第1章發(fā)酵工程第2節(jié)微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用

向經(jīng)過殺菌處理的牛奶中添加某些對(duì)人體有益的細(xì)菌，再經(jīng)過發(fā)酵就可以制成酸奶，由于制作工藝并不復(fù)雜，一些人會(huì)在家里自制酸奶，自制酸奶雖然方便，但是食用自制酸奶導(dǎo)致腸胃不適的事件屢見不鮮，主要原因是在制作過程中有雜菌混入。1.怎樣才能保證無處不在的雜菌不混入發(fā)酵物中呢？制作工具和原料滅菌控制發(fā)酵條件避免雜菌進(jìn)入接種純的菌種微生物的無菌培養(yǎng)技術(shù)2.雜菌屬于微生物，你知道雜菌屬于微生物中的哪種類型嗎？從社會(huì)中來1.

微生物個(gè)體無法用肉眼觀察的微小生物。無細(xì)胞結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞真核細(xì)胞真菌：酵母菌、毛霉等；原生生物：草履蟲、變形蟲等微生物的類群病毒：新冠病毒等RNA病毒；噬菌體等DNA病毒細(xì)菌：藍(lán)細(xì)菌、大腸桿菌、乳酸菌等；放線菌；鏈霉菌等

本章提及的微生物主要指用于發(fā)酵的細(xì)菌和真菌。相關(guān)性信息相關(guān)性信息菌落：分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體。一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下(相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時(shí)間)，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。這些特征包括菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等方面。菌落特征是鑒定菌種的重要依據(jù)。形態(tài)突起(側(cè)面觀)邊緣(部分)標(biāo)點(diǎn)狀圓形絲狀不規(guī)則狀假根狀紡錘狀扁平隆起凸透鏡狀墊狀臍突狀完整波狀裂片狀嚙蝕狀絲狀卷曲狀3.實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物關(guān)鍵:(1）提供微生物生長(zhǎng)繁殖所需營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件(2）確保其它微生物無法混入(3)并將需要的微生物分離出來培養(yǎng)基無菌技術(shù)純化培養(yǎng)相關(guān)性信息2.研究和應(yīng)用微生物的前提（發(fā)酵工程的重要基礎(chǔ)）是：

、

。防止雜菌污染獲得純凈的微生物培養(yǎng)物1.定義：人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。2.作用：用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。3.種類：有無凝固劑瓊脂液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基微生物的分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)擴(kuò)大培養(yǎng)、工業(yè)生產(chǎn)（1）按物理性質(zhì)分微生物在固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，可以形成肉眼可見的菌落。一、培養(yǎng)基的配制不能被微生物利用只起凝固作用3.種類：一、培養(yǎng)基的配制（2）按用途分選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基例如，在培養(yǎng)基中加入_________，可用于選擇培養(yǎng)真菌；在培養(yǎng)基中加入高濃度的鹽水，可用于選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌；不加氮源的無氮培養(yǎng)基可用于選擇培養(yǎng)_______生物；不加碳源的培養(yǎng)基可用于選擇培養(yǎng)_______生物；以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基可用于選擇培養(yǎng)_____________；以纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基可用于選擇培養(yǎng)_______________。允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基?？股毓痰责B(yǎng)尿素分解菌纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基：微生物的分離3.種類：一、培養(yǎng)基的配制（2）按用途分選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基微生物的分離鑒別培養(yǎng)基：根據(jù)微生物的代謝特點(diǎn)，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)試劑配制而成的，用以鑒別不同種類的微生物。伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（大腸桿菌）大腸桿菌的代謝產(chǎn)物（有機(jī)酸）能與伊紅美藍(lán)結(jié)合，從而形成深紫色、并帶有金屬光澤的菌落。一、培養(yǎng)基的配制酚紅（分解尿素菌）在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中，只有能分解尿素的細(xì)菌才能利用尿素這種氮源來生長(zhǎng)繁殖，并長(zhǎng)出菌落。尿素分解菌產(chǎn)生的脲酶能將尿素分解成CO2和NH3，NH3溶于水會(huì)電離出NH4+和OH-，使培養(yǎng)基的pH升高。在該培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果菌落周圍變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。一、培養(yǎng)基的配制剛果紅（分解纖維素菌）剛果紅

+纖維素→紅色復(fù)合物纖維素分解菌→纖維素酶→纖維二糖+葡萄糖（不能與剛果紅形成紅色復(fù)合物）纖維素分解菌周圍出現(xiàn)透明圈3.種類：選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基一、培養(yǎng)基的配制（2）按用途分3.種類：培養(yǎng)基中加氨芐青霉素具有抗氨芐青霉素能力的菌落沒有氨芐青霉素抗性的細(xì)菌選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基+氨芐青霉素培養(yǎng)基沒有抗氨芐青霉素能力的菌落被淘汰怎樣選擇出抗氨芐青霉素能力的細(xì)菌?一、培養(yǎng)基的配制（2）按用途分3.種類：一、培養(yǎng)基的配制（3）按化學(xué)性質(zhì)分含化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)一般用于工業(yè)生產(chǎn)①天然培養(yǎng)基：②合成培養(yǎng)基：計(jì)算稱量溶化滅菌培養(yǎng)基成分明確分類、鑒定3.種類：一、培養(yǎng)基的配制（3）按化學(xué)性質(zhì)分（2）按用途分選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基微生物的分離微生物的鑒定工業(yè)生產(chǎn)微生物的大規(guī)模培養(yǎng)微生物的分離和計(jì)數(shù)（1）按物理性質(zhì)分液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基

加凝固劑（如瓊脂）天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基分類、鑒定一、培養(yǎng)基的配制4.培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分：碳源、氮源、水、無機(jī)鹽一、培養(yǎng)基的配制①碳源無機(jī)碳源：有機(jī)碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、石油等②氮源無機(jī)氮源：有機(jī)氮源：NH4＋、NO3-、硝酸鹽、銨鹽牛肉膏、蛋白胨、尿素等③水④無機(jī)鹽自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物功能：①構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物②有機(jī)碳既是碳源又是能源。功能：主要用于合成蛋白質(zhì)、核酸及含氮代謝產(chǎn)物等。含C、H、O、N的有機(jī)物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源。功能：良好的溶劑；維持生物大分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定功能：提供無機(jī)營(yíng)養(yǎng)；調(diào)節(jié)PH；維持滲透壓4.培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分：碳源、氮源、水、無機(jī)鹽一、培養(yǎng)基的配制⑤其他要求：PH、O2、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)微生物名稱乳酸桿菌霉菌細(xì)菌厭氧微生物對(duì)培養(yǎng)基的特殊要求添加維生素調(diào)至酸性調(diào)至中性或弱堿性提供無氧環(huán)境“個(gè)性定制”生長(zhǎng)因子、氨基酸、維生素、堿基等一、培養(yǎng)基的配制表1-11000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成組分含量提供的主要營(yíng)養(yǎng)牛肉膏5g碳源、磷酸鹽和維生素蛋白胨10g氮源和維生素等NaCl5g無機(jī)鹽H2O定容至1000mL水1.此培養(yǎng)基提供的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有幾種？3.培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是濃度是否越高越好？為什么5種否，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度過高會(huì)使微生物失水，反而不利于微生物生長(zhǎng)。2.為何培養(yǎng)基需要氮源？氮元素是微生物合成蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)所必需的。1.關(guān)于微生物的營(yíng)養(yǎng)，下列說法正確的是A.同一種物質(zhì)不可能既作碳源又作氮源

B.凡是碳源都能提供能量C.除水以外的無機(jī)物僅提供無機(jī)鹽

D.無機(jī)氮源也可能提供能量

√牛肉膏和蛋白胨既既作碳源又作氮源CO2、CO32-、HCO3-等無機(jī)碳源CO2可以為自養(yǎng)微生物提供碳源課堂練習(xí)課堂練習(xí)2.下列有關(guān)培養(yǎng)基的敘述，正確的是A.微生物的培養(yǎng)都需要提供水、碳源、氮源、無機(jī)鹽，缺一不可B.微生物在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，可以形成肉眼可見的單個(gè)細(xì)菌C.培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，需要將培養(yǎng)基調(diào)至中性或弱堿性D.培養(yǎng)基只能培養(yǎng)細(xì)菌√如:固氮菌，其能夠利用空氣中的氮?dú)?，作為氮源形成肉眼可見的菌落還能培養(yǎng)真菌二、無菌技術(shù)1.獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵？

2.無菌技術(shù)包括什么？消毒和滅菌的概念？

常用的消毒和滅菌方法？

3.已滅菌的材料用具應(yīng)注意什么？如何避免周圍環(huán)境微生物的污染？4.(旁欄思考)無菌技術(shù)除用來防止培養(yǎng)物被污染外，還有什么作用？任務(wù)2：請(qǐng)同學(xué)們自主學(xué)習(xí)教材P10-11頁(yè)，思考完成以下問題：

（P10）（P10）二、無菌技術(shù)1.獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵：防止雜菌污染消毒滅菌2.主要方法：（1）消毒：①概念：用較為溫和的理化方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物②適用對(duì)象：實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。③常用方法：煮沸消毒、巴氏消毒、化學(xué)藥劑消毒、紫外線消毒用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子芽孢細(xì)胞膜細(xì)胞壁DNA前孢子芽孢囊早期孢子皮質(zhì)有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體(不是繁殖體)，叫作芽孢。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如有的細(xì)菌的芽孢煮沸3小時(shí)以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜(如溫度、水分適宜)的時(shí)候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個(gè)細(xì)菌。二、無菌技術(shù)孢子是脫離親本后能直接或間接發(fā)育成新個(gè)體的生殖細(xì)胞。有時(shí)候可直接由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞通過細(xì)胞壁加厚和積貯養(yǎng)料而形成，能抵抗不良環(huán)境條件。孢子細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖或休眠作用的生殖細(xì)胞。孢子的特點(diǎn)是能直接長(zhǎng)成新個(gè)體。二、無菌技術(shù)2.無菌技術(shù)的類型：a.煮沸消毒法：b.巴氏消毒法：100℃煮沸5～6min，可以殺死微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和一部分芽孢。62～65℃下消毒30min或80～90℃處理30s～1min，適合一些不耐高溫的液體，如牛奶?？梢詺⑺琅Ｄ讨械慕^大多數(shù)微生物，并且不破壞牛奶的營(yíng)養(yǎng)成分。二、無菌技術(shù)（1）消毒：③常用方法：c.化學(xué)藥劑消毒法：用70%酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等。二、無菌技術(shù)2.無菌技術(shù)的類型：（1）消毒：③常用方法：d.紫外線消毒法：接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)在使用前可用紫外線照射30min。在照射前，適量噴灑石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加強(qiáng)消毒效果。二、無菌技術(shù)2.無菌技術(shù)的類型：（1）消毒：③常用方法：二、無菌技術(shù)2.主要方法：（2）滅菌：①概念：用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子②適用對(duì)象：培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌。③常用方法：濕熱滅菌、干熱滅菌、灼燒滅菌是一種利用沸水、流通蒸汽或高壓蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。常見高壓蒸汽滅菌法（效果最好）主要用于對(duì)培養(yǎng)基及多種器材、物品滅菌100Kpa，121℃，15-30min濕熱滅菌二、無菌技術(shù)a.濕熱滅菌：2.無菌技術(shù)的類型：（2）滅菌：③常用方法：1.滅菌物品不要裝得太擠，以妨礙蒸汽流通而影響滅菌效果注意事項(xiàng)2.錐形瓶和試管口不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包裹的瓶口的紙滲入棉塞3.加熱初期打開排氣閥，待冷空氣排盡之后再關(guān)閉4.斷開電源，讓鍋內(nèi)溫度自然下降，待壓力表指針指到零后打開排氣閥濕熱滅菌二、無菌技術(shù)a.濕熱滅菌：2.無菌技術(shù)的類型：

思考1、培養(yǎng)基滅菌為什么采用高壓蒸汽滅菌而不采用干熱滅菌？

分析：干熱滅菌箱內(nèi)的高溫會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基的_________喪失，而高壓蒸汽鍋內(nèi)的_________較大，不會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基的_________散失。

思考2、如何制備一瓶無菌水？

分析：對(duì)一瓶有菌水進(jìn)行___________________處理。

思考3、某同學(xué)在使用高壓蒸汽滅菌鍋時(shí)，若壓力達(dá)到設(shè)定要求，而鍋內(nèi)并沒有達(dá)到相應(yīng)溫度，最可能的原因是？

分析：_____________________。

思考4、某同學(xué)從高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)拿出培養(yǎng)基后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基已經(jīng)濺滿了錐形瓶的瓶壁，最可能的原因是？

分析：___________________________________________，就提前打開了高壓蒸汽鍋。

思考5：用紫外線可以給接種室消毒，其原理是紫外線能___________________。在照射前，適量噴灑石炭酸或煤酚皂溶液等_________，可以加強(qiáng)消毒效果。水分濕度水分高壓蒸汽滅菌未將鍋內(nèi)冷空氣排盡高壓蒸汽鍋的壓力表讀數(shù)還未降至零損傷細(xì)菌的DNA消毒液干熱滅菌主要用于對(duì)耐高溫和需要干燥的物品，如玻璃皿、吸管、金屬用具等等溫度降到70℃以下再打開箱門160-170℃，維持1-2h二、無菌技術(shù)b.干熱滅菌：2.無菌技術(shù)的類型：（2）滅菌：③常用方法：接種工具涂布器接種環(huán)接種針其他金屬工具直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒接種過程試管口瓶口通過酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒迅速?gòu)氐诇缇茻郎缇?、無菌技術(shù)c.灼燒滅菌：2.無菌技術(shù)的類型：（2）滅菌：③常用方法：常用于接種工具涂布器類型適用范圍操作方法消毒滅菌較為溫和理化方法，殺死部分微生物強(qiáng)烈的理化方法，殺死所有微生物(包括芽孢、孢子)煮沸消毒法日常生活100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高溫的液體62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min化學(xué)藥劑生物活體、水源等擦拭等,如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源紫外線紫外線照射30min灼燒滅菌接種的金屬工具、接種時(shí)用的試管口或瓶口等直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒干熱滅菌耐高溫、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金屬用具等物品放入干熱滅菌箱,160～170℃加熱2～3h濕熱滅菌培養(yǎng)基