分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義實(shí)驗(yàn)一：基因組DNA的提?。ㄒ灾参锶~片為例）實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諒闹参锶~片中提取基因組DNA的方法，了解DNA提取的基本原理。實(shí)驗(yàn)原理植物細(xì)胞含有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核等結(jié)構(gòu)。在提取DNA時(shí)，首先需要破碎細(xì)胞，釋放出細(xì)胞核內(nèi)的DNA。本實(shí)驗(yàn)采用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法，CTAB是一種陽(yáng)離子去污劑，能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（0.7MNaCl）可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度（0.1-0.5MNaCl）下CTAB-核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀，通過(guò)離心可將其與蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)分離。然后用酚-氯仿-異戊醇抽提去除蛋白質(zhì)，最后用乙醇沉淀DNA。實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器材料新鮮的植物葉片。試劑1.CTAB提取緩沖液：2%CTAB，100mMTris-HCl（pH8.0），20mMEDTA（pH8.0），1.4MNaCl，0.2%β-巰基乙醇（使用前加入）。2.氯仿-異戊醇（24:1）。3.酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）。4.70%乙醇。5.無(wú)水乙醇。6.TE緩沖液：10mMTris-HCl（pH8.0），1mMEDTA（pH8.0）。儀器1.研缽和杵。2.離心機(jī)。3.恒溫水浴鍋。4.移液器及吸頭。5.離心管（1.5ml）。實(shí)驗(yàn)步驟1.取約0.1g新鮮植物葉片，放入預(yù)冷的研缽中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末。2.將研磨好的粉末轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，加入600μl預(yù)熱至65℃的CTAB提取緩沖液，輕輕顛倒混勻，于65℃水浴鍋中保溫30min，期間每隔10min輕輕顛倒混勻一次。3.取出離心管，冷卻至室溫，加入等體積（約600μl）的酚-氯仿-異戊醇（25:24:1），輕輕顛倒混勻，12000rpm離心10min。4.將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇（24:1），輕輕顛倒混勻，12000rpm離心10min。5.再次將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，加入2/3體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，輕輕顛倒混勻，可見(jiàn)白色絮狀DNA沉淀。6.12000rpm離心5min，棄去上清液。7.加入1ml70%乙醇，輕輕洗滌沉淀，12000rpm離心5min，棄去上清液。8.重復(fù)步驟7一次。9.打開(kāi)離心管蓋子，置于室溫下晾干，直至乙醇完全揮發(fā)。10.加入50μlTE緩沖液，輕輕吹打混勻，使DNA溶解，于4℃保存?zhèn)溆?。注意事?xiàng)1.研磨葉片時(shí)要迅速，確保在液氮揮發(fā)前將葉片磨成粉末，以防止DNA被核酸酶降解。2.加入酚-氯仿-異戊醇和氯仿-異戊醇時(shí)要輕輕顛倒混勻，避免劇烈振蕩導(dǎo)致DNA斷裂。3.晾干DNA沉淀時(shí)，不要過(guò)度干燥，否則DNA難以溶解。實(shí)驗(yàn)二：DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆窄傊悄z電泳的原理和操作方法，檢測(cè)提取的DNA的質(zhì)量和完整性。實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖凝膠電泳是一種常用的分離和檢測(cè)核酸的方法。DNA分子在電場(chǎng)中會(huì)向正極移動(dòng)，其遷移速度與分子大小、構(gòu)象等因素有關(guān)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度與其分子量的對(duì)數(shù)值成反比。通過(guò)與已知分子量的DNA標(biāo)準(zhǔn)marker進(jìn)行比較，可以大致判斷樣品DNA的分子量大小和完整性。實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器材料提取的植物基因組DNA樣品。試劑1.5×TBE緩沖液：445mMTris-硼酸，10mMEDTA（pH8.0）。2.瓊脂糖。3.溴化乙錠（EB）溶液（10mg/ml）：注意EB是強(qiáng)致癌物質(zhì)，使用時(shí)要戴手套，避免接觸皮膚。4.6×上樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。5.DNA標(biāo)準(zhǔn)marker。儀器1.電泳儀。2.電泳槽。3.凝膠成像系統(tǒng)。4.移液器及吸頭。5.微波爐。6.制膠板和梳子。實(shí)驗(yàn)步驟1.制備1%瓊脂糖凝膠：稱取0.5g瓊脂糖，加入50ml1×TBE緩沖液，在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解，冷卻至約60℃，加入2.5μlEB溶液，混勻后倒入制膠板中，插入梳子，待凝膠凝固。2.準(zhǔn)備樣品：取5μlDNA樣品，加入1μl6×上樣緩沖液，混勻。同時(shí)取5μlDNA標(biāo)準(zhǔn)marker，加入1μl6×上樣緩沖液，混勻。3.上樣：將凝固好的凝膠放入電泳槽中，加入1×TBE緩沖液至沒(méi)過(guò)凝膠表面。用移液器將樣品和DNA標(biāo)準(zhǔn)marker依次加入加樣孔中。4.電泳：接通電源，設(shè)置電壓為100V，電泳約30-60min，直至溴酚藍(lán)遷移至凝膠的合適位置。5.觀察結(jié)果：電泳結(jié)束后，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中，在紫外燈下觀察并拍照記錄。注意事項(xiàng)1.EB是強(qiáng)致癌物質(zhì)，使用時(shí)要嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，避免接觸皮膚和吸入。2.加熱瓊脂糖時(shí)要注意防止溶液溢出，加熱后要冷卻至合適溫度再加入EB，以免EB揮發(fā)。3.上樣時(shí)要小心，避免將樣品溢出加樣孔。實(shí)驗(yàn)三：PCR擴(kuò)增特定基因片段實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誔CR技術(shù)的原理和操作方法，擴(kuò)增特定的基因片段。實(shí)驗(yàn)原理PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是一種體外擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)。它通過(guò)高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟的循環(huán)，使目的DNA片段在短時(shí)間內(nèi)得到大量擴(kuò)增。在變性階段，雙鏈DNA解旋成單鏈；退火階段，引物與單鏈DNA模板互補(bǔ)結(jié)合；延伸階段，DNA聚合酶以引物為起始點(diǎn)，以dNTP為原料，合成新的DNA鏈。經(jīng)過(guò)多次循環(huán)，目的DNA片段的數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器材料提取的植物基因組DNA作為模板。試劑1.10×PCR緩沖液：包含Tris-HCl、KCl、MgCl?等成分，提供PCR反應(yīng)的適宜環(huán)境。2.dNTP混合物（2.5mMeach）：包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP。3.TaqDNA聚合酶（5U/μl）。4.引物（上下游引物，10μM）。5.無(wú)菌去離子水。儀器1.PCR儀。2.移液器及吸頭。3.離心管（0.2ml）。實(shí)驗(yàn)步驟1.在0.2ml離心管中依次加入以下試劑，配制25μl的PCR反應(yīng)體系：-無(wú)菌去離子水：17.3μl-10×PCR緩沖液：2.5μl-dNTP混合物（2.5mMeach）：2μl-上游引物（10μM）：1μl-下游引物（10μM）：1μl-模板DNA：1μl-TaqDNA聚合酶（5U/μl）：0.2μl2.輕輕混勻后，短暫離心，使反應(yīng)液集中于管底。3.將離心管放入PCR儀中，設(shè)置PCR反應(yīng)程序：-預(yù)變性：94℃，5min-變性：94℃，30s-退火：根據(jù)引物的Tm值確定退火溫度，一般為50-65℃，30s-延伸：72℃，根據(jù)擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度確定延伸時(shí)間，一般為1kb/min-循環(huán)次數(shù)：30-35次-最后延伸：72℃，10min-4℃保存4.啟動(dòng)PCR儀，開(kāi)始反應(yīng)。5.反應(yīng)結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，方法同實(shí)驗(yàn)二。注意事項(xiàng)1.配制PCR反應(yīng)體系時(shí)要在冰上操作，避免酶失活。2.引物的設(shè)計(jì)要合理，Tm值要適宜，以保證PCR反應(yīng)的特異性和效率。3.PCR儀的程序設(shè)置要準(zhǔn)確，不同的引物和模板可能需要調(diào)整反應(yīng)條件。實(shí)驗(yàn)四：PCR產(chǎn)物的回收與純化實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誔CR產(chǎn)物回收與純化的方法，去除PCR反應(yīng)體系中的雜質(zhì)，獲得純凈的PCR產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)原理PCR產(chǎn)物回收與純化的方法有多種，本實(shí)驗(yàn)采用柱式回收法。其原理是利用硅膠膜在高鹽低pH條件下能特異性吸附DNA，而在低鹽高pH條件下DNA又能從硅膠膜上解吸附的特性，通過(guò)一系列的洗滌和洗脫步驟，去除PCR反應(yīng)體系中的引物、dNTP、酶等雜質(zhì)，從而獲得純凈的PCR產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器材料經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)有目的條帶的PCR產(chǎn)物。試劑1.DNA回收試劑盒：包含結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液等。2.無(wú)水乙醇。儀器1.離心機(jī)。2.移液器及吸頭。3.離心管（1.5ml）。4.吸附柱及收集管。實(shí)驗(yàn)步驟1.取適量的PCR產(chǎn)物（根據(jù)目的條帶的亮度確定），加入3倍體積的結(jié)合緩沖液，充分混勻。2.將混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000rpm離心1min，棄去收集管中的廢液。3.向吸附柱中加入700μl洗滌緩沖液（使用前已加入無(wú)水乙醇），12000rpm離心1min，棄去收集管中的廢液。4.重復(fù)步驟3一次。5.12000rpm離心2min，以徹底去除洗滌緩沖液。6.將吸附柱轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，向吸附膜中央加入30-50μl洗脫緩沖液，室溫放置2-5min。7.12000rpm離心1min，收集離心管中的液體，即為回收純化后的PCR產(chǎn)物，可于-20℃保存?zhèn)溆?。注意事?xiàng)1.加入結(jié)合緩沖液后要充分混勻，確保DNA能與硅膠膜充分結(jié)合。2.洗滌緩沖液使用前要按說(shuō)明書要求加入無(wú)水乙醇。3.洗脫緩沖液的體積可根據(jù)需要適當(dāng)調(diào)整，體積越小，回收的DNA濃度越高。實(shí)驗(yàn)五：目的基因與載體的連接實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誅NA連接的原理和方法，將回收純化后的PCR產(chǎn)物與載體進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)原理DNA連接是指在DNA連接酶的作用下，將兩個(gè)DNA片段的5'-磷酸基團(tuán)和3'-羥基連接起來(lái)，形成磷酸二酯鍵。常用的DNA連接酶是T4DNA連接酶，它可以連接粘性末端和平末端的DNA片段。在本實(shí)驗(yàn)中，將回收純化后的PCR產(chǎn)物與經(jīng)過(guò)相應(yīng)酶切處理的載體進(jìn)行連接，形成重組質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器材料回收純化后的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)酶切處理的載體（如pUC19質(zhì)粒）。試劑1.T4DNA連接酶（5U/μl）。2.10×T4DNA連接酶緩沖液。3.無(wú)菌去離子水。儀器1.移液器及吸頭。2.離心管（0.2ml）。3.恒溫水浴鍋或PCR儀。實(shí)驗(yàn)步驟1.在0.2ml離心管中依次加入以下試劑，配制10μl的連接反應(yīng)體系：-無(wú)菌去離子水：根據(jù)需要補(bǔ)齊至10μl-10×T4DNA連接酶緩沖液：1μl-經(jīng)過(guò)酶切處理的載體：1μl（約50ng）-回收純化后的PCR產(chǎn)物：3μl（載體與插入片段的摩爾比一般為1:3-1:10）-T4DNA連接酶（5U/μl）：0.5μl2.輕輕混勻后，短暫離心，使反應(yīng)液集中于管底。3.將離心管放入16℃水浴鍋或PCR儀中，連接過(guò)夜（約12-16h）。4.連接反應(yīng)結(jié)束后，可將連接產(chǎn)物用于后續(xù)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)或于-20℃保存。注意事項(xiàng)1.連接反應(yīng)體系的配制要準(zhǔn)確，載體與插入片段的摩爾比要合適，以提高連接效率。2.T4DNA連接酶要在冰上操作，避免酶失活。3.連接反應(yīng)的溫度和時(shí)間要嚴(yán)格控制，不同的連接酶可能有不同的最適反應(yīng)條件。實(shí)驗(yàn)六：大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆沾竽c桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法和轉(zhuǎn)化技術(shù)，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)原理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞是指處于能夠攝取外源DNA分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞。常用的制備感受態(tài)細(xì)胞的方法是CaCl?法，其原理是在低溫下，用低滲的CaCl?溶液處理大腸桿菌細(xì)胞，使細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜通透性增加，從而使外源DNA分子更容易進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)化是指將外源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程，在本實(shí)驗(yàn)中，將重組質(zhì)粒與感受態(tài)細(xì)胞混合，通過(guò)熱激處理，使重組質(zhì)粒進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞，然后在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器材料大腸桿菌DH5α菌株，重組質(zhì)粒連接產(chǎn)物。試劑1.LB液體培養(yǎng)基：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，加水定容至1L，調(diào)pH至7.0，高壓滅菌。2.LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂粉，高壓滅菌后，趁熱倒入培養(yǎng)皿中，凝固備用。3.0.1MCaCl?溶液：稱取1.11gCaCl?，加水定容至100ml，高壓滅菌。4.抗生素溶液（如氨芐青霉素，100mg/ml）：過(guò)濾除菌后，-20℃保存。儀器1.離心機(jī)。2.移液器及吸頭。3.離心管（1.5ml）。4.恒溫水浴鍋。5.搖床。6.超凈工作臺(tái)。7.培養(yǎng)箱。實(shí)驗(yàn)步驟大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備1.從LB固體培養(yǎng)基上挑取單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2.取1ml過(guò)夜培養(yǎng)物接種于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD???=0.3-0.5（約2-3h）。3.將菌液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，冰上放置10min。4.4℃、4000rpm離心10min，棄去上清液。5.加入10ml預(yù)冷的0.1MCaCl?溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置30min。6.4℃、4000rpm離心10min，棄去上清液。7.加入2ml預(yù)冷的0.1MCaCl?溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，制成感受態(tài)細(xì)胞懸液。感受態(tài)細(xì)胞可立即用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)或于-80℃保存?zhèn)溆?。轉(zhuǎn)化1.取100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液，加入5μl重組質(zhì)粒連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰上放置30min。2.42℃熱激90s，迅速放回冰上，放置2min。3.加入900μlLB液體培養(yǎng)基，37℃、150rpm振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)菌復(fù)蘇。4.取適量的菌液（如100μl）均勻涂布于含有相應(yīng)抗生素（如氨芐青霉素）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。5.觀察培養(yǎng)皿上的菌落生長(zhǎng)情況，挑取單菌落進(jìn)行后續(xù)的鑒定實(shí)驗(yàn)。注意事項(xiàng)1.制備感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化過(guò)程要嚴(yán)格無(wú)菌操作，避免污染。2.菌液的培養(yǎng)時(shí)間和OD???值要嚴(yán)格控制，以保證感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)量。3.熱激時(shí)間要準(zhǔn)確，過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。實(shí)驗(yàn)七：重組質(zhì)粒的提取與鑒定實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆罩亟M質(zhì)粒提取的方法和鑒定技術(shù)，驗(yàn)證重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。實(shí)驗(yàn)原理重組質(zhì)粒的提取方法與基因組DNA的提取類似，本實(shí)驗(yàn)采用堿裂解法。其原理是在堿性條件下，細(xì)菌細(xì)胞壁破裂，細(xì)胞膜上的磷脂和蛋白質(zhì)變性，DNA雙鏈解開(kāi)，然后通過(guò)中和作用，使質(zhì)粒DNA復(fù)性，而染色體DNA則形成不可溶的復(fù)合物，通過(guò)離心可將質(zhì)粒DNA與染色體DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)分離。重組質(zhì)粒的鑒定方法有多種，如酶切鑒定、PCR鑒定等，本實(shí)驗(yàn)采用酶切鑒定，通過(guò)用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割重組質(zhì)粒，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，根據(jù)酶切片段的大小和數(shù)量判斷重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器材料含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落。試劑1.溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mMTris-HCl（pH8.0），10mMEDTA（pH8.0），高壓滅菌后4℃保存。2.溶液Ⅱ：0.2MNaOH，1%SDS，現(xiàn)用現(xiàn)配。3.溶液Ⅲ：3M醋酸鉀，pH4.8。4.酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）。5.氯仿-異戊醇（24:1）。6.70%乙醇。7.無(wú)水乙醇。8.TE緩沖液：10mMTris-HCl（pH8.0），1mMEDTA（pH8.0）。9.限制性內(nèi)切酶及相應(yīng)的緩沖液。儀器1.離心機(jī)。2.移液器及吸頭。3.離心管（1.5ml）。4.恒溫水浴鍋。5.電泳儀及電泳槽。6.凝膠成像系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)步驟重組質(zhì)粒的提取1.挑取含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，接種于5ml含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2.取1.5ml菌液于1.5ml離心管中，12000rpm離心1min，棄去上清液。3.加入100μl溶液Ⅰ，劇烈振蕩，使細(xì)菌沉淀完全懸浮。4.加入200μl新鮮配制的溶液Ⅱ，輕輕顛倒混勻，冰上放置5min。5.加入150μl溶液Ⅲ，輕輕顛倒混勻，冰上放置5