人SORL1片段在原核細(xì)胞中的表達(dá)、重組蛋白純化及抗體制備的研究一、引言1.1研究背景阿爾茨海默?。ˋlzheimer'sdisease，AD），又稱老年性癡呆，是一種以記憶力減退為主要表現(xiàn)，伴有其他認(rèn)知功能損害的獲得性智能減退綜合征。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)AD患者數(shù)量眾多，且隨著人口老齡化的加劇，其發(fā)病率呈上升趨勢。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種因素，給患者家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。目前，AD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但大量研究表明，β淀粉樣蛋白（Aβ）在腦組織內(nèi)的異常增加或聚集是導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的主要原因之一。在Aβ蛋白產(chǎn)生過程中，分揀蛋白相關(guān)受體-1基因（sortilin-relatedreceptor1gene，SORL1基因）發(fā)揮著關(guān)鍵作用。SORL1基因是一種新發(fā)現(xiàn)的AD致病基因，參與APP裂解環(huán)節(jié)，可增加遲發(fā)型阿爾茨海默病（Late-onsetAlzheimer'sdisease，Late-onsetAD）的患病風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，SORL1主要存在于早期核內(nèi)體和反式高爾基體中，可通過與不同的胞漿適配器相互作用，影響細(xì)胞內(nèi)β-淀粉樣前體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，參與遲發(fā)性阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展。此外，在人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中敲除Sorl1基因會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膜體增大，這是一種典型的阿爾茨海默病細(xì)胞病理學(xué)改變。針對歐洲血統(tǒng)個體的研究表明，某些SORL1基因變異對AD具有保護(hù)作用，但多數(shù)基因研究集中于歐洲人群。而東亞人群中也存在關(guān)鍵的SORL1基因變異，且在東亞人群中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的AD保護(hù)作用，不過在歐洲人群中卻較為罕見。同時，有報(bào)道稱SORL1在AD患者大腦中的表達(dá)量減低，甚至僅為健康老年人的一半。對SORL1基因的深入研究有助于揭示AD的發(fā)病機(jī)制，為AD的早期診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和思路。然而，目前對SORL1基因的研究仍面臨諸多挑戰(zhàn)，其中獲取高純度的SORL1蛋白及特異性抗體是關(guān)鍵問題之一。原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡單、成本低、表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，是生產(chǎn)重組蛋白的常用方法。通過原核細(xì)胞表達(dá)人SORL1片段，進(jìn)而進(jìn)行基因重組蛋白純化及抗體制備，對于研究SORL1基因的功能及作用機(jī)制具有重要意義。它不僅能夠?yàn)锳D的發(fā)病機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，還有望推動AD診斷試劑和治療藥物的研發(fā)，具有廣闊的應(yīng)用前景和重要的社會價(jià)值。1.2研究目的與意義本研究旨在通過原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)人SORL1片段的高效表達(dá)，并對表達(dá)的基因重組蛋白進(jìn)行純化，進(jìn)而制備特異性抗體，為深入研究SORL1基因在阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制中的作用提供重要的實(shí)驗(yàn)材料和技術(shù)支持。阿爾茨海默?。ˋD）作為一種嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。盡管目前對AD的研究取得了一定進(jìn)展，但發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，有效的治療手段也十分有限。SORL1基因作為AD的重要致病基因之一，其編碼的蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)β淀粉樣蛋白產(chǎn)生和清除方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。深入研究SORL1基因的功能及作用機(jī)制，對于揭示AD的發(fā)病機(jī)制，開發(fā)新的診斷方法和治療策略具有重要意義。通過原核細(xì)胞表達(dá)人SORL1片段并制備特異性抗體，本研究期望達(dá)到以下具體目標(biāo)：一是建立高效穩(wěn)定的人SORL1片段原核表達(dá)體系，優(yōu)化表達(dá)條件，提高蛋白表達(dá)量；二是運(yùn)用合適的純化技術(shù)，獲得高純度的人SORL1基因重組蛋白，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求；三是利用純化后的蛋白制備高質(zhì)量的特異性抗體，為SORL1基因的功能研究和AD的診斷提供有力工具。本研究具有重要的理論和實(shí)際意義。在理論上，有助于深入了解SORL1基因在AD發(fā)病機(jī)制中的作用，為揭示AD的發(fā)病機(jī)制提供新的線索和理論依據(jù)。在實(shí)際應(yīng)用中，制備的特異性抗體可用于開發(fā)AD的診斷試劑，實(shí)現(xiàn)AD的早期診斷和病情監(jiān)測，為患者的早期干預(yù)和治療提供可能。同時，本研究也為AD治療藥物的研發(fā)提供了新的靶點(diǎn)和思路，推動AD治療領(lǐng)域的發(fā)展，具有廣闊的應(yīng)用前景和重要的社會價(jià)值。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在阿爾茨海默病（AD）的研究領(lǐng)域中，人SORL1基因作為重要的致病基因之一，其相關(guān)研究備受關(guān)注。在人SORL1片段的原核細(xì)胞表達(dá)、基因重組蛋白純化及抗體制備方面，國內(nèi)外學(xué)者已開展了一系列研究并取得了一定成果。在原核細(xì)胞表達(dá)方面，已有研究成功構(gòu)建了人SORL1片段的原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌等原核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。如李爽等人采用PCR方法擴(kuò)增人sorllcDNA編碼區(qū)5923～6260bp片段，克隆入原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，利用大腸桿菌BL21(DE3)plysS表達(dá)重組質(zhì)粒，成功實(shí)現(xiàn)了人SORL1蛋白質(zhì)片段在原核細(xì)胞中的高效表達(dá)，為后續(xù)的蛋白純化和抗體研究奠定了基礎(chǔ)。在基因重組蛋白純化方面，多種純化技術(shù)被應(yīng)用于人SORL1基因重組蛋白的純化，如液相色譜法、親和層析法等。通過這些技術(shù)，能夠有效去除雜質(zhì)，提高蛋白純度。李爽等人的研究中，使用液相色譜法對表達(dá)的基因重組蛋白進(jìn)行純化，獲得了較高純度的人SORL1蛋白，純化后的基因重組蛋白在SDS—PAGE中表現(xiàn)為單一條帶，表觀分子量約為13000。在抗體制備方面，利用純化后的人SORL1蛋白免疫動物，可制備特異性抗體。這些抗體在AD的診斷和研究中具有重要應(yīng)用價(jià)值，可用于檢測AD患者體內(nèi)SORL1蛋白的表達(dá)水平和功能變化。然而，目前制備的抗體在特異性和親和力方面仍有待進(jìn)一步提高，以滿足臨床診斷和治療的需求。盡管國內(nèi)外在人SORL1片段的原核細(xì)胞表達(dá)、基因重組蛋白純化及抗體制備方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些不足之處。部分研究中蛋白表達(dá)量較低，影響了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展；在蛋白純化過程中，一些復(fù)雜的雜質(zhì)難以完全去除，導(dǎo)致蛋白純度不夠高；抗體制備過程中，抗體的特異性和穩(wěn)定性有待進(jìn)一步優(yōu)化，以提高其在AD診斷和治療中的應(yīng)用效果。因此，深入研究人SORL1片段的原核細(xì)胞表達(dá)、基因重組蛋白純化及抗體制備方法，具有重要的理論和實(shí)際意義，有望為AD的診斷和治療提供更有效的工具和方法。二、人SORL1片段的原核細(xì)胞表達(dá)2.1實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)所使用的菌株為大腸桿菌BL21(DE3)，其遺傳背景清晰，具有高效表達(dá)外源蛋白的能力，廣泛應(yīng)用于原核表達(dá)系統(tǒng)中。pET-28a(+)表達(dá)質(zhì)粒作為基因工程中常用的表達(dá)載體，具備T7啟動子、His標(biāo)簽等元件，便于目的基因的表達(dá)和后續(xù)蛋白的純化。在試劑方面，選用了多種限制性內(nèi)切酶，如NcoI和XhoI，用于對表達(dá)質(zhì)粒和目的基因進(jìn)行酶切，以實(shí)現(xiàn)兩者的精準(zhǔn)連接。T4DNA連接酶則在連接反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，催化目的基因與表達(dá)質(zhì)粒之間的磷酸二酯鍵形成，構(gòu)建重組表達(dá)載體。PCR反應(yīng)所需的高保真DNA聚合酶，能夠保證擴(kuò)增目的基因時的準(zhǔn)確性，減少堿基錯配的發(fā)生。dNTPs混合液為PCR反應(yīng)提供了四種脫氧核苷酸原料，確保DNA合成的順利進(jìn)行。用于感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化的試劑包括CaCl?溶液，它能夠增加大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性，使外源DNA更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。此外，還準(zhǔn)備了LB培養(yǎng)基，用于大腸桿菌的培養(yǎng)，其成分包括胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉等，為細(xì)菌的生長提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。在培養(yǎng)過程中，為了篩選含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，還添加了卡那霉素，只有成功轉(zhuǎn)入帶有卡那霉素抗性基因重組質(zhì)粒的細(xì)菌才能在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上生長。實(shí)驗(yàn)中用到的儀器設(shè)備種類繁多，PCR儀是實(shí)現(xiàn)目的基因擴(kuò)增的關(guān)鍵儀器，通過精確控制溫度變化，完成DNA的變性、退火和延伸過程。核酸電泳儀則用于檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、酶切產(chǎn)物以及重組質(zhì)粒的大小和純度，利用不同核酸片段在電場中的遷移速率差異，實(shí)現(xiàn)對核酸的分離和鑒定。凝膠成像系統(tǒng)能夠?qū)﹄娪竞蟮哪z進(jìn)行拍照和分析，直觀地展示核酸條帶的位置和亮度。離心機(jī)用于菌體的收集、蛋白的分離等操作，通過高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力，使不同密度的物質(zhì)分離。恒溫?fù)u床為大腸桿菌的培養(yǎng)提供了適宜的溫度和振蕩條件，促進(jìn)細(xì)菌的生長和代謝。2.2目的基因獲取2.2.1PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增是獲取目的基因的常用方法之一，具有高效、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中，以含人SORL1基因的克隆質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。首先，依據(jù)人SORL1基因的序列信息，運(yùn)用專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件，如PrimerPremier5.0，精心設(shè)計(jì)特異性引物。引物設(shè)計(jì)遵循一系列嚴(yán)格原則，包括引物長度一般設(shè)定為18-30bp，以確保引物與模板的特異性結(jié)合；GC含量維持在40%-60%，使引物具有合適的解鏈溫度；避免引物自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物之間出現(xiàn)互補(bǔ)配對，防止非特異性擴(kuò)增的發(fā)生。在引物的5'端添加NcoI和XhoI酶切位點(diǎn)，便于后續(xù)與表達(dá)質(zhì)粒的連接，同時在酶切位點(diǎn)外側(cè)添加保護(hù)堿基，增強(qiáng)酶切反應(yīng)的效率。最終確定的引物序列為：上游引物5'-CCATGGATGCCACCATGCTG-3'（下劃線部分為NcoI酶切位點(diǎn)），下游引物5'-CTCGAGTCACTGGCTCCATC-3'（下劃線部分為XhoI酶切位點(diǎn)）。隨后，準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系。在無菌的0.2ml離心管中，依次加入以下成分：10×PCR緩沖液5μl，為DNA聚合酶提供適宜的反應(yīng)環(huán)境；2.5mMdNTPs4μl，作為DNA合成的原料；10μM上下游引物各1μl，引導(dǎo)DNA聚合酶特異性擴(kuò)增目的基因；含人SORL1基因的克隆質(zhì)粒1μl，作為擴(kuò)增的模板；高保真DNA聚合酶0.5μl，保證擴(kuò)增過程中DNA合成的準(zhǔn)確性；最后用ddH?O補(bǔ)足至50μl，使反應(yīng)體系總體積達(dá)到合適的水平。將配制好的PCR反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件經(jīng)過優(yōu)化確定如下：95℃預(yù)變性5min，使模板DNA完全解鏈，為后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)做好準(zhǔn)備；然后進(jìn)行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30s，使雙鏈DNA解旋為單鏈；58℃退火30s，引物與單鏈模板特異性結(jié)合；72℃延伸1min，在DNA聚合酶的作用下，以dNTPs為原料，沿著引物的方向延伸合成新的DNA鏈；循環(huán)結(jié)束后，72℃再延伸10min，確保所有的擴(kuò)增產(chǎn)物都能得到充分的延伸。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在電泳緩沖液中，DNA分子在電場的作用下向正極移動，由于不同大小的DNA片段在凝膠中的遷移速率不同，從而實(shí)現(xiàn)分離。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，若在預(yù)期大小位置出現(xiàn)明亮、單一的條帶，表明PCR擴(kuò)增成功，獲得了目的基因片段。對擴(kuò)增得到的目的基因片段進(jìn)行測序驗(yàn)證，將測序結(jié)果與已知的人SORL1基因序列進(jìn)行比對，確保擴(kuò)增得到的目的基因序列準(zhǔn)確無誤。2.2.2RT-PCR擴(kuò)增RT-PCR擴(kuò)增是從細(xì)胞或組織中獲取目的基因的另一種重要方法，尤其適用于基因表達(dá)水平的研究。其操作流程主要包括總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA以及PCR擴(kuò)增三個關(guān)鍵步驟。在總RNA提取環(huán)節(jié)，選擇合適的細(xì)胞或組織樣本至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)選取了人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y，該細(xì)胞系具有神經(jīng)元的特性，SORL1基因在其中有較高水平的表達(dá)，能夠?yàn)楹罄m(xù)實(shí)驗(yàn)提供豐富的模板。采用Trizol試劑法提取總RNA，該方法基于Trizol試劑能夠迅速裂解細(xì)胞，同時保持RNA的完整性，有效抑制RNA酶的活性。具體操作如下：將適量的SH-SY5Y細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至對數(shù)期時，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向每孔中加入1mlTrizol試劑，用移液器反復(fù)吹打，使細(xì)胞充分裂解，室溫靜置5min，讓核酸蛋白復(fù)合物完全解離。隨后，加入0.2ml***，劇烈振蕩15s，室溫靜置2-3min，使分層更加明顯。4℃、12000g離心15min，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中間層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相，含有DNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min，使RNA沉淀。4℃、12000g離心10min，棄去上清，此時可見管底有白色的RNA沉淀。用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次加入1ml75%乙醇，輕輕顛倒離心管，使沉淀懸浮，4℃、7500g離心5min，棄去上清。將離心管倒置在濾紙上，晾干RNA沉淀，注意避免過度干燥導(dǎo)致RNA難以溶解。最后，加入適量的無RNase水溶解RNA沉淀，輕輕吹打使RNA充分溶解。采用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，A???/A???比值應(yīng)在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，無蛋白質(zhì)和酚類等雜質(zhì)污染；同時，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，觀察到清晰的28S和18SrRNA條帶，且28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶的2倍，說明RNA無明顯降解，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。獲得高質(zhì)量的總RNA后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，其中包含逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、緩沖液等關(guān)鍵試劑。以隨機(jī)引物或Oligo(dT)引物作為逆轉(zhuǎn)錄引物，它們能夠與RNA模板上的多個位點(diǎn)結(jié)合，啟動cDNA的合成。在無菌的0.2ml離心管中，依次加入以下成分：總RNA2μg，作為逆轉(zhuǎn)錄的模板；5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μl，提供適宜的反應(yīng)環(huán)境；10mMdNTPs2μl，作為cDNA合成的原料；逆轉(zhuǎn)錄引物1μl，引導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA；逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，催化逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的進(jìn)行；最后用無RNase水補(bǔ)足至20μl。將反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，置于PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為：42℃孵育60min，在此溫度下，逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板，合成互補(bǔ)的cDNA鏈；然后70℃保溫15min，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA可直接用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增，也可保存于-20℃?zhèn)溆谩Ｒ阅孓D(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增條件與前面所述的PCR擴(kuò)增基本相同。在PCR反應(yīng)體系中，除模板更換為cDNA外，其他成分和用量保持一致。將配制好的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，同樣取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否在預(yù)期位置出現(xiàn)特異性條帶。若擴(kuò)增成功，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證，確保獲得的目的基因序列準(zhǔn)確無誤。通過RT-PCR擴(kuò)增，能夠從細(xì)胞或組織中特異性地獲取人SORL1基因片段，為后續(xù)的原核細(xì)胞表達(dá)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。2.3表達(dá)載體構(gòu)建2.3.1載體酶切表達(dá)載體的構(gòu)建是原核細(xì)胞表達(dá)人SORL1片段的關(guān)鍵步驟之一，其中載體酶切是構(gòu)建過程的重要環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)選用pET-28a(+)作為表達(dá)載體，該載體具有T7啟動子，能夠高效啟動外源基因的轉(zhuǎn)錄；同時，其攜帶的His標(biāo)簽便于后續(xù)對表達(dá)蛋白進(jìn)行純化和檢測。在進(jìn)行載體酶切時，選用NcoI和XhoI這兩種限制性內(nèi)切酶對pET-28a(+)表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。這兩種酶具有特定的識別序列，NcoI識別序列為CCATGG，XhoI識別序列為CTCGAG，通過雙酶切可以在載體上產(chǎn)生兩個不同的粘性末端，有效防止載體自身環(huán)化，提高目的基因與載體連接的準(zhǔn)確性。酶切反應(yīng)在無菌的0.2ml離心管中進(jìn)行，反應(yīng)體系如下：pET-28a(+)表達(dá)質(zhì)粒5μl，約含1μg質(zhì)粒DNA；10×BufferM5μl，為酶切反應(yīng)提供適宜的緩沖環(huán)境，維持酶的活性；NcoI和XhoI各2μl，確保酶切反應(yīng)的充分進(jìn)行；最后用ddH?O補(bǔ)足至50μl。將反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，置于37℃恒溫金屬浴中孵育3-4h，使限制性內(nèi)切酶充分作用于表達(dá)質(zhì)粒。酶切反應(yīng)結(jié)束后，取5μl酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在電泳過程中，DNA分子在電場的作用下向正極移動，由于不同大小的DNA片段在凝膠中的遷移速率不同，從而實(shí)現(xiàn)分離。通過與DNAMarker進(jìn)行對比，可觀察到線性化的pET-28a(+)表達(dá)質(zhì)粒條帶，其大小約為5.4kb。隨后，使用凝膠回收試劑盒對酶切后的載體大片段進(jìn)行回收。凝膠回收過程基于硅膠膜在高鹽低pH值條件下特異性吸附DNA，而在低鹽高pH值條件下釋放DNA的原理。具體操作如下：將酶切后的凝膠在紫外燈下小心切下含有目的條帶的凝膠塊，放入1.5ml離心管中，加入適量的溶膠液，50-60℃水浴加熱10-15min，使凝膠完全溶解。將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000g離心1min，棄去流出液。向吸附柱中加入適量的洗滌液，12000g離心1min，棄去流出液，重復(fù)洗滌一次。最后，將吸附柱放入新的1.5ml離心管中，加入適量的洗脫緩沖液，室溫靜置2-5min，12000g離心1min，收集洗脫液，即得到回收的載體大片段。采用核酸蛋白測定儀測定回收載體大片段的濃度和純度，A???/A???比值應(yīng)在1.8-2.0之間，表明載體純度較高，可用于后續(xù)的連接反應(yīng)。2.3.2目的基因與載體連接目的基因與載體的連接是構(gòu)建重組表達(dá)載體的核心步驟，通過將PCR擴(kuò)增得到的人SORL1目的基因片段與酶切后的pET-28a(+)表達(dá)載體進(jìn)行連接，形成重組表達(dá)載體，為后續(xù)在原核細(xì)胞中的表達(dá)奠定基礎(chǔ)。在連接之前，需對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切處理，使其兩端產(chǎn)生與載體相同的粘性末端，以便于連接。雙酶切反應(yīng)體系如下：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μl，約含0.5-1μgDNA；10×BufferM5μl，提供適宜的反應(yīng)環(huán)境；NcoI和XhoI各2μl；用ddH?O補(bǔ)足至50μl。將反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，置于37℃恒溫金屬浴中孵育3-4h。酶切反應(yīng)結(jié)束后，同樣取5μl酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察目的基因片段的酶切情況，確保酶切完全。然后使用凝膠回收試劑盒對酶切后的目的基因片段進(jìn)行回收，操作步驟與載體大片段回收類似。將回收后的目的基因片段與載體大片段按照一定的摩爾比進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)使用T4DNA連接酶，該酶能夠催化DNA片段之間磷酸二酯鍵的形成，實(shí)現(xiàn)目的基因與載體的連接。連接反應(yīng)體系如下：回收的目的基因片段3μl，約含50-100ngDNA；回收的載體大片段1μl，約含20-50ngDNA；10×T4DNA連接酶緩沖液1μl，為連接酶提供適宜的反應(yīng)條件；T4DNA連接酶1μl；用ddH?O補(bǔ)足至10μl。將反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，置于16℃恒溫金屬浴中過夜連接，使目的基因與載體充分連接。連接反應(yīng)結(jié)束后，得到的重組表達(dá)載體可用于后續(xù)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。2.4轉(zhuǎn)化與篩選2.4.1轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞是實(shí)現(xiàn)人SORL1片段原核表達(dá)的關(guān)鍵步驟之一。感受態(tài)細(xì)胞是指處于容易吸收外源DNA狀態(tài)的細(xì)胞，在本實(shí)驗(yàn)中，采用CaCl?法制備大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。CaCl?法的原理基于細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和特性。在正常生理狀態(tài)下，大腸桿菌細(xì)胞膜具有一定的屏障作用，阻礙外源DNA的進(jìn)入。而當(dāng)大腸桿菌細(xì)胞處于低溫環(huán)境（0-4℃）中，且與CaCl?溶液接觸時，Ca2?會與細(xì)胞膜上的磷脂分子相互作用，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，形成一些微小的孔洞。這些孔洞為外源DNA的進(jìn)入提供了通道，使得重組表達(dá)載體能夠順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。具體操作過程如下：從-80℃冰箱中取出保存的大腸桿菌BL21(DE3)甘油菌，在無菌條件下，用接種環(huán)挑取少量菌體，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過夜，使細(xì)菌處于對數(shù)生長期。次日，將過夜培養(yǎng)的菌液按1:100的比例轉(zhuǎn)接至50mlLB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)，直至菌液的OD???值達(dá)到0.4-0.6，此時細(xì)菌生長狀態(tài)良好，適合制備感受態(tài)細(xì)胞。將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)移至無菌的離心管中，冰浴10min，使細(xì)胞溫度迅速降低。然后，4℃、5000g離心10min，收集菌體。棄去上清液，用預(yù)冷的0.1MCaCl?溶液輕輕懸浮菌體，冰浴30min，使Ca2?充分作用于細(xì)胞膜。再次4℃、5000g離心10min，棄去上清液，加入適量預(yù)冷的0.1MCaCl?溶液，輕輕懸浮菌體，使細(xì)胞濃度調(diào)整至合適范圍，即得到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。將制備好的感受態(tài)細(xì)胞分裝成50μl/管，保存于-80℃冰箱備用。在轉(zhuǎn)化時，從-80℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，冰浴融化。向50μl感受態(tài)細(xì)胞中加入5μl連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30min，使重組表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞充分接觸。然后，將離心管放入42℃水浴中熱激90s，促進(jìn)重組表達(dá)載體進(jìn)入細(xì)胞。熱激結(jié)束后，迅速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴中，放置2-3min，使細(xì)胞恢復(fù)正常狀態(tài)。向離心管中加入500μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、150rpm振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因。最后，將復(fù)蘇后的菌液涂布于含有卡那霉素（50μg/ml）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上，只有成功轉(zhuǎn)入帶有卡那霉素抗性基因重組表達(dá)載體的大腸桿菌才能生長，從而實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)化子的初步篩選。2.4.2篩選陽性克隆在轉(zhuǎn)化后的LB固體培養(yǎng)基平板上，會出現(xiàn)大量的菌落，其中包含了陽性克?。ê兄亟M表達(dá)質(zhì)粒）和陰性克?。ㄎ闯晒D(zhuǎn)入重組表達(dá)質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)入的是自身環(huán)化的載體）。為了獲得含有重組表達(dá)質(zhì)粒的陽性克隆，需要采用一系列篩選方法，包括抗性篩選、菌落PCR和測序驗(yàn)證等?？剐院Y選是基于重組表達(dá)質(zhì)粒上攜帶的卡那霉素抗性基因。在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，只有成功轉(zhuǎn)入重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌才能抵抗卡那霉素的抑制作用，正常生長并形成菌落；而未轉(zhuǎn)入重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌則因缺乏抗性基因，無法在該培養(yǎng)基上生長。因此，通過觀察菌落的生長情況，可初步篩選出可能含有重組表達(dá)質(zhì)粒的陽性克隆。菌落PCR是一種快速鑒定陽性克隆的方法。其原理是利用PCR技術(shù)，以菌落中的重組表達(dá)質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增目的基因片段。具體操作如下：用無菌牙簽挑取平板上的單菌落，放入含有50μlPCR反應(yīng)體系的0.2ml離心管中。PCR反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液5μl，2.5mMdNTPs4μl，10μM上下游引物各1μl，TaqDNA聚合酶0.5μl，用ddH?O補(bǔ)足至50μl。將離心管短暫離心，使菌落在反應(yīng)體系中充分分散。然后，將離心管置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件與之前擴(kuò)增目的基因時類似，95℃預(yù)變性5min，然后進(jìn)行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)結(jié)束后，72℃再延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。若在預(yù)期大小位置出現(xiàn)明亮、單一的條帶，表明該菌落可能為陽性克隆，其中含有重組表達(dá)質(zhì)粒且目的基因插入正確；若未出現(xiàn)條帶或條帶大小與預(yù)期不符，則該菌落可能為陰性克隆。雖然抗性篩選和菌落PCR能夠初步篩選出陽性克隆，但為了確保篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性，還需要對疑似陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證。將經(jīng)過菌落PCR鑒定為陽性的克隆接種于5ml含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。然后，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組表達(dá)質(zhì)粒。將提取的重組表達(dá)質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行測序，測序引物為與目的基因兩端序列互補(bǔ)的引物。測序結(jié)果返回后，將其與已知的人SORL1基因序列進(jìn)行比對。若測序結(jié)果與目的基因序列完全一致，表明該克隆為陽性克隆，成功構(gòu)建了含有正確人SORL1基因片段的重組表達(dá)質(zhì)粒；若測序結(jié)果存在堿基突變、缺失或插入等情況，則該克隆不符合要求，需要重新篩選。通過抗性篩選、菌落PCR和測序驗(yàn)證等一系列嚴(yán)格的篩選步驟，能夠準(zhǔn)確獲得含有重組表達(dá)質(zhì)粒的陽性克隆，為后續(xù)的人SORL1片段原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)提供可靠的實(shí)驗(yàn)材料。2.5誘導(dǎo)表達(dá)2.5.1培養(yǎng)條件優(yōu)化培養(yǎng)條件的優(yōu)化對于提高人SORL1片段的表達(dá)量至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)主要探討了不同培養(yǎng)溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時間對人SORL1片段表達(dá)量的影響，通過一系列對比實(shí)驗(yàn)，確定最佳誘導(dǎo)條件。在培養(yǎng)溫度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，將含有重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)接種于LB液體培養(yǎng)基（含卡那霉素50μg/ml）中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???值達(dá)到0.6-0.8。然后，將菌液均分為若干份，分別置于不同溫度（25℃、30℃、37℃）下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。向各份菌液中加入IPTG至終濃度為0.5mM，誘導(dǎo)時間設(shè)定為4h。誘導(dǎo)結(jié)束后，收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE分析，通過凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度，比較不同溫度下目的蛋白的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，30℃時人SORL1片段的表達(dá)量相對較高，可能是因?yàn)樵摐囟认麓竽c桿菌的生長代謝和蛋白表達(dá)相關(guān)酶的活性較為適宜，有利于目的蛋白的合成。IPTG濃度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)同樣基于上述培養(yǎng)基礎(chǔ)。在30℃培養(yǎng)條件下，將達(dá)到對數(shù)生長期的菌液均分為若干份，分別加入不同終濃度（0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1.0mM）的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)時間仍為4h。誘導(dǎo)結(jié)束后，收集菌體并進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，當(dāng)IPTG終濃度為0.5mM時，目的蛋白的表達(dá)量最高。IPTG作為誘導(dǎo)劑，其濃度過低可能無法充分激活T7啟動子，導(dǎo)致目的蛋白表達(dá)量不足；而濃度過高則可能對大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生毒性，影響細(xì)胞的正常生長和蛋白表達(dá)。對于誘導(dǎo)時間的優(yōu)化，在30℃培養(yǎng)且IPTG終濃度為0.5mM的條件下，分別在誘導(dǎo)1h、2h、3h、4h、5h、6h后收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，誘導(dǎo)4h時人SORL1片段的表達(dá)量達(dá)到峰值，繼續(xù)延長誘導(dǎo)時間，表達(dá)量無明顯增加，甚至可能由于菌體生長進(jìn)入衰退期，蛋白降解增加，導(dǎo)致表達(dá)量略有下降。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最佳誘導(dǎo)條件為：培養(yǎng)溫度30℃，IPTG終濃度0.5mM，誘導(dǎo)時間4h。在該條件下，人SORL1片段能夠在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，為后續(xù)的蛋白純化和抗體制備提供充足的原料。2.5.2誘導(dǎo)表達(dá)過程在確定了最佳誘導(dǎo)條件（培養(yǎng)溫度30℃，IPTG終濃度0.5mM，誘導(dǎo)時間4h）后，進(jìn)行人SORL1片段的誘導(dǎo)表達(dá)。具體操作步驟如下：從含有卡那霉素（50μg/ml）的LB固體培養(yǎng)基平板上，用無菌接種環(huán)挑取單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基（含卡那霉素50μg/ml）中。將接種后的試管置于37℃恒溫?fù)u床中，220rpm振蕩培養(yǎng)過夜，使細(xì)菌處于對數(shù)生長期。次日，將過夜培養(yǎng)的菌液按1:100的比例轉(zhuǎn)接至50mlLB液體培養(yǎng)基（含卡那霉素50μg/ml）中，繼續(xù)在37℃、220rpm條件下振蕩培養(yǎng)，直至菌液的OD???值達(dá)到0.6-0.8。此時，細(xì)菌生長狀態(tài)良好，適合進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將達(dá)到對數(shù)生長期的菌液轉(zhuǎn)移至無菌的三角瓶中，按照0.5mM的終濃度加入IPTG。加入IPTG時，需緩慢滴加并同時輕輕搖晃三角瓶，使IPTG均勻分布于菌液中。然后，將三角瓶置于30℃恒溫?fù)u床中，220rpm振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。在誘導(dǎo)過程中，要密切觀察菌液的狀態(tài)，確保搖床的溫度和轉(zhuǎn)速穩(wěn)定，避免外界因素對誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生影響。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，將菌液轉(zhuǎn)移至無菌的離心管中，4℃、8000g離心10min，收集菌體。棄去上清液，用預(yù)冷的PBS緩沖液（pH7.4）洗滌菌體2-3次，每次洗滌后均需4℃、8000g離心10min，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。洗滌后的菌體可直接用于后續(xù)的蛋白純化實(shí)驗(yàn)，若暫時不進(jìn)行純化，可將菌體保存于-80℃冰箱中備用。在誘導(dǎo)表達(dá)過程中，需要注意以下事項(xiàng)：一是所有操作均需在無菌條件下進(jìn)行，避免雜菌污染，影響目的蛋白的表達(dá)和后續(xù)實(shí)驗(yàn)；二是IPTG的加入量要準(zhǔn)確，確保誘導(dǎo)濃度符合最佳條件；三是誘導(dǎo)過程中要保持搖床的溫度和轉(zhuǎn)速穩(wěn)定，為細(xì)菌生長和蛋白表達(dá)提供穩(wěn)定的環(huán)境；四是收集菌體時，要確保離心條件合適，使菌體充分沉淀，同時避免過度離心導(dǎo)致菌體受損。通過嚴(yán)格按照上述步驟和注意事項(xiàng)進(jìn)行操作，能夠保證在最佳條件下高效誘導(dǎo)人SORL1片段的表達(dá)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的菌體材料。2.6表達(dá)產(chǎn)物分析2.6.1SDS-PAGE分析SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）是一種常用的蛋白質(zhì)分析技術(shù)，其原理基于SDS能夠與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子帶上大量的負(fù)電荷，掩蓋了蛋白質(zhì)原有的電荷差異。在電場的作用下，蛋白質(zhì)分子僅依據(jù)分子量的大小在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行分離，分子量越小的蛋白質(zhì)遷移速度越快，反之則越慢。在本實(shí)驗(yàn)中，將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體進(jìn)行處理，制備蛋白質(zhì)樣品。取適量誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，4℃、8000g離心10min，收集菌體。棄去上清液，用預(yù)冷的PBS緩沖液（pH7.4）洗滌菌體2-3次，每次洗滌后均需4℃、8000g離心10min，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向洗滌后的菌體中加入適量的細(xì)胞裂解液，冰浴超聲破碎菌體，功率設(shè)置為300W，工作3s，間歇5s，總時間為10min，使細(xì)胞充分裂解，釋放出蛋白質(zhì)。然后，4℃、12000g離心20min，取上清液作為蛋白質(zhì)樣品。同時，取適量未誘導(dǎo)的菌體，按照相同的方法制備蛋白質(zhì)樣品作為對照。將制備好的蛋白質(zhì)樣品與5×SDS上樣緩沖液按照4:1的比例混合，100℃煮沸5min，使蛋白質(zhì)充分變性。冷卻至室溫后，短暫離心，將混合液上樣到12%的SDS-PAGE凝膠中。同時，在凝膠的第一個孔中加入蛋白質(zhì)Marker，用于指示蛋白質(zhì)的分子量大小。電泳采用恒壓模式，先在80V下電泳30min，使蛋白質(zhì)樣品在濃縮膠中充分濃縮，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳90min，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入考馬斯亮藍(lán)染色液中，室溫染色2-3h，使蛋白質(zhì)條帶充分染色。染色結(jié)束后，將凝膠轉(zhuǎn)移至脫色液中，脫色液為甲醇：乙酸：水=45:10:45的混合溶液，室溫脫色3-4h，期間更換2-3次脫色液，直至背景清晰，蛋白質(zhì)條帶清晰可見。通過觀察SDS-PAGE凝膠上的蛋白質(zhì)條帶，分析表達(dá)產(chǎn)物的情況。在誘導(dǎo)表達(dá)的樣品中，若在預(yù)期分子量大小位置出現(xiàn)明顯的條帶，且未誘導(dǎo)的樣品中該位置無條帶出現(xiàn)，表明人SORL1片段在大腸桿菌中成功表達(dá)。根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的指示，確定表達(dá)產(chǎn)物的分子量大小是否與預(yù)期相符。同時，通過比較誘導(dǎo)表達(dá)樣品與未誘導(dǎo)樣品中蛋白質(zhì)條帶的亮度，可初步判斷目的蛋白的表達(dá)量。若誘導(dǎo)表達(dá)樣品中目的蛋白條帶亮度明顯高于未誘導(dǎo)樣品，說明誘導(dǎo)表達(dá)成功提高了目的蛋白的表達(dá)量。2.6.2Westernblot鑒定Westernblot是一種用于檢測和分析特定蛋白質(zhì)的技術(shù)，它結(jié)合了SDS-PAGE的分離能力和抗原-抗體特異性結(jié)合的高靈敏度，能夠準(zhǔn)確鑒定表達(dá)產(chǎn)物是否為人SORL1片段。在進(jìn)行Westernblot鑒定時，首先將SDS-PAGE電泳后的凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜處理。轉(zhuǎn)膜采用濕轉(zhuǎn)法，將凝膠、PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）和濾紙按照凝膠-PVDF膜-濾紙的順序依次放置在轉(zhuǎn)膜裝置中，確保各層之間緊密貼合，無氣泡產(chǎn)生。轉(zhuǎn)膜緩沖液為含有25mMTris、192mM甘氨酸和20%甲醇的溶液，在冰浴條件下，以200mA恒流轉(zhuǎn)膜2h，使凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液（10mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，0.1%Tween-20）中，室溫封閉1-2h，以封閉PVDF膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入含有一抗（抗人SORL1抗體）的TBST緩沖液中，一抗按照1:1000的比例稀釋，4℃孵育過夜，使一抗與目的蛋白特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，將PVDF膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次洗滌10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后，將PVDF膜放入含有二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體）的TBST緩沖液中，二抗按照1:5000的比例稀釋，室溫孵育1-2h，使二抗與一抗特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次洗滌10min，以去除未結(jié)合的二抗。最后，采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色。將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光底物溶液中，室溫孵育1-2min，使底物與HRP發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生熒光信號。將PVDF膜取出，用保鮮膜包裹，放入凝膠成像系統(tǒng)中，曝光成像。若在預(yù)期分子量大小位置出現(xiàn)特異性條帶，表明表達(dá)產(chǎn)物為人SORL1片段，進(jìn)一步驗(yàn)證了表達(dá)的準(zhǔn)確性。三、人SORL1基因重組蛋白純化3.1包涵體的形成與處理在原核細(xì)胞表達(dá)人SORL1片段的過程中，包涵體的形成是一個常見的現(xiàn)象。包涵體是指在重組蛋白的表達(dá)過程中，由于多種因素的影響，蛋白質(zhì)無法正確折疊，進(jìn)而聚集形成的不溶性顆粒。這些顆粒通常由重組蛋白、RNA聚合酶、外膜蛋白等雜蛋白，以及DNA、RNA片段等成分組成。人SORL1重組蛋白在原核細(xì)胞中形成包涵體的原因較為復(fù)雜，主要包括以下幾個方面。一是表達(dá)量過高，當(dāng)人SORL1片段在大腸桿菌中大量表達(dá)時，蛋白質(zhì)的合成速度過快，以至于沒有足夠的時間進(jìn)行正確折疊，二硫鍵也無法正確配對，過多的蛋白間發(fā)生非特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度，最終形成包涵體。有研究表明，在低表達(dá)時，重組蛋白很少形成包涵體，而隨著表達(dá)量的增加，包涵體形成的概率顯著提高。二是重組蛋白的氨基酸組成，一般來說，含硫氨基酸越多的蛋白質(zhì)越容易形成包涵體。人SORL1蛋白的氨基酸序列中可能含有較多的含硫氨基酸，這增加了其形成包涵體的傾向。三是重組蛋白所處的環(huán)境因素，如發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)時，容易形成包涵體。在本實(shí)驗(yàn)中，若誘導(dǎo)表達(dá)時溫度過高，可能會影響蛋白質(zhì)的折疊過程，促使包涵體的形成。四是由于人SORL1蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，缺少真核生物中翻譯后修飾所需的酶類，致使中間體大量積累，也容易形成包涵體沉淀。為了獲得有活性的人SORL1重組蛋白，需要對包涵體進(jìn)行處理，主要包括洗滌和溶解兩個步驟。包涵體的洗滌是為了去除其中的雜質(zhì)，提高重組蛋白的純度。常用的洗滌試劑包括TritonX-100和EDTA等。具體操作如下：將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體離心收集，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌菌體2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基。然后，加入適量的含有0.5%TritonX-100和10mMEDTA（pH8.0）的裂解緩沖液，重懸菌體，室溫放置5分鐘，使洗滌試劑充分作用。接著，4℃、12000g離心15分鐘，棄去上清液。重復(fù)上述洗滌步驟2-3次，直至上清液中雜質(zhì)含量較低。通過SDS-PAGE分析洗滌前后沉淀和上清中的蛋白質(zhì)組成，確定是否大多數(shù)目的蛋白均在沉淀中，且雜質(zhì)已被有效去除。洗滌后的包涵體需要進(jìn)行溶解，以便后續(xù)的復(fù)性和純化。最常用的溶解試劑是鹽酸胍和尿素，一般使用6-8mol/L的濃度。以尿素為例，將洗滌后的包涵體重懸于含有8mol/L尿素的溶解緩沖液中，溶解緩沖液還包含50mMTris-HCl（pH8.0）、150mMNaCl等成分，室溫下攪拌1-2小時，使包涵體充分溶解。在溶解過程中，為了防止蛋白質(zhì)中的巰基氧化形成共價(jià)聚集體或分子內(nèi)錯配的二硫鍵，可以在緩沖液中加入低分子量的巰基試劑，如β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）等，保持巰基處于還原狀態(tài)。溶解后的包涵體溶液可用于后續(xù)的復(fù)性和純化步驟，通過優(yōu)化復(fù)性條件，使蛋白質(zhì)正確折疊，恢復(fù)其生物學(xué)活性。三、人SORL1基因重組蛋白純化3.1包涵體的形成與處理在原核細(xì)胞表達(dá)人SORL1片段的過程中，包涵體的形成是一個常見的現(xiàn)象。包涵體是指在重組蛋白的表達(dá)過程中，由于多種因素的影響，蛋白質(zhì)無法正確折疊，進(jìn)而聚集形成的不溶性顆粒。這些顆粒通常由重組蛋白、RNA聚合酶、外膜蛋白等雜蛋白，以及DNA、RNA片段等成分組成。人SORL1重組蛋白在原核細(xì)胞中形成包涵體的原因較為復(fù)雜，主要包括以下幾個方面。一是表達(dá)量過高，當(dāng)人SORL1片段在大腸桿菌中大量表達(dá)時，蛋白質(zhì)的合成速度過快，以至于沒有足夠的時間進(jìn)行正確折疊，二硫鍵也無法正確配對，過多的蛋白間發(fā)生非特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度，最終形成包涵體。有研究表明，在低表達(dá)時，重組蛋白很少形成包涵體，而隨著表達(dá)量的增加，包涵體形成的概率顯著提高。二是重組蛋白的氨基酸組成，一般來說，含硫氨基酸越多的蛋白質(zhì)越容易形成包涵體。人SORL1蛋白的氨基酸序列中可能含有較多的含硫氨基酸，這增加了其形成包涵體的傾向。三是重組蛋白所處的環(huán)境因素，如發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)時，容易形成包涵體。在本實(shí)驗(yàn)中，若誘導(dǎo)表達(dá)時溫度過高，可能會影響蛋白質(zhì)的折疊過程，促使包涵體的形成。四是由于人SORL1蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，缺少真核生物中翻譯后修飾所需的酶類，致使中間體大量積累，也容易形成包涵體沉淀。為了獲得有活性的人SORL1重組蛋白，需要對包涵體進(jìn)行處理，主要包括洗滌和溶解兩個步驟。包涵體的洗滌是為了去除其中的雜質(zhì)，提高重組蛋白的純度。常用的洗滌試劑包括TritonX-100和EDTA等。具體操作如下：將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體離心收集，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌菌體2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基。然后，加入適量的含有0.5%TritonX-100和10mMEDTA（pH8.0）的裂解緩沖液，重懸菌體，室溫放置5分鐘，使洗滌試劑充分作用。接著，4℃、12000g離心15分鐘，棄去上清液。重復(fù)上述洗滌步驟2-3次，直至上清液中雜質(zhì)含量較低。通過SDS-PAGE分析洗滌前后沉淀和上清中的蛋白質(zhì)組成，確定是否大多數(shù)目的蛋白均在沉淀中，且雜質(zhì)已被有效去除。洗滌后的包涵體需要進(jìn)行溶解，以便后續(xù)的復(fù)性和純化。最常用的溶解試劑是鹽酸胍和尿素，一般使用6-8mol/L的濃度。以尿素為例，將洗滌后的包涵體重懸于含有8mol/L尿素的溶解緩沖液中，溶解緩沖液還包含50mMTris-HCl（pH8.0）、150mMNaCl等成分，室溫下攪拌1-2小時，使包涵體充分溶解。在溶解過程中，為了防止蛋白質(zhì)中的巰基氧化形成共價(jià)聚集體或分子內(nèi)錯配的二硫鍵，可以在緩沖液中加入低分子量的巰基試劑，如β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）等，保持巰基處于還原狀態(tài)。溶解后的包涵體溶液可用于后續(xù)的復(fù)性和純化步驟，通過優(yōu)化復(fù)性條件，使蛋白質(zhì)正確折疊，恢復(fù)其生物學(xué)活性。3.2純化方法選擇3.2.1鎳柱親和層析原理與應(yīng)用鎳柱親和層析是一種基于分子間特異性相互作用的高效蛋白質(zhì)純化技術(shù)，在基因重組蛋白的純化中具有廣泛應(yīng)用。其原理是利用組氨酸（His）殘基上的咪唑基團(tuán)與鎳離子（Ni2?）之間能形成配位鍵的特性，實(shí)現(xiàn)對含有His-Tag（組氨酸標(biāo)簽）的目的蛋白的特異性吸附。在本實(shí)驗(yàn)中，人SORL1基因重組蛋白帶有His-Tag，這使得其能夠與鎳柱發(fā)生特異性結(jié)合。在鎳柱親和層析中，常用的填料為Ni-NTA（次氮基三乙酸鎳）或Ni-IDA（亞氨基二乙酸鎳）。以Ni-NTA為例，其通過螯合鎳離子，為目的蛋白的結(jié)合提供了位點(diǎn)。鎳離子有六個螯合價(jià)位，Ni-NTA螯合了四價(jià)，剩余兩價(jià)。當(dāng)含有His-Tag的人SORL1重組蛋白溶液流經(jīng)鎳柱時，His-Tag上的咪唑基團(tuán)與鎳柱上的鎳離子發(fā)生配位作用，從而使目的蛋白特異性地結(jié)合到鎳柱上；而雜蛋白因不帶有His殘基無法與Ni2?結(jié)合，隨流出液流出，從而實(shí)現(xiàn)了目的蛋白與非目的蛋白的初步分離。鎳柱親和層析的操作過程較為嚴(yán)謹(jǐn)。首先是準(zhǔn)備工作，根據(jù)目的蛋白的性質(zhì)，選擇合適的鎳柱類型和洗脫方式，并配制合適pH值的緩沖液和洗脫液。緩沖液和洗脫液在蛋白純化操作前需用0.45μm或0.22μm濾頭過濾除菌，以避免污染鎳柱，減少其使用壽命。接下來是樣品預(yù)處理，對溶解后的包涵體溶液進(jìn)行預(yù)處理，如離心去除雜質(zhì)、調(diào)整樣品的pH值、用低濃度咪唑溶液透析以去除可能存在的EDTA和鹽溶液等。然后進(jìn)行鎳柱平衡及上樣，利用無咪唑或低濃度咪唑的緩沖液對鎳柱進(jìn)行平衡，待監(jiān)測曲線維穩(wěn)10min左右，即平衡結(jié)束。平衡完成后，將處理完畢的樣品緩慢且勻速地加入鎳柱中，使目的蛋白與鎳柱充分結(jié)合。隨后進(jìn)行除雜，使用低濃度咪唑緩沖液（如2、5、10、20、25mM咪唑）沖洗鎳柱，去除與鎳柱非特異性結(jié)合的雜蛋白。該過程應(yīng)合理控制流速和時間，以確保雜蛋白被完全去除。最后是洗脫步驟，為收集高純度的目的蛋白，使用含有高濃度咪唑的洗脫液將目的蛋白從鎳柱上洗脫下來。通過梯度洗脫的方式，逐步增加洗脫液中咪唑的濃度（如50、100、200、300、400、500mM咪唑）。在目的蛋白首次純化實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)設(shè)置多個從低至高咪唑濃度的緩沖液，探索合適的洗脫條件。收集含目的蛋白的洗脫液樣品后，利用SDS-PAGE電泳等方法對其進(jìn)行分析，以評估其純度和濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用ddH?O沖洗鎳柱，并用20%乙醇溶液沖洗并保存鎳柱，以防止微生物生長。3.2.2其他純化方法比較除了鎳柱親和層析，常見的蛋白質(zhì)純化方法還有離子交換層析、凝膠過濾層析等，它們在原理、適用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)等方面與鎳柱親和層析存在差異。離子交換層析是利用蛋白質(zhì)在不同pH值下所帶電荷的差異進(jìn)行分離的技術(shù)。其原理是基于蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基在不同pH環(huán)境下會發(fā)生質(zhì)子化或去質(zhì)子化，從而使蛋白質(zhì)帶有不同的電荷。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液通過帶有相反電荷的離子交換樹脂時，帶電荷的蛋白質(zhì)會與樹脂發(fā)生靜電相互作用而被吸附，而不帶電荷或電荷性質(zhì)相反的雜質(zhì)則隨溶液流出。通過改變洗脫液的pH值或離子強(qiáng)度，可以使吸附在樹脂上的蛋白質(zhì)依次洗脫下來。離子交換層析適用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的純化，尤其是對電荷性質(zhì)差異較大的蛋白質(zhì)具有較好的分離效果。然而，其缺點(diǎn)是對蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)和洗脫條件要求較為嚴(yán)格，需要精確控制pH值和離子強(qiáng)度，否則容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性或分離效果不佳。在純化人SORL1基因重組蛋白時，若采用離子交換層析，可能需要花費(fèi)較多時間和精力來優(yōu)化洗脫條件，以確保目的蛋白的純度和活性。凝膠過濾層析，又稱分子篩層析，是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差異進(jìn)行分離的方法。該方法使用具有一定孔徑范圍的凝膠顆粒作為固定相，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合溶液通過凝膠柱時，小分子蛋白質(zhì)可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的孔隙，而大分子蛋白質(zhì)則被排阻在凝膠顆粒外部。因此，大分子蛋白質(zhì)先流出凝膠柱，小分子蛋白質(zhì)后流出，從而實(shí)現(xiàn)不同大小蛋白質(zhì)的分離。凝膠過濾層析的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、條件溫和，對蛋白質(zhì)的活性影響較小，且可以同時去除蛋白質(zhì)溶液中的小分子雜質(zhì)和鹽類。但其分辨率相對較低，對于分子量相近的蛋白質(zhì)難以實(shí)現(xiàn)高效分離。對于人SORL1基因重組蛋白的純化，如果其分子量與雜質(zhì)蛋白分子量差異不明顯，凝膠過濾層析可能無法達(dá)到理想的純化效果。與上述兩種方法相比，鎳柱親和層析具有高度選擇性，能夠特異性地結(jié)合帶有His-Tag的目的蛋白，對大部分雜質(zhì)蛋白具有很強(qiáng)的去除能力，可在一步操作中實(shí)現(xiàn)較高的純度和回收率。其操作相對簡單，適用于實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)。然而，鎳柱親和層析也存在一定局限性，如成本相對較高，需要使用特定的鎳柱和緩沖液；若目的蛋白的His-Tag被遮蔽或損壞，可能影響其與鎳柱的結(jié)合，從而降低純化效果。在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)人SORL1基因重組蛋白的特性、實(shí)驗(yàn)需求以及成本等因素，綜合考慮選擇合適的純化方法，也可將多種方法結(jié)合使用，以達(dá)到最佳的純化效果。3.3純化過程優(yōu)化3.3.1洗脫條件優(yōu)化在人SORL1基因重組蛋白的純化過程中，洗脫條件的優(yōu)化對于獲得高純度的目標(biāo)蛋白至關(guān)重要。洗脫緩沖液的濃度和pH值是影響洗脫效果和蛋白純度的關(guān)鍵因素，需要通過一系列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探討和優(yōu)化。對于洗脫緩沖液濃度的優(yōu)化，采用不同濃度梯度的咪唑洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫實(shí)驗(yàn)。在鎳柱親和層析中，咪唑是常用的競爭性洗脫劑，其濃度的變化會影響目的蛋白與鎳柱的結(jié)合與洗脫。準(zhǔn)備一系列咪唑濃度分別為50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM的洗脫緩沖液，其他成分保持一致。將經(jīng)過平衡和上樣處理后的鎳柱，依次用不同濃度的咪唑洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，每個濃度洗脫5個柱體積，收集洗脫液。對收集的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析，通過凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度，比較不同濃度咪唑洗脫緩沖液對目的蛋白洗脫量和純度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)咪唑濃度為200mM時，能夠有效洗脫目的蛋白，且洗脫液中雜蛋白含量較低，目的蛋白純度較高；隨著咪唑濃度進(jìn)一步升高，雖然目的蛋白洗脫量有所增加，但雜蛋白的洗脫量也相應(yīng)增加，導(dǎo)致純度下降。這可能是因?yàn)檩^低濃度的咪唑能夠特異性地競爭結(jié)合鎳柱上的His-Tag，使目的蛋白逐漸洗脫下來；而過高濃度的咪唑則會破壞目的蛋白與鎳柱的結(jié)合特異性，同時洗脫一些與鎳柱非特異性結(jié)合的雜蛋白。洗脫緩沖液的pH值對洗脫效果和蛋白純度也有顯著影響。蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)會隨pH值的變化而改變，從而影響其與鎳柱的結(jié)合能力。設(shè)置不同pH值的洗脫緩沖液，如pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0，咪唑濃度均為200mM。將鎳柱用不同pH值的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，同樣每個pH值洗脫5個柱體積，收集洗脫液并進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，在pH8.0時，目的蛋白的洗脫效果最佳，純度最高。當(dāng)pH值偏離8.0時，目的蛋白的洗脫量和純度均出現(xiàn)不同程度的下降。在酸性條件下（如pH7.0），蛋白質(zhì)可能會發(fā)生質(zhì)子化，電荷性質(zhì)改變，與鎳柱的結(jié)合力增強(qiáng)，導(dǎo)致洗脫困難；而在堿性條件下（如pH9.0），可能會影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，甚至導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，同時也可能使一些雜蛋白更容易與鎳柱結(jié)合，從而降低目的蛋白的純度。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最佳的洗脫條件為：咪唑濃度200mM，洗脫緩沖液pH8.0。在該條件下進(jìn)行洗脫，能夠獲得較高純度和產(chǎn)量的人SORL1基因重組蛋白，為后續(xù)的抗體制備和功能研究提供高質(zhì)量的蛋白樣品。3.3.2純度鑒定為了準(zhǔn)確評估純化后人SORL1重組蛋白的純度，采用了SDS-PAGE和HPLC等多種方法進(jìn)行鑒定。SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）是一種常用的蛋白質(zhì)純度鑒定方法，其原理基于SDS能夠與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子帶上大量的負(fù)電荷，掩蓋了蛋白質(zhì)原有的電荷差異。在電場的作用下，蛋白質(zhì)分子僅依據(jù)分子量的大小在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行分離，分子量越小的蛋白質(zhì)遷移速度越快，反之則越慢。將純化后的人SORL1重組蛋白樣品與蛋白質(zhì)Marker一起進(jìn)行SDS-PAGE分析。首先，制備12%的聚丙烯酰胺凝膠，包括分離膠和濃縮膠。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按照4:1的比例混合，100℃煮沸5min，使蛋白質(zhì)充分變性。冷卻至室溫后，短暫離心，將混合液上樣到凝膠中。電泳采用恒壓模式，先在80V下電泳30min，使蛋白質(zhì)樣品在濃縮膠中充分濃縮，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳90min，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入考馬斯亮藍(lán)染色液中，室溫染色2-3h，使蛋白質(zhì)條帶充分染色。染色結(jié)束后，將凝膠轉(zhuǎn)移至脫色液中，室溫脫色3-4h，期間更換2-3次脫色液，直至背景清晰，蛋白質(zhì)條帶清晰可見。通過觀察SDS-PAGE凝膠上的蛋白質(zhì)條帶，若在預(yù)期分子量大小位置出現(xiàn)單一、清晰的條帶，且無明顯的雜蛋白條帶，表明純化后的人SORL1重組蛋白純度較高。根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的指示，確定目的蛋白的分子量大小是否與預(yù)期相符。HPLC（高效液相色譜）是一種高效的分離分析技術(shù)，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行精確的分離和定量分析。采用反相HPLC對純化后的人SORL1重組蛋白進(jìn)行純度鑒定。選用C18反相色譜柱，流動相A為含0.1%三氟乙酸（TFA）的水溶液，流動相B為含0.1%TFA的乙腈溶液。首先對色譜柱進(jìn)行平衡，使基線穩(wěn)定。將純化后的蛋白樣品用流動相A溶解，以一定的流速注入色譜柱中。通過梯度洗脫的方式，逐漸增加流動相B的比例，使蛋白質(zhì)在色譜柱上實(shí)現(xiàn)分離。在洗脫過程中，利用紫外檢測器在280nm波長下檢測蛋白質(zhì)的洗脫峰。根據(jù)洗脫峰的數(shù)量和面積，計(jì)算目的蛋白的純度。若色譜圖中僅出現(xiàn)一個明顯的主峰，且該主峰的面積占總峰面積的比例較高（如大于95%），則表明純化后的人SORL1重組蛋白純度較高。與SDS-PAGE相比，HPLC能夠更精確地定量分析蛋白質(zhì)的純度，且分離效率高、分析速度快，能夠檢測到SDS-PAGE難以分辨的微量雜質(zhì)。通過SDS-PAGE和HPLC兩種方法的綜合鑒定，能夠全面、準(zhǔn)確地評估純化后人SORL1重組蛋白的純度。若兩種方法的鑒定結(jié)果均表明蛋白純度達(dá)到較高水平，則說明純化過程成功，獲得的人SORL1重組蛋白可滿足后續(xù)抗體制備和功能研究等實(shí)驗(yàn)的需求。四、人SORL1片段抗體制備4.1免疫動物選擇在人SORL1片段抗體制備過程中，免疫動物的選擇至關(guān)重要，它直接影響抗體的質(zhì)量和產(chǎn)量。常見的免疫動物有小鼠、兔子、大鼠、山羊等，每種動物都有其獨(dú)特的優(yōu)缺點(diǎn)，需要綜合多方面因素進(jìn)行考量。小鼠作為常用的免疫動物，具有諸多優(yōu)點(diǎn)。其繁殖周期短，一般6-8周即可達(dá)到性成熟，每年可產(chǎn)多胎，每胎產(chǎn)仔數(shù)較多，這使得實(shí)驗(yàn)者能夠快速獲得大量的實(shí)驗(yàn)動物，滿足不同實(shí)驗(yàn)規(guī)模的需求。小鼠的飼養(yǎng)成本較低，對飼養(yǎng)空間和環(huán)境要求相對不高，在普通的實(shí)驗(yàn)動物房即可飼養(yǎng)，這大大降低了實(shí)驗(yàn)成本。此外，小鼠的免疫應(yīng)答反應(yīng)較為靈敏，能夠?qū)Χ喾N抗原產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)。針對人SORL1片段，小鼠能夠快速產(chǎn)生特異性抗體，在較短時間內(nèi)獲得較高滴度的抗體。小鼠單克隆抗體技術(shù)成熟，相關(guān)的雜交瘤技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)等都非常完善，便于進(jìn)行后續(xù)的抗體篩選和制備工作。小鼠產(chǎn)生的抗體在人體內(nèi)可能會產(chǎn)生免疫反應(yīng)，即人抗鼠抗體（HAMA）反應(yīng)。這是因?yàn)樾∈罂贵w的氨基酸序列與人類抗體存在差異，人體免疫系統(tǒng)會將其識別為外來異物并產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而降低抗體在人體內(nèi)的有效性，甚至可能引發(fā)不良反應(yīng)。在一些需要將抗體應(yīng)用于人體的研究中，如疾病診斷和治療，小鼠抗體的這一缺點(diǎn)限制了其應(yīng)用。兔子也是一種常用的免疫動物，其優(yōu)點(diǎn)同樣顯著。兔子能夠產(chǎn)生較大量的抗體，一次免疫后可采集的血清量較多，一般可達(dá)20-30ml。這對于需要大量抗體的實(shí)驗(yàn)，如抗體的大規(guī)模生產(chǎn)、臨床診斷試劑的研發(fā)等，具有重要意義。兔子的抗體多樣性較高，其免疫系統(tǒng)能夠識別和產(chǎn)生針對多種抗原表位的抗體。在免疫人SORL1片段時，兔子可能產(chǎn)生更多不同類型的抗體，這增加了篩選到高特異性、高親和力抗體的機(jī)會。兔子產(chǎn)生的抗體在特異性和親和力方面往往表現(xiàn)出色，能夠更準(zhǔn)確地識別和結(jié)合人SORL1片段，為后續(xù)的研究提供更可靠的工具。然而，兔子的飼養(yǎng)成本相對較高，需要較大的飼養(yǎng)空間，且對飼料和環(huán)境的要求較為嚴(yán)格。兔子的免疫周期較長，一般需要多次免疫才能獲得較高滴度的抗體，這在一定程度上延長了實(shí)驗(yàn)周期。此外，兔子抗體的純化過程相對復(fù)雜，需要更多的步驟和技術(shù)，增加了實(shí)驗(yàn)的難度和成本。綜合考慮人SORL1片段抗體制備的需求和各種免疫動物的優(yōu)缺點(diǎn)，本研究選擇兔子作為免疫動物。一方面，人SORL1片段是一種較為復(fù)雜的蛋白質(zhì)，需要免疫動物能夠產(chǎn)生多樣性高、特異性強(qiáng)的抗體，兔子在這方面具有明顯優(yōu)勢。通過免疫兔子，有望獲得能夠準(zhǔn)確識別和結(jié)合人SORL1片段不同表位的抗體，為后續(xù)的研究提供更豐富的工具。另一方面，雖然兔子的飼養(yǎng)成本和免疫周期相對不利，但考慮到本研究對抗體質(zhì)量的要求較高，且實(shí)驗(yàn)規(guī)模和時間安排能夠接受兔子的這些特點(diǎn)。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，將通過合理的免疫程序和飼養(yǎng)管理，充分發(fā)揮兔子作為免疫動物的優(yōu)勢，制備高質(zhì)量的人SORL1片段抗體。4.2免疫方案設(shè)計(jì)4.2.1抗原準(zhǔn)備抗原準(zhǔn)備是抗體制備的關(guān)鍵起始步驟，其質(zhì)量直接影響后續(xù)抗體的產(chǎn)生和性能。本研究采用純化后的人SORL1重組蛋白作為抗原，為確保其免疫原性和穩(wěn)定性，需進(jìn)行精細(xì)處理。將純化后的人SORL1重組蛋白與佐劑進(jìn)行乳化，以增強(qiáng)抗原的免疫原性。佐劑的作用是通過多種機(jī)制提高機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答，如延長抗原在體內(nèi)的存在時間，促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞對抗原的攝取和加工，激活免疫細(xì)胞等。本實(shí)驗(yàn)選用弗氏佐劑，它是一種經(jīng)典的免疫佐劑，分為弗氏完全佐劑（CFA）和弗氏不完全佐劑（IFA）。首次免疫時使用弗氏完全佐劑，其含有滅活的結(jié)核分枝桿菌，能夠顯著增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫，誘導(dǎo)Th1細(xì)胞因子（如IL-2、INF-γ、TNF-α、TNF-β等）的產(chǎn)生，介導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。在后續(xù)的加強(qiáng)免疫中，使用弗氏不完全佐劑，其不含結(jié)核分枝桿菌，主要誘導(dǎo)Th2細(xì)胞因子（如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13）的產(chǎn)生，激活B淋巴細(xì)胞并介導(dǎo)基于抗體的體液免疫。乳化過程需嚴(yán)格操作，以確?？乖c佐劑充分混合，形成穩(wěn)定的乳劑。具體操作如下：取適量純化后的人SORL1重組蛋白，用無菌PBS緩沖液（pH7.4）稀釋至合適濃度，一般為1-2mg/ml。將稀釋后的蛋白溶液與等體積的弗氏佐劑加入到無菌的玻璃注射器中。使用雙通針頭將兩個注射器連接起來，反復(fù)推拉混合約10-15分鐘，使抗原與佐劑充分乳化。乳化過程中，可觀察到溶液逐漸變得粘稠，顏色變白。為驗(yàn)證乳化效果，將乳化后的溶液滴一滴在水面上，若溶液呈小油滴狀，不擴(kuò)散，表明乳化成功；若溶液迅速擴(kuò)散，則需繼續(xù)乳化。乳化完成后，將乳劑保存于4℃冰箱中，盡快用于免疫動物。4.2.2免疫程序免疫程序的設(shè)計(jì)對于獲得高質(zhì)量的抗體至關(guān)重要，它包括免疫次數(shù)、時間間隔、免疫劑量和免疫途徑等多個關(guān)鍵因素。本研究采用多次免疫的方法，以激發(fā)兔子產(chǎn)生強(qiáng)烈且持久的免疫應(yīng)答。首次免疫時，將乳化好的抗原（含弗氏完全佐劑）通過皮下多點(diǎn)注射的方式免疫兔子。皮下多點(diǎn)注射能夠使抗原在多個部位緩慢釋放，持續(xù)刺激免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫效果。免疫劑量為每只兔子100μg人SORL1重組蛋白，分8-10個點(diǎn)進(jìn)行注射，每個點(diǎn)注射約0.1-0.2ml乳劑。首次免疫后，間隔2周進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫時，使用含有弗氏不完全佐劑的乳化抗原，免疫劑量與首次免疫相同，免疫途徑仍為皮下多點(diǎn)注射。在第一次加強(qiáng)免疫后的第10天，采集兔子少量血液，分離血清，采用ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）方法檢測血清中抗體的效價(jià)。ELISA法是一種常用的檢測抗體效價(jià)的方法，其原理是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合，通過酶標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，加入底物后，酶催化底物顯色，通過檢測吸光度值來確定抗體的含量。若抗體效價(jià)未達(dá)到預(yù)期水平（一般要求達(dá)到1:10000以上），則在第一次加強(qiáng)免疫后的第3周進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫。第二次加強(qiáng)免疫的抗原、劑量和途徑與第一次加強(qiáng)免疫相同。第二次加強(qiáng)免疫后的第7天，再次采集血液檢測抗體效價(jià)。若效價(jià)仍不理想，可根據(jù)實(shí)際情況，適當(dāng)增加加強(qiáng)免疫的次數(shù)。在多次免疫過程中，要密切觀察兔子的健康狀況，包括精神狀態(tài)、飲食情況、注射部位有無紅腫、硬結(jié)等異?，F(xiàn)象。若兔子出現(xiàn)不良反應(yīng)，如發(fā)熱、食欲不振、注射部位感染等，應(yīng)及時采取相應(yīng)的治療措施，必要時暫停免疫。同時，每次免疫前，需將乳化好的抗原充分混勻，確保免疫劑量的準(zhǔn)確性。通過合理設(shè)計(jì)免疫程序，嚴(yán)格控制免疫過程中的各個環(huán)節(jié)，有望獲得高滴度、高特異性的人SORL1片段抗體。4.3細(xì)胞融合與篩選4.3.1骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞融合細(xì)胞融合是制備單克隆抗體的關(guān)鍵步驟，通過將免疫動物的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，獲得既能產(chǎn)生特異性抗體又能無限增殖的雜交瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的方法進(jìn)行細(xì)胞融合。PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合的原理基于其特殊的理化性質(zhì)。PEG是一種高分子聚合物，具有多個羥基，能夠與水分子形成氫鍵，從而改變細(xì)胞周圍的水分子分布。當(dāng)PEG存在時，它可以降低細(xì)胞表面的電荷密度，減少細(xì)胞間的靜電排斥力。同時，PEG能夠促使細(xì)胞膜發(fā)生結(jié)構(gòu)重排，使相鄰細(xì)胞的膜脂雙層相互親和。在這些作用下，相鄰細(xì)胞的質(zhì)膜在修復(fù)過程中相互合并，最終導(dǎo)致細(xì)胞之間發(fā)生融合。具體操作過程如下：在融合前3-4天，將處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行培養(yǎng)，使其生長狀態(tài)良好。選擇經(jīng)過多次免疫且抗體效價(jià)較高的兔子，心臟采血后，拉頸處死，用75%酒精浸泡5-10min，進(jìn)行消毒處理。在無菌條件下，打開兔子腹腔，取出脾臟，放入盛有預(yù)冷無菌PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，輕輕沖洗，去除表面的血液和雜質(zhì)。用無菌鑷子和剪刀將脾臟剪碎，然后通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)，將脾臟組織過濾到無菌離心管中，制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液4℃、800g離心10min，棄去上清液，用預(yù)冷無菌PBS緩沖液重懸細(xì)胞，再次離心洗滌2-3次，以去除殘留的紅細(xì)胞和雜質(zhì)。最后，用適量的預(yù)冷無菌PBS緩沖液重懸脾細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將培養(yǎng)好的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0從培養(yǎng)瓶中收集，同樣用預(yù)冷無菌PBS緩沖液洗滌2-3次，離心收集細(xì)胞后，用適量的預(yù)冷無菌PBS緩沖液重懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。按照脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞5:1-10:1的比例，將兩種細(xì)胞混合于50ml無菌離心管中，輕輕混勻。室溫下800g離心10min，棄去上清液，輕叩管底使沉淀松動。將離心管置于37℃水浴中預(yù)溫3-5min。緩慢逐滴加入1ml37℃預(yù)溫的50%PEG溶液，邊加邊輕搖混勻，使PEG均勻分布于細(xì)胞懸液中，加完后用吸管輕輕吹打混勻，37℃靜置1-2min。隨后，用20ml37℃預(yù)溫的無菌PBS緩沖液緩慢稀釋PEG，最初1ml在1min內(nèi)加完，之后可適當(dāng)加快速度，邊加邊輕輕搖勻。室溫下800g離心10min，棄去上清液。重復(fù)洗滌、離心一次，以去除殘留的PEG。最后，將沉淀用HAT選擇培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至5×10?個/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入0.2ml細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，為細(xì)胞融合和生長提供適宜的環(huán)境。4.3.2雜交瘤細(xì)胞篩選在細(xì)胞融合后，需要通過篩選獲得能夠分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。首先使用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行初步篩選，然后采用ELISA法進(jìn)一步篩選出分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。HAT培養(yǎng)基篩選的原理基于細(xì)胞DNA合成的兩條途徑。細(xì)胞DNA合成主要有從頭合成途徑和補(bǔ)救合成途徑。正常細(xì)胞可以利用這兩條途徑合成DNA，而骨髓瘤細(xì)胞由于缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），無法通過補(bǔ)救合成途徑合成DNA。在HAT培養(yǎng)基中，含有次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）。氨基蝶呤能夠阻斷細(xì)胞DNA合成的從頭合成途徑。因此，在HAT培養(yǎng)基中，只有融合后的雜交瘤細(xì)胞（既具有骨髓瘤細(xì)胞無限增殖的能力，又具有脾細(xì)胞HGPRT，可利用補(bǔ)救合成途徑合成DNA）能夠存活，而未融合的骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞以及骨髓瘤細(xì)胞自身融合細(xì)胞因無法合成DNA而死亡。將接種有融合細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-7天，期間根據(jù)細(xì)胞生長情況更換HAT培養(yǎng)液。培養(yǎng)過程中，密切觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合孔中出現(xiàn)明顯的細(xì)胞集落時，表明可能存在雜交瘤細(xì)胞。在HAT培養(yǎng)基初步篩選出雜交瘤細(xì)胞后，采用ELISA法進(jìn)一步篩選分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。ELISA法的原理是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合，通過酶標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，加入底物后，酶催化底物顯色，通過檢測吸光度值來確定抗體的含量。具體操作如下：用包被緩沖液將純化后的人SORL1重組蛋白稀釋至1-2μg/ml，加入96孔酶標(biāo)板中，每孔100μl，4℃包被過夜。次日，棄去包被液，用PBST緩沖液（含0.05%Tween-20的PBS緩沖液）洗滌酶標(biāo)板3次，每次洗滌3-5min，以去除未結(jié)合的抗原。加入5%脫脂奶粉的封閉液，每孔200μl，37℃封閉1-2h，封閉酶標(biāo)板上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，用PBST緩沖液洗滌3次。將HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入酶標(biāo)板中，每孔100μl，同時設(shè)置陰性對照（未免疫動物的血清或培養(yǎng)基）和陽性對照（已知的抗人SORL1抗體），37℃孵育1-2h，使抗體與抗原特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，用PBST緩沖液洗滌3次。加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，按照1:5000的比例用5%脫脂奶粉稀釋，每孔100μl，37℃孵育1-2h。再次用PBST緩沖液洗滌3次。加入TMB底物顯色液，每孔100μl，室溫避光顯色10-15min。當(dāng)陽性對照孔出現(xiàn)明顯的藍(lán)色時，加入2MH?SO?終止液，每孔50μl，終止反應(yīng)。此時，溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定各孔的吸光度值（OD值）。若雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液孔的OD值大于陰性對照孔OD值的2.1倍，且與陽性對照孔OD值相近，則該孔中的雜交瘤細(xì)胞可能為分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。對篩選出的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行多次克隆化培養(yǎng)，以獲得穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。四、人SORL1片段抗體制備4.4抗體純化與鑒定4.4.1抗體純化方法抗體純化是獲得高質(zhì)量抗體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本研究采用飽和硫酸銨鹽析結(jié)合ProteinA親和層析的方法對抗體進(jìn)行純化。飽和硫酸銨鹽析是基于蛋白質(zhì)在不同鹽濃度下溶解度的差異進(jìn)行分離的方法。其原理是在高濃度的鹽溶液中，鹽離子與蛋白質(zhì)分子競爭水分子，破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低蛋白質(zhì)的溶解度，使其從溶液中沉淀出來。不同蛋白質(zhì)的