2024年臨床執(zhí)業(yè)醫(yī)師考試輔導(dǎo)講義《生物化學(xué)》第十三章DNA重組技術(shù)第十三章DNA重組技術(shù)第一節(jié)DNA重組技術(shù)概述DNA重組技術(shù)，又稱基因工程，是指將不同來源的DNA分子進(jìn)行體外切割、連接，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，使外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)，從而獲得特定基因產(chǎn)物或新的遺傳性狀的技術(shù)。它誕生于20世紀(jì)70年代，是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心。其基本步驟包括目的基因的獲取、基因載體的選擇與構(gòu)建、目的基因與載體的連接、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞、重組體的篩選與鑒定以及目的基因的表達(dá)與調(diào)控。第二節(jié)工具酶在DNA重組技術(shù)中，工具酶起著關(guān)鍵作用。1.限制性核酸內(nèi)切酶：能夠識別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列，并在識別位點(diǎn)或其附近切割DNA雙鏈。分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，其中Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶在基因工程中應(yīng)用最為廣泛。例如EcoRⅠ，它識別的序列是5’-GAATTC-3’，切割后產(chǎn)生黏性末端。2.DNA連接酶：催化DNA片段之間的磷酸二酯鍵形成，將目的基因與載體連接起來。常用的是T4DNA連接酶，它可以連接黏性末端和平末端。3.DNA聚合酶：如大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ及其大片段（Klenow片段），可用于DNA的合成、缺口填補(bǔ)等。4.逆轉(zhuǎn)錄酶：以RNA為模板合成DNA，在獲取真核生物目的基因時(shí)非常有用。第三節(jié)基因載體基因載體是攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞的工具。1.質(zhì)粒：是細(xì)菌染色體外的環(huán)狀雙鏈DNA分子，具有自主復(fù)制能力。常用的質(zhì)粒載體有pBR322、pUC系列等。質(zhì)粒載體具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)、篩選標(biāo)記（如抗生素抗性基因）等特點(diǎn)。2.噬菌體：如λ噬菌體，經(jīng)過改造后可作為基因載體。它可以容納較大的外源DNA片段，感染細(xì)菌的效率高。3.病毒載體：如腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等，可用于將目的基因?qū)胝婧思?xì)胞，在基因治療中應(yīng)用廣泛。第四節(jié)目的基因的獲取1.基因組DNA文庫：將生物體的全部基因組DNA用限制性核酸內(nèi)切酶切割成一定大小的片段，與載體連接后導(dǎo)入宿主細(xì)胞，構(gòu)建成包含生物體全部基因的文庫。2.cDNA文庫：以mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，再與載體連接導(dǎo)入宿主細(xì)胞，構(gòu)建的文庫只包含表達(dá)的基因。3.PCR技術(shù)：即聚合酶鏈反應(yīng)，通過設(shè)計(jì)特異性引物，在體外快速擴(kuò)增目的基因。它具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。4.化學(xué)合成法：如果已知目的基因的核苷酸序列，可通過化學(xué)方法合成目的基因。第五節(jié)重組DNA分子的構(gòu)建與導(dǎo)入1.重組DNA分子的構(gòu)建：選擇合適的限制酶切割目的基因和載體，然后用DNA連接酶將它們連接起來，形成重組DNA分子。2.重組DNA分子的導(dǎo)入-轉(zhuǎn)化：將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌等原核細(xì)胞的過程。常用的方法有CaCl?法，使細(xì)菌處于感受態(tài)，易于吸收外源DNA。-轉(zhuǎn)染：將重組DNA分子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程。常用的方法有磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等。-感染：利用噬菌體或病毒載體將重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞。第六節(jié)重組體的篩選與鑒定1.遺傳學(xué)方法：根據(jù)載體上的篩選標(biāo)記進(jìn)行篩選，如抗生素抗性篩選。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞接種在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上，只有含有重組質(zhì)粒的細(xì)胞才能生長。2.核酸雜交法：用標(biāo)記的核酸探針與重組體中的DNA進(jìn)行雜交，檢測目的基因的存在。常用的方法有Southern印跡雜交、Northern印跡雜交等。3.PCR法：設(shè)計(jì)特異性引物，對重組體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測目的基因。4.測序法：對重組體中的目的基因進(jìn)行測序，確定其核苷酸序列的正確性。第七節(jié)目的基因的表達(dá)與調(diào)控1.原核表達(dá)系統(tǒng)：常用的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)簡單、生長快、成本低。但原核細(xì)胞缺乏真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)加工和修飾能力。2.真核表達(dá)系統(tǒng)：如酵母表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。真核表達(dá)系統(tǒng)可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的加工和修飾，表達(dá)的蛋白質(zhì)具有天然的生物學(xué)活性。試題1.下列哪種酶是DNA重組技術(shù)中常用的限制性核酸內(nèi)切酶？A.DNA聚合酶B.逆轉(zhuǎn)錄酶C.EcoRⅠD.T4DNA連接酶答案：C。EcoRⅠ是常用的限制性核酸內(nèi)切酶，DNA聚合酶用于DNA合成，逆轉(zhuǎn)錄酶用于以RNA合成DNA，T4DNA連接酶用于連接DNA片段。2.基因工程中常用的質(zhì)粒載體不具有以下哪個(gè)特點(diǎn)？A.多個(gè)限制酶切點(diǎn)B.自主復(fù)制能力C.只能容納小片段DNAD.篩選標(biāo)記答案：C。質(zhì)粒載體可容納一定大小的外源DNA片段，并非只能容納小片段DNA，它具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)、自主復(fù)制能力和篩選標(biāo)記等特點(diǎn)。3.構(gòu)建cDNA文庫時(shí)，需要用到的酶是？A.限制性核酸內(nèi)切酶B.逆轉(zhuǎn)錄酶C.DNA連接酶D.以上都是答案：D。構(gòu)建cDNA文庫時(shí)，先用逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA合成cDNA，再用限制性核酸內(nèi)切酶切割cDNA和載體，最后用DNA連接酶連接。4.PCR技術(shù)的基本反應(yīng)步驟不包括？A.變性B.退火C.延伸D.轉(zhuǎn)錄答案：D。PCR技術(shù)基本步驟為變性、退火、延伸，轉(zhuǎn)錄不是PCR的步驟。5.下列哪種方法可用于將重組DNA分子導(dǎo)入真核細(xì)胞？A.CaCl?法B.轉(zhuǎn)化C.轉(zhuǎn)染D.感染答案：C。CaCl?法和轉(zhuǎn)化主要用于原核細(xì)胞，轉(zhuǎn)染用于將重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞，感染主要指利用病毒載體導(dǎo)入。6.用于篩選含有重組質(zhì)粒的細(xì)胞的方法是？A.核酸雜交法B.抗生素抗性篩選C.PCR法D.測序法答案：B。抗生素抗性篩選是根據(jù)載體上的抗生素抗性基因篩選含有重組質(zhì)粒的細(xì)胞，核酸雜交法、PCR法和測序法主要用于鑒定目的基因。7.原核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)不包括？A.培養(yǎng)簡單B.生長快C.蛋白質(zhì)加工和修飾能力強(qiáng)D.成本低答案：C。原核細(xì)胞缺乏真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)加工和修飾能力，這是原核表達(dá)系統(tǒng)的不足，其優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)簡單、生長快、成本低。8.下列哪種載體可容納較大的外源DNA片段？A.質(zhì)粒載體B.λ噬菌體載體C.酵母表達(dá)載體D.腺病毒載體答案：B。λ噬菌體載體可以容納較大的外源DNA片段，質(zhì)粒載體容納片段相對較小，酵母表達(dá)載體和腺病毒載體主要用于表達(dá)，不是以容納大片段見長。9.逆轉(zhuǎn)錄酶的作用是？A.切割DNAB.連接DNA片段C.以RNA為模板合成DNAD.以DNA為模板合成RNA答案：C。逆轉(zhuǎn)錄酶是以RNA為模板合成DNA的酶。10.以下關(guān)于DNA連接酶的說法正確的是？A.只能連接黏性末端B.只能連接平末端C.可以連接黏性末端和平末端D.不能連接DNA片段答案：C。T4DNA連接酶可以連接黏性末端和平末端。11.構(gòu)建基因組DNA文庫時(shí)，首先要進(jìn)行的步驟是？A.提取基因組DNAB.用限制性核酸內(nèi)切酶切割DNAC.與載體連接D.導(dǎo)入宿主細(xì)胞答案：A。構(gòu)建基因組DNA文庫首先要提取生物體的基因組DNA。12.篩選重組體時(shí)，Southern印跡雜交主要用于檢測？A.RNAB.DNAC.蛋白質(zhì)D.多糖答案：B。Southern印跡雜交用于檢測DNA。13.下列哪種表達(dá)系統(tǒng)可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的加工和修飾？A.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)B.酵母表達(dá)系統(tǒng)C.噬菌體表達(dá)系統(tǒng)D.以上都可以答案：B。酵母表達(dá)系統(tǒng)屬于真核表達(dá)系統(tǒng)，可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的加工和修飾，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和噬菌體表達(dá)系統(tǒng)屬于原核表達(dá)系統(tǒng)，缺乏此能力。14.基因工程中，將重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞常用的方法是？A.轉(zhuǎn)染B.感染C.轉(zhuǎn)化D.電穿孔法答案：C。將重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞常用轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)染用于真核細(xì)胞，感染用于噬菌體或病毒載體導(dǎo)入，電穿孔法也是一種導(dǎo)入方法，但不是常用的細(xì)菌導(dǎo)入方法。15.以下哪種技術(shù)可以在體外快速擴(kuò)增目的基因？A.核酸雜交技術(shù)B.PCR技術(shù)C.化學(xué)合成法D.基因文庫構(gòu)建技術(shù)答案：B。PCR技術(shù)可以在體外快速擴(kuò)增目的基因，核酸雜交技術(shù)用于檢測，化學(xué)合成法用于合成已知序列基因，基因文庫構(gòu)建用于獲取基因。16.常用的質(zhì)粒載體pBR322具有以下哪種篩選標(biāo)記？A.氨芐青霉素抗性基因B.四環(huán)素抗性基因C.兩者都有D.兩者都無答案：C。pBR322具有氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因作為篩選標(biāo)記。17.真核生物基因在原核細(xì)胞中表達(dá)可能會遇到的問題是？A.表達(dá)量低B.蛋白質(zhì)不能正確折疊C.缺乏蛋白質(zhì)加工和修飾D.以上都是答案：D。原核細(xì)胞缺乏真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)加工和修飾能力，可能導(dǎo)致表達(dá)量低、蛋白質(zhì)不能正確折疊等問題。18.下列哪種酶用于填補(bǔ)DNA缺口？A.Klenow片段B.逆轉(zhuǎn)錄酶C.限制性核酸內(nèi)切酶D.T4DNA連接酶答案：A。Klenow片段可用于填補(bǔ)DNA缺口，逆轉(zhuǎn)錄酶用于合成cDNA，限制性核酸內(nèi)切酶用于切割DNA，T4DNA連接酶用于連接DNA片段。19.構(gòu)建cDNA文庫時(shí)，所使用的模板是？A.基因組DNAB.mRNAC.tRNAD.rRNA答案：B。構(gòu)建cDNA文庫以mRNA為模板合成cDNA。20.以下關(guān)于基因載體的說法錯(cuò)誤的是？A.病毒載體可用于基因治療B.噬菌體載體可以容納較大的外源DNA片段C.質(zhì)粒載體只能在原核細(xì)胞中復(fù)制D.酵母人工染色體可用于克隆大片段DNA答案：C。部分質(zhì)粒載體經(jīng)過改造后也可以在真核細(xì)胞中復(fù)制。21.限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA后產(chǎn)生的末端類型不包括？A.黏性末端B.平末端C.單鏈末端D.突出末端答案：C。限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA產(chǎn)生黏性末端和平末端，黏性末端也可稱為突出末端，不產(chǎn)生單鏈末端。22.下列哪種方法不是用于重組體篩選的？A.酶切鑒定B.核酸雜交C.蛋白質(zhì)電泳D.PCR擴(kuò)增答案：C。蛋白質(zhì)電泳主要用于分析蛋白質(zhì)，酶切鑒定、核酸雜交、PCR擴(kuò)增可用于重組體篩選。23.原核表達(dá)系統(tǒng)中，目的基因的表達(dá)調(diào)控元件不包括？A.啟動子B.增強(qiáng)子C.核糖體結(jié)合位點(diǎn)D.終止子答案：B。增強(qiáng)子是真核基因表達(dá)調(diào)控元件，原核表達(dá)系統(tǒng)有啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和終止子等調(diào)控元件。24.基因工程中，常用的病毒載體不包括？A.腺病毒載體B.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體C.λ噬菌體載體D.慢病毒載體答案：C。λ噬菌體載體屬于噬菌體載體，不是病毒載體，腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體是常用的病毒載體。25.用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，需要的物質(zhì)不包括？A.模板DNAB.引物C.四種dNTPD.限制性核酸內(nèi)切酶答案：D。PCR擴(kuò)增需要模板DNA、引物、四種dNTP和DNA聚合酶等，不需要限制性核酸內(nèi)切酶。26.構(gòu)建基因組DNA文庫和cDNA文庫的主要區(qū)別在于？A.所使用的載體不同B.所提取的核酸不同C.構(gòu)建方法不同D.以上都是答案：B。構(gòu)建基因組DNA文庫提取的是基因組DNA，構(gòu)建cDNA文庫提取的是mRNA，這是主要區(qū)別，載體和構(gòu)建方法也有差異，但不是主要區(qū)別。27.以下哪種細(xì)胞可作為真核表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞？A.大腸桿菌B.酵母細(xì)胞C.噬菌體D.以上都可以答案：B。酵母細(xì)胞可作為真核表達(dá)系統(tǒng)宿主細(xì)胞，大腸桿菌和噬菌體屬于原核生物。28.重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，首先要進(jìn)行的篩選是？A.抗生素抗性篩選B.核酸雜交篩選C.PCR篩選D.測序篩選答案：A。通常先根據(jù)載體上的抗生素抗性進(jìn)行初步篩選。29.化學(xué)合成法適用于獲取哪種類型的目的基因？A.已知序列的小片段基因B.未知序列的基因C.大片段基因D.以上都適用答案：A?；瘜W(xué)合成法適用于已知序列的小片段基因，對于未知序列和大片段基因不適用。30.下列哪種酶可以將RNA轉(zhuǎn)化為DNA？A.DNA聚合酶B.逆轉(zhuǎn)錄酶C.限制性核酸內(nèi)切酶D.T4DNA連接酶答案：B。逆轉(zhuǎn)錄酶可以將RNA轉(zhuǎn)化為DNA。31.基因載體的作用不包括？A.攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞B.為目的基因提供復(fù)制能力C.對目的基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控D.切割目的基因答案：D?；蜉d體用于攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞，提供復(fù)制能力和表達(dá)調(diào)控，不用于切割目的基因，切割目的基因用限制性核酸內(nèi)切酶。32.以下哪種方法可用于檢測重組體中目的基因的表達(dá)產(chǎn)物？A.Western印跡雜交B.Southern印跡雜交C.Northern印跡雜交D.PCR技術(shù)答案：A。Western印跡雜交用于檢測蛋白質(zhì)，可檢測目的基因表達(dá)產(chǎn)物，Southern印跡雜交檢測DNA，Northern印跡雜交檢測RNA，PCR技術(shù)用于擴(kuò)增DNA。33.原核表達(dá)系統(tǒng)中，影響目的基因表達(dá)水平的因素不包括？A.啟動子強(qiáng)度B.密碼子偏愛性C.增強(qiáng)子活性D.核糖體結(jié)合位點(diǎn)答案：C。原核細(xì)胞沒有增強(qiáng)子，啟動子強(qiáng)度、密碼子偏愛性和核糖體結(jié)合位點(diǎn)會影響原核表達(dá)系統(tǒng)中目的基因表達(dá)水平。34.真核表達(dá)系統(tǒng)相比原核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢是？A.表達(dá)效率高B.成本低C.蛋白質(zhì)具有天然活性D.培養(yǎng)簡單答案：C。真核表達(dá)系統(tǒng)可對蛋白質(zhì)進(jìn)行正確加工和修飾，使蛋白質(zhì)具有天然活性，原核表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)效率、成本和培養(yǎng)方面有優(yōu)勢。35.構(gòu)建基因文庫時(shí)，載體與目的基因連接后，下一步的操作是？A.導(dǎo)入宿主細(xì)胞B.篩選重組體C.鑒定目的基因D.表達(dá)目的基因答案：A。連接后要將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。36.以下哪種技術(shù)可用于檢測目的基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平？A.Southern印跡雜交B.Northern印跡雜交C.Western印跡雜交D.PCR技術(shù)答案：B。Northern印跡雜交用于檢測RNA，可檢測目的基因轉(zhuǎn)錄水平，Southern印跡雜交檢測DNA，Western印跡雜交檢測蛋白質(zhì)，PCR技術(shù)用于擴(kuò)增DNA。37.基因工程中，常用的篩選標(biāo)記基因不包括？A.綠色熒光蛋白基因B.氯霉素抗性基因C.胰島素基因D.潮霉素抗性基因答案：C。胰島素基因不是篩選標(biāo)記基因，綠色熒光蛋白基因、氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因可作為篩選標(biāo)記。38.下列哪種載體的克隆容量最大？A.質(zhì)粒載體B.λ噬菌體載體C.酵母人工染色體D.腺病毒載體答案：C。酵母人工染色體克隆容量最大，可容納大片段DNA。39.重組DNA技術(shù)中，對目的基因進(jìn)行初步鑒定常用的方法是？A.測序法B.PCR法C.核酸雜交法D.酶切鑒定法答案：D。酶切鑒定法可對目的基因進(jìn)行初步鑒定，測序法最準(zhǔn)確但成本高，PCR法用于擴(kuò)增檢測，核酸雜交法用于檢測存在情況。40.原核表達(dá)系統(tǒng)中，目的基因表達(dá)的產(chǎn)物可能以哪種形式存在？A.可溶性蛋白B.包涵體C.分泌蛋白D.以上都是答案：D。原核表達(dá)系統(tǒng)中目的基因表達(dá)產(chǎn)物可能以可溶性蛋白、包涵體、分泌蛋白形式存在。41.真核表達(dá)系統(tǒng)中，常用的啟動子不包括？A.SV40啟動子B.T7啟動子C.CMV啟動子D.以上都不是答案：B。T7啟動子是原核表達(dá)系統(tǒng)常用啟動子，SV40啟動子和CMV啟動子是真核表達(dá)系統(tǒng)常用啟動子。42.構(gòu)建基因文庫時(shí)，所使用的載體應(yīng)具備的條件不包括？A.多個(gè)限制酶切點(diǎn)B.篩選標(biāo)記C.強(qiáng)啟動子D.自主復(fù)制能力答案：C。載體一般不需要強(qiáng)啟動子，需要多個(gè)限制酶切點(diǎn)、篩選標(biāo)記和自主復(fù)制能力。43.以下哪種方法可用于分離純化重組蛋白？A.離子交換色譜B.親和色譜C.凝膠過濾色譜D.以上都是答案：D。離子交換色譜