學(xué)習(xí)目標(biāo)：

1.基因工程的概念及理論基礎(chǔ)2.基因工程的基本工具

第1節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具第1課時(shí)【復(fù)習(xí)】基因的結(jié)構(gòu)和功能1.基因與DNA的關(guān)系？2.基因的基本單位是什么？基因是有遺傳效應(yīng)的DNA片段DNA平面結(jié)構(gòu)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)CH2

HOHHHHH堿基

磷酸

5’4’3’2’1’脫氧（核糖）核苷酸【復(fù)習(xí)】基因的結(jié)構(gòu)和功能3.基因的功能？?jī)?chǔ)存、傳遞、表達(dá)遺傳信息復(fù)制子代DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯控制蛋白質(zhì)合成復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯DNARNA逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制蛋白質(zhì)

我國(guó)是棉花的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，棉花在種植過(guò)程中，常會(huì)受到一些蟲(chóng)害的侵襲，其中以棉鈴蟲(chóng)最為常見(jiàn)，它可以使棉花產(chǎn)量減少三分之一，甚至絕收。大量施用農(nóng)藥×

能不能導(dǎo)入“殺蟲(chóng)基因”到棉花細(xì)胞，使棉花自身產(chǎn)生抗蟲(chóng)蛋白來(lái)抵抗棉鈴蟲(chóng)呢？抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)基因基因工程指按照人們的愿望，通過(guò)

等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在

上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫作

。轉(zhuǎn)基因DNA分子水平重組DNA技術(shù)一.基因工程的概念與理論基礎(chǔ)1.概念操作對(duì)象及環(huán)境操作水平操作原理結(jié)果基因；生物體外DNA分子水平賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品?；蛑亟M優(yōu)點(diǎn)：

能克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙；定向改造生物的遺傳特性。2.理論基礎(chǔ)分析

拼接的基礎(chǔ)①DNA的基本組成單位相同（四種脫氧核苷酸）

表達(dá)的基礎(chǔ)②都遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則③DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)①基因是控制生物性狀的結(jié)構(gòu)與功能單位②遺傳信息的傳遞都遵循中心法則基因在空間上轉(zhuǎn)移并成功表達(dá)③生物界共用一套遺傳密碼。（相同的遺傳信息在不同的生物體內(nèi)表達(dá)出相同的蛋白質(zhì)）。DNA（基因）

轉(zhuǎn)錄翻譯mRNA蛋白質(zhì)（1）不同生物的基因?yàn)槭裁茨芷唇樱浚?）為什么一種生物的基因可以在另一種生物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)？“分子手術(shù)刀”準(zhǔn)確切割DNA分子“分子縫合針”“分子運(yùn)輸車(chē)”將DNA片段連接起來(lái)將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞重組DNA技術(shù)的基本工具DNA雙螺旋的直徑只有2nm，對(duì)如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，更需要專(zhuān)門(mén)的“分子工具”。二.限制性內(nèi)切核酸酶—“分子手術(shù)刀”（1)來(lái)源：主要是原核生物（2)化學(xué)本質(zhì)：蛋白質(zhì)（3)種類(lèi)：數(shù)千種（不是一種酶，而是一類(lèi)酶）1.基礎(chǔ)知識(shí)準(zhǔn)確切割DNA分子分子手術(shù)刀（4)命名

限制酶名字的由來(lái)EcoRⅠ屬名Escherichia首字母種名coli前兩個(gè)字母R型菌株從中分離的第一個(gè)限制酶例如：流感嗜血桿菌(Haemophilus

influenzae)d株中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindIHindIIHindIII資料卡能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的特定脫氧核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。兩個(gè)特定5'3'5'3'TAGGTATCCA磷酸二酯鍵作用特點(diǎn)：注意：

限制酶只切割

兩個(gè)核苷酸之間

的磷酸二酯鍵。3’5’專(zhuān)一性2.作用3.識(shí)別序列長(zhǎng)度大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識(shí)別序列是由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量的核苷酸組成。中軸線思考·討論：想一想限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？特點(diǎn)1：都可以找到一條中（心）軸線；特點(diǎn)2：中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ(chēng)重復(fù)排列的，稱(chēng)為回文序列。在切割部位，正向讀與另一條鏈反向讀的堿基順序完全一致5’3’5’3’EcoRⅠ限制酶的識(shí)別序列為從5’→3’方向的識(shí)別序列均為GAATTC，并切斷G和A之間的磷酸二酯鍵你知道限制酶是如何精確切割的嗎？能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。第一步第二步中軸線4.作用結(jié)果5’3’5’3’一限制性內(nèi)切核酸酶—“分子手術(shù)刀”例如，EcoRⅠ限制酶的識(shí)別序列為從5’→3’方向的識(shí)別序列均為GAATTC，并切斷G和A之間的磷酸二酯鍵你知道限制酶是如何精確切割的嗎？能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。第一步第二步3’5’5’3’黏性末端黏性末端當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA分子的兩條鏈分別切開(kāi)時(shí)，產(chǎn)生的是黏性末端；注意：限制酶切割磷酸二酯鍵后氫鍵會(huì)自動(dòng)斷裂！4.作用結(jié)果產(chǎn)生的黏性末端：AATT5’3’5’3’一限制性內(nèi)切核酸酶—“分子手術(shù)刀”例如，SmaⅠ限制酶的識(shí)別序列為從5’→3’方向的識(shí)別序列均為CCCGGG，并切斷C和G之間的磷酸二酯鍵中軸線4.作用結(jié)果5’3’5’3’一限制性內(nèi)切核酸酶—“分子手術(shù)刀”例如，SmaⅠ限制酶的識(shí)別序列為平末端當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，產(chǎn)生的是平末端。3’5’5’3’4.作用結(jié)果從5’→3’方向的識(shí)別序列均為CCCGGG，并切斷C和G之間的磷酸二酯鍵請(qǐng)寫(xiě)出下列限制酶切割形成的黏性末端不同的限制酶切割可能形成相同的黏性末端。1、同種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否相同？2、不同限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否一定不同？同種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端相同思考·討論：BamHⅠ________EcoRⅠ________HindⅢ________BglⅡ________GATCAATTAGCTGATC3、你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身安全的目的。4、為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？

DNA分子中不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)。思考·討論：一限制性內(nèi)切核酸酶—“分子手術(shù)刀”--ATGCATGCAT……CCAGAATTCCCA……TCCCTAAGAATTCCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GGTCTTAAGGGT……AGGGATTCTTAAGGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---蘇云金桿菌DNA片段中的部分基因3’5’5’3’可以用EcoRⅠ限制酶將目的基因從DNA片段中切割下來(lái)！你知道切割結(jié)果是怎樣的？EcoRⅠ限制酶的識(shí)別序列GAATTC

目的基因一限制性內(nèi)切核酸酶—“分子手術(shù)刀”蘇云金桿菌DNA片段中的部分基因3’5’5’3’

目的基因

目的基因蘇云金桿菌DNA片段中的部分基因3’5’5’3’5’3’3’5’3’5’5’3’用限制酶切一個(gè)特定基因要切斷幾個(gè)磷酸二酯鍵？若每斷裂一個(gè)磷酸二酯鍵，需要一分子水的作用，切下一個(gè)目的基因，共需要幾分子水？4個(gè)4分子水

目的基因蘇云金桿菌DNA片段中的部分基因3’5’5’3’5’3’3’5’3’5’5’3’要想獲得目的基因必須用限制性核酸內(nèi)切酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端。用同種限制酶切割(EcoRⅠ)TGAATTCGACTTAAGCAGAATTCTTCTTAAGA

把兩種來(lái)源不同的DNA進(jìn)行重組，應(yīng)該怎樣處理？缺口怎么辦基因載體三.DNA連接酶—“分子縫合針”

將雙鏈___________“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的_____________。DNA片段磷酸二酯鍵1.作用：2.種類(lèi)：注意：

不是連接氫鍵，氫鍵的形成不需要酶的催化E.coli

DNA連接酶T4DNA連接酶3.E·coliDNA連接酶的作用且兩個(gè)DNA片段要具有相同的黏性末端才能連接起來(lái)。只能把兩個(gè)DNA片段黏性末端間的縫隙“縫合”起來(lái)；，T4DNA連接酶還可以把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效率相對(duì)較低。4.T4

DNA連接酶作用種類(lèi)來(lái)源大腸桿菌T4噬菌體作用差別只連接____________縫合___________和____________E.coli

DNA連接酶T4DNA連接酶黏性末端黏性末端平末端（效率較低）都能將雙鏈DNA片段“縫合“起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的磷酸二酯鍵。兩種DNA連接酶的區(qū)別GAGTATCDNA連接酶DNA連接酶ATAGTCCGAATTDNA連接酶：連接兩個(gè)DNA片段CAATTDNA聚合酶DNA聚合酶：以DNA的一條鏈作為模板，連接游離的脫氧核苷酸，形成磷酸二酯鍵。思考：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？（72頁(yè)）DNA連接酶DNA聚合酶相同作用實(shí)質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對(duì)象作用結(jié)果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制在兩個(gè)DNA片段間形成磷酸二酯鍵將單個(gè)核苷酸連接到已有DNA片段，形成磷酸二酯鍵DNA連接酶與DNA聚合酶的比較歸納提升與DNA相關(guān)的4種酶的比較名稱(chēng)作用部位作用結(jié)果限制酶DNA連接酶DNA聚合酶解旋酶磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵堿基對(duì)之間的氫鍵將DNA切成兩個(gè)片段將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子將單個(gè)脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈根據(jù)所學(xué)知識(shí)，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA連接酶④DNA聚合酶ba1.切斷a處的酶為_(kāi)______

2.連接a處的酶為_(kāi)______3.切斷b處的酶為_(kāi)______①③④②a：磷酸二酯鍵；b：氫鍵反饋練習(xí)：將外源基因送入受體細(xì)胞,

在受體細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制.

1.作用：2.種類(lèi)：質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒等。種類(lèi)用途不同點(diǎn)質(zhì)粒、噬菌體植物病毒動(dòng)物病毒將外源基因?qū)氪竽c桿菌等受體細(xì)胞將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞將外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞來(lái)源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別四.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體—“分子運(yùn)輸車(chē)”3.最常用的載體——質(zhì)粒

一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。終止子：轉(zhuǎn)錄的終點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起調(diào)控作用。啟動(dòng)子:

驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA復(fù)制原點(diǎn):DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)。標(biāo)記基因其基因?qū)儆诩?xì)胞質(zhì)基因。真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的。4.作為載體需具備的條件（1）有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，

供外源DNA片段（基因）插入其中。（2）能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制或整合

到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制。（3）

常有特殊的標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選。（4）

無(wú)毒害作用避免受體細(xì)胞受到損傷問(wèn)題1：載體要與外源基因連接，需要具備什么條件？問(wèn)題2：要使攜帶的外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，載體需要具備什么條件？問(wèn)題3：我們用肉眼看不到載體是否進(jìn)入受體細(xì)胞，為了便于篩選重組DNA分子，載體需要具備什么條件？目的基因是一個(gè)DNA片段，不含有復(fù)制原點(diǎn)、不含有啟動(dòng)子和終止子。3.為什么不能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞？？1.質(zhì)粒上有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)，有什么作用？思考：大腸桿菌及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖供外源基因或外源DNA片段插入其中。2.質(zhì)粒上有標(biāo)記基因，有什么作用？便于重組DNA分子的篩選。目的基因不能自主復(fù)制，不能穩(wěn)定存在并遺傳給后代。

載體上的標(biāo)記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細(xì)胞沒(méi)有抵抗該抗生素的能力。將含有某抗生素抗性基因的載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，受體細(xì)胞對(duì)該抗生素產(chǎn)生抗性。在含有該抗生素的培養(yǎng)基上，導(dǎo)入了載體并成功表達(dá)了的受體細(xì)胞才能夠生存。如圖所示：標(biāo)記基因的篩選原理…TATCGTACGATAGGTACTTAA…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG5′3′5′3′5′3′5′3′重組DNA分子思考.討論問(wèn)題:剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？

剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。思考?討論

重組DNA分子2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補(bǔ)配對(duì)?如果不能，可能是什么原因造成的？如果制作的黏性末端的堿基不能互補(bǔ)配對(duì)，可能是剪切位點(diǎn)或連接位點(diǎn)選得不對(duì)，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能稱(chēng)得上一個(gè)基因嗎？不能；因?yàn)榛虻拈L(zhǎng)度一般在100個(gè)堿基對(duì)以上。重組DNA分子限制酶的選擇技巧

圖甲

圖乙根據(jù)目的基因確定限制酶的種類(lèi)①不能選擇切割位點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶②應(yīng)選擇切割位點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶；

（不破壞目的基因）限制酶的選擇技巧

圖甲

圖乙根據(jù)載體的特點(diǎn)確定限制酶的種類(lèi)①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致，以確保產(chǎn)生相同的黏性末端；②質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)（1)單酶切法目的基因單酶切的方法缺陷是什么？載體目的基因自身環(huán)化片段間

隨意

連接目的基因自身環(huán)化質(zhì)粒自身環(huán)化目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接反向連接11’22’122’1’21’12’正向連接（1)單酶切法單酶切的方法缺陷為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可選擇兩種不同的限制酶同時(shí)對(duì)目的基因和質(zhì)粒切割（2)雙酶切法雙酶切的優(yōu)點(diǎn):①

防止質(zhì)粒重新環(huán)化②

防止質(zhì)粒與目的基因反向連接③

防止目的基因自身環(huán)化選擇兩種不同的限制酶同時(shí)對(duì)目的基因和質(zhì)粒切割知識(shí)擴(kuò)展：限制酶的選擇原則(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：

通常所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致，如圖中

；

為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)