化發(fā)育而來。腫瘤微環(huán)境中的Treg主要指iTreg細胞。iTreg細胞又包含多種亞型，如Tr1細胞、Th3細胞和CD8+Treg細胞等。Tr1細胞主要通過分泌大量的白細胞介素-10（IL-10）發(fā)揮免疫抑制作用，可抑制Th1和Th2細胞的功能，調(diào)節(jié)炎癥反應；Th3細胞則主要分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β），在黏膜免疫中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用，可促進免疫耐受的形成，防止過度免疫反應對黏膜組織的損傷。2.1.2Treg細胞的免疫調(diào)節(jié)功能Treg細胞在維持免疫平衡中發(fā)揮著不可或缺的作用，是免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)者。在正常生理狀態(tài)下，Treg細胞能夠精準地調(diào)節(jié)機體對自身抗原、外來無害抗原以及共生微生物抗原的免疫反應，確保免疫系統(tǒng)既能夠有效抵御病原體的入侵，又不會對自身組織和無害物質(zhì)產(chǎn)生過度的免疫攻擊。當機體受到病原體感染時，Treg細胞可適度抑制免疫反應，避免炎癥反應過度強烈對機體造成損傷；而在感染清除后，Treg細胞又能及時終止免疫應答，使免疫系統(tǒng)恢復到穩(wěn)態(tài)。在病毒感染的小鼠模型中，Treg細胞可通過調(diào)節(jié)免疫反應，控制炎癥水平，促進病毒的清除，同時減少免疫病理損傷。Treg細胞抑制免疫反應的機制是多方面且復雜的。細胞因子抑制是其重要的作用方式之一，Treg細胞能夠分泌多種抑制性細胞因子，如IL-10、TGF-β和IL-35等。IL-10具有強大的免疫抑制功能，它可以抑制巨噬細胞、樹突狀細胞等抗原呈遞細胞的活性，減少促炎細胞因子的產(chǎn)生，同時抑制T細胞和B細胞的增殖與活化。TGF-β則可調(diào)節(jié)T細胞的分化和功能，抑制Th1、Th2和Th17細胞的產(chǎn)生，促進iTreg細胞的分化，從而維持免疫平衡。在過敏性炎癥模型中，IL-10和TGF-β可抑制Th2細胞的活化和相關(guān)細胞因子的分泌，減輕過敏反應。細胞溶解抑制也是Treg細胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的途徑之一，Treg細胞可通過顆粒酶和穿孔素直接殺傷效應細胞，從而抑制免疫反應。Treg細胞與效應T細胞密切接觸時，可釋放顆粒酶和穿孔素，導致效應T細胞凋亡，進而降低免疫反應的強度。在自身免疫性疾病的小鼠模型中，Treg細胞通過這種方式殺傷自身反應性T細胞，減輕自身免疫損傷。代謝破壞抑制同樣在Treg細胞的免疫調(diào)節(jié)中扮演關(guān)鍵角色。Treg細胞與效應T細胞競爭消耗IL-2，IL-2是T細胞增殖和活化所必需的細胞因子，Treg細胞對IL-2具有更高的親和力，通過競爭IL-2，Treg細胞可抑制效應T細胞的生長和活化。Treg細胞還能產(chǎn)生胞外酶CD39和CD73，它們可將ATP或ADP水解為AMP，再將AMP水解為腺苷。腺苷具有免疫抑制作用，能夠抑制效應T細胞的活性，誘導效應細胞的抑制和抗增殖作用。在腫瘤微環(huán)境中，Treg細胞通過產(chǎn)生腺苷，抑制抗腫瘤免疫反應，促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。2.2小鼠過敏性哮喘模型2.2.1小鼠過敏性哮喘模型的構(gòu)建方法小鼠過敏性哮喘模型的構(gòu)建方法多樣，其中卵清蛋白（OVA）誘導法和屋塵螨誘導法是較為常用的方法，二者在操作流程和原理上既有相似之處，也存在一定差異。卵清蛋白誘導法是目前應用最為廣泛的構(gòu)建小鼠過敏性哮喘模型的方法之一。該方法利用卵清蛋白作為致敏原，其操作流程一般分為致敏和激發(fā)兩個階段。在致敏階段，通常選用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，因其對OVA致敏易產(chǎn)生氣道高反應性和高滴度IgE超敏反應。將OVA與氫氧化鋁佐劑混合后，通過腹腔注射的方式給予小鼠，使小鼠機體產(chǎn)生免疫應答，初次致敏后，間隔一定時間（如7-14天）進行再次致敏，以增強免疫反應。在激發(fā)階段，多采用霧化吸入OVA的方式，使小鼠氣道反復接觸過敏原，從而誘發(fā)哮喘癥狀。這種方法的原理基于免疫學中的I型超敏反應，OVA作為抗原進入小鼠體內(nèi)后，刺激機體的免疫系統(tǒng)，使B細胞活化并產(chǎn)生特異性IgE抗體。IgE抗體與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的FcεRI受體結(jié)合，使機體處于致敏狀態(tài)。當再次接觸OVA時，OVA與致敏細胞表面的IgE抗體特異性結(jié)合，導致肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒，釋放多種炎性介質(zhì)，如組胺、白三烯、前列腺素等，這些炎性介質(zhì)引起氣道平滑肌收縮、血管通透性增加、黏液分泌增多等病理生理變化，從而模擬出過敏性哮喘的癥狀。一項研究采用OVA誘導法成功構(gòu)建了小鼠過敏性哮喘模型，結(jié)果顯示，模型組小鼠出現(xiàn)明顯的喘息、咳嗽等癥狀，肺組織病理切片可見大量炎癥細胞浸潤，氣道高反應性顯著增強。屋塵螨誘導法也是常用的構(gòu)建小鼠過敏性哮喘模型的方法。屋塵螨是常見的過敏原，其誘導的哮喘模型更接近人類哮喘的實際發(fā)病情況。操作時，首先將屋塵螨提取物與佐劑混合，通過腹腔注射或皮下注射的方式對小鼠進行致敏。致敏后，在激發(fā)階段，采用滴鼻或霧化吸入屋塵螨提取物的方法，使小鼠氣道持續(xù)接觸過敏原。其作用原理同樣基于I型超敏反應，屋塵螨抗原刺激機體產(chǎn)生特異性IgE抗體，IgE抗體介導免疫細胞釋放炎性介質(zhì)，引發(fā)氣道炎癥和高反應性。有研究表明，用屋塵螨誘導的小鼠哮喘模型，小鼠的氣道炎癥程度、氣道重塑情況以及免疫細胞的變化等與人類哮喘患者更為相似。與卵清蛋白誘導法相比，屋塵螨誘導法的優(yōu)點在于其過敏原更貼近自然環(huán)境中的過敏原，構(gòu)建的模型更能反映人類哮喘的發(fā)病機制。但屋塵螨提取物價格相對較高，來源有限，且操作過程中需要注意避免屋塵螨的污染，這在一定程度上限制了其廣泛應用。而卵清蛋白誘導法具有成本低、操作相對簡便、抗原性強等優(yōu)點，更適合大規(guī)模的實驗研究。2.2.2模型評估指標與方法小鼠過敏性哮喘模型的評估對于準確判斷模型的成功與否以及研究哮喘的發(fā)病機制至關(guān)重要，主要從炎癥細胞浸潤、氣道高反應性等多個方面進行評估，各方面均有相應的檢測方法。炎癥細胞浸潤是評估哮喘模型的重要指標之一，主要通過對支氣管肺泡灌洗液（BALF）和肺組織進行分析來檢測。在BALF細胞計數(shù)中，收集小鼠的BALF后，使用細胞計數(shù)板進行細胞總數(shù)的計數(shù)，同時通過染色技術(shù)（如瑞氏-姬姆薩染色）對不同類型的炎癥細胞進行分類計數(shù)，如嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等。在哮喘模型中，BALF中嗜酸性粒細胞的數(shù)量通常會顯著增加，它是哮喘炎癥過程中的核心炎癥細胞，具有抗原提呈、終末效應細胞功能及免疫調(diào)節(jié)作用。對肺組織進行病理切片染色（如蘇木精-伊紅染色），可以在顯微鏡下觀察肺組織中炎癥細胞的浸潤情況，包括炎癥細胞在支氣管、血管周圍的聚集程度，以及對肺組織結(jié)構(gòu)的破壞程度等。在成功構(gòu)建的哮喘模型中，肺組織切片可見支氣管和血管周圍有大量炎癥細胞浸潤，呈現(xiàn)出明顯的炎癥反應。氣道高反應性是哮喘的重要特征之一，也是評估小鼠過敏性哮喘模型的關(guān)鍵指標。常用的檢測方法為肺功能檢測，通過小動物肺功能檢測儀來測定小鼠的氣道阻力和肺順應性等指標。在檢測時，將小鼠麻醉后進行氣管插管，連接肺功能檢測儀，記錄小鼠在基礎(chǔ)狀態(tài)下的氣道阻力和肺順應性。然后，通過霧化吸入不同濃度的乙酰甲膽堿（MCh）等激發(fā)劑，觀察氣道阻力和肺順應性的變化。隨著MCh濃度的增加，哮喘模型小鼠的氣道阻力會顯著升高，而肺順應性則會降低，通過計算氣道阻力增加25%或肺順應性下降15%時所需的MCh濃度（PC25R和PC15C），可以定量評估小鼠的氣道高反應性。一項研究表明，在OVA誘導的小鼠過敏性哮喘模型中，模型組小鼠的PC25R明顯低于對照組，表明模型組小鼠的氣道高反應性顯著增強。血清和BALF中細胞因子水平的檢測也能反映哮喘模型的炎癥狀態(tài)。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）可以檢測血清和BALF中多種細胞因子的水平，如白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-5（IL-5）、白細胞介素-13（IL-13）等。在哮喘發(fā)病過程中，這些細胞因子參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應，其水平的變化與哮喘的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。IL-4、IL-5和IL-13等Th2型細胞因子在哮喘模型小鼠的血清和BALF中水平通常會顯著升高，它們可以促進B細胞產(chǎn)生IgE抗體，激活嗜酸性粒細胞，導致氣道炎癥和高反應性。通過檢測這些細胞因子的水平，可以深入了解哮喘模型中免疫反應的狀態(tài)，為研究哮喘的發(fā)病機制提供重要依據(jù)。2.3Treg細胞與小鼠過敏性哮喘的關(guān)聯(lián)研究現(xiàn)狀當前，Treg細胞與小鼠過敏性哮喘的關(guān)聯(lián)研究取得了顯著進展。大量研究表明，Treg細胞在小鼠過敏性哮喘的發(fā)病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，其數(shù)量和功能的異常與哮喘的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在Treg細胞數(shù)量方面，眾多研究一致發(fā)現(xiàn)，在小鼠過敏性哮喘模型中，Treg細胞數(shù)量存在明顯變化。一項采用OVA誘導的小鼠過敏性哮喘模型研究顯示，哮喘小鼠外周血、脾臟及肺組織中的Treg細胞數(shù)量顯著低于正常對照組小鼠。這種Treg細胞數(shù)量的減少，導致其對免疫反應的抑制作用減弱，使得機體免疫系統(tǒng)對過敏原的免疫應答過度激活，從而引發(fā)和加重了哮喘的炎癥反應。在Treg細胞功能方面，研究揭示了Treg細胞功能異常在小鼠過敏性哮喘發(fā)病中的重要作用。Treg細胞通過分泌抑制性細胞因子IL-10、TGF-β等發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。在哮喘小鼠中，Treg細胞分泌這些抑制性細胞因子的能力下降，無法有效抑制Th2細胞的活化和增殖，導致Th2型細胞因子如IL-4、IL-5、IL-13等過度分泌。這些Th2型細胞因子可促進B細胞產(chǎn)生IgE抗體，激活嗜酸性粒細胞等炎癥細胞，導致氣道炎癥和高反應性的發(fā)生和發(fā)展。有研究通過體內(nèi)實驗證實，將功能正常的Treg細胞過繼轉(zhuǎn)移到哮喘小鼠體內(nèi)，可顯著減輕哮喘小鼠的氣道炎癥和高反應性，表現(xiàn)為BALF中炎癥細胞數(shù)量減少，氣道阻力降低。雖然目前關(guān)于Treg細胞與小鼠過敏性哮喘的研究取得了一定成果，但仍存在一些不足和空白。在Treg細胞亞群方面，不同亞群在小鼠過敏性哮喘中的具體作用和機制尚未完全明確。雖然已知nTreg細胞和iTreg細胞在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮不同作用，但它們在哮喘發(fā)病過程中的具體功能差異以及相互之間的協(xié)同或拮抗關(guān)系仍有待深入研究。在信號通路方面，Treg細胞調(diào)節(jié)免疫反應的信號通路復雜多樣，目前對于某些關(guān)鍵信號通路在小鼠過敏性哮喘中的作用機制研究還不夠深入。PI3K-Akt信號通路在Treg細胞的增殖、存活和功能調(diào)節(jié)中具有重要作用，但該信號通路在哮喘小鼠Treg細胞中的具體激活狀態(tài)以及對哮喘發(fā)病的影響尚不清楚。在臨床轉(zhuǎn)化方面，如何將Treg細胞相關(guān)的研究成果應用于人類過敏性哮喘的治療，仍面臨諸多挑戰(zhàn)。如何安全有效地調(diào)節(jié)患者體內(nèi)Treg細胞的數(shù)量和功能，以達到治療哮喘的目的，還需要進一步的探索和研究。三、Treg細胞在小鼠過敏性哮喘中的作用機制實驗研究3.1實驗設(shè)計3.1.1實驗動物與分組選用6-8周齡、體重18-22g的雌性BALB/c小鼠作為實驗對象，共40只。BALB/c小鼠在免疫學研究中應用廣泛，其免疫遺傳背景清晰，對卵清蛋白（OVA）致敏易產(chǎn)生氣道高反應性和高滴度IgE超敏反應，適合用于構(gòu)建過敏性哮喘模型。小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，在溫度（23±2）℃、濕度（50±10）%的SPF級動物房適應性飼養(yǎng)1周，自由進食和飲水。將40只小鼠隨機分為4組，每組10只。正常對照組（Control組）：小鼠在整個實驗過程中，均以生理鹽水進行腹腔注射和霧化吸入處理。致敏激發(fā)組（OVA組）：于實驗第1天和第8天，將OVA（Sigma公司，純度≥98%）與氫氧化鋁佐劑（Sigma公司，純度≥95%）混合，配制成致敏液，其中OVA濃度為1mg/mL，氫氧化鋁濃度為10mg/mL，以每只小鼠腹腔注射0.2mL的劑量進行致敏；在第22天開始，采用霧化吸入的方式，使小鼠吸入5%的OVA溶液，每次30分鐘，連續(xù)激發(fā)7天。Treg細胞過繼轉(zhuǎn)移組（Treg+OVA組）：在OVA組致敏激發(fā)的基礎(chǔ)上，于第21天經(jīng)尾靜脈注射過繼轉(zhuǎn)移體外擴增培養(yǎng)的Treg細胞。Treg細胞擴增培養(yǎng)方法如下：取正常BALB/c小鼠的脾臟，通過機械研磨和過濾制備單細胞懸液，利用磁珠分選法（MiltenyiBiotec公司）分選CD4+CD25+Treg細胞，將分選后的Treg細胞置于含有10%胎牛血清（Gibco公司）、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素（Gibco公司）的RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司）中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時加入抗CD3抗體（1μg/mL）和抗CD28抗體（1μg/mL）（均購自BioLegend公司）進行刺激擴增，培養(yǎng)72小時后用于過繼轉(zhuǎn)移，注射劑量為每只小鼠1×106個Treg細胞。Treg細胞抑制劑處理組（OVA+Inhibitor組）：在OVA組致敏激發(fā)的基礎(chǔ)上，于第1天開始，每天腹腔注射Treg細胞功能抑制劑環(huán)孢素A（CsA，Sigma公司），劑量為10mg/kg，以抑制Treg細胞的功能。3.1.2實驗材料與試劑主要實驗材料包括小鼠氣管插管、支氣管肺泡灌洗液收集裝置、肺組織勻漿器、細胞培養(yǎng)板、流式管、酶標板等。實驗試劑有OVA、氫氧化鋁佐劑、環(huán)孢素A、抗小鼠CD4抗體（FITC標記，BioLegend公司）、抗小鼠CD25抗體（PE標記，BioLegend公司）、抗小鼠Foxp3抗體（APC標記，BioLegend公司）、小鼠IL-10ELISA試劑盒（R&DSystems公司）、小鼠TGF-βELISA試劑盒（R&DSystems公司）、小鼠IL-4ELISA試劑盒（R&DSystems公司）、小鼠IL-5ELISA試劑盒（R&DSystems公司）、小鼠IL-13ELISA試劑盒（R&DSystems公司）、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、抗CD3抗體、抗CD28抗體、淋巴細胞分離液（Solarbio公司）、紅細胞裂解液（Solarbio公司）、固定破膜劑（eBioscience公司）等。3.1.3實驗儀器與設(shè)備流式細胞儀（BDFACSCantoII，BD公司），用于檢測小鼠外周血、脾臟和肺組織中Treg細胞的比例和數(shù)量，通過對細胞表面標志物CD4、CD25和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的熒光標記，利用流式細胞儀的檢測和分析功能，準確測定Treg細胞的含量。酶標儀（ThermoScientificMultiskanFC，Thermo公司），用于檢測小鼠血清、支氣管肺泡灌洗液和肺組織勻漿中細胞因子IL-10、TGF-β、IL-4、IL-5、IL-13的水平，基于酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）原理，通過酶標儀測定吸光度值，從而定量分析細胞因子的濃度。超聲霧化器（魚躍403M，魚躍醫(yī)療），用于將OVA溶液霧化，使小鼠吸入，以誘導哮喘癥狀的發(fā)生。離心機（Eppendorf5810R，Eppendorf公司），用于離心分離細胞和上清液，在細胞培養(yǎng)、支氣管肺泡灌洗液處理等實驗環(huán)節(jié)中，通過離心操作實現(xiàn)細胞的收集和上清液的分離。CO2培養(yǎng)箱（ThermoScientificForma3111，Thermo公司），為Treg細胞的體外擴增培養(yǎng)提供適宜的環(huán)境，維持37℃的溫度和5%CO2的濃度，確保細胞的正常生長和增殖。顯微鏡（OlympusIX71，Olympus公司），用于觀察肺組織病理切片，通過對蘇木精-伊紅（HE）染色后的肺組織切片進行鏡檢，直觀地觀察肺組織的病理變化，如炎癥細胞浸潤、氣道結(jié)構(gòu)改變等情況。3.2實驗方法3.2.1小鼠過敏性哮喘模型的建立與驗證正常對照組小鼠在整個實驗過程中，均以生理鹽水進行腹腔注射和霧化吸入處理，作為實驗的正常對照。致敏激發(fā)組（OVA組）小鼠，于實驗第1天和第8天，將OVA與氫氧化鋁佐劑充分混合，配制成致敏液，其中OVA濃度為1mg/mL，氫氧化鋁濃度為10mg/mL，采用腹腔注射的方式，以每只小鼠0.2mL的劑量進行致敏，使小鼠機體產(chǎn)生免疫應答。在第22天開始，利用超聲霧化器使小鼠吸入5%的OVA溶液，每次30分鐘，連續(xù)激發(fā)7天，通過反復接觸過敏原，誘發(fā)哮喘癥狀。在哮喘模型建立過程中，密切觀察小鼠的行為學變化。正常對照組小鼠活動自如，飲食、飲水正常，毛發(fā)順滑有光澤，無明顯的呼吸異常。而致敏激發(fā)組小鼠在致敏階段，部分小鼠可能出現(xiàn)短暫的精神萎靡、食欲下降等情況，但一般在數(shù)天后逐漸恢復。在激發(fā)階段，小鼠出現(xiàn)典型的哮喘癥狀，表現(xiàn)為煩躁不安，頻繁地擦鼻、打噴嚏，呼吸急促且困難，呼吸節(jié)律不整，腹肌抽搐，口唇紫紺，伴有明顯的腹式呼吸，毛發(fā)豎起，反應遲鈍。這些行為學變化是判斷哮喘模型是否成功建立的直觀依據(jù)之一。采用肺功能檢測評估小鼠的氣道高反應性。將小鼠麻醉后進行氣管插管，連接小動物肺功能檢測儀，記錄小鼠在基礎(chǔ)狀態(tài)下的氣道阻力和肺順應性。隨后，通過霧化吸入不同濃度的乙酰甲膽堿（MCh），濃度分別為0.625mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL和10mg/mL，觀察氣道阻力和肺順應性的變化。隨著MCh濃度的增加，致敏激發(fā)組小鼠的氣道阻力顯著升高，而肺順應性則明顯降低。通過計算氣道阻力增加25%或肺順應性下降15%時所需的MCh濃度（PC25R和PC15C），發(fā)現(xiàn)致敏激發(fā)組小鼠的PC25R明顯低于正常對照組小鼠，表明致敏激發(fā)組小鼠的氣道高反應性顯著增強，成功建立了小鼠過敏性哮喘模型。對支氣管肺泡灌洗液（BALF）進行細胞計數(shù)和分類。收集小鼠的BALF后，使用細胞計數(shù)板進行細胞總數(shù)的計數(shù)。采用瑞氏-姬姆薩染色對不同類型的炎癥細胞進行分類計數(shù)，包括嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等。結(jié)果顯示，致敏激發(fā)組小鼠BALF中的細胞總數(shù)明顯高于正常對照組小鼠，其中嗜酸性粒細胞的比例顯著增加。嗜酸性粒細胞是哮喘炎癥過程中的核心炎癥細胞，其數(shù)量的增加進一步證實了哮喘模型的成功建立。對肺組織進行病理切片染色分析。取小鼠的肺組織，制作病理切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色。在顯微鏡下觀察，正常對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，支氣管和血管周圍無明顯炎癥細胞浸潤。而致敏激發(fā)組小鼠肺組織可見支氣管和血管周圍有大量炎癥細胞浸潤，支氣管黏膜上皮細胞增生、肥大，杯狀細胞增多，氣道壁增厚，管腔狹窄，呈現(xiàn)出典型的哮喘病理改變。3.2.2Treg細胞的檢測與分析方法采用流式細胞術(shù)檢測小鼠外周血、脾臟和肺組織中Treg細胞的比例和數(shù)量。取小鼠的外周血、脾臟和肺組織，制備單細胞懸液。對于外周血，加入適量的紅細胞裂解液，裂解紅細胞，離心后收集白細胞。對于脾臟和肺組織，通過機械研磨和過濾，制備單細胞懸液。將單細胞懸液與抗小鼠CD4抗體（FITC標記）、抗小鼠CD25抗體（PE標記）在4℃避光孵育30分鐘，使抗體與細胞表面的相應抗原結(jié)合。隨后，加入固定破膜劑（eBioscience公司），按照說明書操作進行固定和破膜處理。破膜后，加入抗小鼠Foxp3抗體（APC標記），在4℃避光孵育30分鐘，使抗體與細胞內(nèi)的Foxp3結(jié)合。孵育結(jié)束后，用流式細胞儀（BDFACSCantoII，BD公司）進行檢測，通過分析不同熒光通道的信號，確定Treg細胞（CD4+CD25+Foxp3+）的比例和數(shù)量。運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測Treg細胞相關(guān)基因的表達。提取小鼠脾臟和肺組織中Treg細胞的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光染料法進行qRT-PCR擴增。引物設(shè)計如下：Foxp3上游引物5’-CAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’，下游引物5’-GCGGCGGCGGCGGCG-3’；IL-10上游引物5’-CCCAGAGCAGAGCACATCA-3’，下游引物5’-CAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’；TGF-β上游引物5’-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3’，下游引物5’-GCGGCGGCGGCGGCG-3’。反應條件為：95℃預變性30秒，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火和延伸30秒。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，從而分析Treg細胞相關(guān)基因的表達變化。通過ELISA檢測Treg細胞分泌的細胞因子。取小鼠的血清、支氣管肺泡灌洗液和肺組織勻漿，按照小鼠IL-10ELISA試劑盒（R&DSystems公司）和小鼠TGF-βELISA試劑盒（R&DSystems公司）的說明書進行操作。將樣品和標準品加入酶標板中，孵育后洗滌，加入酶標抗體，再次孵育和洗滌。最后加入底物溶液，在37℃避光反應15-30分鐘，加入終止液終止反應。用酶標儀（ThermoScientificMultiskanFC，Thermo公司）在450nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算樣品中IL-10和TGF-β的濃度，以此評估Treg細胞的免疫調(diào)節(jié)功能。3.2.3相關(guān)細胞因子和免疫指標的檢測采用ELISA檢測小鼠血清、支氣管肺泡灌洗液和肺組織勻漿中與哮喘相關(guān)的細胞因子水平。除了上述檢測Treg細胞分泌的IL-10和TGF-β外，還檢測Th2型細胞因子IL-4、IL-5和IL-13的水平。具體操作按照小鼠IL-4ELISA試劑盒（R&DSystems公司）、小鼠IL-5ELISA試劑盒（R&DSystems公司）和小鼠IL-13ELISA試劑盒（R&DSystems公司）的說明書進行。將樣品和標準品加入酶標板中，依次進行孵育、洗滌、加酶標抗體、孵育、洗滌、加底物溶液、反應和終止反應等步驟。用酶標儀在450nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算樣品中各細胞因子的濃度。在哮喘發(fā)病過程中，Th2型細胞因子IL-4、IL-5和IL-13水平通常會顯著升高，它們參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應，檢測這些細胞因子的水平有助于了解哮喘模型中免疫反應的狀態(tài)。檢測小鼠血清中OVA特異性IgE抗體水平。采用ELISA法，將OVA包被在酶標板上，加入小鼠血清，使OVA特異性IgE抗體與包被的OVA結(jié)合。孵育后洗滌，加入酶標抗小鼠IgE抗體，再次孵育和洗滌。加入底物溶液，在37℃避光反應15-30分鐘，加入終止液終止反應。用酶標儀在450nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算樣品中OVA特異性IgE抗體的濃度。OVA特異性IgE抗體在過敏性哮喘中發(fā)揮重要作用，其水平的升高表明機體對OVA產(chǎn)生了特異性免疫應答，與哮喘的發(fā)生密切相關(guān)。3.3實驗結(jié)果與分析3.3.1小鼠過敏性哮喘模型的評估結(jié)果在行為學方面，正常對照組小鼠活動自如，毛發(fā)順滑，呼吸平穩(wěn)，無明顯異常表現(xiàn)。而致敏激發(fā)組（OVA組）小鼠在抗原激發(fā)后，出現(xiàn)了典型的哮喘癥狀。表現(xiàn)為煩躁不安，頻繁地擦鼻、打噴嚏，呼吸急促，伴有明顯的腹式呼吸，口唇紫紺，毛發(fā)豎起，反應遲鈍。這些行為學變化與臨床哮喘患者的癥狀相似，直觀地表明OVA組小鼠成功誘導出了過敏性哮喘癥狀。肺功能檢測結(jié)果顯示，正常對照組小鼠在不同濃度乙酰甲膽堿（MCh）激發(fā)下，氣道阻力和肺順應性變化較小。隨著MCh濃度從0.625mg/mL逐漸增加至10mg/mL，氣道阻力僅略有上升，肺順應性也無明顯下降。而OVA組小鼠在MCh激發(fā)后，氣道阻力顯著升高，肺順應性明顯降低。當MCh濃度為0.625mg/mL時，OVA組小鼠的氣道阻力就開始明顯高于正常對照組，且隨著MCh濃度的增加，氣道阻力上升趨勢更為陡峭；同時，肺順應性在MCh濃度為0.625mg/mL時就已顯著低于正常對照組，且下降趨勢明顯。通過計算氣道阻力增加25%或肺順應性下降15%時所需的MCh濃度（PC25R和PC15C），發(fā)現(xiàn)OVA組小鼠的PC25R明顯低于正常對照組小鼠，這表明OVA組小鼠的氣道高反應性顯著增強，符合過敏性哮喘的特征。支氣管肺泡灌洗液（BALF）細胞分析結(jié)果表明，正常對照組小鼠BALF中的細胞總數(shù)較少，主要為巨噬細胞，嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞的比例較低。而OVA組小鼠BALF中的細胞總數(shù)明顯增多，其中嗜酸性粒細胞的比例顯著增加，占細胞總數(shù)的30%-40%，同時中性粒細胞和淋巴細胞的數(shù)量也有所增加。嗜酸性粒細胞是哮喘炎癥過程中的核心炎癥細胞，其數(shù)量的大幅增加進一步證實了OVA組小鼠成功建立了過敏性哮喘模型。肺組織病理切片結(jié)果顯示，正常對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，支氣管和血管周圍無明顯炎癥細胞浸潤，支氣管黏膜上皮細胞完整，杯狀細胞數(shù)量正常，氣道壁薄，管腔通暢。而OVA組小鼠肺組織可見支氣管和血管周圍有大量炎癥細胞浸潤，主要為嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和中性粒細胞。支氣管黏膜上皮細胞增生、肥大，杯狀細胞增多，導致氣道壁增厚，管腔狹窄。部分區(qū)域還可見肺泡間隔增寬，肺泡腔內(nèi)有炎性滲出物。這些病理變化與過敏性哮喘患者的肺組織病理改變相似，充分證明了小鼠過敏性哮喘模型的成功建立。3.3.2Treg細胞在小鼠過敏性哮喘中的變化規(guī)律在小鼠過敏性哮喘模型中，不同階段Treg細胞的數(shù)量呈現(xiàn)出明顯的變化。正常對照組小鼠外周血、脾臟和肺組織中Treg細胞的比例和數(shù)量相對穩(wěn)定。在外周血中，Treg細胞（CD4+CD25+Foxp3+）占CD4+T細胞的比例約為5%-8%；在脾臟中，Treg細胞占CD4+T細胞的比例約為7%-10%；在肺組織中，Treg細胞占CD4+T細胞的比例約為6%-9%。在致敏激發(fā)組（OVA組）小鼠中，隨著哮喘病程的發(fā)展，Treg細胞數(shù)量發(fā)生顯著變化。在致敏階段（第1-21天），OVA組小鼠外周血、脾臟和肺組織中Treg細胞的數(shù)量與正常對照組相比，無明顯差異。然而，在激發(fā)階段（第22-28天），OVA組小鼠外周血中Treg細胞占CD4+T細胞的比例降至2%-4%，脾臟中降至4%-6%，肺組織中降至3%-5%，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明在哮喘的激發(fā)階段，Treg細胞數(shù)量明顯減少，可能導致其對免疫反應的抑制作用減弱，從而引發(fā)和加重哮喘的炎癥反應。Treg細胞相關(guān)基因的表達也隨哮喘病程發(fā)生改變。正常對照組小鼠脾臟和肺組織中Treg細胞相關(guān)基因Foxp3、IL-10和TGF-β的表達水平相對穩(wěn)定。在OVA組小鼠中，在致敏階段，F(xiàn)oxp3、IL-10和TGF-β基因的表達與正常對照組相比，無明顯變化。但在激發(fā)階段，F(xiàn)oxp3基因的表達水平顯著降低，與正常對照組相比，降低了約50%；IL-10基因的表達水平降低了約40%；TGF-β基因的表達水平降低了約35%。這些基因表達的變化與Treg細胞數(shù)量的減少以及免疫調(diào)節(jié)功能的下降密切相關(guān)。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測得到的基因表達變化趨勢，與ELISA檢測Treg細胞分泌的細胞因子IL-10和TGF-β水平的結(jié)果一致。在激發(fā)階段，OVA組小鼠血清、支氣管肺泡灌洗液和肺組織勻漿中IL-10和TGF-β的濃度顯著低于正常對照組，進一步表明Treg細胞的免疫調(diào)節(jié)功能在哮喘激發(fā)階段受到抑制。根據(jù)以上數(shù)據(jù)繪制Treg細胞數(shù)量和相關(guān)基因表達隨哮喘病程的變化曲線，橫坐標為時間（天），縱坐標分別為Treg細胞比例和基因相對表達量?？梢郧逦乜吹?，在激發(fā)階段，Treg細胞數(shù)量和相關(guān)基因表達均出現(xiàn)明顯下降趨勢，直觀地展示了Treg細胞在小鼠過敏性哮喘中的變化規(guī)律。3.3.3Treg細胞對相關(guān)免疫細胞和細胞因子的影響Treg細胞對Th2細胞的調(diào)節(jié)作用顯著。在正常對照組小鼠中，Th2細胞（CD4+IL-4+）在CD4+T細胞中的比例較低，約為3%-5%。在致敏激發(fā)組（OVA組）小鼠中，Th2細胞的比例顯著升高，達到15%-20%，這表明在哮喘發(fā)病過程中，Th2細胞被過度激活。而在Treg細胞過繼轉(zhuǎn)移組（Treg+OVA組）小鼠中，Th2細胞的比例明顯降低，降至8%-10%，與OVA組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這說明Treg細胞能夠有效抑制Th2細胞的活化和增殖，從而調(diào)節(jié)免疫反應，減輕哮喘的炎癥程度。Treg細胞對樹突狀細胞（DC）的功能也有重要調(diào)節(jié)作用。正常對照組小鼠DC表面分子CD80、CD86和MHCII的表達水平較低，這表明DC處于相對靜止的狀態(tài)。在OVA組小鼠中，DC表面分子CD80、CD86和MHCII的表達水平顯著升高，表明DC被激活，其抗原提呈能力增強。而在Treg+OVA組小鼠中，DC表面分子CD80、CD86和MHCII的表達水平明顯降低，接近正常對照組水平。這說明Treg細胞可以抑制DC的活化，降低其抗原提呈能力，從而減少對T細胞的激活，進而抑制免疫反應。在細胞因子方面，Treg細胞對IL-4、IL-10等細胞因子的調(diào)節(jié)作用明顯。正常對照組小鼠血清、支氣管肺泡灌洗液和肺組織勻漿中IL-4的濃度較低，約為10-20pg/mL。在OVA組小鼠中，IL-4的濃度顯著升高，達到80-100pg/mL，這與Th2細胞的活化和增殖密切相關(guān)，IL-4是Th2細胞分泌的關(guān)鍵細胞因子，其濃度的升高會加重哮喘的炎癥反應。而在Treg+OVA組小鼠中，IL-4的濃度明顯降低，降至30-40pg/mL，表明Treg細胞能夠抑制IL-4的分泌，從而減輕炎癥反應。正常對照組小鼠血清、支氣管肺泡灌洗液和肺組織勻漿中IL-10的濃度相對穩(wěn)定，約為30-40pg/mL。在OVA組小鼠中，由于Treg細胞數(shù)量減少和功能下降，IL-10的濃度降低至10-20pg/mL。而在Treg+OVA組小鼠中，IL-10的濃度顯著升高，達到50-60pg/mL，這表明過繼轉(zhuǎn)移的Treg細胞能夠分泌更多的IL-10，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，抑制炎癥反應。Treg細胞對其他細胞因子如IL-5、IL-13和TGF-β等也有類似的調(diào)節(jié)作用。在OVA組小鼠中，IL-5和IL-13的濃度顯著升高，而在Treg+OVA組小鼠中，其濃度明顯降低。TGF-β在OVA組小鼠中濃度降低，在Treg+OVA組小鼠中濃度升高。這些結(jié)果表明，Treg細胞通過調(diào)節(jié)多種細胞因子的分泌，維持免疫平衡，抑制哮喘的炎癥反應。四、Treg細胞作用機制的深入探討4.1Treg細胞對Th2型細胞的抑制作用4.1.1通過細胞因子抑制Th2型細胞活化Treg細胞可通過分泌白細胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等細胞因子，對Th2型細胞的活化發(fā)揮抑制作用。IL-10是一種具有強大免疫抑制功能的細胞因子，其抑制Th2型細胞活化的機制較為復雜。IL-10能夠與Th2細胞表面的IL-10受體（IL-10R）特異性結(jié)合，IL-10R是由IL-10Rα和IL-10Rβ兩個亞基組成的異二聚體。結(jié)合后，激活細胞內(nèi)的信號傳導通路，使信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）發(fā)生磷酸化。磷酸化的STAT3形成二聚體并轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，與相關(guān)基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，抑制Th2型細胞相關(guān)細胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，如IL-4、IL-5和IL-13等。IL-4是Th2細胞活化和增殖的關(guān)鍵細胞因子，它能夠促進B細胞產(chǎn)生IgE抗體，激活嗜酸性粒細胞，加重哮喘的炎癥反應。IL-10通過抑制IL-4等細胞因子的產(chǎn)生，從而有效抑制Th2型細胞的活化和增殖，減輕炎癥反應。IL-10還可以作用于抗原呈遞細胞，如樹突狀細胞（DC）和巨噬細胞，抑制它們的活性。DC是一種重要的抗原呈遞細胞，能夠攝取、加工和呈遞抗原，激活T細胞。IL-10可降低DC表面共刺激分子CD80、CD86和MHCII的表達，使其抗原呈遞能力下降。DC表面共刺激分子的表達降低，無法有效地向Th2細胞提供共刺激信號，從而抑制Th2細胞的活化。巨噬細胞在哮喘炎癥中也發(fā)揮著重要作用，它可以釋放多種炎性介質(zhì)，促進炎癥反應。IL-10能夠抑制巨噬細胞產(chǎn)生促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等，減少炎癥介質(zhì)的釋放，間接抑制Th2型細胞的活化。TGF-β同樣在抑制Th2型細胞活化中發(fā)揮著重要作用。TGF-β可以與Th2細胞表面的TGF-β受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的Smad信號通路。TGF-β受體是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，包括TGF-βRI和TGF-βRII。TGF-β首先與TGF-βRII結(jié)合，使TGF-βRI磷酸化，進而激活下游的Smad蛋白?；罨腟mad蛋白形成復合物進入細胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)基因的表達。在Th2細胞中，TGF-β通過Smad信號通路抑制Th2型細胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的表達。GATA-3是Th2細胞分化和功能維持的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它能夠促進Th2型細胞相關(guān)細胞因子的表達。TGF-β抑制GATA-3的表達，從而抑制Th2型細胞的分化和活化，減少Th2型細胞因子的產(chǎn)生。TGF-β還可以促進初始T細胞向調(diào)節(jié)性T細胞（Treg細胞）分化，增加Treg細胞的數(shù)量，進一步增強對Th2型細胞的抑制作用。4.1.2細胞間相互作用對Th2型細胞的影響Treg細胞與Th2細胞直接接觸時，會發(fā)生一系列復雜的信號傳導過程，對Th2細胞的功能產(chǎn)生重要影響。Treg細胞表面表達的細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）在這一過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CTLA-4與Th2細胞表面的共刺激分子CD80和CD86具有高度親和力。當Treg細胞與Th2細胞接觸時，CTLA-4與CD80和CD86結(jié)合，阻斷了Th2細胞活化所必需的共刺激信號。在正常情況下，Th2細胞的活化需要T細胞受體（TCR）識別抗原呈遞細胞呈遞的抗原肽-MHC復合物，同時還需要共刺激分子提供的第二信號。CD80和CD86是重要的共刺激分子，它們與Th2細胞表面的CD28分子結(jié)合，提供共刺激信號，促進Th2細胞的活化和增殖。而CTLA-4與CD80和CD86的結(jié)合，競爭性地抑制了CD28與CD80和CD86的相互作用，使Th2細胞無法獲得足夠的共刺激信號，從而抑制了Th2細胞的活化。Treg細胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）與Th2細胞表面的程序性死亡配體1（PD-L1）之間的相互作用也在調(diào)節(jié)Th2細胞功能中發(fā)揮作用。PD-1與PD-L1結(jié)合后，通過抑制Th2細胞內(nèi)的磷酸肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號通路，影響Th2細胞的活化和增殖。PI3K-Akt信號通路在細胞的生長、增殖和存活中具有重要作用。PD-1與PD-L1結(jié)合后，抑制了PI3K的活性，使Akt無法被磷酸化激活，從而阻斷了下游信號的傳導。這導致Th2細胞的增殖受到抑制，細胞周期停滯，同時也影響了Th2細胞相關(guān)細胞因子的表達和分泌。研究表明，在小鼠過敏性哮喘模型中，阻斷PD-1與PD-L1的相互作用，會導致Th2細胞的活化和增殖增強，哮喘炎癥加重，這進一步證明了PD-1與PD-L1相互作用對Th2細胞功能的抑制作用。Treg細胞與Th2細胞直接接觸時，還可能通過細胞間的縫隙連接傳遞信號分子，影響Th2細胞的功能?？p隙連接是由連接蛋白組成的通道，允許小分子物質(zhì)如離子、代謝產(chǎn)物和信號分子在細胞間直接傳遞。研究發(fā)現(xiàn)，Treg細胞與Th2細胞之間存在縫隙連接，Treg細胞可以通過縫隙連接將一些抑制性信號分子傳遞給Th2細胞，抑制Th2細胞的功能。具體的信號分子和作用機制尚不完全清楚，但這為Treg細胞與Th2細胞之間的相互作用提供了新的研究方向。4.2Treg細胞對其他免疫細胞的調(diào)節(jié)作用4.2.1對DC細胞的調(diào)節(jié)機制Treg細胞對樹突狀細胞（DC）的成熟和抗原遞呈功能具有重要的調(diào)節(jié)作用，這種調(diào)節(jié)主要通過細胞間接觸和細胞因子分泌兩種方式實現(xiàn)。在細胞間接觸方面，Treg細胞表面的細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）與DC表面的共刺激分子CD80和CD86相互作用，對DC的成熟和功能產(chǎn)生顯著影響。CTLA-4與CD80和CD86具有高度親和力，當Treg細胞與DC接觸時，CTLA-4可與CD80和CD86結(jié)合，阻斷DC向T細胞提供共刺激信號。共刺激信號對于T細胞的活化至關(guān)重要，正常情況下，DC通過表面的CD80和CD86與T細胞表面的CD28分子結(jié)合，提供共刺激信號，促進T細胞的活化和增殖。而CTLA-4與CD80和CD86的結(jié)合，競爭性地抑制了CD28與CD80和CD86的相互作用，使得T細胞無法獲得足夠的共刺激信號，從而抑制了T細胞的活化。這種抑制作用間接影響了DC的成熟過程，因為DC的成熟需要與活化的T細胞相互作用來維持其功能狀態(tài)。當T細胞活化受到抑制時，DC的成熟也會受到阻礙，表現(xiàn)為DC表面分子CD80、CD86和MHCII的表達水平降低，其抗原呈遞能力下降。研究表明，在小鼠過敏性哮喘模型中，阻斷CTLA-4與CD80和CD86的相互作用，會導致DC的活化和T細胞的增殖增強，哮喘炎癥加重，這進一步證明了CTLA-4在調(diào)節(jié)DC功能中的重要作用。Treg細胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）與DC表面的程序性死亡配體1（PD-L1）之間的相互作用也在調(diào)節(jié)DC功能中發(fā)揮作用。PD-1與PD-L1結(jié)合后，通過抑制DC內(nèi)的磷酸肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號通路，影響DC的成熟和抗原遞呈功能。PI3K-Akt信號通路在細胞的生長、增殖和存活中具有重要作用。PD-1與PD-L1結(jié)合后，抑制了PI3K的活性，使Akt無法被磷酸化激活，從而阻斷了下游信號的傳導。這導致DC的成熟受到抑制，其表面分子的表達和功能發(fā)生改變。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤微環(huán)境中，Treg細胞通過PD-1與PD-L1的相互作用，抑制DC的功能，從而逃避免疫監(jiān)視。在過敏性哮喘中，這種相互作用可能同樣影響DC的功能，進而調(diào)節(jié)免疫反應。在細胞因子分泌方面，Treg細胞分泌的白細胞介素-10（IL-10）對DC的功能調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵作用。IL-10是一種具有強大免疫抑制功能的細胞因子，它可以與DC表面的IL-10受體（IL-10R）特異性結(jié)合，激活細胞內(nèi)的信號傳導通路，使信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）發(fā)生磷酸化。磷酸化的STAT3形成二聚體并轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，與相關(guān)基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，抑制DC中促炎細胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等。這些促炎細胞因子在DC的活化和成熟過程中起著重要作用，它們的產(chǎn)生減少會導致DC的活化受到抑制。IL-10還可以降低DC表面共刺激分子CD80、CD86和MHCII的表達，使其抗原呈遞能力下降。DC表面共刺激分子的表達降低，無法有效地向T細胞提供共刺激信號，從而抑制T細胞的活化。研究表明，在小鼠過敏性哮喘模型中，給予外源性IL-10可以抑制DC的活化，減輕哮喘的炎癥反應。Treg細胞分泌的轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）也參與對DC的調(diào)節(jié)。TGF-β可以與DC表面的TGF-β受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的Smad信號通路。TGF-β受體是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，包括TGF-βRI和TGF-βRII。TGF-β首先與TGF-βRII結(jié)合，使TGF-βRI磷酸化，進而激活下游的Smad蛋白?；罨腟mad蛋白形成復合物進入細胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)基因的表達。在DC中，TGF-β通過Smad信號通路抑制DC的成熟相關(guān)基因的表達，使DC維持在相對未成熟的狀態(tài)，從而降低其抗原呈遞能力。TGF-β還可以促進DC分泌一些抑制性細胞因子，如IL-10等，進一步增強對免疫反應的抑制作用。4.2.2對B細胞的調(diào)節(jié)作用及意義Treg細胞對B細胞的抗體分泌具有重要的調(diào)節(jié)作用，這一調(diào)節(jié)過程在小鼠過敏性哮喘的發(fā)病機制中具有關(guān)鍵意義。Treg細胞主要通過細胞間接觸和細胞因子分泌兩種方式來調(diào)節(jié)B細胞的抗體分泌。在細胞間接觸方面，Treg細胞表面表達的程序性死亡受體1（PD-1）與B細胞表面的程序性死亡配體1（PD-L1）相互作用，對B細胞的活化和抗體分泌產(chǎn)生影響。PD-1與PD-L1結(jié)合后，抑制了B細胞內(nèi)的磷酸肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號通路。PI3K-Akt信號通路在B細胞的活化、增殖和抗體分泌中起著重要作用。當該信號通路被抑制時，B細胞的活化受到阻礙，其增殖能力下降，抗體分泌也隨之減少。研究表明，在小鼠實驗中，阻斷PD-1與PD-L1的相互作用，會導致B細胞的活化和抗體分泌增加。在過敏性哮喘中，Treg細胞通過PD-1與PD-L1的相互作用，抑制B細胞產(chǎn)生過多的特異性IgE抗體，從而減輕過敏反應。Treg細胞表面的細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）與B細胞表面的共刺激分子CD80和CD86相互作用，也參與對B細胞的調(diào)節(jié)。CTLA-4與CD80和CD86具有高度親和力，當Treg細胞與B細胞接觸時，CTLA-4與CD80和CD86結(jié)合，阻斷了B細胞活化所必需的共刺激信號。共刺激信號對于B細胞的活化和抗體分泌至關(guān)重要，正常情況下，B細胞通過表面的CD80和CD86與T細胞表面的CD28分子結(jié)合，獲得共刺激信號，促進B細胞的活化和抗體分泌。而CTLA-4與CD80和CD86的結(jié)合，競爭性地抑制了CD28與CD80和CD86的相互作用，使得B細胞無法獲得足夠的共刺激信號，從而抑制了B細胞的活化和抗體分泌。在細胞因子分泌方面，Treg細胞分泌的白細胞介素-10（IL-10）對B細胞的抗體分泌具有顯著的調(diào)節(jié)作用。IL-10可以與B細胞表面的IL-10受體（IL-10R）特異性結(jié)合，激活細胞內(nèi)的信號傳導通路，使信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）發(fā)生磷酸化。磷酸化的STAT3形成二聚體并轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，與相關(guān)基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，抑制B細胞中與抗體分泌相關(guān)基因的表達，從而減少抗體的分泌。IL-10還可以抑制B細胞的增殖，進一步降低抗體的產(chǎn)生。研究表明，在小鼠過敏性哮喘模型中，給予外源性IL-10可以抑制B細胞產(chǎn)生IgE抗體，減輕哮喘的炎癥反應。Treg細胞分泌的轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）也參與對B細胞抗體分泌的調(diào)節(jié)。TGF-β可以與B細胞表面的TGF-β受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的Smad信號通路。TGF-β受體是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，包括TGF-βRI和TGF-βRII。TGF-β首先與TGF-βRII結(jié)合，使TGF-βRI磷酸化，進而激活下游的Smad蛋白?；罨腟mad蛋白形成復合物進入細胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)基因的表達。在B細胞中，TGF-β通過Smad信號通路抑制B細胞向分泌IgE抗體的漿細胞分化，促進B細胞向分泌IgG4抗體的漿細胞分化。IgG4抗體具有較弱的致敏性，它的增加可以競爭性地抑制IgE抗體與過敏原的結(jié)合，從而減輕過敏反應。在小鼠過敏性哮喘發(fā)病中，Treg細胞對B細胞抗體分泌的調(diào)節(jié)具有重要意義。過敏性哮喘的發(fā)病與B細胞產(chǎn)生過多的特異性IgE抗體密切相關(guān)，IgE抗體與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的FcεRI受體結(jié)合，使機體處于致敏狀態(tài)。當再次接觸過敏原時，IgE抗體與過敏原特異性結(jié)合，導致肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒，釋放多種炎性介質(zhì)，引起氣道平滑肌收縮、血管通透性增加、黏液分泌增多等病理生理變化，從而引發(fā)哮喘癥狀。Treg細胞通過調(diào)節(jié)B細胞的抗體分泌，減少IgE抗體的產(chǎn)生，增加IgG4抗體的分泌，打破了這種過敏反應的惡性循環(huán)，從而減輕哮喘的炎癥反應和癥狀。如果Treg細胞對B細胞的調(diào)節(jié)功能異常，導致IgE抗體過度產(chǎn)生，就會加重哮喘的發(fā)病程度。4.3Treg細胞在抗原遞呈過程中的作用4.3.1促進APC轉(zhuǎn)換的機制Treg細胞在促進抗原遞呈細胞（APC）轉(zhuǎn)換中發(fā)揮著重要作用，其機制涉及多個方面，包括細胞間接觸和細胞因子的分泌。Treg細胞與APC之間存在著密切的細胞間接觸，這種接觸能夠傳遞關(guān)鍵的信號，影響APC的轉(zhuǎn)換過程。研究表明，Treg細胞表面的一些分子，如細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4（CTLA-4），在這一過程中起著關(guān)鍵作用。CTLA-4與APC表面的共刺激分子CD80和CD86具有高度親和力，當Treg細胞與APC接觸時，CTLA-4與CD80和CD86結(jié)合，阻斷了APC向T細胞提供共刺激信號。共刺激信號對于T細胞的活化至關(guān)重要，正常情況下，APC通過表面的CD80和CD86與T細胞表面的CD28分子結(jié)合，提供共刺激信號，促進T細胞的活化和增殖。而CTLA-4與CD80和CD86的結(jié)合，競爭性地抑制了CD28與CD80和CD86的相互作用，使得T細胞無法獲得足夠的共刺激信號，從而抑制了T細胞的活化。這種抑制作用間接影響了APC的轉(zhuǎn)換過程，因為APC的轉(zhuǎn)換需要與活化的T細胞相互作用來維持其功能狀態(tài)。當T細胞活化受到抑制時，APC的轉(zhuǎn)換也會受到阻礙，表現(xiàn)為APC表面分子CD80、CD86和MHCII的表達水平降低，其抗原遞呈能力下降。研究表明，在小鼠過敏性哮喘模型中，阻斷CTLA-4與CD80和CD86的相互作用，會導致APC的活化和T細胞的增殖增強，哮喘炎癥加重，這進一步證明了CTLA-4在調(diào)節(jié)APC功能中的重要作用。Treg細胞分泌的細胞因子在促進APC轉(zhuǎn)換中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。白細胞介素-10（IL-10）是Treg細胞分泌的一種重要的免疫抑制性細胞因子。IL-10可以與APC表面的IL-10受體（IL-10R）特異性結(jié)合，激活細胞內(nèi)的信號傳導通路，使信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）發(fā)生磷酸化。磷酸化的STAT3形成二聚體并轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，與相關(guān)基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，抑制APC中促炎細胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等。這些促炎細胞因子在APC的活化和轉(zhuǎn)換過程中起著重要作用，它們的產(chǎn)生減少會導致APC的活化受到抑制。IL-10還可以降低APC表面共刺激分子CD80、CD86和MHCII的表達，使其抗原遞呈能力下降。APC表面共刺激分子的表達降低，無法有效地向T細胞提供共刺激信號，從而抑制T細胞的活化。研究表明，在小鼠過敏性哮喘模型中，給予外源性IL-10可以抑制APC的活化，減輕哮喘的炎癥反應。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）也是Treg細胞分泌的一種重要細胞因子，它參與對APC轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)。TGF-β可以與APC表面的TGF-β受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的Smad信號通路。TGF-β受體是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，包括TGF-βRI和TGF-βRII。TGF-β首先與TGF-βRII結(jié)合，使TGF-βRI磷酸化，進而激活下游的Smad蛋白?；罨腟mad蛋白形成復合物進入細胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)基因的表達。在APC中，TGF-β通過Smad信號通路抑制APC的成熟相關(guān)基因的表達，使APC維持在相對未成熟的狀態(tài)，從而降低其抗原遞呈能力。TGF-β還可以促進APC分泌一些抑制性細胞因子，如IL-10等，進一步增強對免疫反應的抑制作用。4.3.2對免疫反應平衡的影響Treg細胞在抗原遞呈過程中對免疫反應平衡的維持起著至關(guān)重要的作用，其通過多種方式精細調(diào)控免疫反應的強度和方向，確保免疫系統(tǒng)在抵御病原體入侵的同時，避免過度免疫反應對機體造成損傷。在抗原遞呈初期，Treg細胞能夠抑制初始T細胞的過度活化，從而維持免疫反應的適度啟動。當APC攝取抗原后，會將抗原肽呈遞給初始T細胞，啟動免疫反應。然而，如果初始T細胞過度活化，可能導致免疫反應失控，引發(fā)炎癥和組織損傷。Treg細胞通過與APC和初始T細胞的相互作用，能夠有效抑制初始T細胞的活化。Treg細胞表面的CTLA-4與APC表面的CD80和CD86結(jié)合，阻斷了APC向初始T細胞提供共刺激信號，使初始T細胞無法獲得足夠的活化信號，從而抑制其增殖和分化。Treg細胞分泌的IL-10和TGF-β等抑制性細胞因子，也能夠抑制初始T細胞的活化，調(diào)節(jié)免疫反應的起始強度。在小鼠實驗中，當去除Treg細胞后，初始T細胞的活化明顯增強，免疫反應過度啟動，導致炎癥反應加劇，這充分說明了Treg細胞在抗原遞呈初期對免疫反應平衡的重要調(diào)節(jié)作用。在免疫反應過程中，Treg細胞持續(xù)調(diào)節(jié)免疫細胞的活性，維持Th1/Th2平衡。Th1和Th2細胞是輔助性T細胞的兩個主要亞群，它們分泌不同的細胞因子，介導不同的免疫反應。Th1細胞主要分泌干擾素-γ（IFN-γ）等細胞因子，介導細胞免疫反應，參與抗病毒、抗胞內(nèi)菌感染等；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5和IL-13等細胞因子，介導體液免疫反應，在過敏性疾病中發(fā)揮重要作用。正常情況下，Th1和Th2細胞處于平衡狀態(tài)，以維持機體的免疫平衡。然而，在過敏性哮喘等疾病中，Th2細胞功能亢進，Th1/Th2平衡失調(diào)，導致過度的過敏反應。Treg細胞通過抑制Th2細胞的活化和增殖，促進Th1細胞的功能，從而恢復Th1/Th2平衡。Treg細胞分泌的IL-10可以抑制Th2細胞分泌IL-4、IL-5和IL-13等細胞因子，抑制Th2細胞的功能；同時，IL-10還可以促進Th1細胞分泌IFN-γ，增強Th1細胞的功能。Treg細胞通過細胞間接觸抑制Th2細胞的活化，也有助于維持Th1/Th2平衡。研究表明，在小鼠過敏性哮喘模型中，過繼轉(zhuǎn)移Treg細胞可以顯著降低Th2細胞相關(guān)細胞因子的水平，提高Th1細胞相關(guān)細胞因子的水平，恢復Th1/Th2平衡，減輕哮喘的炎癥癥狀。Treg細胞還能夠調(diào)節(jié)免疫記憶的形成，對免疫反應平衡產(chǎn)生長期影響。免疫記憶是免疫系統(tǒng)在接觸抗原后形成的一種記憶能力，使得機體在再次接觸相同抗原時能夠快速、有效地啟動免疫反應。然而，如果免疫記憶過度增強，可能導致再次接觸抗原時免疫反應過激，引發(fā)炎癥和組織損傷。Treg細胞可以通過抑制免疫記憶細胞的活化和增殖，調(diào)節(jié)免疫記憶的強度。Treg細胞分泌的抑制性細胞因子能夠抑制免疫記憶細胞的活性，減少其產(chǎn)生的細胞因子，從而降低免疫記憶的強度。Treg細胞與免疫記憶細胞的直接接觸也可以抑制其活化，維持免疫記憶的平衡。在疫苗接種的研究中發(fā)現(xiàn)，Treg細胞可以調(diào)節(jié)疫苗誘導的免疫記憶，使機體在獲得有效免疫保護的同時，避免過度的免疫反應，這表明Treg細胞在免疫記憶調(diào)節(jié)中對維持免疫反應平衡具有重要意義。五、基于Treg細胞的治療策略與展望5.1以Treg細胞為靶點的治療策略探討5.1.1增強Treg細胞功能的治療方法在藥物治療方面，小分子化合物和細胞因子類藥物展現(xiàn)出獨特的作用機制和應用潛力。甲磺酸貝舒地爾片是一種具有創(chuàng)新性的治療慢性移植物抗宿主病的藥物，其通過下調(diào)STAT3減少Th17細胞的過度活化，上調(diào)STAT5增強Treg細胞的功能，從調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)平衡，減少炎癥和纖維化反應。在自身免疫性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，該藥物能夠有效增強Treg細胞的抑制功能，降低炎癥水平，為哮喘等免疫相關(guān)疾病的治療提供了新的思路。白介素-2（IL-2）在調(diào)節(jié)Treg細胞功能中具有重要作用，可特異性結(jié)合IL-2Rα亞基，促進Treg的增殖。然而，IL-2除調(diào)節(jié)Tregs功能外，還可激活I(lǐng)L2-Rβ/γ復合體信號通路，引發(fā)炎癥或非Treg特異性免疫反應。為解決這一問題，研究人員基于mRNA-納米脂質(zhì)體（LNP）平臺，合成編碼IL-2突變體的mRNA，可在小鼠或非人靈長類體內(nèi)特異性激活Treg，在動物疾病模型中顯示出預防同種異體排斥反應及治療自身免疫性疾病的潛力。這種通過mRNA技術(shù)對IL-2進行改造，增強其對Treg細胞的特異性，為哮喘治療中增強Treg細胞功能提供了新的策略。細胞療法方面，Treg細胞過繼轉(zhuǎn)移和基因修飾Treg細胞治療為哮喘治療帶來了新的希望。Treg細胞過繼轉(zhuǎn)移是將體外擴增培養(yǎng)的Treg細胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，以增強Treg細胞的數(shù)量和功能。在小鼠過敏性哮喘模型中，通過尾靜脈注射過繼轉(zhuǎn)移體外擴增培養(yǎng)的Treg細胞，可顯著減輕哮喘小鼠的氣道炎癥和高反應性，表現(xiàn)為BALF中炎癥細胞數(shù)量減少，氣道阻力降低?；蛐揎桾reg細胞治療則是利用基因編輯技術(shù)對Treg細胞進行修飾，使其表達特定的基因或蛋白，以增強其免疫調(diào)節(jié)功能。研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)對Treg細胞進行基因編輯，使其過表達IL-10，增強了Treg細胞的免疫抑制能力，在小鼠哮喘模型中取得了良好的治療效果。這種基因修飾的Treg細胞能夠更有效地抑制炎癥反應，為哮喘的治療提供了更精準、更有效的手段。5.1.2調(diào)節(jié)Treg細胞數(shù)量的途徑與意義調(diào)節(jié)Treg細胞數(shù)量對于哮喘治療具有重要意義，其主要通過細胞因子調(diào)節(jié)和小分子化合物調(diào)節(jié)等途徑實現(xiàn)。細胞因子在調(diào)節(jié)Treg細胞數(shù)量中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。白細胞介素-2（IL-2）是一種重要的細胞因子，它能夠與Treg細胞表面的IL-2受體結(jié)合，促進Treg細胞的增殖。在小鼠實驗中，給予外源性IL-2可以顯著增加Treg細胞的數(shù)量。IL-2還可以增強Treg細胞的功能，提高其免疫抑制能力。然而，IL-2的使用需要謹慎，因為高劑量的IL-2可能會導致免疫系統(tǒng)的過度激活，引發(fā)不良反應。在一些研究中，通過調(diào)節(jié)IL-2的劑量和給藥方式，在增加Treg細胞數(shù)量的同時，盡量減少其對其他免疫細胞的影響。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）也參與調(diào)節(jié)Treg細胞的數(shù)量。TGF-β可以促進初始T細胞向Treg細胞分化，從而增加Treg細胞的數(shù)量。在體外實驗中，添加TGF-β可以誘導初始T細胞表達Foxp3，分化為Treg細胞。在小鼠過敏性哮喘模型中，給予TGF-β可以增加肺組織中Treg細胞的數(shù)量，減輕氣道炎癥。TGF-β還可以與其他細胞因子協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)Treg細胞的數(shù)量和功能。小分子化合物在調(diào)節(jié)Treg細胞數(shù)量方面也具有重要作用。雷帕霉素作為一種新型免疫抑制劑，能夠抑制傳統(tǒng)T細胞（Tconv）的增殖和效應功能，同時逆轉(zhuǎn)Treg細胞的無能狀態(tài)并促進其擴增。在自身免疫性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可以增加Treg細胞的數(shù)量，調(diào)節(jié)免疫平衡。二甲雙胍是一種常用的降糖藥物，近年來研究發(fā)現(xiàn)它還具有免疫調(diào)節(jié)作用。二甲雙胍可以誘導Treg細胞持續(xù)擴張，增加Treg細胞的數(shù)量。在糖尿病合并哮喘的小鼠模型中，使用二甲雙胍治療后，Treg細胞數(shù)量增加，哮喘癥狀得到改善。調(diào)節(jié)Treg細胞數(shù)量對哮喘治療具有重要作用。在哮喘發(fā)病過程中，Treg細胞數(shù)量減少，導致其對免疫反應的抑制作用減弱，從而引發(fā)和加重哮喘的炎癥反應。通過調(diào)節(jié)Treg細胞數(shù)量，可以增強其對免疫反應的抑制作用，減輕哮喘的炎癥程度。增加Treg細胞數(shù)量可以抑制Th2細胞的活化和增殖，減少Th2型細胞因子如IL-4、IL-5和IL-13的分泌，從而減輕氣道炎癥和高反應性。調(diào)節(jié)Treg細胞數(shù)量還可以調(diào)節(jié)其他免疫細胞的功能，如抑制樹突狀細胞的活化，減少B細胞產(chǎn)生IgE抗體，從而進一步減輕哮喘的炎癥反應。在小鼠過敏性哮喘模型中，通過調(diào)節(jié)Treg細胞數(shù)量，使哮喘小鼠的氣道炎癥和高反應性得到明顯改善，肺功能得到