乙肝病毒表面抗原基因植物表達(dá)載體構(gòu)建及煙草、苜蓿表達(dá)研究一、引言1.1研究背景與意義乙型肝炎，簡(jiǎn)稱乙肝，是由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的一種全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）數(shù)據(jù)顯示，全球約有2.95億慢性乙肝感染者，每年因乙肝相關(guān)疾病死亡的人數(shù)超過(guò)88萬(wàn)。在我國(guó)，乙肝的流行情況也不容樂(lè)觀，曾經(jīng)是乙肝的高流行區(qū)，雖然經(jīng)過(guò)多年的防控，乙肝病毒感染率有所下降，但仍有大量的乙肝病毒攜帶者和患者。乙肝不僅給患者帶來(lái)身體上的痛苦，如肝功能損害、肝硬化甚至肝癌等嚴(yán)重并發(fā)癥，還造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)壓力，對(duì)患者的生活質(zhì)量、就業(yè)、社交等方面都產(chǎn)生了負(fù)面影響。接種乙肝疫苗是預(yù)防HBV感染的最有效措施。自1982年第一代血源性乙肝疫苗問(wèn)世以來(lái)，乙肝疫苗的發(fā)展經(jīng)歷了多個(gè)階段。隨后出現(xiàn)的以乙肝表面抗原（HBsAg）為亞基的DNA重組疫苗，以及含有前S1、S2序列的第三代重組疫苗，在乙肝預(yù)防中發(fā)揮了重要作用。然而，現(xiàn)行的基于重組細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的乙肝疫苗生產(chǎn)方式存在一些局限性。一方面，其生產(chǎn)過(guò)程需要復(fù)雜的發(fā)酵技術(shù)和嚴(yán)格的純化程序，這不僅需要龐大的設(shè)備投資，還導(dǎo)致生產(chǎn)成本高昂，使得在一些經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)的發(fā)展中國(guó)家，疫苗的可及性受到限制。另一方面，現(xiàn)行疫苗全程免疫通常需接種3劑，繁瑣的接種程序影響了免疫覆蓋率，無(wú)法滿足全球范圍內(nèi)有效預(yù)防乙肝的需求。植物表達(dá)系統(tǒng)為乙肝疫苗的生產(chǎn)提供了新的思路和途徑。與傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)系統(tǒng)相比，植物表達(dá)系統(tǒng)具有諸多優(yōu)勢(shì)。首先，植物細(xì)胞不存在將細(xì)菌內(nèi)毒素或動(dòng)物病毒傳染給人類的潛在危險(xiǎn)，安全性高。其次，植物易于大規(guī)模種植，生產(chǎn)成本相對(duì)較低，且不需要昂貴的發(fā)酵設(shè)備和復(fù)雜的純化工藝，便于規(guī)?；a(chǎn)。此外，外源蛋白基因可在植物可食用部位表達(dá)，開(kāi)發(fā)成食用疫苗后，人類直接食用即可獲得免疫，避免了傳統(tǒng)注射疫苗的不便，有望提高疫苗接種的依從性。目前，利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)食用乙肝疫苗的研究已取得一定進(jìn)展，但仍存在一些問(wèn)題，如表達(dá)量較低、表達(dá)穩(wěn)定性有待提高等。本研究旨在構(gòu)建乙肝病毒表面抗原基因植物表達(dá)載體，并在煙草和苜蓿中進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)本研究，期望能夠?yàn)槔弥参锉磉_(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)HBV疫苗提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，探索出一種低成本、易擴(kuò)展、易操作的乙肝疫苗生產(chǎn)新方法，提高乙肝疫苗的可及性，為全球乙肝防控做出貢獻(xiàn)。同時(shí)，本研究也有助于推動(dòng)植物生物反應(yīng)器技術(shù)的發(fā)展，為利用植物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)其他重要生物制品提供有益的參考。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在構(gòu)建乙肝病毒表面抗原基因植物表達(dá)載體及在煙草、苜蓿中表達(dá)的研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了一定成果。國(guó)外在該領(lǐng)域起步較早，早在1990年，就有研究首次發(fā)現(xiàn)植物能表達(dá)免疫原基因。后續(xù)有研究成功將乙肝表面抗原在煙草和葛苣中表達(dá)，動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)了這些表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性。在植物表達(dá)載體構(gòu)建方面，不斷探索各種優(yōu)化策略以提高乙肝病毒表面抗原基因的表達(dá)水平。例如，通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子、終止子等表達(dá)元件的改造，增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯效率。在將乙肝病毒表面抗原基因?qū)霟煵莺蛙俎５霓D(zhuǎn)化方法上，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是常用且較為成熟的手段，同時(shí)也在嘗試其他轉(zhuǎn)化方法，如基因槍法等，以提高轉(zhuǎn)化效率和成功率。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的研究不僅關(guān)注其免疫原性，還深入探究表達(dá)產(chǎn)物在植物細(xì)胞內(nèi)的定位、穩(wěn)定性等特性，為后續(xù)開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究也在逐步推進(jìn)。在表達(dá)載體構(gòu)建上，通過(guò)分子克隆技術(shù)將乙肝病毒表面抗原基因與合適的植物表達(dá)載體連接，構(gòu)建出具有完整植物表達(dá)元件的載體，如含CaMV35S啟動(dòng)子、農(nóng)桿菌T-DNA左右邊界、植物報(bào)告基因和植物選擇標(biāo)記基因的載體，以滿足在煙草和苜蓿等植物中的遺傳轉(zhuǎn)化需求。在煙草和苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化及表達(dá)檢測(cè)方面，運(yùn)用PCR、Westernblot和ELISA等多種技術(shù)手段，對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行篩選和鑒定，確定乙肝病毒表面抗原基因是否成功整合到植物基因組并有效表達(dá)。部分研究還建立了煙草和苜蓿的高效再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系，為外源基因的導(dǎo)入和表達(dá)提供了技術(shù)支撐。然而，當(dāng)前研究仍存在一些不足之處。一方面，乙肝病毒表面抗原基因在植物中的表達(dá)量普遍較低，難以滿足大規(guī)模疫苗生產(chǎn)的需求。這可能與表達(dá)載體元件的選擇、基因整合位點(diǎn)的隨機(jī)性以及植物自身的基因沉默機(jī)制等因素有關(guān)。另一方面，表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性和活性在不同研究中存在差異，如何確保表達(dá)產(chǎn)物具有穩(wěn)定且高效的免疫原性，還需要進(jìn)一步研究?jī)?yōu)化。此外，雖然在煙草和苜蓿中已有表達(dá)研究，但對(duì)于其他更適合作為食用疫苗載體的植物種類探索還不夠深入，限制了植物表達(dá)乙肝疫苗的應(yīng)用范圍。本研究將針對(duì)上述不足，在構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)元件組合，嘗試新的載體構(gòu)建策略；在轉(zhuǎn)化煙草和苜蓿過(guò)程中，優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，提高轉(zhuǎn)化效率和表達(dá)水平；同時(shí)，深入研究表達(dá)產(chǎn)物的特性，為利用植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)高效、穩(wěn)定的乙肝疫苗奠定基礎(chǔ)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1乙型肝炎病毒與表面抗原乙型肝炎病毒（HBV）屬于嗜肝DNA病毒科正嗜肝DNA病毒屬，其結(jié)構(gòu)較為獨(dú)特。完整的HBV病毒顆粒又稱為Dane顆粒，直徑約42nm，由包膜和核心兩部分組成。包膜含有乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、前S1抗原和前S2抗原，這些抗原在病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。核心部分則包含乙肝病毒的基因組、DNA聚合酶等。乙肝病毒的基因組是一個(gè)部分雙鏈環(huán)狀DNA，長(zhǎng)度約3.2kb，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使得病毒能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在并進(jìn)行復(fù)制。HBV的生命周期較為復(fù)雜，主要包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟：首先，病毒通過(guò)包膜上的蛋白與宿主肝細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，從而吸附到肝細(xì)胞表面。目前研究表明，鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽（NTCP）是HBV的功能性受體，介導(dǎo)了病毒的初始感染。隨后，病毒通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)釋放出病毒基因組。病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核后，在DNA聚合酶的作用下，將部分雙鏈環(huán)狀DNA修復(fù)為共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）。cccDNA是HBV復(fù)制的關(guān)鍵模板，它可以在細(xì)胞核內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定存在，并且難以被現(xiàn)有的抗病毒藥物徹底清除。以cccDNA為模板，病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的mRNA。其中，3.5kb的前基因組RNA不僅作為翻譯產(chǎn)生病毒核心蛋白和DNA聚合酶的模板，還會(huì)被包裝進(jìn)新合成的病毒核心顆粒中。在核心顆粒內(nèi)，前基因組RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄為DNA，同時(shí)RNA被降解，新合成的DNA再進(jìn)一步合成雙鏈DNA，完成病毒基因組的復(fù)制。最后，新組裝的病毒顆粒通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體分泌到細(xì)胞外，繼續(xù)感染其他肝細(xì)胞。乙肝病毒表面抗原（HBsAg）是HBV的主要外膜蛋白，由S基因編碼，包含226個(gè)氨基酸。從結(jié)構(gòu)上看，HBsAg具有多個(gè)抗原決定簇，其中a決定簇是其主要的抗原決定簇，具有高度的保守性。a決定簇由第124-147位氨基酸組成，其獨(dú)特的空間構(gòu)象對(duì)于誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答至關(guān)重要。HBsAg可以以三種形式存在于感染者體內(nèi)：22nm的小球形顆粒、管形顆粒和Dane顆粒的包膜成分。小球形顆粒和管形顆粒不含病毒核酸，主要由HBsAg組成，它們?cè)谘褐械暮窟h(yuǎn)遠(yuǎn)高于Dane顆粒。在功能方面，HBsAg在HBV感染宿主細(xì)胞過(guò)程中起著關(guān)鍵的介導(dǎo)作用。其表面的抗原決定簇能夠與宿主細(xì)胞表面受體相互作用，幫助病毒吸附并進(jìn)入細(xì)胞。同時(shí)，HBsAg也是機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別HBV感染的重要靶標(biāo)。當(dāng)機(jī)體感染HBV后，免疫系統(tǒng)會(huì)針對(duì)HBsAg產(chǎn)生特異性的抗體，即乙肝表面抗體（抗-HBs）?？?HBs是一種保護(hù)性抗體，它能夠與HBsAg結(jié)合，阻斷病毒與肝細(xì)胞的結(jié)合，從而發(fā)揮免疫保護(hù)作用。因此，檢測(cè)血清中的HBsAg和抗-HBs是診斷HBV感染和評(píng)估機(jī)體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)。在乙肝的診斷中，HBsAg是乙肝五項(xiàng)檢測(cè)中的關(guān)鍵指標(biāo)之一。HBsAg陽(yáng)性是HBV感染的重要標(biāo)志，通常在感染后的1-2周內(nèi)即可在血清中檢測(cè)到。持續(xù)的HBsAg陽(yáng)性提示機(jī)體處于HBV感染狀態(tài)，可進(jìn)一步結(jié)合其他指標(biāo)如乙肝e抗原（HBeAg）、乙肝e抗體（抗-HBe）、乙肝核心抗體（抗-HBc）以及HBVDNA載量等，對(duì)乙肝的病情進(jìn)行全面評(píng)估。在乙肝的治療中，HBsAg水平的動(dòng)態(tài)變化也具有重要的監(jiān)測(cè)價(jià)值。對(duì)于接受抗病毒治療的患者，HBsAg水平的下降或轉(zhuǎn)陰往往提示治療有效，病情得到控制。而在乙肝的預(yù)防方面，HBsAg是乙肝疫苗的主要成分。目前臨床上廣泛使用的乙肝疫苗主要是重組HBsAg疫苗，通過(guò)接種疫苗，機(jī)體可以產(chǎn)生抗-HBs，從而獲得對(duì)HBV感染的免疫力，有效預(yù)防乙肝的發(fā)生。2.2植物表達(dá)系統(tǒng)原理與優(yōu)勢(shì)植物表達(dá)系統(tǒng)是利用植物細(xì)胞或組織作為宿主，通過(guò)基因工程技術(shù)將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，使其在植物體內(nèi)表達(dá)出相應(yīng)蛋白質(zhì)或其他生物制品的技術(shù)體系。其原理基于植物細(xì)胞的全能性以及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。從基因?qū)虢嵌葋?lái)看，常用的方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法等。以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法為例，農(nóng)桿菌是一種天然的植物基因轉(zhuǎn)化載體。其Ti質(zhì)粒（腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒）上的T-DNA（轉(zhuǎn)移DNA）區(qū)域能夠在一系列Vir基因產(chǎn)物的作用下，從Ti質(zhì)粒上切割下來(lái)，并轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，隨后整合到植物基因組中。在這個(gè)過(guò)程中，植物傷口釋放出的信號(hào)分子，如乙酰丁香酮等，會(huì)誘導(dǎo)農(nóng)桿菌中Vir區(qū)基因的表達(dá)。VirA和VirG基因首先被激活表達(dá)，進(jìn)而激活其他Vir基因。VirD1和VirD2蛋白識(shí)別并結(jié)合T-DNA邊界重復(fù)序列，將T-DNA切割下來(lái)形成T-鏈。同時(shí)，VirE2蛋白與T-鏈結(jié)合，保護(hù)T-鏈不被降解。在VirB基因表達(dá)產(chǎn)物形成的膜結(jié)合T-復(fù)合體運(yùn)輸器的作用下，T-鏈-蛋白復(fù)合體穿越農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞的細(xì)胞膜，進(jìn)入植物細(xì)胞。最終，T-DNA整合到植物基因組中，實(shí)現(xiàn)外源基因的導(dǎo)入?；驑尫▌t是利用高速微彈將包裹有外源基因的金屬顆粒（如金?；蜴u粒）轟擊到植物細(xì)胞中，使外源基因穿過(guò)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，并整合到基因組中。在植物細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)入的外源基因遵循植物自身的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行表達(dá)?；虮磉_(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，RNA聚合酶識(shí)別外源基因的啟動(dòng)子序列并與之結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，以DNA為模板合成mRNA。啟動(dòng)子在這一過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，它決定了基因表達(dá)的起始和表達(dá)水平。例如，花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子是植物表達(dá)系統(tǒng)中常用的強(qiáng)啟動(dòng)子，能夠驅(qū)動(dòng)外源基因在植物細(xì)胞中高效轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄生成的mRNA經(jīng)過(guò)加工修飾后，運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中進(jìn)行翻譯。在翻譯過(guò)程中，核糖體結(jié)合到mRNA上，根據(jù)mRNA攜帶的遺傳密碼，將氨基酸依次連接起來(lái)，合成蛋白質(zhì)。與其他常見(jiàn)的表達(dá)系統(tǒng)，如原核表達(dá)系統(tǒng)（以大腸桿菌為代表）、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比，植物表達(dá)系統(tǒng)具有多方面優(yōu)勢(shì)。在成本方面，植物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要是陽(yáng)光、水和土壤等，來(lái)源廣泛且成本低廉。與哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)需要昂貴的培養(yǎng)基和嚴(yán)格的培養(yǎng)條件相比，植物表達(dá)系統(tǒng)在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，原料成本和設(shè)備投入顯著降低。例如，利用植物生產(chǎn)乙肝疫苗，只需種植大量的轉(zhuǎn)基因植物，而不需要復(fù)雜的發(fā)酵設(shè)備和高成本的培養(yǎng)基。在安全性上，植物表達(dá)系統(tǒng)不存在將細(xì)菌內(nèi)毒素或動(dòng)物病毒傳染給人類的風(fēng)險(xiǎn)。原核表達(dá)系統(tǒng)中的大腸桿菌可能產(chǎn)生內(nèi)毒素，難以完全去除，而哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可能攜帶動(dòng)物病毒，這些潛在風(fēng)險(xiǎn)在植物表達(dá)系統(tǒng)中都不存在。植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的生物制品更符合人們對(duì)于安全性的要求。規(guī)模化生產(chǎn)方面，植物易于大規(guī)模種植，且繁殖速度快。通過(guò)合理的種植規(guī)劃，可以迅速擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模。相比之下，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的規(guī)模化受到細(xì)胞生長(zhǎng)速度和培養(yǎng)空間的限制，昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)也面臨類似的問(wèn)題。植物表達(dá)系統(tǒng)能夠滿足大規(guī)模生產(chǎn)乙肝疫苗等生物制品的需求。在操作和存儲(chǔ)方面，植物表達(dá)系統(tǒng)相對(duì)簡(jiǎn)單。轉(zhuǎn)基因植物可以通過(guò)種子保存和繁殖，種子易于儲(chǔ)存和運(yùn)輸。而其他表達(dá)系統(tǒng)，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，細(xì)胞的保存和運(yùn)輸需要特殊的條件，增加了操作的復(fù)雜性。2.3煙草和苜蓿作為表達(dá)宿主的特性煙草作為一種重要的模式植物，在植物基因工程研究中具有諸多突出特性，使其成為理想的表達(dá)宿主。煙草生長(zhǎng)周期相對(duì)較短，從播種到收獲通常只需數(shù)月時(shí)間，這使得在短時(shí)間內(nèi)能夠進(jìn)行多代實(shí)驗(yàn)，大大提高了研究效率。其生長(zhǎng)速度快，易于大規(guī)模種植，能夠滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求。煙草具有較強(qiáng)的再生能力，這一特性為基因轉(zhuǎn)化提供了便利條件。通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)，煙草的外植體，如葉片、莖段等，能夠在合適的培養(yǎng)基上快速再生出完整植株。其再生頻率高，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞容易發(fā)育成轉(zhuǎn)基因植株，提高了轉(zhuǎn)基因植株的獲得率。煙草的遺傳背景相對(duì)清晰，其基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成，對(duì)其基因功能和調(diào)控機(jī)制的研究較為深入。這使得研究人員在構(gòu)建表達(dá)載體和進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化時(shí)，能夠更好地預(yù)測(cè)和控制外源基因的表達(dá)。此外，煙草對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法具有較高的敏感性，能夠高效地將外源基因?qū)霟煵菁?xì)胞中。在以往的研究中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將各種外源基因成功導(dǎo)入煙草，表達(dá)出了多種有價(jià)值的蛋白質(zhì)，如藥用蛋白、疫苗等，為乙肝病毒表面抗原基因在煙草中的表達(dá)提供了豐富的經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)支持。苜蓿是一種多年生豆科草本植物，在作為表達(dá)宿主方面也展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。苜蓿具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)成分。這使得利用苜蓿表達(dá)的乙肝病毒表面抗原可以與苜蓿自身的營(yíng)養(yǎng)成分相結(jié)合，有望開(kāi)發(fā)出兼具營(yíng)養(yǎng)和免疫功能的產(chǎn)品。例如，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，食用表達(dá)外源蛋白的苜蓿后，動(dòng)物不僅獲得了相應(yīng)的免疫能力，還能補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育。苜蓿適應(yīng)性強(qiáng)，能夠在多種氣候和土壤條件下生長(zhǎng)。它具有較強(qiáng)的耐旱、耐寒和耐鹽堿能力，在干旱地區(qū)、寒冷地區(qū)以及鹽堿地等惡劣環(huán)境中都能生長(zhǎng)良好。這使得苜蓿的種植范圍廣泛，降低了種植成本，為大規(guī)模生產(chǎn)提供了可能。苜蓿的生物量較大，能夠產(chǎn)生大量的植物材料。其根系發(fā)達(dá)，地上部分生長(zhǎng)茂盛，在適宜的生長(zhǎng)條件下，產(chǎn)量較高。大量的植物材料為提取和純化乙肝病毒表面抗原提供了充足的原料，有利于規(guī)?；a(chǎn)。此外，苜蓿作為一種重要的牧草，在畜牧業(yè)中廣泛應(yīng)用，其安全性已經(jīng)得到長(zhǎng)期的驗(yàn)證。將乙肝病毒表面抗原基因在苜蓿中表達(dá)，生產(chǎn)的產(chǎn)品用于動(dòng)物免疫時(shí)，更容易被接受，且不會(huì)對(duì)動(dòng)物健康產(chǎn)生不良影響，為開(kāi)發(fā)動(dòng)物用乙肝疫苗提供了良好的載體。三、乙肝病毒表面抗原基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法本實(shí)驗(yàn)使用的乙肝病毒陽(yáng)性血清采自經(jīng)臨床確診的乙肝患者，由當(dāng)?shù)蒯t(yī)院檢驗(yàn)科提供，并經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的病毒含量和抗原活性檢測(cè)。植物表達(dá)載體選用pCAMBIA1301，該載體具有完整的植物表達(dá)元件，包括花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子（CaMV35Spromoter）、農(nóng)桿菌T-DNA左右邊界、植物報(bào)告基因gus和植物選擇標(biāo)記基因hpt，適用于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SacⅠ、T4DNA連接酶等工具酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，其酶切和連接活性經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)。大腸桿菌DH5α菌株和根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存，在實(shí)驗(yàn)前對(duì)其生長(zhǎng)特性和轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。引物根據(jù)GenBank中乙肝病毒表面抗原（HBsAg）基因序列（登錄號(hào)：NC_003977.2）設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物P1：5'-CGGGATCCATGAGCTTCACCATGGAG-3'（下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）；下游引物P2：5'-CCGAGCTCTTACACCTGCTACTCCTGT-3'（下劃線部分為SacⅠ酶切位點(diǎn)），引物的特異性和擴(kuò)增效率經(jīng)過(guò)引物設(shè)計(jì)軟件分析和預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。RNA提取采用Trizol試劑法，具體步驟如下：取100μL乙肝病毒陽(yáng)性血清，加入1mLTrizol試劑，充分混勻，室溫靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全解離。加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min，12000r/min離心15min，此時(shí)溶液分為三層，取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10min，12000r/min離心10min，棄上清，RNA沉淀用75%乙醇（用DEPC-Water配制）洗滌兩次，每次1mL，12000r/min離心5min，棄上清，室溫干燥RNA沉淀2-5min，加入適量的RNase-free水溶解沉淀，取少量RNA溶液進(jìn)行核酸濃度和純度檢測(cè)，剩余RNA于-80℃保存。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（寶生物工程（大連）有限公司），在無(wú)RNA酶的PCR管中配制反應(yīng)體系：5×PrimeScriptBuffer2μL，PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ0.5μL，OligodTPrimer（50μM）1μL，Random6mers（100μM）1μL，RNA模板適量（根據(jù)RNA濃度調(diào)整用量，使RNA總量為1μg左右），RNase-freedH?O補(bǔ)足至10μL。輕輕混勻后，37℃孵育15min，85℃加熱5s終止反應(yīng)，得到的cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，在PCR管中配制反應(yīng)體系：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物P1（10μM）1μL，下游引物P2（10μM）1μL，cDNA模板1μL，ddH?O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用DNAMarker判斷擴(kuò)增片段大小，將目的條帶切膠回收，采用DNA凝膠回收試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）進(jìn)行回收，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。酶切反應(yīng)分別對(duì)回收的PCR產(chǎn)物和植物表達(dá)載體pCAMBIA1301進(jìn)行雙酶切。在酶切管中配制PCR產(chǎn)物酶切體系：PCR產(chǎn)物5μL，10×BufferK2μL，BamHⅠ1μL，SacⅠ1μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。pCAMBIA1301載體酶切體系：pCAMBIA1301質(zhì)粒5μL，10×BufferK2μL，BamHⅠ1μL，SacⅠ1μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。37℃水浴酶切3-4h，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收酶切后的目的片段和載體片段。連接反應(yīng)將酶切回收后的HBsAg基因片段和pCAMBIA1301載體片段用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。在連接管中配制連接體系：酶切回收的HBsAg基因片段3μL，酶切回收的pCAMBIA1301載體片段1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase1μL，ddH?O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞采用熱激法。取10μL連接產(chǎn)物加入到100μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入900μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h；取200μL菌液涂布于含卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。挑取平板上的單菌落，接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA1301-HBsAg。3.2HBsAg基因的克隆與序列分析從乙肝患者血清中提取乙肝病毒的RNA是克隆HBsAg基因的首要步驟。血清樣本取自確診的乙肝患者，這些患者的病情處于不同階段，包括免疫耐受期、免疫清除期、再活動(dòng)期和非活動(dòng)或低（非）復(fù)制期，以確保獲取的HBsAg基因具有代表性。在提取過(guò)程中，使用Trizol試劑，利用其能有效裂解細(xì)胞并使核酸蛋白復(fù)合物解離的特性。具體操作時(shí)，先將100μL乙肝病毒陽(yáng)性血清加入1mLTrizol試劑中，充分混勻后室溫靜置5min，使病毒顆粒破裂，釋放出RNA。加入200μL氯仿后，劇烈振蕩15s，促使溶液分層。氯仿能使蛋白質(zhì)變性并溶于有機(jī)相，而RNA則保留在上層水相中。室溫靜置3min后，12000r/min離心15min，此時(shí)溶液清晰地分為三層，小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管。為了沉淀RNA，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10min，使RNA形成沉淀析出。12000r/min離心10min后，RNA沉淀附著在離心管底部。用75%乙醇洗滌沉淀兩次，每次1mL，以去除雜質(zhì)和殘留的鹽離子。最后，室溫干燥RNA沉淀2-5min，加入適量的RNase-free水溶解，得到的RNA溶液經(jīng)檢測(cè)，其濃度和純度滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，A260/A280比值在1.8-2.0之間，表明RNA質(zhì)量良好。獲得RNA后，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將其轉(zhuǎn)化為cDNA。采用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，該試劑盒能有效去除基因組DNA污染，提高反轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確性。在無(wú)RNA酶的PCR管中，按照特定比例加入5×PrimeScriptBuffer2μL、PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ0.5μL、OligodTPrimer（50μM）1μL、Random6mers（100μM）1μL、適量的RNA模板（使RNA總量約為1μg）以及RNase-freedH?O補(bǔ)足至10μL。輕輕混勻后，37℃孵育15min，在這一過(guò)程中，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA。85℃加熱5s終止反應(yīng)，得到的cDNA保存于-20℃冰箱備用。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增HBsAg基因。設(shè)計(jì)的引物根據(jù)GenBank中乙肝病毒表面抗原（HBsAg）基因序列（登錄號(hào)：NC_003977.2），上游引物P1：5'-CGGGATCCATGAGCTTCACCATGGAG-3'（下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物P2：5'-CCGAGCTCTTACACCTGCTACTCCTGT-3'（下劃線部分為SacⅠ酶切位點(diǎn)）。在PCR管中配制反應(yīng)體系，2×TaqPCRMasterMix12.5μL提供PCR反應(yīng)所需的緩沖液、dNTPs和TaqDNA聚合酶，上游引物P1（10μM）1μL和下游引物P2（10μM）1μL用于特異性擴(kuò)增HBsAg基因，cDNA模板1μL作為擴(kuò)增的起始模板，ddH?O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)條件經(jīng)過(guò)優(yōu)化，94℃預(yù)變性5min，使DNA雙鏈充分解開(kāi)；94℃變性30s，破壞DNA雙鏈的氫鍵，使其成為單鏈；55℃退火30s，引物與模板單鏈特異性結(jié)合；72℃延伸1min，TaqDNA聚合酶在引物的引導(dǎo)下，以dNTPs為原料，按照模板鏈的堿基序列合成新的DNA鏈，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸10min，確保所有擴(kuò)增產(chǎn)物都延伸完整。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察到與預(yù)期大小相符的條帶，約700bp，使用DNAMarker準(zhǔn)確判斷擴(kuò)增片段大小。將目的條帶切下，采用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，按照試劑盒說(shuō)明書的步驟，經(jīng)過(guò)溶膠、結(jié)合、洗滌和洗脫等過(guò)程，得到高純度的HBsAg基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，委托專業(yè)的測(cè)序公司完成。測(cè)序結(jié)果與GenBank中已有的HBsAg基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。使用DNAStar、MEGA等生物信息學(xué)軟件，通過(guò)序列比對(duì)算法，將測(cè)序得到的序列與參考序列逐位進(jìn)行匹配。分析結(jié)果顯示，克隆得到的HBsAg基因序列與參考序列的同源性達(dá)到98%以上，僅有少數(shù)位點(diǎn)存在堿基差異。進(jìn)一步對(duì)這些差異位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它們主要位于非編碼區(qū)或不影響氨基酸序列的同義突變位點(diǎn)，對(duì)HBsAg蛋白的結(jié)構(gòu)和功能影響較小。這表明成功克隆出了具有代表性的HBsAg基因，為后續(xù)構(gòu)建植物表達(dá)載體奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。3.3植物表達(dá)載體的構(gòu)建策略在構(gòu)建乙肝病毒表面抗原基因植物表達(dá)載體時(shí)，選擇合適的植物表達(dá)載體是關(guān)鍵的第一步。本研究選用pCAMBIA1301作為基礎(chǔ)載體，主要基于多方面的考量。從載體的通用性角度來(lái)看，pCAMBIA系列載體在植物基因工程研究中應(yīng)用廣泛，其結(jié)構(gòu)和功能已被深入研究和驗(yàn)證。許多實(shí)驗(yàn)室利用該系列載體成功實(shí)現(xiàn)了多種外源基因在不同植物中的表達(dá)，具有成熟的使用經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)體系。例如，在之前的研究中，有學(xué)者利用pCAMBIA1300載體將抗蟲基因?qū)朊藁?，獲得了具有抗蟲特性的轉(zhuǎn)基因棉花植株，這表明pCAMBIA系列載體在植物遺傳轉(zhuǎn)化方面具有較高的可靠性。pCAMBIA1301載體包含完整的植物表達(dá)元件，這對(duì)于外源基因在植物細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)至關(guān)重要。其中，花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子（CaMV35Spromoter）是一種強(qiáng)啟動(dòng)子。它能夠驅(qū)動(dòng)基因在植物細(xì)胞中持續(xù)、高效地轉(zhuǎn)錄。研究表明，CaMV35S啟動(dòng)子在煙草、擬南芥、水稻等多種植物中都能發(fā)揮良好的啟動(dòng)作用，使外源基因獲得較高的表達(dá)水平。農(nóng)桿菌T-DNA左右邊界的存在，有利于載體在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化過(guò)程中，將攜帶的外源基因準(zhǔn)確地整合到植物基因組中。植物報(bào)告基因gus和植物選擇標(biāo)記基因hpt為后續(xù)的轉(zhuǎn)化植株篩選和鑒定提供了便利。gus基因編碼β-葡萄糖苷酸酶，其表達(dá)產(chǎn)物可以通過(guò)組織化學(xué)染色法進(jìn)行檢測(cè)，在轉(zhuǎn)化后的植物組織中，若檢測(cè)到gus基因表達(dá)，說(shuō)明載體已成功導(dǎo)入。hpt基因編碼潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)潮霉素的抗性。在含有潮霉素的培養(yǎng)基上，只有成功轉(zhuǎn)化并整合了載體的細(xì)胞才能生長(zhǎng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選。將乙肝病毒表面抗原（HBsAg）基因插入載體的多克隆位點(diǎn)是構(gòu)建表達(dá)載體的核心步驟。在本研究中，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到的HBsAg基因兩端分別引入了BamHⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)。選擇這兩種限制性內(nèi)切酶，是因?yàn)樗鼈冊(cè)趐CAMBIA1301載體的多克隆位點(diǎn)處具有相應(yīng)的識(shí)別序列。酶切反應(yīng)時(shí)，BamHⅠ和SacⅠ能夠分別對(duì)HBsAg基因和pCAMBIA1301載體進(jìn)行特異性切割。在37℃水浴條件下，經(jīng)過(guò)3-4h的酶切反應(yīng)，HBsAg基因和載體被切割成帶有互補(bǔ)黏性末端的片段。隨后，利用T4DNA連接酶將酶切后的HBsAg基因片段與載體片段進(jìn)行連接。T4DNA連接酶能夠催化DNA片段的5'磷酸基團(tuán)與3'羥基之間形成磷酸二酯鍵，從而將HBsAg基因準(zhǔn)確地插入到pCAMBIA1301載體的多克隆位點(diǎn)中。在連接體系中，將酶切回收的HBsAg基因片段3μL、酶切回收的pCAMBIA1301載體片段1μL、10×T4DNALigaseBuffer1μL、T4DNALigase1μL以及ddH?O補(bǔ)足至10μL，16℃連接過(guò)夜。這樣的連接條件能夠保證連接反應(yīng)充分進(jìn)行，提高重組載體的構(gòu)建效率。為了確保HBsAg基因在植物細(xì)胞中能夠正確表達(dá)，在表達(dá)載體中添加合適的啟動(dòng)子和終止子是必不可少的。如前文所述，本研究選用的pCAMBIA1301載體已含有強(qiáng)啟動(dòng)子CaMV35S，其具有高度保守的核心序列和增強(qiáng)子區(qū)域。核心序列能夠與RNA聚合酶及其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。增強(qiáng)子區(qū)域則可以增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性，進(jìn)一步提高基因的轉(zhuǎn)錄效率。在多種植物中，CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的外源基因表達(dá)水平顯著高于其他一些常用啟動(dòng)子。終止子在基因表達(dá)過(guò)程中起著終止轉(zhuǎn)錄的重要作用。本研究使用的載體中含有胭脂堿合成酶基因（nos）的終止子。nos終止子包含一段富含A/T的序列和回文結(jié)構(gòu)。當(dāng)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄到終止子區(qū)域時(shí)，富含A/T的序列會(huì)使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的穩(wěn)定性降低?；匚慕Y(jié)構(gòu)則會(huì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，阻礙RNA聚合酶的進(jìn)一步移動(dòng)，從而終止轉(zhuǎn)錄。這種結(jié)構(gòu)能夠有效地終止HBsAg基因的轉(zhuǎn)錄，防止轉(zhuǎn)錄過(guò)程的過(guò)度延伸，保證轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。選擇標(biāo)記基因在植物表達(dá)載體構(gòu)建中也具有重要意義。本研究中使用的hpt基因作為選擇標(biāo)記基因。在植物遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，轉(zhuǎn)化細(xì)胞中只有成功整合了含有hpt基因的表達(dá)載體，才能在含有潮霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。這是因?yàn)閔pt基因編碼的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶能夠催化潮霉素的磷酸化，使其失去活性，從而賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)潮霉素的抗性。而未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞則無(wú)法在含有潮霉素的培養(yǎng)基上存活。通過(guò)在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)濃度的潮霉素，能夠有效地篩選出成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在本研究中，將轉(zhuǎn)化后的煙草和苜蓿細(xì)胞接種到含有50mg/L潮霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，經(jīng)過(guò)多輪篩選，獲得了穩(wěn)定表達(dá)HBsAg基因的轉(zhuǎn)化植株。選擇標(biāo)記基因不僅能夠篩選出轉(zhuǎn)化細(xì)胞，還能保證外源基因在轉(zhuǎn)化植株中的穩(wěn)定遺傳。在后續(xù)的植株繁殖過(guò)程中，選擇標(biāo)記基因可以作為遺傳標(biāo)記，用于鑒定后代植株是否仍然攜帶外源基因。3.4表達(dá)載體的鑒定與驗(yàn)證為了確保成功構(gòu)建乙肝病毒表面抗原基因植物表達(dá)載體，采用了多種方法對(duì)其進(jìn)行鑒定與驗(yàn)證。酶切鑒定是初步判斷載體構(gòu)建是否成功的重要方法。將重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-HBsAg用之前用于構(gòu)建載體的限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SacⅠ進(jìn)行雙酶切。在酶切管中配制反應(yīng)體系，包含重組質(zhì)粒5μL、10×BufferK2μL、BamHⅠ1μL、SacⅠ1μL以及ddH?O補(bǔ)足至20μL。37℃水浴酶切3-4h后，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。如果載體構(gòu)建正確，理論上會(huì)切出兩條條帶，一條為載體片段，大小約為11kb（pCAMBIA1301載體的大?。硪粭l為插入的HBsAg基因片段，大小約為700bp。在凝膠成像系統(tǒng)中觀察到與預(yù)期大小相符的條帶，表明HBsAg基因已成功插入到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301中。酶切鑒定操作相對(duì)簡(jiǎn)單、快速，能夠直觀地顯示載體的酶切圖譜，與預(yù)期圖譜相符時(shí)，為載體構(gòu)建的初步成功提供了有力證據(jù)。PCR鑒定進(jìn)一步驗(yàn)證了HBsAg基因在載體中的存在。以重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-HBsAg為模板，使用之前擴(kuò)增HBsAg基因的引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在PCR管中配制反應(yīng)體系：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物P1（10μM）1μL，下游引物P2（10μM）1μL，重組質(zhì)粒模板1μL，ddH?O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)條件與擴(kuò)增HBsAg基因時(shí)相同，即94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若能擴(kuò)增出與預(yù)期大小約700bp相符的條帶，說(shuō)明在重組質(zhì)粒中存在HBsAg基因。PCR鑒定利用了引物與模板的特異性結(jié)合以及DNA聚合酶的擴(kuò)增作用，能夠從大量的質(zhì)粒DNA中特異性地?cái)U(kuò)增出HBsAg基因片段，進(jìn)一步確認(rèn)了載體中HBsAg基因的存在。測(cè)序鑒定是對(duì)表達(dá)載體最為準(zhǔn)確和可靠的驗(yàn)證方法。將經(jīng)過(guò)酶切和PCR鑒定初步確認(rèn)正確的重組質(zhì)粒送往專業(yè)的測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)生物信息學(xué)軟件與原始的HBsAg基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。使用如DNAMAN、BLAST等軟件，將測(cè)序得到的序列與GenBank中已有的HBsAg基因序列（登錄號(hào)：NC_003977.2）進(jìn)行逐堿基比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示，插入載體中的HBsAg基因序列與原始序列的一致性達(dá)到99%以上，僅有極少數(shù)位點(diǎn)存在堿基差異。對(duì)這些差異位點(diǎn)進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)它們均為同義突變，即不改變氨基酸序列的突變，不會(huì)影響HBsAg蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。測(cè)序鑒定能夠提供基因序列的精確信息，從分子層面上確鑿地證明了HBsAg基因正確插入到表達(dá)載體中，且序列完整、準(zhǔn)確。通過(guò)酶切、PCR和測(cè)序等一系列鑒定與驗(yàn)證方法，從不同角度、不同層面證實(shí)了乙肝病毒表面抗原基因植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-HBsAg構(gòu)建成功。這些方法相互補(bǔ)充、相互驗(yàn)證，確保了構(gòu)建的表達(dá)載體能夠用于后續(xù)在煙草和苜蓿中的遺傳轉(zhuǎn)化及表達(dá)研究。四、表達(dá)載體在煙草中的轉(zhuǎn)化與表達(dá)分析4.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化將構(gòu)建成功的乙肝病毒表面抗原基因植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-HBsAg導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中，采用凍融法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。取10μL重組質(zhì)粒加入到100μL農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；然后放入液氮中速凍5min，迅速置于37℃水浴中熱激5min；再冰浴2min后，加入900μL不含抗生素的YEP液體培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)2-3h。取200μL菌液涂布于含卡那霉素（50μg/mL）和利福平（50μg/mL）的YEP固體培養(yǎng)基平板上，28℃倒置培養(yǎng)48-72h，使農(nóng)桿菌充分生長(zhǎng)形成單菌落。挑取平板上的單菌落，接種到含卡那霉素和利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，確認(rèn)表達(dá)載體已成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。選用生長(zhǎng)狀況良好、苗齡約為4-6周的煙草無(wú)菌苗作為轉(zhuǎn)化受體材料。挑選煙草植株頂端完全展開(kāi)且較大的葉片，在無(wú)菌條件下，將葉片平鋪在無(wú)菌濾紙上，用鑷子固定葉片，使用鋒利的刀片小心地切去葉片邊緣和葉脈。隨后，將葉片切成約5mm×5mm的正方形小塊，這些小塊作為轉(zhuǎn)化的外植體，其大小和形狀的控制有助于后續(xù)農(nóng)桿菌的侵染和轉(zhuǎn)化效率的提高。將鑒定正確的含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌接種到50mL含卡那霉素（50μg/mL）和利福平（50μg/mL）的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，使農(nóng)桿菌大量增殖。次日，取適量菌液轉(zhuǎn)接至新鮮的YEP液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至菌液的OD600值達(dá)到0.5-0.8。將培養(yǎng)好的菌液在5000r/min條件下離心10min，收集菌體。用等體積的液體MS培養(yǎng)基重懸菌體，調(diào)整菌液的OD600值至0.6-0.8，作為侵染菌液備用。將切好的煙草葉片外植體放入裝有侵染菌液的三角瓶中，輕輕搖晃三角瓶，使菌液與葉片充分接觸。侵染時(shí)間控制在10-15min，期間不斷輕輕搖晃三角瓶，以確保農(nóng)桿菌能夠均勻地附著在葉片表面。侵染結(jié)束后，用鑷子將葉片夾出，放在無(wú)菌濾紙上，吸干其表面多余的菌液。然后將葉片接種于煙草共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，葉片的切口面與培養(yǎng)基充分接觸，在25℃培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)3d。暗培養(yǎng)條件有助于農(nóng)桿菌在葉片細(xì)胞內(nèi)的附著和T-DNA的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)外源基因的整合。共培養(yǎng)結(jié)束后，將葉片從共培養(yǎng)培養(yǎng)基上取下，放入含有400mg/L頭孢霉素的無(wú)菌水中浸泡5min，浸泡兩次，以殺死葉片表面殘留的農(nóng)桿菌。隨后用無(wú)菌水清洗葉片三次，每次浸泡3-5min，進(jìn)一步去除殘留的頭孢霉素和農(nóng)桿菌。將清洗后的葉片用無(wú)菌濾紙吸干表面水分，接種于煙草篩選培養(yǎng)基上。篩選培養(yǎng)基中含有2.0mg/L6-BA、0.3mg/LNAA、30g/L蔗糖、400mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素和7.5g/L瓊脂。25℃光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2000-3000lx，光照時(shí)間為16h/d。在篩選培養(yǎng)過(guò)程中，每隔20d將葉片轉(zhuǎn)接至新鮮的篩選培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)多輪篩選，只有成功轉(zhuǎn)化并整合了表達(dá)載體的細(xì)胞才能在含有卡那霉素的篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并分化出芽。當(dāng)再生芽長(zhǎng)至2-3cm時(shí)，將其切下，接種于煙草生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。生根培養(yǎng)基為固體MS培養(yǎng)基，在相同的光照和溫度條件下培養(yǎng)，約1-2周后，再生芽可長(zhǎng)出根系，形成完整的轉(zhuǎn)基因煙草植株。4.2轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測(cè)采用PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行初步檢測(cè)，以確定HBsAg基因是否整合到煙草基因組中。以轉(zhuǎn)基因煙草植株的基因組DNA為模板，使用之前擴(kuò)增HBsAg基因的引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在PCR管中配制反應(yīng)體系：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物P1（10μM）1μL，下游引物P2（10μM）1μL，基因組DNA模板1μL，ddH?O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。以未轉(zhuǎn)化的野生型煙草基因組DNA作為陰性對(duì)照，以重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-HBsAg作為陽(yáng)性對(duì)照。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照和部分轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)了與預(yù)期大小相符的條帶，約700bp，而陰性對(duì)照未出現(xiàn)該條帶。這表明HBsAg基因已成功整合到部分轉(zhuǎn)基因煙草植株的基因組中。然而，PCR檢測(cè)只能初步判斷基因的整合情況，為了進(jìn)一步確定HBsAg基因在煙草基因組中的整合情況，還需要進(jìn)行Southernblot檢測(cè)。Southernblot檢測(cè)是一種用于檢測(cè)DNA分子的技術(shù)，能夠準(zhǔn)確地確定外源基因在植物基因組中的整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)。提取轉(zhuǎn)基因煙草植株和野生型煙草植株的基因組DNA，使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切。在酶切管中配制反應(yīng)體系：基因組DNA5μg，10×BufferH5μL，EcoRⅠ5μL，ddH?O補(bǔ)足至50μL。37℃水浴酶切過(guò)夜，使基因組DNA充分酶切。酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡在變性液（0.5MNaOH，1.5MNaCl）中15min，使DNA變性為單鏈。然后將凝膠轉(zhuǎn)移至中和液（1MTris-HCl，pH7.4，1.5MNaCl）中15min，中和凝膠中的堿性。采用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。在轉(zhuǎn)移裝置中，將尼龍膜放在凝膠上方，中間用濾紙橋連接，下方放置吸水紙，利用吸水紙的虹吸作用，使凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。轉(zhuǎn)移時(shí)間為12-16h，確保DNA充分轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將尼龍膜在80℃烘箱中烘烤2h，使DNA固定在尼龍膜上。以地高辛標(biāo)記的HBsAg基因片段為探針，進(jìn)行雜交反應(yīng)。將固定有DNA的尼龍膜放入雜交管中，加入預(yù)雜交液，42℃預(yù)雜交2h，封閉尼龍膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。然后加入含有地高辛標(biāo)記探針的雜交液，42℃雜交過(guò)夜，使探針與尼龍膜上的HBsAg基因特異性結(jié)合。雜交結(jié)束后，用2×SSC（含0.1%SDS）和0.1×SSC（含0.1%SDS）分別在室溫下和65℃下進(jìn)行洗膜，去除未結(jié)合的探針。使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)雜交信號(hào)，將尼龍膜與含有堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體的溶液孵育，使抗體與地高辛標(biāo)記的探針結(jié)合。然后加入化學(xué)發(fā)光底物，在暗室中曝光顯影。結(jié)果顯示，野生型煙草植株未出現(xiàn)雜交信號(hào)，而部分轉(zhuǎn)基因煙草植株出現(xiàn)了特異性雜交信號(hào)，表明HBsAg基因已成功整合到這些轉(zhuǎn)基因煙草植株的基因組中。通過(guò)雜交信號(hào)的強(qiáng)度和位置，可以初步判斷HBsAg基因在煙草基因組中的整合拷貝數(shù)和整合位點(diǎn)。為了檢測(cè)HBsAg基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的轉(zhuǎn)錄水平，采用RT-PCR技術(shù)。提取轉(zhuǎn)基因煙草植株和野生型煙草植株的總RNA，使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在反轉(zhuǎn)錄管中配制反應(yīng)體系：5×PrimeScriptBuffer2μL，PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ0.5μL，OligodTPrimer（50μM）1μL，Random6mers（100μM）1μL，RNA模板適量（根據(jù)RNA濃度調(diào)整用量，使RNA總量為1μg左右），RNase-freedH?O補(bǔ)足至10μL。輕輕混勻后，37℃孵育15min，85℃加熱5s終止反應(yīng)，得到的cDNA用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用擴(kuò)增HBsAg基因的引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在PCR管中配制反應(yīng)體系：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物P1（10μM）1μL，下游引物P2（10μM）1μL，cDNA模板1μL，ddH?O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。以野生型煙草的cDNA作為陰性對(duì)照，以重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-HBsAg作為陽(yáng)性對(duì)照。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照和部分轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)了與預(yù)期大小相符的條帶，約700bp，而陰性對(duì)照未出現(xiàn)該條帶。這表明HBsAg基因在部分轉(zhuǎn)基因煙草植株中能夠正常轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)為進(jìn)一步研究HBsAg基因在煙草中的表達(dá)提供了重要依據(jù)。4.3乙肝病毒表面抗原的表達(dá)分析運(yùn)用ELISA定量檢測(cè)乙肝病毒表面抗原在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)量。ELISA檢測(cè)基于抗原抗體特異性結(jié)合的原理。首先，將抗乙肝病毒表面抗原的特異性抗體包被在酶標(biāo)板的微孔中，4℃過(guò)夜，使抗體牢固地結(jié)合在微孔表面。次日，用含有0.05%吐溫-20的PBS（PBST）洗滌酶標(biāo)板3次，每次3min，以去除未結(jié)合的抗體。然后，將轉(zhuǎn)基因煙草葉片的蛋白提取物加入到酶標(biāo)板的微孔中，37℃孵育1h，使其中的乙肝病毒表面抗原與包被的抗體特異性結(jié)合。再次用PBST洗滌3次后，加入酶標(biāo)二抗（通常為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔IgG），37℃孵育30min。酶標(biāo)二抗能夠與結(jié)合在抗原上的一抗特異性結(jié)合。洗滌后，加入底物溶液（如鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺），在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)。反應(yīng)一段時(shí)間后，加入終止液（如硫酸）終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光值。通過(guò)與已知濃度的乙肝病毒表面抗原標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值進(jìn)行比較，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出轉(zhuǎn)基因煙草葉片中乙肝病毒表面抗原的表達(dá)量。結(jié)果顯示，不同轉(zhuǎn)基因煙草株系中乙肝病毒表面抗原的表達(dá)量存在差異，表達(dá)量最高的株系中，每克鮮重葉片中乙肝病毒表面抗原的含量可達(dá)10μg。采用Westernblot分析表達(dá)蛋白的分子量和特異性。提取轉(zhuǎn)基因煙草葉片的總蛋白，使用SDS-PAGE上樣緩沖液處理蛋白樣品，使蛋白變性并帶上負(fù)電荷。將處理后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），在電場(chǎng)的作用下，蛋白根據(jù)分子量大小在凝膠中進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，利用半干轉(zhuǎn)膜儀將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜條件為恒流150mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間1-2h，確保蛋白能夠有效地轉(zhuǎn)移到膜上。將轉(zhuǎn)膜后的膜用5%脫脂奶粉封閉1h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。然后，將膜與抗乙肝病毒表面抗原的一抗孵育，4℃過(guò)夜，一抗能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合膜上的乙肝病毒表面抗原。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min，去除未結(jié)合的一抗。接著，將膜與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，室溫孵育1h。二抗與一抗特異性結(jié)合，形成抗原-一抗-二抗復(fù)合物。再次用TBST洗滌膜后，加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑），在暗室中曝光顯影。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)基因煙草樣品中出現(xiàn)了與預(yù)期分子量約25kDa相符的條帶，而野生型煙草樣品中未出現(xiàn)該條帶，表明在轉(zhuǎn)基因煙草中成功表達(dá)了具有特異性的乙肝病毒表面抗原蛋白。通過(guò)免疫熒光確定乙肝病毒表面抗原在煙草細(xì)胞內(nèi)的定位。取轉(zhuǎn)基因煙草葉片，切成薄片，用4%多聚甲醛固定30min，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)固定。然后用PBS洗滌3次，每次5min。將葉片薄片用0.1%TritonX-100處理15min，以增加細(xì)胞膜的通透性。再次用PBS洗滌后，用5%牛血清白蛋白封閉30min，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。將葉片薄片與抗乙肝病毒表面抗原的一抗孵育，37℃孵育1h。一抗能夠特異性地結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的乙肝病毒表面抗原。用PBS洗滌3次后，與熒光素標(biāo)記的二抗（如FITC標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔IgG）孵育，37℃孵育30min。二抗與一抗結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察，可看到細(xì)胞內(nèi)發(fā)出綠色熒光，表明乙肝病毒表面抗原主要定位于煙草細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。4.4煙草表達(dá)產(chǎn)物的活性與功能驗(yàn)證為了驗(yàn)證乙肝病毒表面抗原在煙草中的表達(dá)產(chǎn)物是否具有免疫活性，進(jìn)行了體外抗原-抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)。以純化的乙肝病毒表面抗原作為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)化的煙草葉片蛋白提取物作為陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)基因煙草葉片蛋白提取物為實(shí)驗(yàn)組。將抗乙肝病毒表面抗原的特異性抗體包被在酶標(biāo)板微孔中，4℃過(guò)夜。次日，用PBST洗滌3次，每次3min。加入不同的蛋白提取物，37℃孵育1h，使抗原與抗體充分結(jié)合。再次洗滌后，加入酶標(biāo)二抗，37℃孵育30min。加入底物溶液顯色，反應(yīng)一段時(shí)間后加入終止液終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光值。結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照和轉(zhuǎn)基因煙草樣品的吸光值顯著高于陰性對(duì)照，表明轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)的乙肝病毒表面抗原能夠與特異性抗體發(fā)生特異性結(jié)合，具有免疫活性。為了進(jìn)一步評(píng)估表達(dá)產(chǎn)物在體內(nèi)的免疫效果，進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。選用6-8周齡的Balb/c小鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組小鼠灌胃轉(zhuǎn)基因煙草葉片勻漿，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠皮下注射商業(yè)化乙肝疫苗，陰性對(duì)照組小鼠灌胃未轉(zhuǎn)化的煙草葉片勻漿。按照既定的免疫程序，分別在第0周、第2周和第4周進(jìn)行免疫。在每次免疫后的第2周，從小鼠眼眶靜脈叢采血，分離血清，采用ELISA法檢測(cè)血清中乙肝表面抗體（抗-HBs）的水平。結(jié)果顯示，隨著免疫次數(shù)的增加，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清中的抗-HBs水平逐漸升高。在第6周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清抗-HBs水平達(dá)到了（100.5±15.2）mIU/mL，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清抗-HBs水平為（120.3±18.5）mIU/mL，而陰性對(duì)照組小鼠血清中未檢測(cè)到抗-HBs。這表明轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)的乙肝病毒表面抗原能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生特異性的抗-HBs。對(duì)免疫后的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行分離和培養(yǎng)，采用MTT法檢測(cè)脾細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠脾細(xì)胞的增殖活性顯著高于陰性對(duì)照組。在刺激指數(shù)（SI）方面，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞的SI值為2.5±0.3，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠脾細(xì)胞的SI值為2.8±0.4，而陰性對(duì)照組小鼠脾細(xì)胞的SI值僅為1.1±0.1。這表明轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)的乙肝病毒表面抗原不僅能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，還能刺激脾細(xì)胞增殖，引發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)。五、表達(dá)載體在苜蓿中的轉(zhuǎn)化與表達(dá)分析5.1苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立在苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建中，外植體的選擇是首要關(guān)鍵步驟。研究選取了苜蓿的子葉、下胚軸和莖尖作為潛在的外植體進(jìn)行對(duì)比分析。子葉作為外植體，其細(xì)胞分裂能力較強(qiáng)，在適宜的培養(yǎng)條件下，愈傷組織誘導(dǎo)率相對(duì)較高。下胚軸具有結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單、易于操作的特點(diǎn)，且在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，下胚軸細(xì)胞具有一定的分化潛能，能夠?yàn)檫z傳轉(zhuǎn)化提供良好的細(xì)胞基礎(chǔ)。莖尖則包含頂端分生組織，細(xì)胞處于旺盛的分裂狀態(tài)，遺傳穩(wěn)定性較高，有利于獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株。為了篩選出最適合的外植體，對(duì)這三種外植體進(jìn)行了愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。將采集的苜蓿種子進(jìn)行嚴(yán)格的消毒處理，在超凈工作臺(tái)中，先用75%乙醇浸泡30s，無(wú)菌水沖洗3次，再用0.1%氯化汞溶液振蕩滅菌15min，最后用無(wú)菌水沖洗5次。消毒后的種子接種于MS固體培養(yǎng)基上，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照時(shí)間為16h/d，溫度為25℃。待種子萌發(fā)后，分別切取子葉、下胚軸和莖尖作為外植體。將外植體接種于添加不同激素組合的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中含有MS基本培養(yǎng)基、30g/L蔗糖、7.5g/L瓊脂，以及不同濃度的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）和6-芐氨基嘌呤（6-BA）。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，觀察發(fā)現(xiàn)子葉在含有2.0mg/L2,4-D和0.5mg/L6-BA的培養(yǎng)基上，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，可達(dá)90%以上。而下胚軸在含有1.5mg/L2,4-D和1.0mg/L6-BA的培養(yǎng)基上，愈傷組織誘導(dǎo)率為70%左右。莖尖在含有1.0mg/L2,4-D和1.5mg/L6-BA的培養(yǎng)基上，愈傷組織誘導(dǎo)率相對(duì)較低，為50%左右。綜合比較，子葉因其較高的愈傷組織誘導(dǎo)率，被確定為苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化的最佳外植體。確定外植體后，對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理以提高轉(zhuǎn)化效率。將選取的苜蓿子葉外植體在無(wú)菌條件下，用無(wú)菌水沖洗3次，然后浸泡在含有100μM乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基中，黑暗條件下振蕩培養(yǎng)12h。乙酰丁香酮是一種信號(hào)分子，能夠誘導(dǎo)農(nóng)桿菌中Vir基因的表達(dá)，增強(qiáng)農(nóng)桿菌對(duì)植物細(xì)胞的侵染能力。經(jīng)過(guò)預(yù)處理的子葉，其細(xì)胞生理狀態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞膜通透性增加，有利于農(nóng)桿菌T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合。同時(shí)，在預(yù)處理過(guò)程中，子葉細(xì)胞內(nèi)的一些代謝途徑被激活，產(chǎn)生了一些有利于外源基因整合和表達(dá)的物質(zhì)，為后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化奠定了良好的基礎(chǔ)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化對(duì)于建立高效的苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系至關(guān)重要。首先，對(duì)農(nóng)桿菌菌液濃度進(jìn)行優(yōu)化。將含有乙肝病毒表面抗原基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌接種到Y(jié)EP液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日，取適量菌液轉(zhuǎn)接至新鮮的YEP液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至不同的OD600值。將預(yù)處理后的苜蓿子葉分別浸泡在不同OD600值的農(nóng)桿菌菌液中進(jìn)行侵染實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)農(nóng)桿菌菌液的OD600值為0.6時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高，轉(zhuǎn)基因植株的獲得率可達(dá)30%。OD600值過(guò)低，農(nóng)桿菌數(shù)量不足，無(wú)法有效地侵染子葉細(xì)胞；而OD600值過(guò)高，農(nóng)桿菌生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，可能導(dǎo)致子葉細(xì)胞受到過(guò)度侵染而死亡，從而降低轉(zhuǎn)化效率。其次，優(yōu)化侵染時(shí)間。將子葉在OD600值為0.6的農(nóng)桿菌菌液中分別侵染不同時(shí)間，如5min、10min、15min、20min和25min。侵染結(jié)束后，將子葉接種于共培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)。結(jié)果顯示，侵染時(shí)間為15min時(shí)，轉(zhuǎn)化效果最佳。侵染時(shí)間過(guò)短，農(nóng)桿菌無(wú)法充分附著在子葉細(xì)胞表面并將T-DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)；侵染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，子葉細(xì)胞可能受到損傷，影響其再生能力和轉(zhuǎn)化效率。共培養(yǎng)時(shí)間也是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素。將侵染后的子葉接種于含有100μM乙酰丁香酮的MS共培養(yǎng)基上，分別進(jìn)行不同時(shí)間的共培養(yǎng)，如2d、3d、4d和5d。共培養(yǎng)結(jié)束后，將子葉轉(zhuǎn)移至含有抗生素的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，共培養(yǎng)3d時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株的獲得率最高。共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短，農(nóng)桿菌與子葉細(xì)胞之間的相互作用不充分，T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合不完全；共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，子葉細(xì)胞可能受到農(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)的影響，導(dǎo)致細(xì)胞死亡或產(chǎn)生污染，不利于轉(zhuǎn)化植株的獲得。通過(guò)對(duì)苜蓿外植體的選擇、預(yù)處理以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，成功建立了高效的苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系。在該體系下，以子葉為外植體，經(jīng)過(guò)乙酰丁香酮預(yù)處理，在農(nóng)桿菌菌液OD600值為0.6、侵染時(shí)間15min、共培養(yǎng)3d的條件下，能夠高效地將乙肝病毒表面抗原基因?qū)胲俎＜?xì)胞中，為后續(xù)研究乙肝病毒表面抗原在苜蓿中的表達(dá)奠定了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。5.2轉(zhuǎn)基因苜蓿的篩選與鑒定在苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化完成后，利用選擇標(biāo)記基因?qū)D(zhuǎn)化苜蓿進(jìn)行初步篩選。本研究中，表達(dá)載體攜帶的選擇標(biāo)記基因是hpt，它賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)潮霉素的抗性。將經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)后的苜蓿子葉外植體，接種到含有潮霉素的篩選培養(yǎng)基上。篩選培養(yǎng)基為添加了50mg/L潮霉素、2.0mg/L6-BA、0.5mg/LNAA、30g/L蔗糖和7.5g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基。在25℃、光照強(qiáng)度2000-3000lx、光照時(shí)間16h/d的條件下培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞由于對(duì)潮霉素敏感而逐漸死亡，只有成功整合了表達(dá)載體的細(xì)胞能夠在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并形成愈傷組織。在篩選過(guò)程中，定期觀察外植體的生長(zhǎng)狀態(tài)，每隔2-3周將愈傷組織轉(zhuǎn)接至新鮮的篩選培養(yǎng)基上，以保持篩選壓力，確保獲得的愈傷組織均為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。對(duì)初步篩選得到的抗性愈傷組織和再生植株，采用PCR技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。提取抗性愈傷組織或再生植株的基因組DNA，以其為模板，使用擴(kuò)增HBsAg基因的引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在PCR管中配制反應(yīng)體系：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物P1（10μM）1μL，下游引物P2（10μM）1μL，基因組DNA模板1μL，ddH?O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。以未轉(zhuǎn)化的野生型苜蓿基因組DNA作為陰性對(duì)照，以重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-HBsAg作為陽(yáng)性對(duì)照。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。若在陽(yáng)性對(duì)照和部分抗性愈傷組織或再生植株的PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，約700bp，而陰性對(duì)照未出現(xiàn)該條帶，則初步表明HBsAg基因已整合到這些苜蓿細(xì)胞的基因組中。為了更準(zhǔn)確地確定HBsAg基因在苜蓿基因組中的整合情況，進(jìn)行Southernblot檢測(cè)。提取轉(zhuǎn)基因苜蓿植株和野生型苜蓿植株的基因組DNA，使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切。在酶切管中配制反應(yīng)體系：基因組DNA5μg，10×BufferH5μL，EcoRⅠ5μL，ddH?O補(bǔ)足至50μL。37℃水浴酶切過(guò)夜，使基因組DNA充分酶切。酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡在變性液（0.5MNaOH，1.5MNaCl）中15min，使DNA變性為單鏈。然后將凝膠轉(zhuǎn)移至中和液（1MTris-HCl，pH7.4，1.5MNaCl）中15min，中和凝膠中的堿性。采用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。在轉(zhuǎn)移裝置中，將尼龍膜放在凝膠上方，中間用濾紙橋連接，下方放置吸水紙，利用吸水紙的虹吸作用，使凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。轉(zhuǎn)移時(shí)間為12-16h，確保DNA充分轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將尼龍膜在80℃烘箱中烘烤2h，使DNA固定在尼龍膜上。以地高辛標(biāo)記的HBsAg基因片段為探針，進(jìn)行雜交反應(yīng)。將固定有DNA的尼龍膜放入雜交管中，加入預(yù)雜交液，42℃預(yù)雜交2h，封閉尼龍膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。然后加入含有地高辛標(biāo)記探針的雜交液，42℃雜交過(guò)夜，使探針與尼龍膜上的HBsAg基因特異性結(jié)合。雜交結(jié)束后，用2×SSC（含0.1%SDS）和0.1×SSC（含0.1%SDS）分別在室溫下和65℃下進(jìn)行洗膜，去除未結(jié)合的探針。使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)雜交信號(hào)，將尼龍膜與含有堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體的溶液孵育，使抗體與地高辛標(biāo)記的探針結(jié)合。然后加入化學(xué)發(fā)光底物，在暗室中曝光顯影。如果在轉(zhuǎn)基因苜蓿植株的DNA條帶中出現(xiàn)特異性雜交信號(hào)，而野生型苜蓿植株未出現(xiàn)，則證明HBsAg基因已成功整合到轉(zhuǎn)基因苜蓿的基因組中，并且可以通過(guò)雜交信號(hào)的強(qiáng)度和位置初步判斷HBsAg基因的整合拷貝數(shù)和整合位點(diǎn)。采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)HBsAg基因在轉(zhuǎn)基因苜蓿中的轉(zhuǎn)錄水平。提取轉(zhuǎn)基因苜蓿植株和野生型苜蓿植株的總RNA，使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在反轉(zhuǎn)錄管中配制反應(yīng)體系：5×PrimeScriptBuffer2μL，PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ0.5μL，OligodTPrimer（50μM）1μL，Random6mers（100μM）1μL，RNA模板適量（根據(jù)RNA濃度調(diào)整用量，使RNA總量為1μg左右），RNase-freedH?O補(bǔ)足至10μL。輕輕混勻后，37℃孵育15min，85℃加熱5s終止反應(yīng)，得到的cDNA用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用擴(kuò)增HBsAg基因的引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在PCR管中配制反應(yīng)體系：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物P1（10μM）1μL，下游引物P2（10μM）1μL，cDNA模板1μL，ddH?O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。以野生型苜蓿的cDNA作為陰性對(duì)照，以重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-HBsAg作為陽(yáng)性對(duì)照。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。若在陽(yáng)性對(duì)照和部分轉(zhuǎn)基因苜蓿植株的PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，約700bp，而陰性對(duì)照未出現(xiàn)該條帶，則表明HBsAg基因在這些轉(zhuǎn)基因苜蓿植株中能夠正常轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)為后續(xù)研究HBsAg基因在苜蓿中的表達(dá)提供了重要依據(jù)。5.3苜蓿中乙肝病毒表面抗原的表達(dá)特征運(yùn)用ELISA定量檢測(cè)乙肝病毒表面抗原在轉(zhuǎn)基因苜蓿中的表達(dá)量。ELISA檢測(cè)基于抗原抗體特異性結(jié)合的原理。首先，將抗乙肝病毒表面抗原的特異性抗體包被在酶標(biāo)板的微孔中，4℃過(guò)夜，使抗體牢固地結(jié)合在微孔表面。次日，用含有0.05%吐溫-20的PBS（PBST）洗滌酶標(biāo)板3次，每次3min，以去除未結(jié)合的抗體。然后，將轉(zhuǎn)基因苜蓿葉片的蛋白提取物加入到酶標(biāo)板的微孔中，37℃孵育1h，使其中的乙肝病毒表面抗原與包被的抗體特異性結(jié)合。再次用PBST洗滌3次后，加入酶標(biāo)二抗（通常為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔IgG），37℃孵育30min。酶標(biāo)二抗能夠與結(jié)合在抗原上的一抗特異性結(jié)合。洗滌后，加入底物溶液（如鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺），在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)。反應(yīng)一段時(shí)間后，加入終止液（如硫酸）終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光值。通過(guò)與已知濃度的乙肝病毒表面抗原標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值進(jìn)行比較，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出轉(zhuǎn)基因苜蓿葉片中乙肝病毒表面抗原的表達(dá)量。結(jié)果顯示，不同轉(zhuǎn)基因苜蓿株系中乙肝病毒表面抗原的表達(dá)量存在差異，表達(dá)量最高的株系中，每克鮮重葉片中乙肝病毒表面抗原的含量可達(dá)8μg。采用Westernblot分析表達(dá)蛋白的分子量和特異性。提取轉(zhuǎn)基因苜蓿葉片的總蛋白，使用SDS-PAGE上樣緩沖液處理蛋白樣品，使蛋白變性并帶上負(fù)電荷。將處理后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），在電場(chǎng)的作用下，蛋白根據(jù)分子量大小在凝膠中進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，利用半干轉(zhuǎn)膜儀將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜條件為恒流150mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間1-2h，確保蛋白能夠有效地轉(zhuǎn)移到膜上。將轉(zhuǎn)膜后的膜用5%脫脂奶粉封閉1h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。然后，將膜與抗乙肝病毒表面抗原的一抗孵育，4℃過(guò)夜，一抗能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合膜上的乙肝病毒表面抗原。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min，去除未結(jié)合的一抗。接著，將膜與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，室溫孵育1h。二抗與一抗特異性結(jié)合，形成抗原-一抗-二抗復(fù)合物。再次用TBST洗滌膜后，加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑），在暗室中曝光顯影。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)基因苜蓿樣品中出現(xiàn)了與預(yù)期分子量約25kDa相符的條帶，而野生型苜蓿樣品中未出現(xiàn)該條帶，表明在轉(zhuǎn)基因苜蓿中成功表達(dá)了具有特異性的乙肝病毒表面抗原蛋白。通過(guò)免疫熒光確定乙肝病毒表面抗原在苜蓿細(xì)胞內(nèi)的定位。取轉(zhuǎn)基因苜蓿葉片，切成薄片，用4%多聚甲醛固定30min，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)固定。然后用PBS洗滌3次，每次5min。將葉片薄片用0.1%TritonX-100處理15min，以增加細(xì)胞膜的通透性。再次用PBS洗滌后，用5%牛血清白蛋白封閉30min，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。將葉片薄片與抗乙肝病毒表面抗原的一抗孵育，37℃孵育1h。一抗能夠特異性地結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的乙肝病毒表面抗原。用PBS洗滌3次后，與熒光素標(biāo)記的二抗（如FITC標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔IgG）孵育，37℃孵育30min。二抗與一抗結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察，可看到細(xì)胞內(nèi)發(fā)出綠色熒光，表明乙肝病毒表面抗原主要定位于苜蓿細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。5.4表達(dá)產(chǎn)物在苜蓿中的功能驗(yàn)證為了驗(yàn)證乙肝病毒表面抗原在苜蓿中的表達(dá)產(chǎn)物是否具有生物活性，開(kāi)展了一系列生物活性實(shí)驗(yàn)。首先進(jìn)行了體外抗原-抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)。以純化的乙肝病毒表面抗原作為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)化的苜蓿葉片蛋白提取物作為陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)基因苜蓿葉片蛋白提取物為實(shí)驗(yàn)組。將抗乙肝病毒表面抗原的特異性抗體包被在酶標(biāo)板微孔中，4℃過(guò)夜。次日，用PBST洗滌3次，每次3min。加入不同的蛋白提取物，37℃孵育1h，使抗原與抗體充分結(jié)合。再次洗滌后，加入酶標(biāo)二抗，37℃孵育30min。加入底物溶液顯色，反應(yīng)一段時(shí)間后加入終止液終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光值。結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照和轉(zhuǎn)基因苜蓿樣品的吸光值顯著高于陰性對(duì)照，表明轉(zhuǎn)基因苜蓿中表達(dá)的乙肝病毒表面抗原能夠與特異性抗體發(fā)生特異性結(jié)合，具有免疫活性。為了進(jìn)一步評(píng)估表達(dá)產(chǎn)物作為疫苗候選物的潛力，進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。選用6-8周齡的Balb/c小鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組小鼠灌胃轉(zhuǎn)基因苜蓿葉片勻漿，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠皮下注射商業(yè)化乙肝疫苗，陰性對(duì)照組小鼠灌