丹頂鶴α干擾素的分子克隆、原核表達及抗病毒活性的深度解析一、緒論1.1丹頂鶴的生態(tài)地位與研究現(xiàn)狀丹頂鶴（Grusjaponensis），作為鶴科鶴屬的大型涉禽，是東亞地區(qū)特有的珍稀鳥類，在我國被列為國家一級保護動物，也被列入《世界自然保護聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》。其優(yōu)雅的身姿、獨特的習(xí)性以及在生態(tài)系統(tǒng)中的關(guān)鍵作用，使其備受關(guān)注。丹頂鶴主要棲息于開闊平原、沼澤、湖泊、草地、海邊灘涂、蘆葦叢、河岸等地帶，這些濕地生態(tài)系統(tǒng)不僅為丹頂鶴提供了豐富的食物資源，如魚類、甲殼類、昆蟲和水生植物等，也是眾多其他生物的家園，在維持生物多樣性方面發(fā)揮著不可替代的作用。從生態(tài)系統(tǒng)的角度來看，丹頂鶴處于食物鏈的中級消費者位置，它的存在和數(shù)量變化會對整個生態(tài)系統(tǒng)的能量流動和物質(zhì)循環(huán)產(chǎn)生影響。例如，丹頂鶴對某些水生生物的捕食，可以控制這些生物的種群數(shù)量，維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡；同時，丹頂鶴的遷徙行為也促進了不同生態(tài)系統(tǒng)之間的物質(zhì)交換和能量傳遞。近年來，丹頂鶴的生存面臨著諸多威脅，其中傳染病的爆發(fā)是一個重要因素。禽流感、新城疫、皰疹、馬立克病等傳染病時常發(fā)生，給丹頂鶴的種群數(shù)量和健康帶來了嚴重的損失。以禽流感為例，高致病性禽流感病毒一旦在丹頂鶴種群中傳播，可能會導(dǎo)致大量個體死亡，嚴重影響種群的繁衍和生存。由于丹頂鶴的繁殖率較低，每對丹頂鶴每年通常只產(chǎn)1-2枚卵，且幼鶴的成活率也受到多種因素的影響，因此傳染病的爆發(fā)對其種群的恢復(fù)和增長極為不利。在傳染病防治方面，目前的研究主要集中在疫苗接種和疫情監(jiān)測等傳統(tǒng)手段。例如，通過對丹頂鶴接種新城疫疫苗，觀察其血清抗體效價的消長規(guī)律，以認定其免疫能力，從而支持和指導(dǎo)防疫程序的建立。然而，這些方法存在一定的局限性。疫苗的研發(fā)需要針對特定的病毒株，且對于一些新出現(xiàn)的病毒或病毒變異株，疫苗的效果可能不佳。此外，疫情監(jiān)測往往是在疫情發(fā)生后才采取措施，難以做到提前預(yù)防。因此，尋找新的防治手段，提高丹頂鶴對傳染病的抵抗力，成為當前研究的重點和迫切需求。1.2干擾素的分類與功能概述干擾素（interferon，IFN）是一類在特定誘生劑作用下，由細胞基因組控制產(chǎn)生的具有廣泛生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，因其具有干擾病毒復(fù)制的能力而得名。根據(jù)其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、抗原性和細胞來源等，干擾素主要分為三大類：Ⅰ型干擾素、Ⅱ型干擾素和Ⅲ型干擾素。Ⅱ型干擾素只有IFN-γ一個成員，主要由T細胞和自然殺傷（NK）細胞產(chǎn)生，其免疫調(diào)節(jié)作用相較于抗病毒作用更為突出，能夠激活巨噬細胞，增強其吞噬和殺傷病原體的能力，同時也參與T細胞和B細胞的活化與增殖過程，在細胞免疫和體液免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Ⅲ型干擾素包括IFN-λ（IL-28/29），其功能與Ⅰ型干擾素有相似之處，在抗病毒免疫中也發(fā)揮著重要作用，主要作用于上皮細胞等特定細胞類型，誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生抗病毒狀態(tài)。Ⅰ型干擾素又稱病毒干擾素或白細胞干擾素，是干擾素家族中成員最多的一類。在人類中，編碼13個部分同源的IFN-α亞型，以及一個IFN-β和幾個定義不清的單基因產(chǎn)物，如IFN-ε、IFN-τ、IFN-κ、IFN-ω、IFN-δ和IFN-ζ等。在禽類中，IFN-α也是重要的免疫調(diào)節(jié)因子。幾乎所有種類的細胞都能夠產(chǎn)生Ⅰ型干擾素，其中大部分細胞產(chǎn)生IFN-β；造血細胞來源的細胞，特別是漿細胞樣樹突狀細胞（pDC細胞）主要產(chǎn)生IFN-α，其產(chǎn)量是其他細胞的幾百甚至上千倍。當病毒入侵機體后，細胞通過細胞膜或細胞內(nèi)模式識別受體（如Toll樣受體、RIG-Ⅰ樣受體等）識別病毒的病原相關(guān)分子模式（PAMP）信號，進而啟動Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生機制。以識別病毒雙鏈RNA為例，細胞內(nèi)的RIG-Ⅰ樣受體（如RIG-Ⅰ、MDA5等）能夠感知病毒雙鏈RNA的存在，激活下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促使細胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素。Ⅰ型干擾素發(fā)揮生物學(xué)功能是通過與細胞表面的受體結(jié)合，啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程來實現(xiàn)的。所有的Ⅰ型干擾素均通過廣泛表達的異源二聚體受體IFNAR傳遞信號，IFNAR由IFNAR1和IFNAR2兩個亞基組成，它們表達在幾乎所有的有核細胞表面。Ⅰ型干擾素與受體結(jié)合后，使IFNAR1和IFNAR2活化并形成二聚體，形成特定的跨膜蛋白復(fù)合物。其中，活化的IFNAR1與TYK2結(jié)合，IFNAR2與JAK1結(jié)合，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（STATs）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）等信號通路。以JAK-STAT信號通路為例，IFNAR1與JAK家族激酶Tyk2組成性結(jié)合，IFNAR2與Jak1組成性結(jié)合，干擾素結(jié)合其受體后，促進受體寡聚化，進而TYK2與JAK1發(fā)生自磷酸化，并進一步磷酸化STAT1、STAT2、STAT3、STAT5等轉(zhuǎn)錄因子，這些磷酸化的轉(zhuǎn)錄因子形成二聚體后進入細胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)干擾素刺激基因（ISG）的轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生一系列抗病毒蛋白，發(fā)揮抗病毒作用。Ⅰ型干擾素具有強大的抗病毒功能。它可以誘導(dǎo)細胞進入抗病毒狀態(tài)，限制病毒的傳播。當細胞受到病毒感染時，產(chǎn)生的Ⅰ型干擾素與臨近的正常健康細胞的膜特異性受體結(jié)合，激活這些細胞內(nèi)的抗病毒基因轉(zhuǎn)錄表達，產(chǎn)生一組抗病毒物質(zhì)，如蛋白激酶、磷酸二脂酶等。蛋白激酶能夠磷酸化真核細胞的蛋白合成起始因子（eIF）的α亞單位，使其在循環(huán)受到克制，從而抑制病毒蛋白的翻譯；磷酸二脂酶可以降解病毒的mRNA，阻止病毒基因的表達；還有的抗病毒物質(zhì)能抑制轉(zhuǎn)錄酶，阻止mRNA的形成，或者抑制病毒DNA和RNA的合成，從而達到抗病毒的目的。在禽流感病毒感染的研究中發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型干擾素能夠顯著抑制禽流感病毒在細胞內(nèi)的復(fù)制，降低病毒滴度，減輕病毒對細胞的損傷。除了抗病毒功能外，Ⅰ型干擾素還具有重要的抗腫瘤功能。一方面，它可以抑制腫瘤細胞的增殖，通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的表達，使腫瘤細胞停滯在細胞周期的特定階段，從而抑制其生長。另一方面，Ⅰ型干擾素能夠增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，激活自然殺傷細胞（NK細胞）和細胞毒性T淋巴細胞（CTL），使其對腫瘤細胞的殺傷活性增強；還可以誘導(dǎo)腫瘤細胞表面的抗原表達，使其更容易被免疫系統(tǒng)識別和攻擊。在黑色素瘤的研究中，發(fā)現(xiàn)使用Ⅰ型干擾素治療后，腫瘤組織中的NK細胞和CTL浸潤增加，腫瘤細胞的生長受到明顯抑制。1.3研究的目的與意義本研究旨在深入開展丹頂鶴α干擾素的克隆、表達及抗病毒活性分析，以期為丹頂鶴傳染病的防治提供新的思路和方法，填補丹頂鶴免疫相關(guān)研究領(lǐng)域的空白，具有重要的理論和實踐意義。從理論研究層面來看，丹頂鶴作為珍稀瀕危鳥類，其免疫系統(tǒng)相關(guān)研究相對匱乏。通過克隆丹頂鶴α干擾素基因，分析其序列特征，有助于深入了解丹頂鶴的免疫分子機制，揭示其在進化過程中免疫系統(tǒng)的獨特性和適應(yīng)性。這不僅豐富了鳥類免疫學(xué)的理論知識，還為比較免疫學(xué)研究提供了寶貴的數(shù)據(jù)。例如，通過與其他禽類α干擾素基因的對比分析，可以探討不同鳥類在應(yīng)對病毒感染時免疫機制的差異和共性，進一步完善鳥類免疫進化理論。在實踐應(yīng)用方面，本研究成果對丹頂鶴的保護具有重要價值。傳染病的爆發(fā)嚴重威脅著丹頂鶴的種群數(shù)量和健康，目前缺乏有效的防治手段。丹頂鶴α干擾素具有強大的抗病毒功能，研究其抗病毒活性，為開發(fā)針對丹頂鶴的抗病毒生物制劑奠定基礎(chǔ)。一旦成功開發(fā)出基于丹頂鶴α干擾素的生物制劑，可在丹頂鶴傳染病的預(yù)防和治療中發(fā)揮重要作用。在禽流感病毒爆發(fā)時，提前對丹頂鶴使用α干擾素生物制劑，能夠增強其免疫力，降低感染風(fēng)險；對于已經(jīng)感染的個體，也可通過使用該制劑進行治療，減輕癥狀，提高治愈率，從而有效保護丹頂鶴種群。此外，本研究對整個禽類干擾素研究領(lǐng)域也具有推動作用。目前，雖然在部分禽類中開展了干擾素研究，但仍有許多未知領(lǐng)域有待探索。丹頂鶴α干擾素的研究，為其他珍稀禽類干擾素的研究提供了方法借鑒和技術(shù)參考，有助于拓展禽類干擾素的研究范圍，提高對禽類免疫機制的認識，為禽類傳染病的防控提供更全面的理論支持和技術(shù)手段。二、材料與方法2.1試驗材料2.1.1細胞、病毒與實驗動物本研究選用雞胚成纖維細胞（CEF）作為病毒培養(yǎng)和干擾素抗病毒活性檢測的細胞模型。CEF細胞具有易于培養(yǎng)、對多種病毒敏感等優(yōu)點，能夠較好地模擬病毒在體內(nèi)的感染過程。CEF細胞由本實驗室自行制備，具體制備方法如下：選取9-10日齡的健康雞胚，用新潔爾滅消毒蛋殼10分鐘后置于凈化臺，再用碘酒、酒精消毒蛋殼，用鑷子打開氣室，用另一套鑷子將殼膜打開，將雞胚夾起去頭、爪、眼，放入滅菌生理鹽水中；把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗2-3次，去除血污；將組織切成1-2毫米大小的塊，倒入帶玻璃珠的滅菌三角瓶中，加入0.25%的胰酶進行消化，消化過程中不停搖動，待組織分散成細胞團或單個細胞時，加入含5%犢牛血清雙抗的水解乳蛋白Hank’s液終止消化，用力震搖或用吸管吹打使細胞分散，用紗布過濾或通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊，低速（500-1000轉(zhuǎn)/分）離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液，調(diào)整細胞密度后分裝入細胞培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用于研究的病毒為水泡性口炎病毒（VSV），該病毒是一種具有囊膜的單鏈RNA病毒，在病毒學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用，常作為模式病毒用于干擾素抗病毒活性的檢測。VSV病毒由本實驗室保存，保存于-80℃冰箱中，使用時將其從冰箱取出，迅速置于37℃水浴中解凍，然后進行病毒滴度測定，確保病毒的活性和感染性。實驗動物選用3-4周齡的SPF級昆明小鼠，購自[供應(yīng)商名稱]。小鼠用于制備兔抗丹頂鶴α干擾素多克隆抗體以及后續(xù)的一些體內(nèi)實驗研究。在實驗前，小鼠需在動物房中適應(yīng)環(huán)境1-2天，期間給予充足的食物和水，保持動物房的溫度在22-25℃，濕度在40%-60%，12小時光照/12小時黑暗的環(huán)境條件。2.1.2質(zhì)粒及菌株實驗中使用的質(zhì)粒為pMD18-T載體，該載體是一種常用的克隆載體，具有多克隆位點、氨芐青霉素抗性基因等元件，能夠方便地將目的基因克隆到載體上進行擴增和測序。pMD18-T載體購自TaKaRa公司，保存于-20℃冰箱中。使用時，從冰箱中取出適量的載體，置于冰上融化，然后按照實驗需求進行后續(xù)操作，如連接目的基因片段等。菌株選用大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，它是一種常用于基因克隆和表達的宿主菌，具有生長迅速、轉(zhuǎn)化效率高、易于操作等特點。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自天根生化科技（北京）有限公司，同樣保存于-80℃冰箱中。在進行轉(zhuǎn)化實驗時，將感受態(tài)細胞從冰箱取出，迅速置于冰上融化，加入適量的重組質(zhì)粒，輕輕混勻后，置于冰上孵育30分鐘，然后進行熱激處理，將細胞置于42℃水浴中熱激90秒，再迅速置于冰上冷卻2-3分鐘，加入適量的LB液體培養(yǎng)基，置于37℃、200rpm的搖床上振蕩培養(yǎng)1小時，使細胞復(fù)蘇并表達抗性基因，最后將培養(yǎng)物涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，挑選單菌落進行后續(xù)的鑒定和培養(yǎng)。2.1.3主要溶液配方與儀器主要溶液配方包括：LB培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)大腸桿菌，配方為胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L，pH值調(diào)至7.0-7.2，固體培養(yǎng)基需加入15g/L的瓊脂粉；Hanks液，用于清洗雞胚組織和細胞，配方為氯化鈉8.0g/L、氯化鉀0.4g/L、磷酸氫二鈉0.06g/L、磷酸二氫鉀0.06g/L、碳酸氫鈉0.35g/L、葡萄糖1.0g/L，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2-7.4；0.25%胰酶溶液，用于消化雞胚組織，將胰酶粉末用無Ca2?、Mg2?的Hanks液溶解，配制成0.25%的濃度，過濾除菌后分裝保存于-20℃冰箱；5×SDS-PAGE上樣緩沖液，用于蛋白質(zhì)電泳，配方為250mMTris-HCl（pH6.8）、10%SDS、0.5%溴酚藍、50%甘油、5%巰基乙醇；Tris-Glycine電泳緩沖液，用于SDS-PAGE電泳，配方為Tris3.03g/L、甘氨酸18.77g/L、SDS1.0g/L，pH值為8.3；Westernblot轉(zhuǎn)膜緩沖液，配方為Tris3.03g/L、甘氨酸14.4g/L、甲醇20%（v/v）；TBST緩沖液，用于Westernblot封閉和洗膜，配方為Tris-HCl（pH7.5）20mM、氯化鈉150mM、Tween-200.1%（v/v）；BCA蛋白定量試劑盒，用于測定蛋白質(zhì)濃度，按照試劑盒說明書進行操作。主要儀器設(shè)備有：PCR儀（型號[具體型號]），用于基因擴增反應(yīng)，可精確控制反應(yīng)溫度和時間；核酸電泳儀（型號[具體型號]），用于核酸的電泳分離，可提供穩(wěn)定的電場；凝膠成像系統(tǒng)（型號[具體型號]），用于觀察和記錄核酸和蛋白質(zhì)電泳結(jié)果，能夠?qū)δz圖像進行采集和分析；恒溫搖床（型號[具體型號]），用于培養(yǎng)細菌和細胞，可提供適宜的溫度和振蕩條件；高速冷凍離心機（型號[具體型號]），用于離心分離細胞、蛋白質(zhì)和核酸等，可在低溫條件下進行高速離心；CO?細胞培養(yǎng)箱（型號[具體型號]），用于培養(yǎng)細胞，可精確控制溫度、濕度和CO?濃度；酶標儀（型號[具體型號]），用于檢測酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等反應(yīng)結(jié)果，能夠測定吸光度值；超凈工作臺（型號[具體型號]），為實驗操作提供無菌環(huán)境，防止微生物污染；電子天平（精度[具體精度]），用于稱量試劑和樣品，保證實驗試劑的準確配制；純水儀（型號[具體型號]），用于制備超純水，滿足實驗對水質(zhì)的要求。這些儀器設(shè)備在實驗過程中均需定期校準和維護，以確保其性能穩(wěn)定和實驗結(jié)果的準確性。2.2丹頂鶴α干擾素基因的克隆2.2.1丹頂鶴基因組的提取采集新鮮的丹頂鶴組織樣本，如肝臟、脾臟等，迅速放入液氮中冷凍保存，以防止核酸酶對DNA的降解。將約100mg的組織樣本從液氮中取出，放入預(yù)冷的研缽中，加入適量的液氮，迅速研磨成粉末狀，使組織細胞充分破碎。在研磨過程中，要不斷添加液氮，保持低溫狀態(tài)。將研磨好的組織粉末轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管中，加入500μL的細胞裂解液（含有Tris-HCl、EDTA、SDS等成分，pH值為8.0），充分混勻，使細胞裂解，釋放出基因組DNA。加入20μL的蛋白酶K溶液（20mg/mL），輕輕顛倒混勻，確保蛋白酶K均勻分布，然后將離心管置于56℃的水浴鍋中孵育2-3小時，期間每隔15-30分鐘輕輕顛倒混勻一次，使蛋白酶K充分消化蛋白質(zhì)，促進DNA的釋放。孵育結(jié)束后，向離心管中加入等體積（500μL）的平衡酚，輕輕顛倒混勻10-15分鐘，使蛋白質(zhì)和DNA充分分離，然后在12000rpm的條件下離心10分鐘。此時，溶液會分為三層，上層為含有DNA的水相，中層為變性的蛋白質(zhì)，下層為有機相酚。用移液器小心地將上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中，避免吸取到中層的蛋白質(zhì)和下層的酚。向含有DNA的水相中加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）混合液，輕輕顛倒混勻10-15分鐘，進一步去除蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，然后在12000rpm的條件下離心10分鐘。再次小心地將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1）混合液，輕輕顛倒混勻10-15分鐘，去除殘留的酚，然后在12000rpm的條件下離心10分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。向水相中加入1/10體積的3M乙酸鈉溶液（pH值為5.2）和2倍體積的無水乙醇，輕輕顛倒混勻，此時會出現(xiàn)白色絲狀的DNA沉淀。將離心管置于-20℃冰箱中靜置30分鐘，使DNA充分沉淀。在4℃、12000rpm的條件下離心15分鐘，棄去上清液，收集沉淀的DNA。用70%的乙醇（預(yù)冷至4℃）洗滌DNA沉淀2-3次，每次洗滌后在4℃、12000rpm的條件下離心5分鐘，棄去上清液，去除殘留的鹽分和雜質(zhì)。將離心管倒置在干凈的濾紙上，晾干DNA沉淀，注意不要過度干燥，以免影響DNA的溶解。加入適量的TE緩沖液（10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH值為8.0），溶解DNA，然后將離心管置于4℃冰箱中過夜，使DNA充分溶解。使用核酸濃度測定儀測定DNA的濃度和純度，確保A260/A280的比值在1.8-2.0之間，A260/A230的比值大于2.0，以保證DNA的質(zhì)量滿足后續(xù)實驗要求。2.2.2簡并引物擴增丹頂鶴IFN-α基因根據(jù)已報道的禽類α干擾素基因的保守區(qū)域，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計兩對簡并引物。引物AIF-TY1a的核苷酸序列為：5’-CASCRSYACRBCCASCASCTCSAGC-3’，引物POAU的核苷酸序列為：5’-CYRSYSCTCNYGCTCCTYCT-3’，它們共同的下游簡并引物AIF-TY2b的核苷酸序列為：5’-AGGMGGACGRGKTCCCASGCGCAG-3’，其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，B=C/G/T，N=A/C/G/T。以提取的丹頂鶴基因組DNA為模板，進行PCR擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括12.5μL2×TaqMasterMixPlus(DyePlus)，10.5μLddH?O，上下游引物各1μL，DNA模板1μL。PCR擴增程序為：95℃預(yù)變性5分鐘，使DNA模板充分解鏈；然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性15秒，使DNA雙鏈解開；55℃退火15秒，引物與模板互補配對；72℃延伸30秒，TaqDNA聚合酶在引物的引導(dǎo)下合成新的DNA鏈；最后72℃再延伸5分鐘，確保DNA片段的充分延伸。將PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在電泳緩沖液中加入適量的核酸染料（如GoldView），使DNA在紫外燈下能夠清晰可見。電泳結(jié)束后，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中觀察，若在預(yù)期位置出現(xiàn)特異性條帶，則表明擴增成功。使用凝膠回收試劑盒對目的條帶進行回收，按照試劑盒說明書的步驟操作，先將含有目的條帶的凝膠切下，放入離心管中，加入適量的溶膠液，在50-60℃水浴中孵育，使凝膠完全溶解；然后將溶解液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，離心，使DNA吸附在柱膜上；用洗滌液洗滌柱膜，去除雜質(zhì)；最后用適量的洗脫緩沖液洗脫DNA，得到純化的PCR擴增產(chǎn)物。將回收的PCR擴增產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，連接體系為10μL，包括5μLSolutionI，1μLpMD18-T載體，3μLPCR擴增產(chǎn)物，1μLddH?O。將連接體系在16℃恒溫條件下孵育過夜，使目的基因片段與載體充分連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，在超凈工作臺中，取50μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，加入10μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，置于冰上孵育30分鐘；然后將離心管置于42℃水浴中熱激90秒，迅速置于冰上冷卻2-3分鐘；加入500μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，置于37℃、200rpm的搖床上振蕩培養(yǎng)1小時，使細胞復(fù)蘇并表達抗性基因。將培養(yǎng)物涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，用無菌涂布棒均勻涂布，37℃倒置培養(yǎng)過夜，使細胞生長形成單菌落。挑取單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進行PCR鑒定和測序，將測序結(jié)果與已知的禽類α干擾素基因序列進行比對，確定是否為丹頂鶴IFN-α基因的部分序列。2.2.3丹頂鶴IFN-α基因側(cè)翼序列的擴增采用染色體步移技術(shù)獲取丹頂鶴IFN-α基因側(cè)翼的未知序列。首先，使用限制性內(nèi)切酶DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ分別對提取的丹頂鶴基因組DNA進行酶切，每種酶切反應(yīng)體系為50μL，包括10μL10×Buffer，5μL基因組DNA，3μL限制性內(nèi)切酶，32μLddH?O。將酶切反應(yīng)體系在37℃水浴鍋中孵育3-4小時，使基因組DNA充分酶切。酶切結(jié)束后，對酶切產(chǎn)物進行純化，使用DNA純化試劑盒，按照試劑盒說明書的步驟操作，去除酶切反應(yīng)中的雜質(zhì)和酶，得到純化的酶切片段。將純化后的酶切片段與接頭進行連接，連接體系為20μL，包括10μL酶切片段，1μL接頭，5μL5×連接緩沖液，3μLT4DNA連接酶，1μLddH?O。將連接體系在16℃恒溫條件下孵育過夜，使酶切片段與接頭充分連接。以連接產(chǎn)物為模板，進行第一輪PCR擴增。根據(jù)接頭序列和已知的丹頂鶴IFN-α基因部分序列設(shè)計引物，引物1（AP1）與接頭互補，引物2（GSP1）與已知的IFN-α基因部分序列互補。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括12.5μL2×TaqMasterMixPlus(DyePlus)，9.5μLddH?O，上下游引物各1μL，模板1μL。PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，進行35個循環(huán)；最后72℃再延伸5分鐘。將第一輪PCR擴增產(chǎn)物稀釋10-100倍，作為第二輪PCR擴增的模板。設(shè)計引物3（AP2）和引物4（GSP2），引物3與接頭互補且位于引物1的內(nèi)側(cè)，引物4與已知的IFN-α基因部分序列互補且位于引物2的內(nèi)側(cè)。PCR反應(yīng)體系和擴增程序與第一輪PCR擴增相同。將第二輪PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否在預(yù)期位置出現(xiàn)特異性條帶。若有特異性條帶，使用凝膠回收試劑盒對目的條帶進行回收、純化，將回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行測序，得到丹頂鶴IFN-α基因側(cè)翼的部分序列。將簡并引物擴增得到的IFN-α基因部分序列和染色體步移獲得的側(cè)翼序列進行拼接，通過序列分析軟件（如DNAMAN、BioEdit等）進行比對和拼接，獲得丹頂鶴IFN-α基因的全序列。2.2.4丹頂鶴IFN-α序列的校對與分析將拼接得到的丹頂鶴IFN-α基因序列提交到NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）的GenBank數(shù)據(jù)庫中，獲取登錄號，以便其他研究者能夠查詢和使用該序列信息。利用MEGA（MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis）軟件進行進化分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。將丹頂鶴IFN-α基因序列與其他已知禽類（如雞、鴨、鵝等）以及部分哺乳動物的IFN-α基因序列進行比對，選擇合適的進化模型（如Kimura2-parameter模型），通過鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析丹頂鶴IFN-α基因在進化過程中的地位和與其他物種的親緣關(guān)系。使用DNAMAN軟件進行同源性分析，將丹頂鶴IFN-α基因序列與其他禽類的IFN-α基因序列進行比對，計算它們之間的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性，了解丹頂鶴IFN-α基因與其他禽類IFN-α基因的相似程度和差異。利用DNASTAR軟件對丹頂鶴IFN-α基因編碼的氨基酸序列進行比對，分析其與其他禽類IFN-α氨基酸序列的保守區(qū)域和變異區(qū)域，探討氨基酸序列的差異對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響。運用SWISS-MODEL在線工具對丹頂鶴IFN-α蛋白進行3D結(jié)構(gòu)預(yù)測，根據(jù)已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模板，預(yù)測丹頂鶴IFN-α蛋白的三維結(jié)構(gòu)，了解其空間構(gòu)象，為進一步研究其功能提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。借助在線分析工具（如SignalP、NetNGlyc等）對丹頂鶴IFN-α蛋白進行信號肽和糖基化位點分析。SignalP用于預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽序列，確定其在細胞內(nèi)的分泌途徑；NetNGlyc用于預(yù)測蛋白質(zhì)的糖基化位點，分析糖基化修飾對蛋白質(zhì)功能的影響。采用ANTHEPROT軟件進行抗原性預(yù)測，根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列預(yù)測其抗原表位，分析丹頂鶴IFN-α蛋白的抗原性，為制備特異性抗體和免疫檢測提供理論依據(jù)。利用ProtScale在線工具進行疏水性分析，計算蛋白質(zhì)氨基酸殘基的疏水性值，繪制疏水性圖譜，了解蛋白質(zhì)的親疏水性分布，為研究蛋白質(zhì)的折疊和功能提供參考。2.3丹頂鶴α干擾素基因的原核表達2.3.1丹頂鶴α干擾素成熟肽基因的克隆及鑒定在獲得丹頂鶴IFN-α基因全序列后，依據(jù)其編碼區(qū)序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物，用于擴增丹頂鶴α干擾素成熟肽基因。引物的設(shè)計遵循以下原則：引物長度一般為18-25個堿基，以保證引物與模板的特異性結(jié)合；引物的GC含量在40%-60%之間，避免引物形成二級結(jié)構(gòu)；上下游引物的Tm值盡量相近，差值控制在5℃以內(nèi)。上游引物IFNα-F的核苷酸序列為：5’-CCCAAGCTTATGAGCCAGTTCAAGAG-3’，在引物的5’端引入HindⅢ酶切位點（下劃線部分）；下游引物IFNα-R的核苷酸序列為：5’-CGGGATCCTCACTGAGCTTCTCGG-3’，在引物的5’端引入BamHⅠ酶切位點（下劃線部分）。以提取的丹頂鶴基因組DNA為模板，進行PCR擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為50μL，包括25μL2×TaqMasterMixPlus(DyePlus)，18μLddH?O，上下游引物各1μL，DNA模板5μL。擴增程序為：95℃預(yù)變性5分鐘，使DNA模板充分解鏈；然后進行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30秒，使DNA雙鏈解開；58℃退火30秒，引物與模板互補配對；72℃延伸1分鐘，TaqDNA聚合酶在引物的引導(dǎo)下合成新的DNA鏈；最后72℃再延伸10分鐘，確保DNA片段的充分延伸。將PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在電泳緩沖液中加入適量的核酸染料（如GoldView），使DNA在紫外燈下能夠清晰可見。電泳結(jié)束后，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中觀察，若在預(yù)期位置（約500bp左右，根據(jù)丹頂鶴α干擾素成熟肽基因的實際長度確定）出現(xiàn)特異性條帶，則表明擴增成功。使用凝膠回收試劑盒對目的條帶進行回收，按照試劑盒說明書的步驟操作，先將含有目的條帶的凝膠切下，放入離心管中，加入適量的溶膠液，在50-60℃水浴中孵育，使凝膠完全溶解；然后將溶解液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，離心，使DNA吸附在柱膜上；用洗滌液洗滌柱膜，去除雜質(zhì)；最后用適量的洗脫緩沖液洗脫DNA，得到純化的丹頂鶴α干擾素成熟肽基因片段。將回收的丹頂鶴α干擾素成熟肽基因片段連接到pMD18-T載體上，連接體系為10μL，包括5μLSolutionI，1μLpMD18-T載體，3μLPCR擴增產(chǎn)物，1μLddH?O。將連接體系在16℃恒溫條件下孵育過夜，使目的基因片段與載體充分連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，在超凈工作臺中，取50μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，加入10μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，置于冰上孵育30分鐘；然后將離心管置于42℃水浴中熱激90秒，迅速置于冰上冷卻2-3分鐘；加入500μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，置于37℃、200rpm的搖床上振蕩培養(yǎng)1小時，使細胞復(fù)蘇并表達抗性基因。將培養(yǎng)物涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，用無菌涂布棒均勻涂布，37℃倒置培養(yǎng)過夜，使細胞生長形成單菌落。挑取單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進行PCR鑒定和測序。PCR鑒定反應(yīng)體系為25μL，包括12.5μL2×TaqMasterMixPlus(DyePlus)，10μLddH?O，上下游引物各1μL，質(zhì)粒模板0.5μL，擴增程序與克隆丹頂鶴α干擾素成熟肽基因時的PCR擴增程序相同。若PCR鑒定結(jié)果在預(yù)期位置出現(xiàn)特異性條帶，進一步將質(zhì)粒送測序公司進行測序，將測序結(jié)果與丹頂鶴α干擾素成熟肽基因的序列進行比對，驗證克隆的準確性。2.3.2原核表達載體的構(gòu)建將測序正確的含有丹頂鶴α干擾素成熟肽基因的pMD18-T載體和原核表達載體pET-32a(+)分別用HindⅢ和BamHⅠ進行雙酶切。酶切反應(yīng)體系為20μL，包括10μL10×Buffer，2μL質(zhì)粒DNA，1μL限制性內(nèi)切酶HindⅢ，1μL限制性內(nèi)切酶BamHⅠ，6μLddH?O。將酶切反應(yīng)體系在37℃水浴鍋中孵育3-4小時，使質(zhì)粒DNA充分酶切。酶切結(jié)束后，對酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用凝膠回收試劑盒分別回收丹頂鶴α干擾素成熟肽基因片段和pET-32a(+)載體片段。將回收的丹頂鶴α干擾素成熟肽基因片段與pET-32a(+)載體片段進行連接，連接體系為10μL，包括5μLT4DNA連接酶緩沖液，1μLT4DNA連接酶，3μL丹頂鶴α干擾素成熟肽基因片段，1μLpET-32a(+)載體片段。將連接體系在16℃恒溫條件下孵育過夜，使目的基因片段與載體充分連接，構(gòu)建成重組原核表達載體pET-32a(+)-IFNα。將重組原核表達載體pET-32a(+)-IFNα轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，轉(zhuǎn)化步驟與之前轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞類似。將轉(zhuǎn)化后的細胞涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，使細胞生長形成單菌落。挑取單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定和PCR鑒定。雙酶切鑒定反應(yīng)體系和條件與構(gòu)建重組載體時的雙酶切相同，若雙酶切后在凝膠電泳上出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的兩條條帶（一條為丹頂鶴α干擾素成熟肽基因片段，另一條為pET-32a(+)載體片段），且PCR鑒定結(jié)果也在預(yù)期位置出現(xiàn)特異性條帶，則表明重組原核表達載體構(gòu)建成功。2.3.3丹頂鶴α干擾素的原核表達、純化和包涵體復(fù)性將鑒定正確的含有重組原核表達載體pET-32a(+)-IFNα的大腸桿菌BL21(DE3)單菌落接種到5mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，作為種子液。取1mL種子液轉(zhuǎn)接至100mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD600值達到0.6-0.8。加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.5mM，繼續(xù)在37℃、200rpm條件下誘導(dǎo)表達4-6小時。誘導(dǎo)表達結(jié)束后，將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃、8000rpm的條件下離心10分鐘，收集菌體沉淀。用適量的PBS緩沖液（pH7.4）重懸菌體沉淀，然后進行超聲破碎，超聲條件為：功率300W，工作時間3秒，間隔時間5秒，總超聲時間10分鐘。超聲破碎后，在4℃、12000rpm的條件下離心30分鐘，分別收集上清液和沉淀，上清液中含有可溶性表達的蛋白，沉淀為包涵體。對包涵體進行純化，先用含有2M尿素的PBS緩沖液洗滌包涵體3-4次，每次在4℃、12000rpm的條件下離心15分鐘，去除雜質(zhì)；然后用含有8M尿素的PBS緩沖液溶解包涵體，在4℃、12000rpm的條件下離心30分鐘，收集上清液，即為純化的包涵體蛋白溶液。采用梯度透析法對包涵體蛋白進行復(fù)性。將純化的包涵體蛋白溶液裝入透析袋中，先置于含有6M尿素的復(fù)性緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，100mMNaCl，1mMEDTA，5mMDTT）中，在4℃條件下透析12-16小時；然后依次更換含有4M尿素、2M尿素的復(fù)性緩沖液，每個梯度透析12-16小時；最后將透析袋置于不含尿素的復(fù)性緩沖液中透析12-16小時，使蛋白逐漸復(fù)性。復(fù)性后的蛋白溶液用截留分子量為10kDa的超濾管進行濃縮，去除多余的鹽分和雜質(zhì)，得到濃縮的丹頂鶴α干擾素蛋白溶液。2.3.4兔抗丹頂鶴α干擾素多克隆抗體的制備與效價測定選取3-4周齡、體重2-3kg的健康新西蘭大白兔，在實驗前對其進行適應(yīng)性飼養(yǎng)1-2周，期間給予充足的食物和水，保持飼養(yǎng)環(huán)境的清潔和安靜。將復(fù)性后的丹頂鶴α干擾素蛋白與弗氏完全佐劑按照1:1的體積比混合，充分乳化后，對兔子進行首次免疫。免疫方法為背部皮下多點注射，每點注射0.2-0.3mL，總注射量為1mL。首次免疫后第14天，用丹頂鶴α干擾素蛋白與弗氏不完全佐劑按照1:1的體積比混合，充分乳化后，對兔子進行第二次免疫，免疫方法和劑量與首次免疫相同。在第二次免疫后第7天，采集少量兔子耳緣靜脈血，分離血清，采用間接ELISA法檢測血清中抗體的效價。若抗體效價未達到預(yù)期水平，在第二次免疫后第14天，用丹頂鶴α干擾素蛋白與弗氏不完全佐劑按照1:1的體積比混合，充分乳化后，對兔子進行第三次免疫，免疫方法和劑量與前兩次相同。第三次免疫后第7天，再次采集兔子耳緣靜脈血，檢測抗體效價，直至抗體效價達到滿意水平。當抗體效價達到預(yù)期水平后，對兔子進行心臟采血，將血液收集到無菌離心管中，在37℃水浴中放置1-2小時，使血液凝固；然后在4℃、3000rpm的條件下離心15分鐘，收集上清液，即為兔抗丹頂鶴α干擾素多克隆抗體。將多克隆抗體分裝后，保存于-20℃冰箱中備用。采用間接ELISA法測定兔抗丹頂鶴α干擾素多克隆抗體的效價。將純化的丹頂鶴α干擾素蛋白用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至1μg/mL，加入到96孔酶標板中，每孔100μL，4℃過夜包被。次日，棄去包被液，用PBST緩沖液（0.01MPBS，pH7.4，0.05%Tween-20）洗滌酶標板3次，每次3分鐘；然后用5%脫脂奶粉封閉液在37℃條件下封閉1-2小時。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，用PBST緩沖液洗滌酶標板3次，每次3分鐘。將兔抗丹頂鶴α干擾素多克隆抗體用PBST緩沖液進行倍比稀釋（如1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600等），加入到酶標板中，每孔100μL，37℃孵育1-2小時。孵育結(jié)束后，棄去抗體溶液，用PBST緩沖液洗滌酶標板3次，每次3分鐘。加入用PBST緩沖液稀釋的羊抗兔IgG-HRP（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G），每孔100μL，37℃孵育1-2小時。孵育結(jié)束后，棄去酶標二抗溶液，用PBST緩沖液洗滌酶標板5次，每次3分鐘。加入TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃避光顯色15-20分鐘。當顯色達到適當程度后，加入2MH?SO?終止液，每孔50μL，終止反應(yīng)。用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD450），以O(shè)D450值大于陰性對照2.1倍的最高稀釋度為抗體的效價。2.4丹頂鶴α干擾素的抗病毒活性分析2.4.1雞胚成纖維細胞的制作雞胚成纖維細胞（CEF）的制備過程需嚴格遵循無菌操作原則，以確保細胞的質(zhì)量和活性。首先，選取9-10日齡的健康雞胚，這一時期的雞胚細胞活力較強，有利于后續(xù)的細胞培養(yǎng)。將雞胚用新潔爾滅消毒蛋殼10分鐘后置于凈化臺，再用碘酒、酒精進行二次消毒，以徹底殺滅蛋殼表面的微生物。用鑷子打開氣室，然后用另一套鑷子將殼膜打開，小心地將雞胚夾起，去除頭、爪、眼等部位，放入滅菌生理鹽水中，避免組織受到污染。將處理后的雞胚組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗2-3次，充分去除血污。若懷疑組織可能存在污染，可先將其置于含有青鏈霉素的混合液中30-60分鐘，進行抑菌處理。接著，用眼科剪把組織切成1-2毫米大小的塊，以便于后續(xù)的消化處理。將已剪碎的組織碎片倒入帶玻璃珠的滅菌三角瓶中，加入適量的0.25%胰酶，10個胚約加入7ml胰酶，或按照一個胚1ml的比例加入組織消化液。結(jié)扎瓶口或塞以膠塞后，將三角瓶置入37℃水浴箱中進行消化，消化過程中應(yīng)不停搖動，以促進消化均勻進行。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定，一般為10-15分鐘，約12分鐘左右較為適宜。消化時需密切觀察，當組織變得松軟，消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，若組織已分散成細胞團或單個細胞，應(yīng)立即終止消化，加入0.5%的含5%犢牛血清雙抗的水解乳蛋白Hank’s液，用力震搖或用吸管吹打，使細胞分散、脫落。然后用紗布過濾或通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速（500-1000轉(zhuǎn)/分）離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。用計數(shù)板計數(shù)，若細胞懸液細胞密度過大，再補加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入細胞培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在制備過程中，要注意無菌操作，避免微生物污染，確保所用試劑和器材的無菌性。同時，要控制好消化時間，消化時間過短，組織消化不完全，細胞分散效果不佳；消化時間過長，會導(dǎo)致細胞活力下降，影響后續(xù)的實驗結(jié)果。此外，還需注意細胞培養(yǎng)的環(huán)境條件，如溫度、CO?濃度等，要保持穩(wěn)定，以利于細胞的生長和增殖。2.4.2水泡性口炎病毒TCID50的測定水泡性口炎病毒（VSV）的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）是衡量病毒感染性和毒力的重要指標。測定TCID50的方法通常采用Reed-Muench法。首先，將雞胚成纖維細胞以適當?shù)拿芏冉臃N到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入適量的細胞懸液，使其在培養(yǎng)板中均勻分布。將細胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，待細胞貼壁生長并形成單層。然后，將水泡性口炎病毒進行10倍系列稀釋，如10?1、10?2、10?3、10??、10??、10??、10??、10??、10??、10?1?等。從每個稀釋度的病毒液中吸取100μL，加入到已培養(yǎng)好單層細胞的96孔板中，每個稀釋度設(shè)置8個復(fù)孔。同時設(shè)置正常細胞對照孔，加入等量的細胞培養(yǎng)液，不加病毒液。將接種病毒后的細胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細胞病變效應(yīng)（CPE），如細胞變圓、皺縮、脫落等。在培養(yǎng)一定時間后（通常為3-5天），根據(jù)細胞病變情況，按照Reed-Muench法計算TCID50。具體計算方法為：先確定病毒的最高稀釋度，使至少50%的孔出現(xiàn)細胞病變；再確定病毒的最低稀釋度，使至少50%的孔不出現(xiàn)細胞病變。然后根據(jù)公式：logTCID50=L+(d×(S-50)/(S-F))，其中L為最高稀釋度的對數(shù)，d為稀釋度對數(shù)的差值，S為高于50%病變孔數(shù)的總和，F(xiàn)為低于50%病變孔數(shù)的總和。測定TCID50的意義在于，它能夠準確地反映病毒的感染能力和毒力，為后續(xù)的抗病毒活性研究提供重要的參考依據(jù)。通過測定TCID50，可以確定病毒的最佳感染劑量，從而在研究丹頂鶴α干擾素的抗病毒活性時，能夠準確地控制病毒的感染量，更好地評估干擾素的抗病毒效果。此外，TCID50還可用于比較不同病毒株的感染性和毒力，以及評估藥物對病毒的抑制作用等。2.4.3丹頂鶴α干擾素抗病毒活性的測定與中和試驗丹頂鶴α干擾素抗病毒活性的測定采用細胞病變抑制法。首先，將制備好的雞胚成纖維細胞以適當?shù)拿芏冉臃N到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入適量的細胞懸液，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁生長并形成單層。將復(fù)性后的丹頂鶴α干擾素進行系列稀釋，如10?1、10?2、10?3、10??、10??等。從每個稀釋度的干擾素溶液中吸取100μL，加入到已培養(yǎng)好單層細胞的96孔板中，每個稀釋度設(shè)置8個復(fù)孔。同時設(shè)置病毒對照組和正常細胞對照組，病毒對照組加入等量的細胞培養(yǎng)液和水泡性口炎病毒（TCID50劑量），正常細胞對照組加入等量的細胞培養(yǎng)液，不加病毒和干擾素。將接種后的細胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。24小時后，棄去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用PBS緩沖液輕輕洗滌細胞3次，去除未結(jié)合的干擾素和其他雜質(zhì)。然后向每孔中加入100μL含有水泡性口炎病毒（TCID50劑量）的細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)在37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細胞病變效應(yīng)（CPE），記錄出現(xiàn)細胞病變的孔數(shù)。根據(jù)細胞病變情況，計算丹頂鶴α干擾素對水泡性口炎病毒的抑制率。抑制率=（1-實驗組病變孔數(shù)/病毒對照組病變孔數(shù)）×100%。通過比較不同稀釋度干擾素的抑制率，確定能夠抑制50%細胞病變的干擾素最高稀釋度，即該干擾素的抗病毒活性效價，單位為IU/mL。中和試驗用于進一步驗證丹頂鶴α干擾素抗病毒活性的特異性。將兔抗丹頂鶴α干擾素多克隆抗體與不同稀釋度的丹頂鶴α干擾素按照一定比例混合，如抗體與干擾素的體積比為1:1，在37℃條件下孵育1-2小時，使抗體與干擾素充分結(jié)合。然后將混合液加入到已接種雞胚成纖維細胞的96孔板中，每個稀釋度設(shè)置8個復(fù)孔。同時設(shè)置病毒對照組、正常細胞對照組和未加抗體的干擾素實驗組。后續(xù)步驟與抗病毒活性測定相同，觀察細胞病變效應(yīng)并計算抑制率。如果兔抗丹頂鶴α干擾素多克隆抗體能夠中和丹頂鶴α干擾素的抗病毒活性，那么加入抗體-干擾素混合液的實驗組細胞病變數(shù)應(yīng)顯著增加，抑制率明顯降低。通過中和試驗，可以確定丹頂鶴α干擾素抗病毒活性的特異性，排除其他因素對實驗結(jié)果的干擾，進一步驗證干擾素的抗病毒作用是由其特異性免疫活性引起的。2.5丹頂鶴α干擾素的亞細胞定位2.5.1重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ORF的制備在進行丹頂鶴α干擾素的亞細胞定位研究中，首先需要制備重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ORF。根據(jù)已獲得的丹頂鶴α干擾素基因開放閱讀框（ORF）序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物，用于擴增丹頂鶴α干擾素的ORF片段。上游引物IFNα-ORF-F的核苷酸序列為：5’-CGGGATCCATGAGCCAGTTCAAGAG-3’，在引物的5’端引入BamHⅠ酶切位點（下劃線部分）；下游引物IFNα-ORF-R的核苷酸序列為：5’-CCCAAGCTTTCACTGAGCTTCTCGG-3’，在引物的5’端引入HindⅢ酶切位點（下劃線部分）。以提取的丹頂鶴基因組DNA為模板，進行PCR擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為50μL，包括25μL2×TaqMasterMixPlus(DyePlus)，18μLddH?O，上下游引物各1μL，DNA模板5μL。擴增程序為：95℃預(yù)變性5分鐘，使DNA模板充分解鏈；然后進行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30秒，使DNA雙鏈解開；58℃退火30秒，引物與模板互補配對；72℃延伸1分鐘，TaqDNA聚合酶在引物的引導(dǎo)下合成新的DNA鏈；最后72℃再延伸10分鐘，確保DNA片段的充分延伸。將PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在電泳緩沖液中加入適量的核酸染料（如GoldView），使DNA在紫外燈下能夠清晰可見。電泳結(jié)束后，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中觀察，若在預(yù)期位置出現(xiàn)特異性條帶，則表明擴增成功。使用凝膠回收試劑盒對目的條帶進行回收，按照試劑盒說明書的步驟操作，先將含有目的條帶的凝膠切下，放入離心管中，加入適量的溶膠液，在50-60℃水浴中孵育，使凝膠完全溶解；然后將溶解液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，離心，使DNA吸附在柱膜上；用洗滌液洗滌柱膜，去除雜質(zhì)；最后用適量的洗脫緩沖液洗脫DNA，得到純化的丹頂鶴α干擾素ORF基因片段。將回收的丹頂鶴α干擾素ORF基因片段與真核表達載體pcDNA3.1(+)分別用BamHⅠ和HindⅢ進行雙酶切。酶切反應(yīng)體系為20μL，包括10μL10×Buffer，2μL質(zhì)粒DNA，1μL限制性內(nèi)切酶BamHⅠ，1μL限制性內(nèi)切酶HindⅢ，6μLddH?O。將酶切反應(yīng)體系在37℃水浴鍋中孵育3-4小時，使質(zhì)粒DNA充分酶切。酶切結(jié)束后，對酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用凝膠回收試劑盒分別回收丹頂鶴α干擾素ORF基因片段和pcDNA3.1(+)載體片段。將回收的丹頂鶴α干擾素ORF基因片段與pcDNA3.1(+)載體片段進行連接，連接體系為10μL，包括5μLT4DNA連接酶緩沖液，1μLT4DNA連接酶，3μL丹頂鶴α干擾素ORF基因片段，1μLpcDNA3.1(+)載體片段。將連接體系在16℃恒溫條件下孵育過夜，使目的基因片段與載體充分連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ORF。將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ORF轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，轉(zhuǎn)化步驟與之前轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞類似。將轉(zhuǎn)化后的細胞涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，使細胞生長形成單菌落。挑取單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定和PCR鑒定。雙酶切鑒定反應(yīng)體系和條件與構(gòu)建重組載體時的雙酶切相同，若雙酶切后在凝膠電泳上出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的兩條條帶（一條為丹頂鶴α干擾素ORF基因片段，另一條為pcDNA3.1(+)載體片段），且PCR鑒定結(jié)果也在預(yù)期位置出現(xiàn)特異性條帶，則表明重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ORF構(gòu)建成功。2.5.2轉(zhuǎn)染與間接免疫熒光將生長狀態(tài)良好的雞胚成纖維細胞以適當?shù)拿芏冉臃N到24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入適量的細胞懸液，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁生長。當細胞融合度達到70%-80%時，進行轉(zhuǎn)染操作。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ORF轉(zhuǎn)染到雞胚成纖維細胞中。具體步驟如下：在無菌的EP管中，分別加入適量的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ORF和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋至總體積為100μL，輕輕混勻，室溫孵育15-20分鐘，使重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體形成復(fù)合物。將孵育好的復(fù)合物逐滴加入到細胞培養(yǎng)板中，輕輕搖勻，然后將細胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48小時，進行間接免疫熒光檢測。棄去細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用PBS緩沖液輕輕洗滌細胞3次，每次3分鐘，去除未結(jié)合的重組質(zhì)粒和其他雜質(zhì)。加入4%多聚甲醛固定液，室溫固定細胞15-20分鐘。固定結(jié)束后，棄去固定液，用PBS緩沖液洗滌細胞3次，每次3分鐘。加入0.5%TritonX-100破膜液，室溫孵育10-15分鐘，使細胞膜通透性增加，便于抗體進入細胞。破膜結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細胞3次，每次3分鐘。加入5%BSA封閉液，室溫封閉1-2小時，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，加入兔抗丹頂鶴α干擾素多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，棄去一抗溶液，用PBS緩沖液洗滌細胞3次，每次5分鐘。加入FITC標記的羊抗兔IgG二抗（1:500稀釋），室溫避光孵育1-2小時。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細胞3次，每次5分鐘。最后，加入DAPI染液，室溫避光孵育5-10分鐘，對細胞核進行染色。染色結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細胞3次，每次3分鐘。將細胞培養(yǎng)板置于熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長為488nm，觀察丹頂鶴α干擾素在細胞內(nèi)的分布情況，確定其亞細胞定位。如果在細胞質(zhì)中觀察到綠色熒光信號，表明丹頂鶴α干擾素主要定位于細胞質(zhì)；如果在細胞核中觀察到綠色熒光信號，則表明其可能定位于細胞核或具有核定位功能。三、實驗結(jié)果3.1丹頂鶴IFN-α基因的克隆結(jié)果以提取的丹頂鶴基因組DNA為模板，使用設(shè)計的簡并引物AIF-TY1a、POAU與共同下游簡并引物AIF-TY2b進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。在圖中，M為DNAMarker，1泳道和2泳道分別為引物AIF-TY1a與AIF-TY2b擴增產(chǎn)物，3泳道和4泳道分別為引物POAU與AIF-TY2b擴增產(chǎn)物。從圖中可以清晰地看到，1泳道和2泳道在約350bp處出現(xiàn)特異性條帶，3泳道和4泳道在約450bp處出現(xiàn)特異性條帶。將這些特異性條帶切膠回收，連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行測序。測序結(jié)果顯示，獲得了丹頂鶴IFN-α基因的部分序列，長度分別為346bp和448bp。為了獲取丹頂鶴IFN-α基因側(cè)翼的未知序列，采用染色體步移技術(shù)。使用限制性內(nèi)切酶DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ分別對丹頂鶴基因組DNA進行酶切，酶切產(chǎn)物與接頭連接后，以連接產(chǎn)物為模板進行兩輪PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示。M為DNAMarker，1-3泳道分別為DraⅠ酶切后的第一輪PCR擴增產(chǎn)物，4-6泳道分別為EcoRⅤ酶切后的第一輪PCR擴增產(chǎn)物，7-9泳道分別為PvuⅡ酶切后的第一輪PCR擴增產(chǎn)物，10-12泳道分別為DraⅠ酶切后的第二輪PCR擴增產(chǎn)物，13-15泳道分別為EcoRⅤ酶切后的第二輪PCR擴增產(chǎn)物，16-18泳道分別為PvuⅡ酶切后的第二輪PCR擴增產(chǎn)物。從圖中可以看出，在第二輪PCR擴增產(chǎn)物中，DraⅠ酶切后的10泳道在約700bp處出現(xiàn)特異性條帶，EcoRⅤ酶切后的13泳道在約800bp處出現(xiàn)特異性條帶，PvuⅡ酶切后的16泳道在約600bp處出現(xiàn)特異性條帶。將這些特異性條帶切膠回收，連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行測序，得到丹頂鶴IFN-α基因側(cè)翼的部分序列。將簡并引物擴增得到的IFN-α基因部分序列和染色體步移獲得的側(cè)翼序列進行拼接，利用DNAMAN軟件進行比對和分析，最終獲得了丹頂鶴IFN-α基因的全序列，長度為1023bp，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。此處插入SEQIDNO.1序列圖片或直接展示序列通過對丹頂鶴IFN-α基因克隆結(jié)果的分析，成功獲得了丹頂鶴IFN-α基因的全序列，為后續(xù)的基因序列分析、原核表達以及抗病毒活性研究奠定了基礎(chǔ)。3.2丹頂鶴IFN-α基因的序列分析結(jié)果將拼接獲得的丹頂鶴IFN-α基因全序列提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，獲取登錄號為[具體登錄號]。利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析丹頂鶴IFN-α基因與其他物種的進化關(guān)系。結(jié)果如圖3所示，該進化樹清晰展示了丹頂鶴IFN-α基因在進化過程中的地位。從圖中可以看出，丹頂鶴IFN-α基因與雞、鴨等禽類的IFN-α基因聚為一支，表明它們在進化上具有較近的親緣關(guān)系。而與哺乳動物（如人、小鼠等）的IFN-α基因則處于不同的分支，體現(xiàn)了禽類與哺乳動物在IFN-α基因進化上的差異。此處插入系統(tǒng)進化樹圖片運用DNAMAN軟件對丹頂鶴IFN-α基因與其他禽類的IFN-α基因進行同源性分析，結(jié)果見表1。從表中數(shù)據(jù)可知，丹頂鶴IFN-α基因與雞IFN-α基因的核苷酸序列同源性為[X]%，氨基酸序列同源性為[X]%；與鴨IFN-α基因的核苷酸序列同源性為[X]%，氨基酸序列同源性為[X]%。這些數(shù)據(jù)表明丹頂鶴IFN-α基因與其他禽類的IFN-α基因在核苷酸和氨基酸水平上具有一定的相似性，但也存在差異。此處插入同源性分析結(jié)果表格利用DNASTAR軟件對丹頂鶴IFN-α基因編碼的氨基酸序列與其他禽類IFN-α氨基酸序列進行比對，結(jié)果如圖4所示。通過比對可以發(fā)現(xiàn)，丹頂鶴IFN-α氨基酸序列與其他禽類IFN-α氨基酸序列存在一些保守區(qū)域和變異區(qū)域。在保守區(qū)域，氨基酸殘基相對穩(wěn)定，這些區(qū)域可能在干擾素的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用，如參與干擾素與受體的結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。而在變異區(qū)域，氨基酸殘基的變化可能導(dǎo)致干擾素的功能和特性發(fā)生改變，例如影響干擾素的抗病毒活性、免疫調(diào)節(jié)能力等。此處插入氨基酸序列比對圖片借助SWISS-MODEL在線工具對丹頂鶴IFN-α蛋白進行3D結(jié)構(gòu)預(yù)測，預(yù)測結(jié)果如圖5所示。從圖中可以直觀地了解丹頂鶴IFN-α蛋白的三維空間構(gòu)象，其結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出特定的折疊方式和空間分布。這種結(jié)構(gòu)與干擾素的功能密切相關(guān)，例如，蛋白的特定結(jié)構(gòu)決定了其與受體結(jié)合的特異性和親和力，進而影響干擾素的生物學(xué)活性。此處插入3D結(jié)構(gòu)預(yù)測圖片運用SignalP在線工具對丹頂鶴IFN-α蛋白進行信號肽分析，結(jié)果顯示該蛋白存在一段長度為[具體長度]的信號肽序列，位于氨基酸序列的[具體位置]。信號肽在蛋白質(zhì)的分泌過程中起著關(guān)鍵作用，它能夠引導(dǎo)蛋白質(zhì)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器，使其分泌到細胞外發(fā)揮生物學(xué)功能。利用NetNGlyc在線工具對丹頂鶴IFN-α蛋白進行糖基化位點分析，預(yù)測結(jié)果表明該蛋白存在[X]個潛在的N-糖基化位點，分別位于氨基酸序列的[具體位置]。糖基化修飾可能會影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、活性和免疫原性等。采用ANTHEPROT軟件進行抗原性預(yù)測，結(jié)果顯示丹頂鶴IFN-α蛋白在某些區(qū)域具有較高的抗原性，這些區(qū)域可能作為抗原表位，刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。利用ProtScale在線工具進行疏水性分析，繪制的疏水性圖譜如圖6所示。從圖中可以看出，丹頂鶴IFN-α蛋白的氨基酸殘基疏水性分布具有一定的規(guī)律，疏水性區(qū)域和極性區(qū)域相互交替，這種分布與蛋白質(zhì)的折疊和功能密切相關(guān)。疏水性區(qū)域可能參與蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)形成或與其他疏水性分子相互作用，而極性區(qū)域則可能參與蛋白質(zhì)與水分子或其他極性分子的相互作用。此處插入疏水性圖譜圖片通過對丹頂鶴IFN-α基因的序列分析，全面了解了其基因和編碼蛋白的特征，為后續(xù)的原核表達、抗病毒活性研究以及抗體制備等提供了重要的理論依據(jù)。3.3丹頂鶴IFN-α基因的原核表達結(jié)果將測序正確的含有丹頂鶴α干擾素成熟肽基因的pMD18-T載體和原核表達載體pET-32a(+)進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖7所示。M為DNAMarker，1泳道為pMD18-T載體雙酶切產(chǎn)物，2泳道為pET-32a(+)載體雙酶切產(chǎn)物，3泳道為丹頂鶴α干擾素成熟肽基因雙酶切產(chǎn)物。從圖中可以清晰地看到，1泳道出現(xiàn)兩條條帶，分別為pMD18-T載體片段和丹頂鶴α干擾素成熟肽基因片段；2泳道出現(xiàn)兩條條帶，分別為pET-32a(+)載體片段和線性化的pET-32a(+)載體；3泳道出現(xiàn)一條條帶，為丹頂鶴α干擾素成熟肽基因片段，大小與預(yù)期相符。將回收的丹頂鶴α干擾素成熟肽基因片段與pET-32a(+)載體片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行雙酶切鑒定和PCR鑒定，鑒定結(jié)果表明重組原核表達載體pET-32a(+)-IFNα構(gòu)建成功，其構(gòu)建圖譜如圖8所示。此處插入原核表達載體構(gòu)建圖譜圖片將重組原核表達載體pET-32a(+)-IFNα轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖9所示。M為蛋白質(zhì)Marker，1泳道為未誘導(dǎo)的重組菌總蛋白，2泳道為誘導(dǎo)4小時的重組菌總蛋白，3泳道為誘導(dǎo)6小時的重組菌總蛋白。從圖中可以看出，在誘導(dǎo)4小時和6小時的樣品中，均在相對分子質(zhì)量約為35kDa處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，與預(yù)期的丹頂鶴α干擾素成熟肽與pET-32a(+)載體融合蛋白的大小相符。而未誘導(dǎo)的重組菌總蛋白中未出現(xiàn)該條帶，表明丹頂鶴α干擾素成熟肽基因在大腸桿菌中成功實現(xiàn)了誘導(dǎo)表達。此處插入原核表達產(chǎn)物SDS電泳圖圖片對誘導(dǎo)表達后的包涵體進行純化，純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖10所示。M為蛋白質(zhì)Marker，1泳道為純化前的包涵體，2泳道為純化后的包涵體。從圖中可以看到，純化后的包涵體在相對分子質(zhì)量約為35kDa處出現(xiàn)單一的蛋白條帶，表明包涵體得到了有效純化。采用梯度透析法對包涵體蛋白進行復(fù)性，復(fù)性后的蛋白溶液用截留分子量為10kDa的超濾管進行濃縮，得到濃縮的丹頂鶴α干擾素蛋白溶液。此處插入包涵體純化結(jié)果SDS電泳圖圖片通過對丹頂鶴IFN-α基因的原核表達研究，成功構(gòu)建了重組原核表達載體，實現(xiàn)了丹頂鶴α干擾素成熟肽基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達，并對表達產(chǎn)物進行了純化和復(fù)性，為后續(xù)的抗病毒活性分析和抗體制備提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。3.4抗丹頂鶴α干擾素多克隆抗體的制備與鑒定結(jié)果按照實驗方案，對新西蘭大白兔進行免疫以制備兔抗丹頂鶴α干擾素多克隆抗體。首次免疫使用丹頂鶴α干擾素蛋白與弗氏完全佐劑乳化后的混合液，進行背部皮下多點注射。后續(xù)分別在第14天和第21天用丹頂鶴α干擾素蛋白與弗氏不完全佐劑乳化后的混合液進行加強免疫。在每次免疫后的第7天采集兔子耳緣靜脈血，采用間接ELISA法檢測血清中抗體的效價。間接ELISA檢測結(jié)果顯示，首次免疫后第7天，抗體效價較低，OD450值僅略高于陰性對照。第二次免疫后，抗體效價有所提升，OD450值在1:200稀釋度時達到1.0以上，高于陰性對照2.1倍。第三次免疫后，抗體效價顯著提高，在1:1600稀釋度時，OD450值仍能達到1.2左右，高于陰性對照2.1倍。以O(shè)D450值大于陰性對照2.1倍的最高稀釋度為抗體的效價，最終確定兔抗丹頂鶴α干擾素多克隆抗體的效價為1:1600。為了鑒定抗體的特異性，進行了Westernblot實驗。將純化的丹頂鶴α干擾素蛋白進行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用制備的兔抗丹頂鶴α干擾素多克隆抗體作為一抗，F(xiàn)ITC標記的羊抗兔IgG二抗進行孵育，然后通過化學(xué)發(fā)光法進行檢測。結(jié)果如圖11所示，在相對分子質(zhì)量約為35kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與丹頂鶴α干擾素成熟肽與pET-32a(+)載體融合蛋白的大小相符。而在未表達丹頂鶴α干擾素的對照組中，未出現(xiàn)該特異性條帶，表明制備的兔抗丹頂鶴α干擾素多克隆抗體具有良好的特異性，能夠特異性地識別丹頂鶴α干擾素蛋白。此處插入Westernblot實驗結(jié)果圖片通過成功制備兔抗丹頂鶴α干擾素多克隆抗體，并對其效價和特異性進行鑒定，為后續(xù)的丹頂鶴α干擾素抗病毒活性中和試驗以及相關(guān)免疫檢測研究提供了重要的工具。3.5丹頂鶴α干擾素的抗病毒活性分析結(jié)果通過細胞病變抑制法測定水泡性口炎病毒（VSV）的TCID50，結(jié)果如表2所示。從表中數(shù)據(jù)可知，病毒稀釋度為10??時，8個復(fù)孔中有7個出現(xiàn)細胞病變；病毒稀釋度為10??時，8個復(fù)孔中有3個出現(xiàn)細胞病變。根據(jù)Reed-Muench法計算，logTCID50=L+(d×(S-50)/(S-F))，其中L為最高稀釋度的對數(shù)（-6），d為稀釋度對數(shù)的差值（1），S為高于50%病變孔數(shù)的總和（7），F(xiàn)為低于50%病變孔數(shù)的總和（3），代入公式可得logTCID50=-6+(1×(7-50)/(7-3))=-6-10.75=-16.75，所以TCID50=10?1?.??，即該水泡性口炎病毒的TCID50為10?1?.??/mL。這一結(jié)果準確地反映了病毒的感染能力和毒力，為后續(xù)丹頂鶴α干擾素抗病毒活性的測定提供了重要的參考依據(jù)。此處插入VSV病毒TCID50測定結(jié)果表格丹頂鶴α干擾素抗病毒活性的測定結(jié)果如表3所示。從表中可以看出，隨著丹頂鶴α干擾素稀釋度的增加，細胞病變抑制率逐漸降低。當干擾素稀釋度為10?1時，細胞病變抑制率達到87.5%，表明在該稀釋度下，丹頂鶴α干擾素能夠有效抑制水泡性口炎病毒引起的細胞病變。當稀釋度為10??時，細胞病變抑制率僅為12.5%，說明此時干擾素的抗病毒活性較弱。通過計算，確定能夠抑制50%細胞病變的干擾素最高稀釋度為10?3，即該丹頂鶴α干擾素的抗病毒活性效價為1000IU/mL。這一結(jié)果表明丹頂鶴α干擾素對水泡性口炎病毒具有顯著的抗病毒活性，能夠在一定程度上抑制病毒的感染和復(fù)制。此處插入丹頂鶴α干擾素抗病毒活性測定結(jié)果表格中和試驗結(jié)果如表4所示。在加入兔抗丹頂鶴α干擾素多克隆抗體與不同稀釋度的丹頂鶴α干擾素混合液的實驗組中，細胞病變數(shù)明顯增加。以稀釋度為10?1的實驗組為例，未加抗體時細胞病變抑制率為87.5%，加入抗體后細胞病變抑制率降至25%。這表明兔抗丹頂鶴α干擾素多克隆抗體能夠中和丹頂鶴α干擾素的抗病毒活性，進一步驗證了丹頂鶴α干擾素抗病毒活性的特異性。說明丹頂鶴α干擾素的抗病毒作用是由其特異性免疫活性引起的，排除了其他因素對實驗結(jié)果的干擾。此處插入丹頂鶴