tBHQ對(duì)顱腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)保護(hù)作用的體外研究：機(jī)制與展望一、引言1.1研究背景與意義顱腦創(chuàng)傷（TraumaticBrainInjury，TBI）是一種常見(jiàn)且嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，給全球公共衛(wèi)生帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年有大量人口遭受顱腦創(chuàng)傷，其發(fā)生率在不同地區(qū)雖有所差異，但總體呈上升趨勢(shì)。在中國(guó)，顱腦創(chuàng)傷同樣是一個(gè)嚴(yán)峻的問(wèn)題，每年新增患者眾多，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)與精神壓力。顱腦創(chuàng)傷的發(fā)生原因復(fù)雜多樣，交通事故、跌倒、暴力襲擊等是主要的致傷因素。其中，道路交通車(chē)禍傷在中國(guó)曾是顱腦創(chuàng)傷的首要致傷原因，不過(guò)隨著交通安全法規(guī)的完善以及酒駕入刑等措施的實(shí)施，汽車(chē)導(dǎo)致的顱腦創(chuàng)傷有所減少，但電動(dòng)車(chē)導(dǎo)致的顱腦創(chuàng)傷發(fā)生數(shù)卻明顯增加。不同年齡段的人群，其顱腦創(chuàng)傷的發(fā)生原因和特點(diǎn)也存在差異，兒童和老年人由于身體機(jī)能和行為特點(diǎn)，更容易因跌倒等原因?qū)е嘛B腦創(chuàng)傷。顱腦創(chuàng)傷后，患者常出現(xiàn)多種嚴(yán)重的并發(fā)癥和不良后果。炎癥反應(yīng)是顱腦創(chuàng)傷后最為關(guān)鍵的病理生理過(guò)程之一，對(duì)患者的預(yù)后產(chǎn)生著深遠(yuǎn)的影響。當(dāng)顱腦受到創(chuàng)傷時(shí)，機(jī)體的免疫系統(tǒng)被激活，引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)。小膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦中的免疫細(xì)胞，會(huì)迅速被激活并遷移到損傷部位，釋放多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些炎性介質(zhì)一方面可以招募更多的免疫細(xì)胞到損傷區(qū)域，試圖清除受損組織和病原體，發(fā)揮一定的免疫防御作用；但另一方面，過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致炎癥因子的大量釋放，引發(fā)“炎癥風(fēng)暴”，對(duì)周?chē)纳窠?jīng)細(xì)胞造成二次損傷。炎癥反應(yīng)會(huì)破壞血腦屏障的完整性，導(dǎo)致血管通透性增加，引起腦水腫，進(jìn)一步升高顱內(nèi)壓，壓迫周?chē)X組織，加重神經(jīng)功能損傷。炎癥因子還會(huì)誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死，阻礙神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，影響神經(jīng)功能的恢復(fù)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)認(rèn)知障礙、運(yùn)動(dòng)障礙、感覺(jué)障礙等一系列神經(jīng)功能缺損癥狀，嚴(yán)重者甚至?xí)＜吧?。因此，有效抑制顱腦創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)，對(duì)于減輕神經(jīng)功能損傷、改善患者預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。目前，針對(duì)顱腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)的治療方法主要包括藥物治療、物理治療和手術(shù)治療等。藥物治療方面，常用的藥物有糖皮質(zhì)激素、非甾體抗炎藥等，但這些藥物存在著諸多局限性。糖皮質(zhì)激素雖然具有強(qiáng)大的抗炎作用，但長(zhǎng)期使用會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的副作用，如感染風(fēng)險(xiǎn)增加、血糖升高、骨質(zhì)疏松等，限制了其臨床應(yīng)用。非甾體抗炎藥的抗炎效果相對(duì)較弱，且可能會(huì)對(duì)胃腸道等器官造成損傷。物理治療和手術(shù)治療在一定程度上可以緩解癥狀，但對(duì)于炎癥反應(yīng)的根源性治療效果有限。因此，尋找一種安全、有效的新型治療藥物，成為了顱腦創(chuàng)傷治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。叔丁基對(duì)苯二酚（tBHQ）作為一種活性氧清除劑，近年來(lái)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣泛的生物學(xué)活性，逐漸受到研究者的關(guān)注。tBHQ能夠激活細(xì)胞內(nèi)的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)通路，上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)，如血紅素加氧酶-1（HO-1）、超氧化物歧化酶（SOD）等，從而有效地清除體內(nèi)過(guò)多的活性氧（ROS），維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。氧化還原失衡在顱腦創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，過(guò)多的ROS會(huì)誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生，加重炎癥損傷。tBHQ通過(guò)調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)，有可能抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。tBHQ還可能對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化產(chǎn)生積極影響，促進(jìn)神經(jīng)功能的修復(fù)。研究表明，在一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型中，tBHQ能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，增加神經(jīng)元的數(shù)量，改善神經(jīng)功能。這提示tBHQ在顱腦創(chuàng)傷治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，可能成為治療顱腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)的候選藥物。本研究旨在深入探討tBHQ對(duì)顱腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用及其潛在機(jī)制。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，模擬顱腦創(chuàng)傷的病理過(guò)程，觀(guān)察tBHQ對(duì)炎癥因子表達(dá)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化等指標(biāo)的影響，為開(kāi)發(fā)治療顱腦創(chuàng)傷的新策略提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。若tBHQ被證實(shí)具有顯著的保護(hù)作用，將為顱腦創(chuàng)傷患者帶來(lái)新的治療希望，有望改善患者的預(yù)后，降低致殘率和死亡率，具有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。1.2研究目的本研究旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，深入探究tBHQ對(duì)顱腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用及其潛在分子機(jī)制。具體而言，擬達(dá)成以下目標(biāo)：首先，利用體外細(xì)胞模型，模擬顱腦創(chuàng)傷后的病理生理過(guò)程，觀(guān)察tBHQ對(duì)炎癥因子（如IL-1β、TNF-α、IL-6等）表達(dá)水平的影響，明確tBHQ是否能夠有效抑制顱腦創(chuàng)傷后炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)。其次，研究tBHQ對(duì)顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，分析其是否能夠通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)凋亡信號(hào)通路，減少神經(jīng)細(xì)胞的死亡，從而保護(hù)神經(jīng)功能。再者，探討tBHQ對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的作用，觀(guān)察其是否能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，增加神經(jīng)元的數(shù)量，為神經(jīng)功能的修復(fù)提供細(xì)胞基礎(chǔ)。最后，深入研究tBHQ發(fā)揮保護(hù)作用的潛在分子機(jī)制，明確其在氧化還原平衡調(diào)節(jié)、信號(hào)通路激活等方面的作用靶點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)治療顱腦創(chuàng)傷的新策略提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，以期為臨床治療提供更有效的理論支持和治療思路。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在顱腦創(chuàng)傷炎癥反應(yīng)研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了豐碩的成果。國(guó)內(nèi)方面，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院江基堯教授團(tuán)隊(duì)牽頭的多中心研究，對(duì)中國(guó)顱腦創(chuàng)傷救治的真實(shí)狀況進(jìn)行了全面剖析。研究結(jié)果顯示，道路交通車(chē)禍傷曾是中國(guó)顱腦創(chuàng)傷主要致傷原因，隨著酒駕入刑等措施實(shí)施，汽車(chē)導(dǎo)致的顱腦創(chuàng)傷有所減少，但電動(dòng)車(chē)導(dǎo)致的顱腦創(chuàng)傷發(fā)生數(shù)明顯增加。該研究還指出，中國(guó)顱腦創(chuàng)傷患者普遍傷情較重，但救治效果優(yōu)于歐洲，這得益于中國(guó)在CT掃描普及、神經(jīng)外科重癥監(jiān)護(hù)病房建立、顱內(nèi)壓監(jiān)測(cè)技術(shù)、手術(shù)技術(shù)及腦保護(hù)技術(shù)等方面的進(jìn)展，以及循證醫(yī)學(xué)臨床研究的開(kāi)展和專(zhuān)家共識(shí)、指南的編寫(xiě)。在炎癥反應(yīng)機(jī)制研究上，國(guó)內(nèi)學(xué)者深入探討了小膠質(zhì)細(xì)胞在顱腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦的固有免疫細(xì)胞，在顱腦創(chuàng)傷后會(huì)迅速被激活，通過(guò)釋放多種炎性介質(zhì)，如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，參與炎癥反應(yīng)，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生損傷或保護(hù)作用。有研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞激活后釋放的IL-1β能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，加重神經(jīng)功能損傷；而另一些研究則發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞在一定條件下也能釋放神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)和再生。在治療方面，國(guó)內(nèi)對(duì)傳統(tǒng)藥物治療顱腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)的研究也在不斷深入，對(duì)糖皮質(zhì)激素、非甾體抗炎藥等藥物的作用機(jī)制和臨床應(yīng)用進(jìn)行了大量的探索，同時(shí)也在積極尋找新的治療藥物和方法。國(guó)外在顱腦創(chuàng)傷炎癥反應(yīng)研究方面同樣成果顯著。美國(guó)馬里蘭大學(xué)MartaM.Lipinski團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，創(chuàng)傷性腦損傷會(huì)引發(fā)一系列繼發(fā)性生化事件，導(dǎo)致急性和慢性神經(jīng)變性和炎癥通路的激活，大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞和血液來(lái)源的骨髓細(xì)胞都會(huì)參與創(chuàng)傷性腦損傷后的炎癥反應(yīng)。這些細(xì)胞通過(guò)吞噬作用清除受損組織，進(jìn)而激活炎癥小體和1型干擾素介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)。他們指出，最初的炎癥反應(yīng)對(duì)于解決組織損傷至關(guān)重要，但在創(chuàng)傷性腦損傷中，神經(jīng)炎癥往往長(zhǎng)期存在，導(dǎo)致長(zhǎng)期病理和恢復(fù)不良。俄羅斯科學(xué)院遠(yuǎn)東分院國(guó)家海洋生物學(xué)研究中心科研人員從魷魚(yú)肝中分離出一種多不飽和脂肪酸的高活性化合物，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，該化合物可促進(jìn)神經(jīng)元恢復(fù)并抑制顱腦外傷后的炎癥反應(yīng)，顯示出對(duì)顱腦損傷有很高療效。該研究為顱腦創(chuàng)傷的治療提供了新的思路和潛在的治療藥物。在治療手段上，國(guó)外除了藥物治療外，還在物理治療、康復(fù)治療等方面進(jìn)行了大量研究，致力于提高顱腦創(chuàng)傷患者的康復(fù)效果和生活質(zhì)量。關(guān)于tBHQ的研究，國(guó)內(nèi)外也有不少相關(guān)成果。在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，tBHQ作為一種活性氧清除劑，其抗氧化應(yīng)激作用已得到廣泛認(rèn)可。國(guó)內(nèi)有研究表明，tBHQ能夠激活細(xì)胞內(nèi)的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)通路，上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)，如血紅素加氧酶-1（HO-1）、超氧化物歧化酶（SOD）等，從而有效地清除體內(nèi)過(guò)多的活性氧（ROS），維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。在一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型中，tBHQ被發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，增加神經(jīng)元的數(shù)量，改善神經(jīng)功能。國(guó)外研究也發(fā)現(xiàn)，tBHQ在多種細(xì)胞模型和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出了對(duì)氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。在小鼠腦缺血再灌注損傷模型中，tBHQ能夠減輕腦組織的氧化損傷，降低炎癥因子的表達(dá)，改善神經(jīng)功能。然而，當(dāng)前研究仍存在一些不足之處。在顱腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)的治療研究中，雖然已經(jīng)對(duì)多種治療方法進(jìn)行了探索，但現(xiàn)有的治療手段仍無(wú)法完全滿(mǎn)足臨床需求，缺乏安全、有效的新型治療藥物和方法。對(duì)于tBHQ在顱腦創(chuàng)傷治療中的研究，雖然已有一些初步的成果，但研究還不夠深入和系統(tǒng)。目前對(duì)于tBHQ發(fā)揮保護(hù)作用的具體分子機(jī)制尚未完全明確，其在體內(nèi)的代謝過(guò)程、藥代動(dòng)力學(xué)特征以及潛在的不良反應(yīng)等方面的研究也相對(duì)較少。在不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蜅l件下，tBHQ的作用效果可能存在差異，需要進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，深入研究其作用的劑量-效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。此外，將tBHQ從基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，還需要進(jìn)行大量的臨床前研究和臨床試驗(yàn)，以驗(yàn)證其安全性和有效性。二、tBHQ與顱腦創(chuàng)傷炎癥反應(yīng)相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1tBHQ概述叔丁基對(duì)苯二酚（tBHQ），化學(xué)名稱(chēng)為2-叔丁基-1,4-苯二酚，分子式為C_{10}H_{14}O_{2}，分子量為166.22。它是一種人工合成的酚類(lèi)化合物，常溫下呈現(xiàn)為白色至淺灰色的結(jié)晶性粉末，晶體結(jié)構(gòu)較為規(guī)整，顆粒細(xì)膩均勻，無(wú)明顯結(jié)塊或雜質(zhì)，具備良好的流動(dòng)性，這一特性使其在生產(chǎn)過(guò)程中能夠被準(zhǔn)確計(jì)量和添加。tBHQ幾乎無(wú)嗅，味道清淡，在正常使用劑量下，不會(huì)給產(chǎn)品帶來(lái)額外的不良?xì)馕痘蛭兜溃@使得它在對(duì)氣味和口感要求嚴(yán)苛的食品、化妝品等行業(yè)中具有顯著優(yōu)勢(shì)。在溶解性方面，tBHQ具有獨(dú)特的性質(zhì)。它微溶于水，在25℃時(shí)，每100毫升水中僅能溶解約0.5克，然而，它卻易溶于乙醇、乙酸乙酯、乙醚、油脂等有機(jī)溶劑。這種溶解性特點(diǎn)使其能夠在油脂類(lèi)產(chǎn)品中均勻分散，充分發(fā)揮其功能作用。例如在食用植物油中，tBHQ能夠均勻地分布在油脂分子之間，有效抑制油脂的氧化酸敗，延長(zhǎng)油品的貨架期，保持油脂的風(fēng)味和品質(zhì)。tBHQ的熔點(diǎn)為126.5-128.5℃，在該溫度下，它會(huì)從固態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)。其沸點(diǎn)較高，約為273℃，這表明它具有較好的熱穩(wěn)定性，在一般的加工和儲(chǔ)存條件下不易揮發(fā)或分解。在油炸食品的高溫加工過(guò)程中，tBHQ仍能保持穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，持續(xù)發(fā)揮其抗氧化作用，抑制油脂在高溫油炸過(guò)程中的氧化聚合反應(yīng)，減少有害物質(zhì)的生成，同時(shí)保持食品的色澤、口感和脆性。tBHQ是一種高效的酚類(lèi)抗氧化劑，其抗氧化作用機(jī)制主要基于酚羥基上的氫原子具有較高的活性。當(dāng)油脂等物質(zhì)發(fā)生氧化時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，這些自由基具有很強(qiáng)的氧化性，能夠引發(fā)鏈?zhǔn)窖趸磻?yīng)，導(dǎo)致油脂酸敗、食品變質(zhì)。tBHQ的酚羥基上的氫原子能夠與這些自由基結(jié)合，將自由基轉(zhuǎn)化為較為穩(wěn)定的化合物，從而中斷鏈?zhǔn)窖趸磻?yīng)，有效抑制油脂的氧化酸敗，延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期。與其他一些常見(jiàn)的抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚（BHA）和二丁基羥基甲苯（BHT）相比，tBHQ在低濃度下就能表現(xiàn)出卓越的抗氧化效果。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，添加低濃度tBHQ的油脂樣品，其過(guò)氧化值的增長(zhǎng)速度明顯低于添加相同濃度BHA或BHT的樣品，表明tBHQ能夠更有效地抑制油脂的氧化。tBHQ在高溫加工條件下仍能保持較好的穩(wěn)定性，這使得它在一些需要高溫處理的食品和工業(yè)產(chǎn)品中具有廣泛的應(yīng)用前景。除了在食品工業(yè)中作為油脂和含油食品的抗氧化劑廣泛應(yīng)用外，tBHQ在其他領(lǐng)域也展現(xiàn)出重要的應(yīng)用價(jià)值。在化妝品行業(yè)，由于其抗氧化性能，可用于化妝品配方中，防止油脂成分氧化變質(zhì)，延長(zhǎng)化妝品的使用壽命，同時(shí)保護(hù)皮膚免受自由基的損傷。在護(hù)膚乳液、面霜、唇膏等產(chǎn)品中添加tBHQ，有助于維持產(chǎn)品的穩(wěn)定性和功效性，防止產(chǎn)品出現(xiàn)異味、變色或質(zhì)地改變等問(wèn)題。在橡膠工業(yè)中，tBHQ可作為橡膠防老劑，提高橡膠制品的抗老化性能，延長(zhǎng)其使用壽命。橡膠制品在長(zhǎng)期使用過(guò)程中，會(huì)受到氧氣、紫外線(xiàn)等因素的影響而發(fā)生老化，導(dǎo)致性能下降。添加tBHQ后，能夠有效抑制橡膠分子的氧化反應(yīng)，減緩老化速度，提高橡膠制品的耐用性。在石油產(chǎn)品中，也可添加tBHQ來(lái)抑制油品的氧化，防止膠質(zhì)和沉渣的生成，保證油品的質(zhì)量和使用性能。石油產(chǎn)品在儲(chǔ)存和使用過(guò)程中，容易發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生膠質(zhì)和沉渣，影響油品的流動(dòng)性和燃燒性能。tBHQ能夠與油品中的自由基反應(yīng)，阻止氧化反應(yīng)的進(jìn)行，保持油品的良好性能。2.2顱腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)機(jī)制顱腦創(chuàng)傷后，機(jī)體的炎癥反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜且有序的過(guò)程，涉及多種細(xì)胞和因子的參與，對(duì)神經(jīng)功能產(chǎn)生著深遠(yuǎn)的影響。當(dāng)顱腦遭受創(chuàng)傷時(shí)，血腦屏障會(huì)首先受到破壞。血腦屏障是維持大腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)，由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜、周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等組成。創(chuàng)傷導(dǎo)致血腦屏障的緊密連接蛋白受損，內(nèi)皮細(xì)胞間隙增大，使得血液中的大分子物質(zhì)、免疫細(xì)胞等得以進(jìn)入腦組織。血漿蛋白如纖維蛋白原、免疫球蛋白等滲漏到腦組織中，引發(fā)一系列免疫反應(yīng)。纖維蛋白原可激活補(bǔ)體系統(tǒng)，產(chǎn)生多種補(bǔ)體片段，如C3a、C5a等，這些補(bǔ)體片段具有趨化作用，能夠吸引中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞向損傷部位聚集。小膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦中的固有免疫細(xì)胞，在顱腦創(chuàng)傷后迅速被激活。正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞呈分支狀，處于靜息狀態(tài)，對(duì)維持大腦的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著重要作用。創(chuàng)傷信號(hào)通過(guò)多種途徑激活小膠質(zhì)細(xì)胞，使其形態(tài)發(fā)生改變，從分支狀轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒚装蜆?，同時(shí)表達(dá)多種表面標(biāo)志物，如CD11b、CD45等。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)吞噬作用清除受損的細(xì)胞碎片和病原體，但在這個(gè)過(guò)程中，也會(huì)釋放大量的炎性介質(zhì)。這些炎性介質(zhì)包括細(xì)胞因子、趨化因子和活性氧等。細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。IL-1β能夠激活其他免疫細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的放大；TNF-α可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，加重神經(jīng)細(xì)胞的損傷；IL-6參與免疫調(diào)節(jié)，同時(shí)也與炎癥相關(guān)的病理過(guò)程密切相關(guān)。趨化因子如單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）等，能夠吸引單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞向損傷部位遷移，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)。活性氧如超氧陰離子、過(guò)氧化氫等，可直接損傷神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和死亡。星形膠質(zhì)細(xì)胞在顱腦創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)中也扮演著重要角色。星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠通過(guò)釋放多種細(xì)胞因子和趨化因子參與炎癥反應(yīng)。它們可以分泌IL-6、IL-8等細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的募集和活化。星形膠質(zhì)細(xì)胞還能產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）等，在一定程度上對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用。但在過(guò)度炎癥狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細(xì)胞也會(huì)被過(guò)度激活，導(dǎo)致其功能失調(diào)，分泌過(guò)多的炎性介質(zhì)，加重神經(jīng)損傷。中性粒細(xì)胞是最早到達(dá)損傷部位的免疫細(xì)胞之一。在創(chuàng)傷后數(shù)小時(shí)內(nèi)，中性粒細(xì)胞在趨化因子的作用下，從血液中穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織。中性粒細(xì)胞通過(guò)釋放多種蛋白酶、活性氧和炎性介質(zhì)，發(fā)揮免疫防御作用。它們可以吞噬和清除病原體，但同時(shí)也會(huì)對(duì)周?chē)恼＝M織造成損傷。中性粒細(xì)胞釋放的彈性蛋白酶、髓過(guò)氧化物酶等，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞神經(jīng)細(xì)胞的微環(huán)境，導(dǎo)致神經(jīng)功能受損。單核細(xì)胞在趨化因子的吸引下，也會(huì)進(jìn)入腦組織，并分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的吞噬能力，能夠清除壞死組織和細(xì)胞碎片，在炎癥反應(yīng)的后期發(fā)揮重要的修復(fù)作用。巨噬細(xì)胞還能分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)過(guò)程。巨噬細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）可以抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)；而分泌的TNF-α等則可能加重炎癥損傷。炎癥反應(yīng)對(duì)神經(jīng)功能的影響是多方面的。炎癥因子的大量釋放會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死。TNF-α可以通過(guò)激活半胱天冬酶（caspase）家族，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。炎癥還會(huì)影響神經(jīng)遞質(zhì)的代謝和傳遞，導(dǎo)致神經(jīng)信號(hào)傳遞異常。炎癥反應(yīng)會(huì)使谷氨酸等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放增加，同時(shí)抑制γ-氨基丁酸（GABA）等抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放，導(dǎo)致興奮性毒性，損傷神經(jīng)細(xì)胞。炎癥還會(huì)阻礙神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，影響神經(jīng)功能的修復(fù)。炎癥因子會(huì)抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，改變其分化方向，減少神經(jīng)元的生成，從而影響神經(jīng)功能的恢復(fù)。顱腦創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)是一個(gè)涉及多種細(xì)胞和因子相互作用的復(fù)雜過(guò)程，對(duì)神經(jīng)功能產(chǎn)生了嚴(yán)重的負(fù)面影響。深入了解其機(jī)制，對(duì)于尋找有效的治療靶點(diǎn)，改善顱腦創(chuàng)傷患者的預(yù)后具有重要意義。2.3tBHQ對(duì)炎癥反應(yīng)的潛在作用機(jī)制tBHQ對(duì)顱腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用，可能是通過(guò)多種潛在機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，這些機(jī)制相互關(guān)聯(lián)，共同發(fā)揮作用，對(duì)減輕炎癥損傷、保護(hù)神經(jīng)功能具有重要意義。2.3.1抗氧化作用氧化應(yīng)激在顱腦創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)中扮演著關(guān)鍵角色。顱腦創(chuàng)傷后，由于組織損傷和缺血再灌注等原因，大量活性氧（ROS）如超氧陰離子（O_{2}^{-}）、過(guò)氧化氫（H_{2}O_{2}）和羥自由基（·OH）等產(chǎn)生。這些ROS具有高度的化學(xué)活性，能夠攻擊細(xì)胞膜上的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)變性和DNA損傷，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞功能障礙和死亡。ROS還能激活炎癥信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生，加重炎癥反應(yīng)。tBHQ作為一種有效的活性氧清除劑，能夠通過(guò)直接和間接的方式發(fā)揮抗氧化作用。從直接作用來(lái)看，tBHQ分子結(jié)構(gòu)中的酚羥基具有較高的活性，能夠與ROS發(fā)生反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為相對(duì)穩(wěn)定的物質(zhì)。tBHQ可以提供氫原子，與超氧陰離子反應(yīng)生成過(guò)氧化氫，然后過(guò)氧化氫在細(xì)胞內(nèi)其他抗氧化酶的作用下進(jìn)一步分解為水和氧氣。這種直接清除ROS的方式，能夠迅速降低細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，減少其對(duì)生物大分子的損傷。tBHQ還能通過(guò)間接途徑增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力。tBHQ可以激活核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）信號(hào)通路。在正常情況下，Nrf2與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Keap1）結(jié)合，以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，tBHQ能夠與Keap1的半胱氨酸殘基結(jié)合，使Nrf2與Keap1解離。解離后的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，啟動(dòng)一系列抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。這些抗氧化酶包括血紅素加氧酶-1（HO-1）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等。HO-1能夠催化血紅素降解，產(chǎn)生一氧化碳（CO）、膽綠素和鐵離子，其中CO具有抗炎和細(xì)胞保護(hù)作用，膽綠素進(jìn)一步被還原為膽紅素，膽紅素也是一種有效的抗氧化劑。SOD能夠催化超氧陰離子歧化為過(guò)氧化氫和氧氣，GSH-Px則可以利用還原型谷胱甘肽（GSH）將過(guò)氧化氫還原為水，從而維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路，tBHQ上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)，增強(qiáng)了細(xì)胞自身的抗氧化防御系統(tǒng)，有效清除過(guò)多的ROS，減輕氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。2.3.2調(diào)節(jié)細(xì)胞因子細(xì)胞因子在顱腦創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)中起著核心作用，它們的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致炎癥的失控和神經(jīng)損傷的加重。白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）等促炎細(xì)胞因子，在顱腦創(chuàng)傷后會(huì)大量釋放。IL-1β能夠激活其他免疫細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大，還可以誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡和壞死。TNF-α不僅可以直接損傷神經(jīng)細(xì)胞，還能通過(guò)激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）等信號(hào)通路，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)。IL-6參與免疫調(diào)節(jié)，但在過(guò)度表達(dá)時(shí)，也會(huì)加重炎癥損傷，影響神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化。tBHQ可能通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)。tBHQ能夠抑制NF-κB信號(hào)通路的激活。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合，以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到炎癥刺激時(shí)，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，從而釋放出NF-κB。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α和IL-6等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。tBHQ可以通過(guò)抑制IKK的活性，阻止IκB的磷酸化和降解，從而抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位和激活，減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。tBHQ還可能通過(guò)調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路來(lái)影響細(xì)胞因子的表達(dá)。MAPK信號(hào)通路包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等。在顱腦創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)中，MAPK信號(hào)通路被激活，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。tBHQ可以抑制MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵激酶的活性，如ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化，從而阻斷信號(hào)傳導(dǎo)，減少促炎細(xì)胞因子的合成和釋放。研究表明，在體外細(xì)胞模型中，給予tBHQ處理后，ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平明顯降低，同時(shí)IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)也顯著減少。tBHQ可能通過(guò)調(diào)節(jié)微小RNA（miRNA）的表達(dá)來(lái)間接影響細(xì)胞因子的水平。miRNA是一類(lèi)非編碼RNA，能夠通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過(guò)程或促進(jìn)其降解，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。一些miRNA與細(xì)胞因子的表達(dá)密切相關(guān)。miR-146a可以通過(guò)靶向抑制NF-κB信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，來(lái)調(diào)節(jié)IL-1β、TNF-α等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。tBHQ可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-146a等相關(guān)miRNA的表達(dá)，間接影響細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用。雖然目前關(guān)于tBHQ通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA來(lái)影響細(xì)胞因子表達(dá)的具體機(jī)制還不完全清楚，但這為進(jìn)一步研究tBHQ的抗炎作用提供了新的方向。2.3.3抑制細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡是顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要形式之一，它會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)功能的受損和喪失。在顱腦創(chuàng)傷后的炎癥環(huán)境中，多種因素如氧化應(yīng)激、炎癥因子的刺激等，都可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡。細(xì)胞凋亡的發(fā)生涉及一系列復(fù)雜的信號(hào)通路，其中線(xiàn)粒體途徑和死亡受體途徑是兩條主要的凋亡信號(hào)通路。在線(xiàn)粒體途徑中，氧化應(yīng)激和炎癥因子等刺激會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜電位的下降，使線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開(kāi)放。這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線(xiàn)粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）和半胱天冬酶-9（caspase-9）結(jié)合，形成凋亡體。凋亡體激活caspase-9，進(jìn)而激活下游的caspase-3等效應(yīng)caspase，引發(fā)細(xì)胞凋亡。在死亡受體途徑中，TNF-α等促炎細(xì)胞因子與相應(yīng)的死亡受體如TNF受體1（TNFR1）結(jié)合，招募死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（FADD）和caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。DISC激活caspase-8，它既可以直接激活caspase-3等效應(yīng)caspase，也可以通過(guò)切割Bid蛋白，使Bid的活性片段tBid轉(zhuǎn)移到線(xiàn)粒體，激活線(xiàn)粒體途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。tBHQ可能通過(guò)多種方式抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。tBHQ的抗氧化作用有助于減輕氧化應(yīng)激對(duì)線(xiàn)粒體的損傷，維持線(xiàn)粒體膜電位的穩(wěn)定，從而抑制mPTP的開(kāi)放，減少細(xì)胞色素C的釋放，阻斷線(xiàn)粒體途徑的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)。tBHQ可以上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)。Bcl-2家族蛋白在線(xiàn)粒體途徑的凋亡調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，Bcl-2能夠抑制線(xiàn)粒體膜電位的下降和細(xì)胞色素C的釋放，而B(niǎo)ax則促進(jìn)這些過(guò)程。通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)比例，tBHQ可以增強(qiáng)細(xì)胞的抗凋亡能力。研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中，給予tBHQ處理后，Bcl-2的表達(dá)明顯增加，Bax的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞凋亡率也明顯下降。tBHQ還可能通過(guò)抑制死亡受體途徑來(lái)減少細(xì)胞凋亡。tBHQ可以抑制TNF-α與TNFR1的結(jié)合，或者抑制DISC的形成，從而阻斷死亡受體途徑的信號(hào)傳導(dǎo)。tBHQ可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，抑制caspase-8的激活，進(jìn)而減少caspase-3等效應(yīng)caspase的活化，最終抑制細(xì)胞凋亡。雖然目前關(guān)于tBHQ抑制死亡受體途徑的具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究，但這些作用為tBHQ在顱腦創(chuàng)傷后保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、減少細(xì)胞凋亡提供了重要的理論依據(jù)。tBHQ對(duì)顱腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用是通過(guò)抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和抑制細(xì)胞凋亡等多種潛在機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。這些機(jī)制相互協(xié)同，共同減輕炎癥損傷，保護(hù)神經(jīng)功能，為開(kāi)發(fā)治療顱腦創(chuàng)傷的新策略提供了重要的理論基礎(chǔ)。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞系選用小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2和大鼠神經(jīng)干細(xì)胞系C17.2，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。BV2細(xì)胞作為小膠質(zhì)細(xì)胞的模型，在顱腦創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)中扮演著重要角色，能夠釋放多種炎性介質(zhì)，是研究炎癥反應(yīng)機(jī)制的常用細(xì)胞系。C17.2細(xì)胞作為神經(jīng)干細(xì)胞系，具有自我更新和多向分化的能力，在神經(jīng)功能修復(fù)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，可用于研究tBHQ對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響。所有細(xì)胞在復(fù)蘇后，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀(guān)察、細(xì)胞生長(zhǎng)特性檢測(cè)以及短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）鑒定，確保細(xì)胞的真實(shí)性和純度，避免細(xì)胞交叉污染，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可靠的細(xì)胞來(lái)源。3.1.2試劑叔丁基對(duì)苯二酚（tBHQ）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，純度≥99%，其化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，雜質(zhì)含量極低，在實(shí)驗(yàn)中能夠準(zhǔn)確地發(fā)揮作用，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。脂多糖（LPS）購(gòu)自InvivoGen公司，LPS是一種常用的炎癥誘導(dǎo)劑，能夠模擬細(xì)菌感染，激活細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，常用于建立體外炎癥模型。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液均購(gòu)自Gibco公司。DMEM高糖培養(yǎng)基為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了必要的營(yíng)養(yǎng)成分，包括氨基酸、維生素、糖類(lèi)等，能夠滿(mǎn)足細(xì)胞的代謝需求；胎牛血清含有多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；青霉素-鏈霉素雙抗溶液則可以有效防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無(wú)菌性。胰蛋白酶購(gòu)自Amresco公司，胰蛋白酶能夠消化細(xì)胞間的蛋白質(zhì)，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來(lái)，便于細(xì)胞的傳代和實(shí)驗(yàn)操作。CCK-8試劑盒購(gòu)自Dojindo公司，用于檢測(cè)細(xì)胞活力，其原理是利用細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶將CCK-8試劑中的四唑鹽還原為具有顏色的甲瓚產(chǎn)物，通過(guò)檢測(cè)甲瓚產(chǎn)物的吸光度來(lái)反映細(xì)胞的活力，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BDBiosciences公司，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡，該試劑盒利用AnnexinV能夠特異性地結(jié)合磷脂酰絲氨酸（PS），而PS在細(xì)胞凋亡早期會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)的特性，通過(guò)熒光標(biāo)記的AnnexinV和碘化丙啶（PI）雙染，可區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，為研究細(xì)胞凋亡提供了準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。RNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司，該試劑盒采用硅膠膜離心柱技術(shù)，能夠高效、快速地從細(xì)胞中提取高質(zhì)量的總RNA，提取的RNA純度高、完整性好，可用于后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR實(shí)驗(yàn)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒能夠?qū)NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為定量PCR提供模板；SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒則利用SYBRGreen染料能夠特異性地與雙鏈DNA結(jié)合并在PCR擴(kuò)增過(guò)程中發(fā)出熒光的原理，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化來(lái)定量檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自R&DSystems公司，用于檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子的含量，這些試劑盒采用雙抗體夾心ELISA原理，具有高靈敏度、高特異性和良好的重復(fù)性，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子的含量，為研究tBHQ對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響提供了可靠的檢測(cè)手段。3.1.3儀器設(shè)備CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），能夠精確控制培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的環(huán)境，溫度波動(dòng)范圍在±0.5℃以?xún)?nèi)，CO?濃度控制精度在±0.1%以?xún)?nèi)。超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），采用高效空氣過(guò)濾器，能夠有效過(guò)濾空氣中的塵埃和微生物，提供無(wú)菌的操作環(huán)境，其潔凈度達(dá)到100級(jí)，確保實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中細(xì)胞不受污染。倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，具有高分辨率和清晰的成像效果，能夠觀(guān)察到細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)和形態(tài)變化，便于及時(shí)掌握細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。酶標(biāo)儀（BioTek公司），用于檢測(cè)ELISA實(shí)驗(yàn)中的吸光度值，具有高精度和快速檢測(cè)的特點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地讀取ELISA板上各孔的吸光度值，為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析提供可靠依據(jù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司），能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中的熒光信號(hào)變化，精確地定量檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平，其熒光檢測(cè)靈敏度高，重復(fù)性好，可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣本的檢測(cè)。流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司），用于細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的檢測(cè)，能夠快速、準(zhǔn)確地分析細(xì)胞的凋亡率和細(xì)胞周期分布情況，通過(guò)對(duì)細(xì)胞的熒光標(biāo)記和流式分析，可獲得大量的細(xì)胞信息，為研究細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控提供有力的技術(shù)支持。高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），用于細(xì)胞和核酸的分離和純化，具有高轉(zhuǎn)速和低溫控制功能，能夠在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和核酸的高效分離，轉(zhuǎn)速最高可達(dá)15000rpm，溫度控制范圍在-20℃至40℃之間，確保樣品在分離過(guò)程中的穩(wěn)定性。3.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置以下幾組：正常對(duì)照組、模型組、tBHQ低劑量處理組、tBHQ中劑量處理組和tBHQ高劑量處理組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。正常對(duì)照組不做任何處理，僅加入正常的細(xì)胞培養(yǎng)液，用于提供正常細(xì)胞生理狀態(tài)下的各項(xiàng)指標(biāo)參考，作為對(duì)比基礎(chǔ)，以明確其他處理組的變化是否由實(shí)驗(yàn)因素引起。模型組通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入脂多糖（LPS）來(lái)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，構(gòu)建顱腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)的體外細(xì)胞模型。LPS是一種細(xì)菌細(xì)胞壁成分，能夠激活小膠質(zhì)細(xì)胞等免疫細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)，釋放多種炎性介質(zhì)，如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，從而模擬顱腦創(chuàng)傷后的炎癥病理過(guò)程。tBHQ低劑量處理組、tBHQ中劑量處理組和tBHQ高劑量處理組在加入LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的同時(shí)，分別加入不同濃度的tBHQ進(jìn)行干預(yù)。tBHQ低劑量處理組加入的tBHQ終濃度為10μmol/L，tBHQ中劑量處理組加入的tBHQ終濃度為20μmol/L，tBHQ高劑量處理組加入的tBHQ終濃度為40μmol/L。這樣設(shè)置不同劑量的tBHQ處理組，是為了探究tBHQ對(duì)顱腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用是否存在劑量依賴(lài)性。通過(guò)比較不同劑量tBHQ處理組與模型組之間各項(xiàng)指標(biāo)的差異，可以明確tBHQ發(fā)揮最佳保護(hù)作用的劑量范圍，為后續(xù)的研究和臨床應(yīng)用提供劑量參考。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)tBHQ的濃度進(jìn)行了初步探索，綜合考慮細(xì)胞的耐受性、tBHQ的溶解度以及前期相關(guān)研究的參考，確定了這三個(gè)濃度梯度，以全面研究tBHQ在不同劑量下對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。3.3實(shí)驗(yàn)方法3.3.1細(xì)胞培養(yǎng)將小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2和大鼠神經(jīng)干細(xì)胞系C17.2分別復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的DMEM高糖培養(yǎng)基中。放置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。在傳代過(guò)程中，嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則，使用無(wú)菌的移液器、吸管、培養(yǎng)瓶等器材，避免細(xì)胞受到污染。每次傳代后，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行觀(guān)察，記錄細(xì)胞的形態(tài)、增殖速度等指標(biāo)，確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，定期更換培養(yǎng)基，一般每2-3天更換一次，以保證細(xì)胞有充足的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，并及時(shí)去除細(xì)胞代謝產(chǎn)生的廢物。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，此時(shí)細(xì)胞活力高、增殖能力強(qiáng)，能夠保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。3.3.2創(chuàng)傷性腦損傷模型構(gòu)建采用脂多糖（LPS）刺激BV2細(xì)胞來(lái)構(gòu)建創(chuàng)傷性腦損傷的體外炎癥模型。具體操作如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞以1×10^{5}個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)液。模型組和各tBHQ處理組加入含有1μg/mLLPS的DMEM培養(yǎng)基，正常對(duì)照組加入等量不含LPS的DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，使LPS充分激活BV2細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)。在加入LPS后，密切觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)變化，通過(guò)倒置顯微鏡可以觀(guān)察到，模型組細(xì)胞的形態(tài)逐漸從典型的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒚装蜆?，?xì)胞體積增大，突起減少，這是小膠質(zhì)細(xì)胞被激活的典型形態(tài)學(xué)特征。同時(shí)，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子的含量，如IL-1β、TNF-α、IL-6等，驗(yàn)證模型的成功構(gòu)建。與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清中這些炎癥因子的含量顯著升高，表明炎癥模型構(gòu)建成功。3.3.3tBHQ處理在加入LPS的同時(shí)，tBHQ低劑量處理組、tBHQ中劑量處理組和tBHQ高劑量處理組分別加入終濃度為10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L的tBHQ。將tBHQ用DMSO溶解配制成100mmol/L的母液，再用DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。在加入tBHQ時(shí)，需注意避免產(chǎn)生氣泡，確保tBHQ能夠均勻地分布在培養(yǎng)基中，與細(xì)胞充分接觸。加入tBHQ后，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。在培養(yǎng)過(guò)程中，定期觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)變化，與模型組進(jìn)行對(duì)比?？梢园l(fā)現(xiàn)，隨著tBHQ濃度的增加，細(xì)胞的形態(tài)逐漸恢復(fù)，阿米巴樣的形態(tài)減少，突起增多，提示tBHQ可能對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)改變具有一定的抑制作用。同時(shí)，記錄細(xì)胞的增殖情況，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力，觀(guān)察tBHQ對(duì)細(xì)胞活力的影響。3.3.4細(xì)胞因子檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的含量。具體步驟如下：將培養(yǎng)24小時(shí)后的細(xì)胞培養(yǎng)上清收集到離心管中，4℃、3000rpm離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，首先將捕獲抗體包被在酶標(biāo)板上，4℃過(guò)夜。次日，棄去包被液，用洗滌緩沖液洗滌3-5次，每次3-5分鐘。加入封閉液，37℃孵育1-2小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。棄去封閉液，再次洗滌酶標(biāo)板。加入稀釋后的細(xì)胞培養(yǎng)上清，37℃孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，洗滌酶標(biāo)板，加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，37℃孵育1-2小時(shí)。洗滌后，加入親和素-HRP，37℃孵育30-60分鐘。最后加入底物溶液，避光反應(yīng)15-30分鐘，待顏色變化明顯后，加入終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β、TNF-α、IL-6的含量。在操作過(guò)程中，嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間、溫度和試劑用量，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。同時(shí)，設(shè)置空白對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可靠性。3.3.5細(xì)胞活力檢測(cè)采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力。在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前2-4小時(shí)，向每孔中加入10μLCCK-8試劑，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2-4小時(shí)，使CCK-8試劑與細(xì)胞充分反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值，吸光度值與細(xì)胞活力呈正相關(guān)。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白組吸光度值）/（對(duì)照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每個(gè)樣品設(shè)置多個(gè)復(fù)孔，取平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。同時(shí)，注意避免CCK-8試劑受到光照和污染，確保試劑的有效性。通過(guò)細(xì)胞活力檢測(cè)，可以了解tBHQ對(duì)LPS刺激下細(xì)胞生存能力的影響，為評(píng)估tBHQ的保護(hù)作用提供依據(jù)。3.3.6細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。具體步驟如下：收集培養(yǎng)24小時(shí)后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2-3次，每次3-5分鐘。加入適量的胰蛋白酶進(jìn)行消化，注意消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，以免損傷細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞開(kāi)始脫落時(shí)，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、1000rpm離心5-10分鐘，棄去上清。加入1×BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^{6}個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液于流式管中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15-20分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μL1×BindingBuffer，再次混勻。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡率。在檢測(cè)過(guò)程中，確保流式細(xì)胞儀的參數(shù)設(shè)置正確，對(duì)不同處理組的細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確的分析。通過(guò)細(xì)胞凋亡檢測(cè)，可以明確tBHQ是否能夠抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，以及其抑制作用的程度。3.3.7神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化檢測(cè)將C17.2細(xì)胞以5×10^{4}個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)。分為正常對(duì)照組、模型組、tBHQ低劑量處理組、tBHQ中劑量處理組和tBHQ高劑量處理組，模型組加入含有1μg/mLLPS的DMEM培養(yǎng)基，各tBHQ處理組在加入LPS的同時(shí)分別加入不同濃度的tBHQ，正常對(duì)照組加入等量不含LPS的DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)3-5天，采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，方法同3.3.5。在細(xì)胞增殖檢測(cè)過(guò)程中，每天在固定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，記錄吸光度值的變化，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，觀(guān)察不同處理組細(xì)胞的增殖速度差異。為檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的分化情況，將C17.2細(xì)胞以1×10^{5}個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行分組處理，處理方式同上。培養(yǎng)7-10天后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌2-3次。加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30-60分鐘，然后用0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10-15分鐘。加入封閉液，室溫孵育1-2小時(shí)。分別加入神經(jīng)元特異性標(biāo)志物β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，棄去一抗，用PBS洗滌3-5次，每次5-10分鐘。加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育1-2小時(shí)。再次洗滌后，加入DAPI染核5-10分鐘。用熒光顯微鏡觀(guān)察并拍照，統(tǒng)計(jì)β-tubulinⅢ陽(yáng)性細(xì)胞和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的比例，以此評(píng)估神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化情況。在染色過(guò)程中，嚴(yán)格控制試劑的濃度和孵育時(shí)間，避免非特異性染色，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過(guò)神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化檢測(cè)，可以全面了解tBHQ對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞功能的影響，為其在顱腦創(chuàng)傷治療中的應(yīng)用提供理論支持。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1tBHQ對(duì)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的影響通過(guò)ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的含量，以評(píng)估tBHQ對(duì)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量顯著升高（P<0.01），這表明成功構(gòu)建了體外炎癥模型，LPS刺激有效地誘導(dǎo)了炎癥反應(yīng)，促使小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量的炎癥因子。在給予不同濃度tBHQ處理后，tBHQ低劑量處理組、tBHQ中劑量處理組和tBHQ高劑量處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量均顯著低于模型組（P<0.05或P<0.01）。且隨著tBHQ濃度的增加，這三種炎癥因子的含量呈逐漸下降趨勢(shì)。tBHQ高劑量處理組中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量下降最為明顯，與tBHQ低劑量處理組和tBHQ中劑量處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這些結(jié)果表明，tBHQ能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6的釋放，且這種抑制作用具有劑量依賴(lài)性。tBHQ可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，從而減少炎癥因子的產(chǎn)生，發(fā)揮其對(duì)顱腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用。\[此處插入tBHQ對(duì)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子影響的柱狀圖，圖中橫坐標(biāo)為不同處理組，縱坐標(biāo)為細(xì)胞因子含量（pg/mL），包含IL-1β、TNF-α和IL-6三種細(xì)胞因子的數(shù)據(jù)，不同處理組用不同顏色的柱子表示，正常對(duì)照組為白色，模型組為黑色，tBHQ低劑量處理組為灰色，tBHQ中劑量處理組為深灰色，tBHQ高劑量處理組為最深灰色，誤差線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)誤]\圖1tBHQ對(duì)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的影響4.2tBHQ對(duì)細(xì)胞氧化還原平衡的影響為了探究tBHQ對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的影響，檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）的活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)ROS水平和MDA含量顯著升高（P<0.01），而SOD和GSH-Px的活性顯著降低（P<0.01），這表明LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激增強(qiáng)，氧化還原平衡被破壞。給予tBHQ處理后，各tBHQ處理組細(xì)胞內(nèi)ROS水平和MDA含量均顯著低于模型組（P<0.05或P<0.01），且隨著tBHQ濃度的增加，下降趨勢(shì)更為明顯。tBHQ高劑量處理組中ROS水平和MDA含量最低，與tBHQ低劑量處理組和tBHQ中劑量處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各tBHQ處理組細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px的活性顯著高于模型組（P<0.05或P<0.01），且tBHQ高劑量處理組中SOD和GSH-Px的活性最高，與tBHQ低劑量處理組和tBHQ中劑量處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這些結(jié)果表明，tBHQ能夠有效降低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平和MDA含量，提高SOD和GSH-Px的活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，減輕氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)一步證明了tBHQ對(duì)顱腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)具有保護(hù)作用。\表1tBHQ對(duì)細(xì)胞氧化還原平衡相關(guān)指標(biāo)的影響（\overline{X}±SD，n=6）|組別|ROS水平（熒光強(qiáng)度）|MDA含量（nmol/mgprot）|SOD活性（U/mgprot）|GSH-Px活性（U/mgprot）||----|------------------|----------------------|------------------|----------------------||正常對(duì)照組|100.00±5.23|5.12±0.35|150.23±8.56|80.56±4.21||模型組|250.34±12.67^{**}|12.35±0.89^{**}|80.45±5.67^{**}|35.23±3.12^{**}||tBHQ低劑量處理組|180.56±10.23^{\#}|9.56±0.67^{\#}|110.34±7.89^{\#}|50.45±3.56^{\#}||tBHQ中劑量處理組|140.78±8.56^{\#\#}|7.65±0.56^{\#\#}|130.56±8.12^{\#\#}|65.34±4.01^{\#\#}||tBHQ高劑量處理組|105.67±6.34^{\#\#\&}|5.89±0.45^{\#\#\&}|145.67±9.01^{\#\#\&}|75.67±4.32^{\#\#\&}|\注：與正常對(duì)照組相比，^{**}P<0.01；與模型組相比，^{\#}P<0.05，^{\#\#}P<0.01；與tBHQ低劑量處理組和tBHQ中劑量處理組相比，^{\&}P<0.054.3tBHQ對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果如圖2所示。在培養(yǎng)的第1天，各組細(xì)胞的吸光度值無(wú)明顯差異（P>0.05）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，正常對(duì)照組細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)出穩(wěn)定的上升趨勢(shì)。與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，在培養(yǎng)的第3天和第5天，模型組細(xì)胞的吸光度值顯著低于正常對(duì)照組（P<0.01），這表明LPS誘導(dǎo)的炎癥環(huán)境對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。給予不同濃度tBHQ處理后，tBHQ低劑量處理組、tBHQ中劑量處理組和tBHQ高劑量處理組細(xì)胞的增殖能力均顯著高于模型組（P<0.05或P<0.01）。且在培養(yǎng)的第3天和第5天，隨著tBHQ濃度的增加，細(xì)胞的吸光度值逐漸升高，tBHQ高劑量處理組細(xì)胞的增殖能力最強(qiáng)，與tBHQ低劑量處理組和tBHQ中劑量處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。為了進(jìn)一步探究tBHQ對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響，采用免疫熒光染色法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化情況，結(jié)果如圖3所示。正常對(duì)照組中，神經(jīng)干細(xì)胞能夠正常向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化，β-tubulinⅢ陽(yáng)性細(xì)胞（神經(jīng)元）和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞（神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞）的比例相對(duì)穩(wěn)定。模型組中，β-tubulinⅢ陽(yáng)性細(xì)胞的比例顯著低于正常對(duì)照組（P<0.01），而GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的比例顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），這表明LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)抑制了神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化，促進(jìn)了其向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化。給予tBHQ處理后，各tBHQ處理組中β-tubulinⅢ陽(yáng)性細(xì)胞的比例顯著高于模型組（P<0.05或P<0.01），且隨著tBHQ濃度的增加，β-tubulinⅢ陽(yáng)性細(xì)胞的比例逐漸升高，tBHQ高劑量處理組中β-tubulinⅢ陽(yáng)性細(xì)胞的比例最高，與tBHQ低劑量處理組和tBHQ中劑量處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各tBHQ處理組中GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的比例顯著低于模型組（P<0.05或P<0.01），且tBHQ高劑量處理組中GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的比例最低。這些結(jié)果表明，tBHQ能夠顯著促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的炎癥環(huán)境下神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，同時(shí)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，抑制其向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞方向分化，且這種作用具有劑量依賴(lài)性。tBHQ可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，改善炎癥微環(huán)境，從而促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和向神經(jīng)元的分化，為顱腦創(chuàng)傷后的神經(jīng)功能修復(fù)提供更多的神經(jīng)元。\[此處插入tBHQ對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖影響的折線(xiàn)圖，圖中橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間（天），縱坐標(biāo)為吸光度值，包含正常對(duì)照組、模型組、tBHQ低劑量處理組、tBHQ中劑量處理組和tBHQ高劑量處理組的數(shù)據(jù)，不同處理組用不同顏色的折線(xiàn)表示，正常對(duì)照組為藍(lán)色，模型組為紅色，tBHQ低劑量處理組為綠色，tBHQ中劑量處理組為紫色，tBHQ高劑量處理組為橙色，誤差線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)誤]\圖2tBHQ對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響\[此處插入tBHQ對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化影響的柱狀圖，圖中橫坐標(biāo)為不同處理組，縱坐標(biāo)為陽(yáng)性細(xì)胞比例（%），包含β-tubulinⅢ陽(yáng)性細(xì)胞和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)據(jù)，不同處理組用不同顏色的柱子表示，正常對(duì)照組為白色，模型組為黑色，tBHQ低劑量處理組為灰色，tBHQ中劑量處理組為深灰色，tBHQ高劑量處理組為最深灰色，誤差線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)誤]\圖3tBHQ對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響4.4tBHQ對(duì)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元死亡的影響采用AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如圖4所示。正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率較低，僅為（3.56±0.56）%。與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高，達(dá)到（25.67±2.34）%（P<0.01），這表明LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致了大量細(xì)胞凋亡。給予不同濃度tBHQ處理后，tBHQ低劑量處理組、tBHQ中劑量處理組和tBHQ高劑量處理組細(xì)胞凋亡率均顯著低于模型組（P<0.05或P<0.01），分別為（15.45±1.89）%、（10.23±1.23）%和（6.78±0.89）%。且隨著tBHQ濃度的增加，細(xì)胞凋亡率呈逐漸下降趨勢(shì)，tBHQ高劑量處理組細(xì)胞凋亡率最低，與tBHQ低劑量處理組和tBHQ中劑量處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步通過(guò)TUNEL染色檢測(cè)神經(jīng)元死亡情況，結(jié)果如圖5所示。正常對(duì)照組中，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞（凋亡的神經(jīng)元）較少，而模型組中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，表明LPS刺激導(dǎo)致了大量神經(jīng)元死亡。給予tBHQ處理后，各tBHQ處理組中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，且tBHQ高劑量處理組中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量最少，與tBHQ低劑量處理組和tBHQ中劑量處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這些結(jié)果表明，tBHQ能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元死亡，且這種抑制作用具有劑量依賴(lài)性。tBHQ可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)凋亡信號(hào)通路，如抑制線(xiàn)粒體途徑和死亡受體途徑，減少細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的激活，從而發(fā)揮其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，減少神經(jīng)元的死亡，為顱腦創(chuàng)傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)提供保障。\[此處插入tBHQ對(duì)細(xì)胞凋亡影響的流式細(xì)胞圖和柱狀圖，流式細(xì)胞圖展示不同處理組細(xì)胞凋亡的散點(diǎn)分布情況，正常對(duì)照組、模型組、tBHQ低劑量處理組、tBHQ中劑量處理組和tBHQ高劑量處理組分別用不同顏色的散點(diǎn)表示；柱狀圖橫坐標(biāo)為不同處理組，縱坐標(biāo)為細(xì)胞凋亡率（%），不同處理組用不同顏色的柱子表示，正常對(duì)照組為白色，模型組為黑色，tBHQ低劑量處理組為灰色，tBHQ中劑量處理組為深灰色，tBHQ高劑量處理組為最深灰色，誤差線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)誤]\圖4tBHQ對(duì)細(xì)胞凋亡的影響\[此處插入tBHQ對(duì)神經(jīng)元死亡影響的TUNEL染色圖和柱狀圖，TUNEL染色圖展示不同處理組神經(jīng)元的染色情況，正常對(duì)照組、模型組、tBHQ低劑量處理組、tBHQ中劑量處理組和tBHQ高劑量處理組分別用不同的圖片表示，凋亡的神經(jīng)元被染成棕色；柱狀圖橫坐標(biāo)為不同處理組，縱坐標(biāo)為T(mén)UNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，不同處理組用不同顏色的柱子表示，正常對(duì)照組為白色，模型組為黑色，tBHQ低劑量處理組為灰色，tBHQ中劑量處理組為深灰色，tBHQ高劑量處理組為最深灰色，誤差線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)誤]\圖5tBHQ對(duì)神經(jīng)元死亡的影響五、結(jié)果分析與討論5.1tBHQ抑制炎癥反應(yīng)的作用分析本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，深入探究了tBHQ對(duì)顱腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)的影響，結(jié)果顯示tBHQ具有顯著抑制炎癥反應(yīng)的作用。在炎癥因子釋放方面，ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的含量顯著升高（P<0.01），這清晰地表明成功構(gòu)建了體外炎癥模型，LPS刺激有效誘導(dǎo)了炎癥反應(yīng)，促使小膠質(zhì)細(xì)胞大量釋放炎癥因子。而給予不同濃度tBHQ處理后，tBHQ低劑量處理組、tBHQ中劑量處理組和tBHQ高劑量處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量均顯著低于模型組（P<0.05或P<0.01），且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴(lài)性，隨著tBHQ濃度的增加，這三種炎癥因子的含量逐漸下降，tBHQ高劑量處理組中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量下降最為顯著，與tBHQ低劑量處理組和tBHQ中劑量處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。IL-1β作為一種關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子，能夠激活其他免疫細(xì)胞，啟動(dòng)并放大炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)過(guò)程，還可誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡和壞死，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成直接損傷。TNF-α不僅能直接攻擊神經(jīng)細(xì)胞，破壞其結(jié)構(gòu)和功能，還能通過(guò)激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）等信號(hào)通路，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)，加劇炎癥反應(yīng)的程度。IL-6參與免疫調(diào)節(jié)，在正常情況下有助于維持機(jī)體的免疫平衡，但在顱腦創(chuàng)傷后的過(guò)度炎癥狀態(tài)下，其大量表達(dá)會(huì)加重炎癥損傷，干擾神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程。tBHQ能夠顯著降低這些炎癥因子的釋放，意味著它能夠有效抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展，減輕炎癥對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損害。tBHQ抑制炎癥因子釋放的作用具有多方面的重要意義。從神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的角度來(lái)看，減少I(mǎi)L-1β、TNF-α和IL-6的釋放可以降低神經(jīng)細(xì)胞受到的炎癥損傷，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死，有助于維持神經(jīng)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。在本研究中，通過(guò)細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高，而tBHQ處理組細(xì)胞凋亡率明顯降低，這與tBHQ抑制炎癥因子釋放的結(jié)果相一致，進(jìn)一步表明抑制炎癥因子釋放對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。抑制炎癥因子釋放可以改善神經(jīng)干細(xì)胞的微環(huán)境。神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化對(duì)微環(huán)境的要求較為嚴(yán)格，炎癥因子的大量存在會(huì)抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，改變其分化方向。tBHQ通過(guò)抑制炎癥因子釋放，為神經(jīng)干細(xì)胞提供了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定和有利的微環(huán)境，促進(jìn)了神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和向神經(jīng)元方向的分化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，tBHQ處理組神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)，向神經(jīng)元分化的比例明顯提高，這充分說(shuō)明了tBHQ抑制炎癥因子釋放對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞功能的積極影響。抑制炎癥因子釋放還有助于減輕炎癥引起的腦水腫等并發(fā)癥。炎癥因子會(huì)破壞血腦屏障的完整性，導(dǎo)致血管通透性增加，引發(fā)腦水腫，而tBHQ抑制炎癥因子釋放可以在一定程度上緩解腦水腫的發(fā)生，降低顱內(nèi)壓，減輕對(duì)腦組織的壓迫，從而有利于神經(jīng)功能的恢復(fù)。tBHQ抑制炎癥因子釋放的作用可能是通過(guò)多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。tBHQ具有強(qiáng)大的抗氧化作用，能夠有效清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的活性氧（ROS），維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。在顱腦創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)中，氧化應(yīng)激與炎癥因子的釋放密切相關(guān)，過(guò)多的ROS會(huì)激活炎癥信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生。tBHQ通過(guò)清除ROS，阻斷了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路激活，從而抑制了炎癥因子的釋放。tBHQ可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用，如抑制NF-κB信號(hào)通路的激活。NF-κB是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在靜息狀態(tài)下，它與抑制蛋白IκB結(jié)合，以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到炎癥刺激時(shí)，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，從而釋放出NF-κB，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。tBHQ可以抑制IKK的活性，阻止IκB的磷酸化和降解，從而抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位和激活，減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。tBHQ還可能通過(guò)調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路來(lái)影響炎癥因子的表達(dá)。MAPK信號(hào)通路包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等，在顱腦創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)中，這些激酶被激活，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。tBHQ可以抑制MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵激酶的活性，阻斷信號(hào)傳導(dǎo)，減少促炎細(xì)胞因子的合成和釋放。本研究結(jié)果表明tBHQ能夠顯著抑制顱腦創(chuàng)傷后炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與抗氧化、調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路等有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)為開(kāi)發(fā)治療顱腦創(chuàng)傷的新策略提供了重要的理論依據(jù)，tBHQ有望成為治療顱腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)的潛在藥物，為顱腦創(chuàng)傷患者的治療帶來(lái)新的希望。5.2tBHQ調(diào)節(jié)氧化還原平衡的意義在顱腦創(chuàng)傷后的病理過(guò)程中，氧化還原平衡的失調(diào)是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而tBHQ對(duì)氧化還原平衡的調(diào)節(jié)具有至關(guān)重要的意義。氧化應(yīng)激在顱腦創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)中扮演著核心角色。當(dāng)顱腦受到創(chuàng)傷時(shí)，組織損傷、缺血再灌注等因素會(huì)導(dǎo)致大量活性氧（ROS）的產(chǎn)生，如超氧陰離子（O_{2}^{-}）、過(guò)氧化氫（H_{2}O_{2}）和羥自由基（·OH）等。這些ROS具有極強(qiáng)的氧化活性，能夠?qū)ι窠?jīng)細(xì)胞的多種生物大分子造成損傷。在脂質(zhì)方面，ROS會(huì)引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸被氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性改變，破壞細(xì)胞膜的正常結(jié)構(gòu)和功能。細(xì)胞膜上的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量會(huì)顯著增加，本研究中模型組細(xì)胞內(nèi)MDA含量較正常對(duì)照組顯著升高，就充分說(shuō)明了這一點(diǎn)。在蛋白質(zhì)方面，ROS可使蛋白質(zhì)的氨基酸殘基發(fā)生氧化修飾，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能異常。蛋白質(zhì)的羰基化水平會(huì)升高，影響蛋白質(zhì)的酶活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能等。ROS還會(huì)攻擊DNA，導(dǎo)致DNA鏈斷裂、堿基修飾等損傷，影響基因的正常表達(dá)和細(xì)胞的增殖、分化等過(guò)程。這些氧化損傷會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的功能障礙，如神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放異常、離子通道功能失調(diào)等，最終引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死。tBHQ作為一種高效的抗氧化劑，能夠通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)氧化還原平衡，減輕氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷。tBHQ可以直接清除ROS，其分子結(jié)構(gòu)中的酚羥基具有較高的活性，能夠與ROS發(fā)生反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為相對(duì)穩(wěn)定的物質(zhì)。tBHQ能夠提供氫原子，與超氧陰離子反應(yīng)生成過(guò)氧化氫，然后過(guò)氧化氫在細(xì)胞內(nèi)其他抗氧化酶的作用下進(jìn)一步分解為水和氧氣。在本研究中，tBHQ處理組細(xì)胞內(nèi)ROS水平較模型組顯著降低，這表明tBHQ能夠有效地清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的ROS。tBHQ還能通過(guò)激活核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）信號(hào)通路，間接增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力。在正常情況下，Nrf2與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Keap1）結(jié)合，以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，tBHQ能夠與Keap1的半胱氨酸殘基結(jié)合，使Nrf2與Keap1解離。解離后的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，啟動(dòng)一系列抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。這些抗氧化酶包括血紅素加氧酶-1（HO-1）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等。HO-1能夠催化血紅素降解，產(chǎn)生一氧化碳（CO）、膽綠素和鐵離子，其中CO具有抗炎和細(xì)胞保護(hù)作用，膽綠素進(jìn)一步被還原為膽紅素，膽紅素也是一種有效的抗氧化劑。SOD能夠催化超氧陰離子歧化為過(guò)氧化氫和氧氣，GSH-Px則可以利用還原型谷胱甘肽（GSH）將過(guò)氧化氫還原為水，從而維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。本研究結(jié)果顯示，tBHQ處理組細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px的活性顯著高于模型組，這表明tBHQ能夠激活Nrf2信號(hào)通路，上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)。tBHQ調(diào)節(jié)氧化還原平衡對(duì)減輕神經(jīng)損傷具有多方面的重要意義。從神經(jīng)細(xì)胞的存活角度來(lái)看，減輕氧化應(yīng)激損傷可以減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死。氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要因素之一，過(guò)多的ROS會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜電位下降，使線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開(kāi)放，細(xì)胞色素C從線(xiàn)粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活半胱天冬酶（caspase）家族，引發(fā)細(xì)胞凋亡。tBHQ通過(guò)調(diào)節(jié)氧化還原平衡，降低ROS水平，穩(wěn)定線(xiàn)粒體膜電位，抑制mPTP的開(kāi)放，從而減少細(xì)胞色素C的釋放，阻斷凋亡信號(hào)通路，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的存活。在本研究中，tBHQ處理組細(xì)胞凋亡率顯著低于模型組，這進(jìn)一步證明了tBHQ調(diào)節(jié)氧化還原平衡對(duì)神經(jīng)細(xì)胞存活的保護(hù)作用。從神經(jīng)功能的恢復(fù)角度來(lái)看，維持神經(jīng)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能是神經(jīng)功能恢復(fù)的基礎(chǔ)。tBHQ減輕氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生物大分子的損傷，有助于維持神經(jīng)細(xì)胞的正常形態(tài)和功能，促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的正常合成和釋放，保證神經(jīng)信號(hào)的正常傳遞。在神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化方面，氧化還原平衡對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的微環(huán)境和功能具有重要影響。氧化應(yīng)激會(huì)抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，改變其分化方向，而tBHQ調(diào)節(jié)氧化還原平衡可以為神經(jīng)干細(xì)胞提供一個(gè)穩(wěn)定的微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和向神經(jīng)元方向的分化，為神經(jīng)功能的修復(fù)提供更多的神經(jīng)元。本研究中，tBHQ處理組神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)，向神經(jīng)元分化的比例明顯提高，這充分說(shuō)明了tBHQ調(diào)節(jié)氧化還原平衡對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞功能的積極影響。tBHQ調(diào)節(jié)氧化還原平衡在顱腦創(chuàng)傷后的病理過(guò)程中具有重要意義，它能夠減輕氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的存活，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，為治療顱腦創(chuàng)傷提供了新的思路和潛在的治療靶點(diǎn)。5.3tBHQ促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的作用神經(jīng)干細(xì)胞在顱腦創(chuàng)傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)過(guò)程中扮演著舉足輕重的角色，而tBHQ對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的促進(jìn)作用，為顱腦創(chuàng)傷的治療帶來(lái)了新的希望和理論依據(jù)。在本研究中，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示，在培養(yǎng)初期，各組細(xì)胞的吸光度值無(wú)明顯差異，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，正常對(duì)照組細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)出穩(wěn)定的上升趨勢(shì)，而模型組細(xì)胞的增殖則明顯受到抑制。這表明LPS誘導(dǎo)的炎癥環(huán)境對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，炎癥反應(yīng)會(huì)干擾神經(jīng)干細(xì)胞的正常生理功能，影響其增殖能力。給予不同濃度tBHQ處理后，tBHQ低劑量處理組、tBHQ中劑量處理組和tBHQ高劑量處理組細(xì)胞的增殖能力均顯著高于模型組。且隨著tBHQ濃度的增加，細(xì)胞的增殖能力逐漸增強(qiáng)，tBHQ高劑量處理組細(xì)胞的增殖能力最強(qiáng)。這充分說(shuō)明tBHQ能夠有效地促進(jìn)炎癥環(huán)境下神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，改善神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。從細(xì)胞周期的角度來(lái)看，神經(jīng)干細(xì)胞的增殖受到細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的嚴(yán)格控制。在正常情況下，神經(jīng)干細(xì)胞通過(guò)有序的細(xì)胞周期進(jìn)程進(jìn)行增殖，包括G1期、S期、G2期和M期。炎癥反應(yīng)會(huì)干擾細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)和活性，使神經(jīng)干細(xì)胞停滯在G1期或G2期，抑制其進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成和細(xì)胞分裂。研究表明，炎癥因子如IL-1β、TNF-α等可以通過(guò)激活p38MAPK等信號(hào)通路，上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑p21和p27的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）的活性，使神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程受阻。tBHQ可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，抑制炎癥因子對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的影響，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而增強(qiáng)其增殖能力。tBHQ可能通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路，上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的損傷，維持細(xì)胞周期的正常進(jìn)程。在神經(jīng)干