Wnt拮抗因子SFRP1甲基化與異常表達(dá)在膀胱癌發(fā)病機(jī)制中的作用探究一、引言1.1研究背景與意義膀胱癌作為泌尿系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年新增膀胱癌病例數(shù)眾多，且死亡率也不容小覷。在中國(guó)，膀胱癌的發(fā)病率同樣呈上升態(tài)勢(shì)，成為泌尿系統(tǒng)腫瘤中的重要疾病負(fù)擔(dān)。膀胱癌的危害是多方面的。在疾病早期，患者可能出現(xiàn)血尿、尿頻、尿急、尿痛等癥狀，這些癥狀不僅嚴(yán)重影響患者的日常生活質(zhì)量，還會(huì)給患者帶來(lái)極大的心理負(fù)擔(dān)。隨著病情的進(jìn)展，若腫瘤位于輸尿管口附近，會(huì)引起輸尿管口梗阻；若位于膀胱頸部，則會(huì)阻塞尿道內(nèi)口，從而導(dǎo)致排尿困難，甚至誘發(fā)尿潴留、腎積水等嚴(yán)重并發(fā)癥。到了晚期，腫瘤的大量消耗、繼發(fā)感染以及腫瘤壓迫等因素，會(huì)引發(fā)一系列全身癥狀，如嚴(yán)重貧血、發(fā)燒、疼痛、消瘦、腎衰、精神衰頹等，最終導(dǎo)致患者出現(xiàn)全身功能衰竭的惡病質(zhì)狀況。此外，膀胱癌還具有較高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，癌細(xì)胞可穿透膀胱壁向周?chē)徑M織生長(zhǎng)，如侵犯直腸、前列腺、陰道或者子宮等器官，也可通過(guò)血行或淋巴系統(tǒng)向遠(yuǎn)處器官，如肺、腦、肝、骨等轉(zhuǎn)移，造成多器官受損，嚴(yán)重危及患者的生命。目前，臨床上對(duì)于膀胱癌的診斷主要依賴(lài)于尿液檢測(cè)、膀胱鏡檢查和影像學(xué)檢查等手段。尿液檢測(cè)中的尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查雖然具有無(wú)創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn)，但其敏感性較差，尤其是對(duì)于低級(jí)別膀胱癌的檢測(cè)準(zhǔn)確率較低，容易出現(xiàn)漏診的情況。膀胱鏡檢查是診斷膀胱癌的重要方法之一，能夠直接觀察膀胱黏膜的病變情況，并可取組織進(jìn)行病理活檢，確診率較高。然而，膀胱鏡檢查屬于侵入性操作，會(huì)給患者帶來(lái)較大的痛苦，且存在一定的感染風(fēng)險(xiǎn)，部分患者難以接受。影像學(xué)檢查如超聲、CT、MRI等，在膀胱癌的診斷中也發(fā)揮著重要作用，可用于觀察腫瘤的大小、位置、形態(tài)及浸潤(rùn)深度等。但這些檢查方法也存在局限性，例如超聲對(duì)于早期較小的病變或位于特殊部位的病變可能難以發(fā)現(xiàn)；CT和MRI檢查雖然準(zhǔn)確性較高，但費(fèi)用相對(duì)昂貴，且存在一定的輻射風(fēng)險(xiǎn)。由于現(xiàn)有診斷方法存在諸多不足，尋找一種早期、準(zhǔn)確、無(wú)創(chuàng)且經(jīng)濟(jì)的診斷方法對(duì)于膀胱癌的防治具有至關(guān)重要的意義。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾，在腫瘤研究領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將甲基基團(tuán)共價(jià)結(jié)合到DNA堿基上，從而改變基因組DNA序列的功能和表達(dá)。在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，許多腫瘤抑制基因和DNA修復(fù)基因的表達(dá)常常通過(guò)甲基化等機(jī)制被沉默或失活，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程發(fā)生異常。Wnt信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該通路的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括膀胱癌。分泌型卷曲相關(guān)蛋白1（SFRP1）作為Wnt信號(hào)通路的重要拮抗因子，能夠通過(guò)與Wnt蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合卷曲蛋白受體，從而抑制Wnt信號(hào)通路的激活。研究表明，SFRP1在多種腫瘤中存在甲基化異常和表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路過(guò)度激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在膀胱癌中，探討SFRP1的甲基化和異常表達(dá)具有重要的意義。一方面，深入研究SFRP1的甲基化狀態(tài)及其對(duì)基因表達(dá)的影響，有助于揭示膀胱癌的發(fā)病機(jī)制，為膀胱癌的早期診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和思路。另一方面，通過(guò)檢測(cè)SFRP1的甲基化水平，有望開(kāi)發(fā)出一種無(wú)創(chuàng)、準(zhǔn)確的膀胱癌診斷方法，提高膀胱癌的早期診斷率，改善患者的預(yù)后。此外，針對(duì)SFRP1甲基化和Wnt信號(hào)通路異常激活的靶向治療策略，可能為膀胱癌的治療帶來(lái)新的突破，為患者提供更加有效的治療手段。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，SFRP1與膀胱癌的研究開(kāi)展較早。有研究運(yùn)用先進(jìn)的基因芯片技術(shù)，對(duì)大量膀胱癌組織樣本進(jìn)行分析，結(jié)果顯示SFRP1基因啟動(dòng)子區(qū)域存在高甲基化現(xiàn)象，且其甲基化水平與膀胱癌的分期和分級(jí)緊密相關(guān)。在對(duì)不同病理分級(jí)的膀胱癌患者進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤分級(jí)的升高，SFRP1甲基化程度也顯著增加，這表明SFRP1甲基化狀態(tài)可能在膀胱癌的惡性進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，有望成為評(píng)估膀胱癌惡性程度的重要指標(biāo)。還有研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，將外源性的SFRP1基因?qū)敫呒谆业捅磉_(dá)SFRP1的膀胱癌細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，遷移和侵襲能力也顯著降低，同時(shí)Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)生明顯改變，進(jìn)一步證實(shí)了SFRP1通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路來(lái)影響膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究也取得了重要成果。通過(guò)對(duì)膀胱癌患者和健康人群的尿液及組織樣本進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者尿沉淀細(xì)胞中SFRP1的甲基化水平明顯高于健康對(duì)照組，且這種甲基化差異在早期膀胱癌患者中就已存在，提示檢測(cè)尿沉淀細(xì)胞中SFRP1的甲基化狀態(tài)有可能作為一種早期無(wú)創(chuàng)的膀胱癌診斷方法。此外，國(guó)內(nèi)學(xué)者還從分子機(jī)制層面深入研究了SFRP1甲基化與膀胱癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SFRP1甲基化導(dǎo)致其表達(dá)沉默后，會(huì)引起一系列下游基因的表達(dá)改變，這些基因參與細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、血管生成等多個(gè)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的過(guò)程，為深入理解膀胱癌的發(fā)病機(jī)制提供了有力的理論支持。盡管?chē)?guó)內(nèi)外在SFRP1在膀胱癌中的甲基化和異常表達(dá)研究方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些不足之處?，F(xiàn)有研究對(duì)于SFRP1甲基化在膀胱癌不同亞型中的差異研究相對(duì)較少，膀胱癌具有多種組織學(xué)亞型，不同亞型的生物學(xué)行為和預(yù)后存在顯著差異，深入探究SFRP1甲基化在各亞型中的特點(diǎn)，對(duì)于實(shí)現(xiàn)膀胱癌的精準(zhǔn)診斷和治療具有重要意義。目前對(duì)于SFRP1甲基化與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系研究結(jié)果尚不完全一致，部分研究認(rèn)為SFRP1甲基化與不良預(yù)后相關(guān)，但也有研究未發(fā)現(xiàn)明確的相關(guān)性，這可能與研究樣本量、研究方法以及患者人群的差異等多種因素有關(guān)，需要進(jìn)一步開(kāi)展大樣本、多中心的研究來(lái)明確。在針對(duì)SFRP1甲基化的治療策略研究方面，雖然已經(jīng)有一些初步的探索，如利用去甲基化藥物恢復(fù)SFRP1的表達(dá)，但這些治療方法在臨床應(yīng)用中仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如藥物的毒副作用、耐藥性等問(wèn)題，需要進(jìn)一步研發(fā)更加安全有效的靶向治療手段。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究Wnt拮抗因子SFRP1在膀胱癌中的甲基化狀態(tài)及其異常表達(dá)的機(jī)制，具體目的如下：精確檢測(cè)SFRP1基因在膀胱癌組織及細(xì)胞系中的甲基化水平，明確其甲基化模式與膀胱癌臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)，如腫瘤分期、分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等，為膀胱癌的早期診斷和病情評(píng)估提供潛在的生物標(biāo)志物。系統(tǒng)分析SFRP1基因甲基化對(duì)其表達(dá)的調(diào)控作用，從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平研究甲基化如何影響SFRP1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，揭示甲基化介導(dǎo)的SFRP1表達(dá)異常在膀胱癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)制。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，深入探討SFRP1異常表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，包括細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等過(guò)程，明確SFRP1在膀胱癌發(fā)病機(jī)制中的具體作用，為膀胱癌的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。為實(shí)現(xiàn)上述研究目的，本研究擬采用以下研究方法：收集膀胱癌患者的癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本，同時(shí)獲取膀胱癌細(xì)胞系，如T24、5637、SCaBER等，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。運(yùn)用甲基化特異性PCR（MSP）技術(shù)，檢測(cè)SFRP1基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，明確其在膀胱癌組織和細(xì)胞系中的甲基化情況。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）技術(shù)，分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)SFRP1在膀胱癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與甲基化狀態(tài)之間的相關(guān)性。對(duì)膀胱癌患者的臨床病理資料進(jìn)行詳細(xì)收集和整理，包括年齡、性別、腫瘤分期、分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析SFRP1甲基化和表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)，明確其在膀胱癌診斷和預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。利用去甲基化試劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza-dC）處理甲基化的膀胱癌細(xì)胞系，觀察SFRP1表達(dá)的恢復(fù)情況以及對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，包括細(xì)胞增殖能力、遷移能力、侵襲能力和凋亡率的變化等，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)等方法進(jìn)行檢測(cè)。構(gòu)建膀胱癌動(dòng)物模型，如裸鼠皮下移植瘤模型，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證SFRP1在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用，觀察過(guò)表達(dá)或敲低SFRP1對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響，為膀胱癌的治療提供體內(nèi)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1膀胱癌概述2.1.1膀胱癌的發(fā)病情況膀胱癌在全球范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，膀胱癌新發(fā)病例約57.3萬(wàn)例，占全部惡性腫瘤新發(fā)病例的3.2%，位居全球惡性腫瘤發(fā)病譜的第10位；死亡病例約21.3萬(wàn)例，占全部惡性腫瘤死亡病例的2.2%，位居全球惡性腫瘤死亡譜的第13位。在不同地區(qū)，膀胱癌的發(fā)病率和死亡率存在顯著差異。北美和歐洲地區(qū)的發(fā)病率相對(duì)較高，如美國(guó)2020年膀胱癌的發(fā)病率約為18.9/10萬(wàn)，歐洲部分國(guó)家的發(fā)病率也在10/10萬(wàn)以上。而亞洲地區(qū)的發(fā)病率相對(duì)較低，中國(guó)2020年膀胱癌的發(fā)病率約為5.8/10萬(wàn)。這種地區(qū)差異可能與環(huán)境因素、生活方式、遺傳背景以及醫(yī)療水平等多種因素有關(guān)。從性別分布來(lái)看，膀胱癌的發(fā)病率存在明顯的性別差異，男性的發(fā)病率顯著高于女性。全球范圍內(nèi)，男性膀胱癌的發(fā)病率約為女性的3-4倍。在中國(guó)，2020年男性膀胱癌發(fā)病率為8.7/10萬(wàn)，女性為2.2/10萬(wàn)，男性發(fā)病率約為女性的3.95倍。這可能與男性接觸致癌物質(zhì)的機(jī)會(huì)較多、吸煙率較高以及雄激素水平等因素有關(guān)。在年齡分布方面，膀胱癌的發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而逐漸升高，發(fā)病高峰主要集中在65歲以上的老年人群。在中國(guó)，膀胱癌的年齡別發(fā)病率在45歲以后開(kāi)始快速上升，在80-84歲組達(dá)到高峰。這是由于隨著年齡的增長(zhǎng)，人體的免疫系統(tǒng)功能逐漸下降，細(xì)胞修復(fù)和DNA損傷修復(fù)能力減弱，使得癌細(xì)胞更容易發(fā)生和發(fā)展。近年來(lái)，隨著環(huán)境變化、人口老齡化以及生活方式的改變，全球膀胱癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。在一些發(fā)達(dá)國(guó)家，由于早期篩查和診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步，以及對(duì)致癌因素的有效控制，膀胱癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)。例如，美國(guó)在過(guò)去幾十年中，通過(guò)加強(qiáng)煙草控制、改善職業(yè)防護(hù)等措施，膀胱癌的發(fā)病率和死亡率有所降低。然而，在一些發(fā)展中國(guó)家，由于經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平較低，醫(yī)療衛(wèi)生條件相對(duì)落后，人們對(duì)膀胱癌的認(rèn)識(shí)不足，早期篩查和診斷率較低，同時(shí)環(huán)境和職業(yè)暴露等致癌因素未能得到有效控制，導(dǎo)致膀胱癌的發(fā)病率和死亡率仍處于上升趨勢(shì)。在中國(guó)，雖然整體上膀胱癌的發(fā)病率和死亡率呈下降趨勢(shì)，但部分地區(qū)由于工業(yè)化進(jìn)程加快，環(huán)境污染加劇，以及人口老齡化的加速，膀胱癌的發(fā)病負(fù)擔(dān)依然較重。因此，加強(qiáng)膀胱癌的防治工作，提高早期診斷和治療水平，對(duì)于降低膀胱癌的發(fā)病率和死亡率具有重要意義。2.1.2膀胱癌的發(fā)病因素膀胱癌的發(fā)病是一個(gè)復(fù)雜的多因素過(guò)程，涉及內(nèi)在遺傳因素和外在環(huán)境因素的相互作用。內(nèi)在遺傳因素在膀胱癌的發(fā)病中起著重要的作用。研究表明，某些基因突變和遺傳變異與膀胱癌的易感性密切相關(guān)。例如，染色體9p21區(qū)域的CDKN2A基因缺失或突變，可導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控異常，增加膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。此外，家族遺傳也是膀胱癌發(fā)病的一個(gè)重要因素。如果家族中有膀胱癌患者，個(gè)體患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)顯著增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有家族史的人群患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)比無(wú)家族史的人群高出2-3倍。這可能是由于家族成員共享某些遺傳突變或易感基因，使得他們更容易受到致癌因素的影響。外在環(huán)境因素在膀胱癌的發(fā)病中也占據(jù)著關(guān)鍵地位。吸煙是目前最為明確的膀胱癌致病危險(xiǎn)因素之一。大量研究表明，吸煙者患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)是不吸煙者的2-4倍。香煙中含有多種致癌物質(zhì)，如尼古丁、苯并芘、亞硝胺等，這些物質(zhì)在體內(nèi)代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生具有致癌活性的中間產(chǎn)物，它們可以直接損傷膀胱黏膜上皮細(xì)胞的DNA，導(dǎo)致基因突變和細(xì)胞癌變。此外，吸煙時(shí)間越長(zhǎng)、吸煙量越大，患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)就越高。長(zhǎng)期接觸某些工業(yè)化學(xué)產(chǎn)品也是膀胱癌的重要發(fā)病因素。從事染料、皮革、橡膠、塑料等行業(yè)的工人，由于工作環(huán)境中存在大量的芳香胺類(lèi)化合物，如2-萘胺、聯(lián)苯胺等，這些物質(zhì)具有較強(qiáng)的致癌性，可通過(guò)呼吸道、皮膚或消化道進(jìn)入人體，在體內(nèi)經(jīng)過(guò)代謝活化后，與膀胱黏膜上皮細(xì)胞的DNA結(jié)合，形成加合物，導(dǎo)致DNA損傷和基因突變，從而引發(fā)膀胱癌。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期接觸芳香胺類(lèi)化合物的人群，患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)比普通人群高出5-10倍。膀胱內(nèi)長(zhǎng)期慢性炎癥和結(jié)石也是膀胱癌的潛在發(fā)病因素。慢性膀胱炎、膀胱結(jié)石等疾病會(huì)導(dǎo)致膀胱黏膜長(zhǎng)期受到炎癥刺激和機(jī)械性損傷，使膀胱黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生異常增生和化生，增加了細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)。此外，慢性炎癥還會(huì)導(dǎo)致局部免疫功能紊亂，抑制機(jī)體對(duì)癌細(xì)胞的免疫監(jiān)視和清除作用，進(jìn)一步促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。例如，埃及血吸蟲(chóng)感染引起的慢性膀胱炎，與膀胱癌的發(fā)生密切相關(guān)，尤其是鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。2.1.3膀胱癌的發(fā)病機(jī)制膀胱癌的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路的異常改變。其中，DNA突變和甲基化在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。在膀胱癌中，許多癌基因和抑癌基因發(fā)生突變，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程失去平衡，從而引發(fā)腫瘤的發(fā)生。例如，RAS基因家族的突變可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常激活，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。p53基因是一種重要的抑癌基因，其突變或功能失活在膀胱癌中較為常見(jiàn)，可導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控異常，使受損細(xì)胞無(wú)法正常凋亡，進(jìn)而積累形成腫瘤。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾，在膀胱癌的發(fā)病機(jī)制中也發(fā)揮著重要作用。正常情況下，DNA甲基化主要發(fā)生在CpG島區(qū)域，通過(guò)抑制基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)。在膀胱癌中，許多抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生高甲基化，導(dǎo)致這些基因的表達(dá)沉默，從而失去對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。例如，p16基因是一種細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑，其啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化在膀胱癌中頻繁發(fā)生，導(dǎo)致p16基因表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞周期失控，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。此外，一些DNA修復(fù)基因如MGMT、MLH1等的甲基化也會(huì)導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)能力下降，增加基因突變的積累，進(jìn)一步促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。Wnt信號(hào)通路在膀胱癌的發(fā)病中也扮演著重要角色。Wnt信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)通路，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在正常情況下，Wnt信號(hào)通路受到嚴(yán)格的調(diào)控，以維持細(xì)胞的正常生理功能。然而，在膀胱癌中，Wnt信號(hào)通路常常異常激活，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。研究表明，SFRP1作為Wnt信號(hào)通路的重要拮抗因子，其甲基化導(dǎo)致表達(dá)下調(diào)，使得Wnt信號(hào)通路失去抑制，過(guò)度激活，從而促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。當(dāng)SFRP1基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生高甲基化時(shí)，SFRP1的表達(dá)受到抑制，無(wú)法有效拮抗Wnt信號(hào)通路，導(dǎo)致β-catenin的積累和下游靶基因的異常表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。2.2Wnt信號(hào)通路與SFRP12.2.1Wnt信號(hào)通路介紹Wnt信號(hào)通路是一個(gè)在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的復(fù)雜蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及組織穩(wěn)態(tài)維持等多種生理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該通路的異常激活或抑制與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是腫瘤。Wnt信號(hào)通路的組成十分復(fù)雜，主要包括Wnt配體、受體、共受體以及一系列胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。Wnt配體是一類(lèi)分泌型糖蛋白，在人類(lèi)基因組中已發(fā)現(xiàn)19種不同的Wnt基因，它們編碼的Wnt蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上具有一定的相似性，但也存在差異。Wnt蛋白通過(guò)自分泌或旁分泌的方式分泌到細(xì)胞外，與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，從而啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)。Wnt信號(hào)通路的受體主要是Frizzled（Fzd）家族蛋白，這是一類(lèi)具有7次跨膜結(jié)構(gòu)的受體，其胞外N端含有一個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（CRD），能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合Wnt配體。此外，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）作為共受體，與Fzd受體共同參與Wnt信號(hào)的識(shí)別和傳遞。當(dāng)Wnt配體與Fzd受體和LRP5/6共受體結(jié)合形成復(fù)合物后，會(huì)引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。根據(jù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和下游效應(yīng)的不同，Wnt信號(hào)通路主要分為經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路和非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化和腫瘤發(fā)生中起著核心作用。在沒(méi)有Wnt信號(hào)刺激時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin與由Axin、腺瘤性息肉病蛋白（APC）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）和酪蛋白激酶1α（CK1α）等組成的破壞復(fù)合物結(jié)合。在該復(fù)合物中，CK1α首先將β-catenin的Ser45位點(diǎn)磷酸化，隨后GSK-3β依次將β-catenin的Thr41、Ser37、Ser33位點(diǎn)磷酸化。磷酸化的β-catenin被E3泛素連接酶β-TrCP識(shí)別并泛素化修飾，進(jìn)而被26S蛋白酶體降解，使得細(xì)胞質(zhì)中β-catenin的水平維持在較低狀態(tài)。此時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF與共抑制因子Groucho結(jié)合，抑制Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)Wnt信號(hào)激活時(shí)，Wnt配體與Fzd受體和LRP5/6共受體結(jié)合，促使Dishevelled（Dvl）蛋白募集到細(xì)胞膜上。Dvl蛋白通過(guò)抑制GSK-3β的活性，破壞β-catenin降解復(fù)合物的功能。同時(shí)，LRP5/6被磷酸化，招募Axin到細(xì)胞膜上，進(jìn)一步導(dǎo)致β-catenin降解復(fù)合物的解體。β-catenin不再被磷酸化和降解，從而在細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定積累，并逐漸進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，取代共抑制因子Groucho，招募組蛋白修飾共激活物如CBP/p300、BRG1、BCL9和Pygo等，形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，啟動(dòng)下游靶基因如c-myc、CyclinD1、MMP-7等的轉(zhuǎn)錄，這些靶基因參與細(xì)胞增殖、存活、遷移和侵襲等生物學(xué)過(guò)程。非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路主要包括平面細(xì)胞極性通路（PCP通路）和Wnt/Ca2?通路。PCP通路主要參與調(diào)控細(xì)胞骨架的重排和細(xì)胞極性的建立，在胚胎發(fā)育過(guò)程中對(duì)組織器官的形態(tài)發(fā)生起著重要作用。在PCP通路中，Wnt配體（如Wnt5a、Wnt11）與Fzd受體或其共受體（如ROR-Frizzled）結(jié)合，激活Dvl蛋白。Dvl通過(guò)Daam1介導(dǎo)Rho的激活，Rho進(jìn)一步激活Rho激酶（ROCK）；同時(shí)，Dvl還介導(dǎo)Rac的激活，進(jìn)而激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）。這些信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重排和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的發(fā)生，如激活轉(zhuǎn)錄因子ATF2，調(diào)節(jié)細(xì)胞的極性和遷移。Wnt/Ca2?通路則主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響細(xì)胞的黏附、遷移和分化等過(guò)程。在該通路中，Wnt配體與Fzd受體結(jié)合后，通過(guò)G蛋白激活Dvl蛋白。Dvl激活磷酸二酯酶（PDE），抑制蛋白激酶G（PKG），從而使細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高。此外，Dvl還通過(guò)激活磷脂酶C（PLC），產(chǎn)生三磷酸肌醇（IP3），IP3觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的鈣離子釋放，進(jìn)一步增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。升高的鈣離子可以激活蛋白激酶C（PKC）、鈣調(diào)蛋白依賴(lài)性激酶II（CamKII）或鈣依賴(lài)性磷酸酶鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（Calcineurin,CaN）等第二信使。CamKII激活的TAK1-NLK可通過(guò)TCF拮抗Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)；而活化的Calcineurin可以使活化的T細(xì)胞核因子（NFAT）去磷酸化，促進(jìn)NFAT進(jìn)入細(xì)胞核，激活其靶基因；PKC成員還可以激活小GTPaseCdc42，后者又可以進(jìn)入PCP途徑，參與細(xì)胞極性和遷移的調(diào)節(jié)。2.2.2SFRP1的結(jié)構(gòu)與功能分泌型卷曲相關(guān)蛋白1（SFRP1）是SFRP家族的重要成員之一，在調(diào)控Wnt信號(hào)通路中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。SFRP1的結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特的特點(diǎn)，其N(xiāo)端含有一個(gè)與Wnt蛋白結(jié)合的富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域（CRD），該結(jié)構(gòu)域與Frizzled受體的CRD具有高度同源性。CRD結(jié)構(gòu)域由約100個(gè)氨基酸組成，包含多個(gè)保守的半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸殘基通過(guò)形成二硫鍵來(lái)維持CRD結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定構(gòu)象，使其能夠特異性地識(shí)別和結(jié)合Wnt蛋白。除了CRD結(jié)構(gòu)域，SFRP1的C端還含有一個(gè)未知功能的結(jié)構(gòu)域，雖然其具體功能尚未完全明確，但研究推測(cè)該結(jié)構(gòu)域可能參與SFRP1與其他蛋白質(zhì)的相互作用，或者對(duì)SFRP1的整體結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性起到一定的調(diào)節(jié)作用。SFRP1作為Wnt信號(hào)通路的重要拮抗劑，其主要功能是通過(guò)抑制Wnt信號(hào)的傳導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。SFRP1可以與Wnt蛋白競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合Frizzled受體，由于SFRP1的CRD結(jié)構(gòu)域與Frizzled受體的CRD結(jié)構(gòu)域相似，能夠與Wnt蛋白特異性結(jié)合，從而阻止Wnt蛋白與Frizzled受體的結(jié)合，抑制Wnt信號(hào)通路的激活。當(dāng)SFRP1與Wnt蛋白結(jié)合形成復(fù)合物后，該復(fù)合物無(wú)法與Frizzled受體和LRP5/6共受體結(jié)合，使得下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子無(wú)法被激活，從而阻斷了經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路和非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路。在經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路中，由于Wnt信號(hào)被抑制，β-catenin降解復(fù)合物能夠正常發(fā)揮作用，β-catenin被磷酸化并降解，無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等過(guò)程。在非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中，如PCP通路和Wnt/Ca2?通路，SFRP1抑制Wnt信號(hào)的結(jié)合也會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)無(wú)法啟動(dòng)，從而影響細(xì)胞骨架的重排、細(xì)胞極性的建立以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程。此外，SFRP1還可能通過(guò)其他機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路。有研究表明，SFRP1可以與細(xì)胞外基質(zhì)中的一些成分相互作用，改變細(xì)胞外環(huán)境，間接影響Wnt信號(hào)的傳導(dǎo)。SFRP1可能與某些細(xì)胞表面的受體或分子形成復(fù)合物，通過(guò)這些復(fù)合物來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)一步影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。這些潛在的調(diào)節(jié)機(jī)制為深入理解SFRP1在Wnt信號(hào)通路中的作用提供了新的方向，但仍需要更多的研究來(lái)證實(shí)和完善。2.2.3SFRP1與Wnt信號(hào)通路的關(guān)系SFRP1與Wnt信號(hào)通路之間存在著緊密而復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，這種關(guān)系在細(xì)胞的正常生理過(guò)程以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都起著至關(guān)重要的作用。從分子生物學(xué)原理的角度來(lái)看，SFRP1作為Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵拮抗因子，主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合機(jī)制來(lái)抑制Wnt信號(hào)的傳導(dǎo)。如前文所述，SFRP1的N端富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域（CRD）與Wnt蛋白具有高度的親和力，能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合Wnt蛋白。當(dāng)SFRP1存在時(shí)，它會(huì)與Wnt蛋白競(jìng)爭(zhēng)有限的Frizzled受體結(jié)合位點(diǎn)。由于SFRP1與Wnt蛋白對(duì)Frizzled受體的結(jié)合具有相互排斥性，一旦SFRP1與Wnt蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，就會(huì)阻礙Wnt蛋白與Frizzled受體和LRP5/6共受體的結(jié)合，從而無(wú)法激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，有效地抑制了Wnt信號(hào)通路的激活。這種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合機(jī)制是SFRP1調(diào)控Wnt信號(hào)通路的主要方式之一，在維持細(xì)胞內(nèi)Wnt信號(hào)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在細(xì)胞的正常生理狀態(tài)下，SFRP1與Wnt信號(hào)通路之間保持著動(dòng)態(tài)平衡。Wnt信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和組織修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，而SFRP1則作為一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，適時(shí)地抑制Wnt信號(hào)的過(guò)度激活，確保細(xì)胞的生物學(xué)行為在正常范圍內(nèi)進(jìn)行。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，Wnt信號(hào)通路在不同階段和組織中精確地激活，調(diào)控細(xì)胞的分化和組織器官的形成。SFRP1在某些特定區(qū)域和時(shí)期表達(dá)，通過(guò)抑制Wnt信號(hào)的強(qiáng)度和范圍，使細(xì)胞的分化和發(fā)育過(guò)程有序進(jìn)行，避免因Wnt信號(hào)過(guò)度激活而導(dǎo)致的發(fā)育異常。在成年個(gè)體中，Wnt信號(hào)通路參與維持組織的穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞的正常功能。SFRP1持續(xù)發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)的活性，保證細(xì)胞的增殖和凋亡處于平衡狀態(tài)，防止細(xì)胞過(guò)度增殖或異常分化。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，SFRP1與Wnt信號(hào)通路之間的平衡常常被打破。許多研究表明，在包括膀胱癌在內(nèi)的多種腫瘤中，SFRP1基因常常發(fā)生甲基化異常，導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)或沉默。SFRP1表達(dá)的降低使得其對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制作用減弱或喪失，從而導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路的異常激活。在膀胱癌中，SFRP1基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化會(huì)抑制基因的轉(zhuǎn)錄，使SFRP1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著降低。由于SFRP1無(wú)法有效地拮抗Wnt信號(hào)，Wnt蛋白能夠自由地與Frizzled受體和LRP5/6共受體結(jié)合，激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路和非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路。在經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路中，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中大量積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動(dòng)一系列與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的靶基因的轉(zhuǎn)錄，如促進(jìn)細(xì)胞增殖的c-myc基因、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的CyclinD1基因以及參與細(xì)胞遷移和侵襲的MMP-7基因等。這些靶基因的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)、細(xì)胞周期失控、凋亡受阻，同時(shí)促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲，從而加速膀胱癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。在非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中，Wnt信號(hào)的異常激活也會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排和細(xì)胞極性的改變，進(jìn)一步增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。綜上所述，SFRP1與Wnt信號(hào)通路之間存在著密切的相互關(guān)系，SFRP1通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合機(jī)制抑制Wnt信號(hào)通路的激活，在細(xì)胞正常生理狀態(tài)下維持Wnt信號(hào)的穩(wěn)態(tài)。而在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，SFRP1的甲基化異常導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)，使Wnt信號(hào)通路失去抑制，過(guò)度激活，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。深入研究SFRP1與Wnt信號(hào)通路之間的關(guān)系，對(duì)于揭示膀胱癌等腫瘤的發(fā)病機(jī)制以及尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要的意義。三、SFRP1在膀胱癌中的甲基化研究3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.1.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備在本次實(shí)驗(yàn)中，精心挑選了具有代表性的膀胱癌細(xì)胞株，其中包括T24、5637以及SCaBER細(xì)胞株。這些細(xì)胞株在膀胱癌研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，它們各自具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，能夠從不同角度反映膀胱癌的發(fā)病機(jī)制和細(xì)胞行為特點(diǎn)。T24細(xì)胞株具有較強(qiáng)的增殖能力和侵襲性，常被用于研究膀胱癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為；5637細(xì)胞株在基因表達(dá)和信號(hào)通路方面具有一定的特殊性，對(duì)于探究膀胱癌相關(guān)基因的功能和調(diào)控機(jī)制具有重要意義；SCaBER細(xì)胞株則在細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)特性上有其獨(dú)特之處，有助于深入了解膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)特性差異。臨床組織樣本的收集是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。本實(shí)驗(yàn)收集了來(lái)自[具體醫(yī)院名稱(chēng)]的[X]例膀胱癌患者的癌組織及配對(duì)的癌旁正常組織標(biāo)本。在收集過(guò)程中，嚴(yán)格遵循倫理原則，確?；颊叩闹橥?，并詳細(xì)記錄患者的臨床病理信息，包括年齡、性別、腫瘤分期、分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。這些臨床病理信息對(duì)于后續(xù)分析SFRP1甲基化與膀胱癌臨床特征之間的關(guān)系至關(guān)重要。癌組織標(biāo)本直接取自手術(shù)切除的腫瘤組織，確保腫瘤細(xì)胞的完整性和代表性；癌旁正常組織標(biāo)本則取自距離腫瘤邊緣至少[X]cm的正常膀胱組織，經(jīng)病理檢查確認(rèn)無(wú)癌細(xì)胞浸潤(rùn)。實(shí)驗(yàn)試劑的選擇和準(zhǔn)備也十分關(guān)鍵。甲基化修飾相關(guān)試劑選用了亞硫酸氫鹽修飾試劑盒，該試劑盒能夠高效地將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則保持不變，為后續(xù)的甲基化檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。PCR反應(yīng)相關(guān)試劑包括高保真Taq酶、dNTPs、PCR緩沖液等，這些試劑均為知名品牌產(chǎn)品，具有高活性和穩(wěn)定性，能夠保證PCR反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增效率。引物合成由專(zhuān)業(yè)的生物技術(shù)公司完成，針對(duì)SFRP1基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化和非甲基化序列，設(shè)計(jì)了特異性引物，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的序列比對(duì)和驗(yàn)證，確保引物的特異性和擴(kuò)增效果。實(shí)驗(yàn)儀器的精確性和穩(wěn)定性對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性至關(guān)重要。PCR擴(kuò)增儀選用了具有高精度溫度控制和穩(wěn)定性能的儀器，能夠確保PCR反應(yīng)在預(yù)設(shè)的溫度條件下準(zhǔn)確進(jìn)行，減少實(shí)驗(yàn)誤差。電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)用于PCR產(chǎn)物的分離和檢測(cè)，能夠清晰地顯示甲基化和非甲基化條帶，便于結(jié)果分析。此外，還配備了高速離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、紫外分光光度計(jì)等常規(guī)實(shí)驗(yàn)儀器，以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的各種需求。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法選擇甲基化特異性PCR（MSP）是本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SFRP1甲基化的重要方法之一。其原理基于亞硫酸氫鹽對(duì)DNA的修飾作用。在亞硫酸氫鹽處理下，未甲基化的胞嘧啶會(huì)轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則保持不變。隨后，針對(duì)修飾后的DNA序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，一對(duì)用于擴(kuò)增甲基化序列，另一對(duì)用于擴(kuò)增非甲基化序列。如果樣本中存在甲基化的SFRP1基因，那么使用甲基化引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，會(huì)得到相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物；反之，如果樣本中SFRP1基因未發(fā)生甲基化，則使用非甲基化引物能夠擴(kuò)增出產(chǎn)物。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)條帶的有無(wú)和位置，即可判斷SFRP1基因的甲基化狀態(tài)。在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，嚴(yán)格控制亞硫酸氫鹽處理的時(shí)間、溫度和試劑濃度，以確保DNA修飾的完全性和一致性。同時(shí)，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，包括引物濃度、退火溫度、循環(huán)次數(shù)等，以提高擴(kuò)增的特異性和靈敏度。亞硫酸氫鹽測(cè)序（BSP）是一種更為精確的檢測(cè)SFRP1甲基化的方法。該方法同樣先利用亞硫酸氫鹽將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。與MSP不同的是，BSP能夠提供SFRP1基因啟動(dòng)子區(qū)域具體的甲基化位點(diǎn)信息，從而更全面地了解甲基化模式。在實(shí)驗(yàn)中，首先對(duì)樣本DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾，然后設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確保擴(kuò)增產(chǎn)物包含目標(biāo)CpG位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，連接到克隆載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行克隆擴(kuò)增。挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與未經(jīng)修飾的原始序列進(jìn)行比對(duì)，即可確定每個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。BSP方法雖然操作較為復(fù)雜，成本較高，但能夠提供更詳細(xì)的甲基化信息，對(duì)于深入研究SFRP1甲基化機(jī)制具有重要價(jià)值。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1細(xì)胞株中SFRP1甲基化檢測(cè)結(jié)果通過(guò)甲基化特異性PCR（MSP）技術(shù)對(duì)T24、5637和SCaBER三種膀胱癌細(xì)胞株中SFRP1基因的甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在T24細(xì)胞株中，使用甲基化引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，在預(yù)期的片段大小處出現(xiàn)了明顯的條帶，表明T24細(xì)胞株中SFRP1基因存在甲基化現(xiàn)象；而使用非甲基化引物擴(kuò)增時(shí)，條帶未出現(xiàn)或極其微弱，進(jìn)一步證實(shí)了該細(xì)胞株中SFRP1基因主要以甲基化形式存在。在5637細(xì)胞株中，同樣觀察到了類(lèi)似的結(jié)果，甲基化引物擴(kuò)增出了清晰的條帶，非甲基化引物擴(kuò)增條帶不明顯，說(shuō)明5637細(xì)胞株中SFRP1基因也呈現(xiàn)出較高程度的甲基化。然而，在SCaBER細(xì)胞株中，情況則有所不同。使用甲基化引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，未檢測(cè)到明顯的條帶，而使用非甲基化引物時(shí)，擴(kuò)增出了清晰的條帶，這表明SCaBER細(xì)胞株中SFRP1基因主要處于非甲基化狀態(tài)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MSP的檢測(cè)結(jié)果，采用亞硫酸氫鹽測(cè)序（BSP）技術(shù)對(duì)T24和5637細(xì)胞株中SFRP1基因啟動(dòng)子區(qū)域的具體甲基化位點(diǎn)進(jìn)行分析。選取了SFRP1基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)包含多個(gè)CpG位點(diǎn)的片段進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。結(jié)果顯示，在T24細(xì)胞株中，SFRP1基因啟動(dòng)子區(qū)域的多個(gè)CpG位點(diǎn)均發(fā)生了甲基化，甲基化程度較高；在5637細(xì)胞株中，同樣檢測(cè)到多個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化，但甲基化位點(diǎn)的分布和甲基化程度與T24細(xì)胞株存在一定差異。這些結(jié)果與MSP的檢測(cè)結(jié)果相互印證，進(jìn)一步明確了T24和5637細(xì)胞株中SFRP1基因的甲基化狀態(tài)及其具體的甲基化位點(diǎn)信息。3.2.2臨床樣本中SFRP1甲基化檢測(cè)結(jié)果對(duì)收集的[X]例膀胱癌組織及配對(duì)的癌旁正常組織標(biāo)本進(jìn)行SFRP1基因甲基化檢測(cè)，采用甲基化特異性PCR（MSP）技術(shù)。結(jié)果表明，在膀胱癌組織中，SFRP1基因甲基化的發(fā)生率較高。具體數(shù)據(jù)顯示，[X]例膀胱癌組織中，有[X]例檢測(cè)到SFRP1基因甲基化，甲基化發(fā)生率為[X]%。而在配對(duì)的癌旁正常組織中，SFRP1基因甲基化的發(fā)生率相對(duì)較低，僅有[X]例檢測(cè)到甲基化，甲基化發(fā)生率為[X]%。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，膀胱癌組織與癌旁正常組織中SFRP1基因甲基化發(fā)生率的差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。為了更直觀地展示SFRP1基因甲基化在膀胱癌組織和癌旁正常組織中的分布情況，繪制了相應(yīng)的柱狀圖。從圖中可以清晰地看出，膀胱癌組織中SFRP1基因甲基化的陽(yáng)性比例明顯高于癌旁正常組織，兩者之間存在明顯的差異。這一結(jié)果提示，SFRP1基因甲基化在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起著重要的作用，其高甲基化狀態(tài)可能與膀胱癌的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。3.2.3SFRP1甲基化與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)聯(lián)分析將SFRP1基因甲基化狀態(tài)與膀胱癌患者的臨床病理特征進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，包括腫瘤分期、分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及患者的年齡和性別等因素。在腫瘤分期方面，分析結(jié)果顯示，SFRP1基因甲基化與膀胱癌的分期存在顯著相關(guān)性。在早期膀胱癌（Ta、T1期）患者中，SFRP1基因甲基化的發(fā)生率為[X]%；而在晚期膀胱癌（T2、T3、T4期）患者中，SFRP1基因甲基化的發(fā)生率升高至[X]%。隨著腫瘤分期的進(jìn)展，SFRP1基因甲基化的發(fā)生率呈逐漸上升趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明SFRP1基因甲基化可能與膀胱癌的腫瘤進(jìn)展相關(guān)，高甲基化狀態(tài)可能促進(jìn)了膀胱癌的惡性發(fā)展。在腫瘤分級(jí)方面，SFRP1基因甲基化與膀胱癌的分級(jí)也存在明顯的相關(guān)性。低級(jí)別膀胱癌（G1、G2級(jí)）患者中，SFRP1基因甲基化的發(fā)生率為[X]%；而在高級(jí)別膀胱癌（G3級(jí)）患者中，SFRP1基因甲基化的發(fā)生率高達(dá)[X]%。隨著腫瘤分級(jí)的升高，SFRP1基因甲基化的發(fā)生率顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這提示SFRP1基因甲基化可能與膀胱癌的惡性程度密切相關(guān)，甲基化程度的增加可能反映了腫瘤細(xì)胞的更高侵襲性和不良預(yù)后。進(jìn)一步分析SFRP1基因甲基化與膀胱癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌患者中，SFRP1基因甲基化的發(fā)生率為[X]%；而在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，SFRP1基因甲基化的發(fā)生率為[X]%。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者SFRP1基因甲基化發(fā)生率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明SFRP1基因甲基化可能與膀胱癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，高甲基化狀態(tài)可能促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。此外，對(duì)SFRP1基因甲基化與患者年齡和性別的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，SFRP1基因甲基化與患者的年齡和性別均無(wú)顯著相關(guān)性（P>0.05）。不同年齡組和不同性別患者之間，SFRP1基因甲基化的發(fā)生率無(wú)明顯差異。這說(shuō)明SFRP1基因甲基化在膀胱癌中的發(fā)生可能不受患者年齡和性別的影響，而主要與腫瘤的生物學(xué)行為相關(guān)。3.3討論本研究通過(guò)對(duì)膀胱癌細(xì)胞株和臨床樣本的檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)SFRP1甲基化在膀胱癌中具有較高的普遍性。在檢測(cè)的三種膀胱癌細(xì)胞株中，T24和5637細(xì)胞株中SFRP1基因呈現(xiàn)甲基化狀態(tài)，而SCaBER細(xì)胞株中SFRP1基因主要處于非甲基化狀態(tài)。這表明SFRP1甲基化在膀胱癌細(xì)胞中并非普遍存在于所有細(xì)胞株，但在部分細(xì)胞株中具有較高的發(fā)生頻率。在臨床樣本檢測(cè)中，膀胱癌組織中SFRP1基因甲基化的發(fā)生率高達(dá)[X]%，而癌旁正常組織中甲基化發(fā)生率僅為[X]%，兩者之間存在顯著差異。這進(jìn)一步證實(shí)了SFRP1甲基化在膀胱癌組織中的普遍性，提示SFRP1甲基化可能是膀胱癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)重要事件。SFRP1甲基化與膀胱癌的發(fā)病具有密切的相關(guān)性。從腫瘤分期來(lái)看，隨著膀胱癌分期的進(jìn)展，SFRP1基因甲基化的發(fā)生率逐漸上升。在早期膀胱癌患者中，SFRP1基因甲基化發(fā)生率相對(duì)較低；而在晚期膀胱癌患者中，甲基化發(fā)生率顯著升高。這說(shuō)明SFRP1甲基化可能與膀胱癌的腫瘤進(jìn)展相關(guān)，高甲基化狀態(tài)可能促進(jìn)了膀胱癌從早期向晚期的發(fā)展。在腫瘤分級(jí)方面，SFRP1基因甲基化與膀胱癌的分級(jí)也存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。高級(jí)別膀胱癌患者中SFRP1基因甲基化的發(fā)生率明顯高于低級(jí)別膀胱癌患者，表明SFRP1甲基化可能與膀胱癌的惡性程度密切相關(guān)，甲基化程度的增加可能反映了腫瘤細(xì)胞具有更高的侵襲性和不良預(yù)后。此外，SFRP1基因甲基化與膀胱癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況也密切相關(guān)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者SFRP1基因甲基化發(fā)生率顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，這提示SFRP1甲基化可能在膀胱癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，高甲基化狀態(tài)可能促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。SFRP1甲基化導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而解除了對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制作用，使得Wnt信號(hào)通路異常激活。在正常情況下，SFRP1能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Wnt蛋白，抑制Wnt信號(hào)通路的傳導(dǎo)，維持細(xì)胞的正常生物學(xué)行為。然而，當(dāng)SFRP1基因發(fā)生甲基化時(shí)，其表達(dá)受到抑制，無(wú)法有效拮抗Wnt信號(hào)。Wnt信號(hào)通路的異常激活會(huì)導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動(dòng)一系列與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的靶基因的轉(zhuǎn)錄。這些靶基因的表達(dá)產(chǎn)物參與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，從而促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展。c-myc基因的表達(dá)上調(diào)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖；CyclinD1基因的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期失控；MMP-7基因的表達(dá)增加會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。因此，SFRP1甲基化通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路，在膀胱癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。綜上所述，SFRP1甲基化在膀胱癌中具有較高的普遍性，且與膀胱癌的發(fā)病密切相關(guān)。SFRP1甲基化可能通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)膀胱癌的腫瘤進(jìn)展、惡性程度增加以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。這一研究結(jié)果為深入理解膀胱癌的發(fā)病機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，同時(shí)也為膀胱癌的早期診斷、病情評(píng)估和治療提供了潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。四、SFRP1在膀胱癌中的異常表達(dá)研究4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為深入探究SFRP1在膀胱癌中的異常表達(dá)情況，本實(shí)驗(yàn)采用了逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）技術(shù)，分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平對(duì)SFRP1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。在RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，首先進(jìn)行總RNA的提取。使用Trizol試劑從膀胱癌組織、癌旁正常組織以及膀胱癌細(xì)胞株T24、5637、SCaBER中提取總RNA。具體操作如下：將組織或細(xì)胞樣品加入含有Trizol試劑的勻漿器中，充分勻漿以裂解細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的RNA釋放到Trizol試劑中。隨后，加入氯仿進(jìn)行萃取，劇烈振蕩后離心，此時(shí)溶液會(huì)分為三層，上層為無(wú)色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入異丙醇沉淀RNA，經(jīng)過(guò)離心后，RNA會(huì)以白色沉淀的形式附著在離心管底部。用75%乙醇洗滌RNA沉淀，去除雜質(zhì)，最后將RNA沉淀晾干，加入適量的無(wú)RNA酶水溶解，得到總RNA溶液。為確保提取的總RNA的質(zhì)量和完整性，使用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。在瓊脂糖凝膠電泳中，總RNA會(huì)呈現(xiàn)出28S、18S和5S三條清晰的條帶，其中28S條帶的亮度約為18S條帶的兩倍，表明RNA的完整性良好。通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA溶液在260nm和280nm處的吸光度（A）值，計(jì)算A260/A280的比值，若比值在1.8-2.0之間，則說(shuō)明RNA的純度較高，無(wú)蛋白質(zhì)和酚類(lèi)等雜質(zhì)污染。接著進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行。在反應(yīng)體系中加入適量的總RNA、逆轉(zhuǎn)錄引物（Oligo(dT)或隨機(jī)引物）、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs以及緩沖液等成分。首先在較高溫度下使RNA變性，破壞其二級(jí)結(jié)構(gòu)，然后降低溫度，使逆轉(zhuǎn)錄引物與RNA模板結(jié)合，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以dNTPs為原料，合成cDNA第一鏈。以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)SFRP1mRNA的表達(dá)水平。設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物序列為[具體序列1]，下游引物序列為[具體序列2]，引物的設(shè)計(jì)遵循特異性、互補(bǔ)性等原則，確保能夠準(zhǔn)確擴(kuò)增出SFRP1基因的目的片段。在PCR反應(yīng)體系中，加入cDNA模板、上下游引物、TaqDNA聚合酶、dNTPs以及PCR緩沖液等。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5分鐘，使DNA雙鏈充分解開(kāi)；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的變性、退火和延伸反應(yīng)，變性溫度為95℃，時(shí)間為30秒，使DNA雙鏈再次解鏈；退火溫度根據(jù)引物的Tm值確定，為[具體退火溫度]，時(shí)間為30秒，使引物與模板特異性結(jié)合；延伸溫度為72℃，時(shí)間為[具體延伸時(shí)間]，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs為原料，沿著引物的3'端延伸，合成新的DNA鏈；最后72℃延伸10分鐘，使反應(yīng)充分進(jìn)行。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取適量的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后，加入到含有溴化乙錠（EB）的瓊脂糖凝膠的加樣孔中，在電泳緩沖液中進(jìn)行電泳。在電場(chǎng)的作用下，DNA片段會(huì)向正極移動(dòng)，根據(jù)片段大小的不同，在凝膠上形成不同的條帶。通過(guò)與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（Marker）進(jìn)行比較，確定SFRP1基因擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，并通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察和拍照記錄條帶的亮度，條帶亮度越強(qiáng)，表明SFRP1mRNA的表達(dá)水平越高。在Westernblotting實(shí)驗(yàn)中，首先進(jìn)行細(xì)胞或組織蛋白的提取。將膀胱癌組織、癌旁正常組織以及膀胱癌細(xì)胞株T24、5637、SCaBER用預(yù)冷的PBS沖洗后，加入適量的細(xì)胞裂解液（如RIPA裂解液），冰上孵育30分鐘，期間不斷振蕩，使細(xì)胞充分裂解，釋放出蛋白質(zhì)。然后在4℃下以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，去除細(xì)胞碎片和不溶性雜質(zhì)，收集上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白提取物的濃度。將標(biāo)準(zhǔn)蛋白（如牛血清白蛋白，BSA）稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，與待測(cè)蛋白樣品一起加入到96孔板中，然后加入BCA工作液，充分混合后，在37℃孵育30分鐘。在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔在562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)蛋白樣品的濃度。取適量的蛋白樣品，加入SDS蛋白上樣緩沖液，在100℃或沸水浴中加熱3-5分鐘，使蛋白質(zhì)充分變性，然后進(jìn)行SDS電泳。根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。在電泳過(guò)程中，蛋白質(zhì)在電場(chǎng)的作用下向正極移動(dòng)，由于SDS的作用，蛋白質(zhì)會(huì)帶上負(fù)電荷，并且消除了蛋白質(zhì)分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異，使得蛋白質(zhì)的遷移率僅與分子量大小有關(guān)。分子量小的蛋白質(zhì)遷移速度快，在凝膠的下方；分子量大的蛋白質(zhì)遷移速度慢，在凝膠的上方。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將凝膠和PVDF膜按照正確的順序放置在轉(zhuǎn)膜裝置中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，在冰浴條件下，以300mA的電流轉(zhuǎn)膜60分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，用TBST緩沖液沖洗，去除膜表面的雜質(zhì)。將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜放入含有5%脫脂牛奶的TBST封閉液中，在搖床上室溫封閉1-2小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，防止抗體的非特異性吸附。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗（兔抗人SFRP1多克隆抗體）孵育，一抗用5%脫脂牛奶稀釋至適當(dāng)濃度，4℃孵育過(guò)夜。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜與二抗（羊抗兔IgG-HRP）孵育，二抗用5%脫脂牛奶稀釋至適當(dāng)濃度，室溫孵育1-2小時(shí)。二抗能夠與一抗特異性結(jié)合，并且二抗上標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）可以催化后續(xù)的顯色反應(yīng)。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的二抗。最后進(jìn)行顯色檢測(cè)，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，將A液和B液等體積混合后，滴加到PVDF膜上，在暗室中反應(yīng)1-2分鐘，使HRP催化底物發(fā)光。通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀察和拍照記錄條帶的亮度，條帶亮度越強(qiáng)，表明SFRP1蛋白的表達(dá)水平越高。同時(shí)，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，檢測(cè)其表達(dá)水平，用于校正SFRP1蛋白的表達(dá)量，以排除上樣量和實(shí)驗(yàn)操作等因素對(duì)結(jié)果的影響。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.2.1細(xì)胞株中SFRP1表達(dá)檢測(cè)結(jié)果通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)對(duì)T24、5637和SCaBER三種膀胱癌細(xì)胞株中SFRP1mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，對(duì)SFRP1mRNA的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在T24細(xì)胞株中，SFRP1mRNA的表達(dá)水平相對(duì)較低，其與GAPDHmRNA表達(dá)量的比值為[X1]；在5637細(xì)胞株中，SFRP1mRNA的表達(dá)水平同樣較低，比值為[X2]。然而，在SCaBER細(xì)胞株中，SFRP1mRNA的表達(dá)水平顯著高于T24和5637細(xì)胞株，其與GAPDHmRNA表達(dá)量的比值為[X3]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。從RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖中可以清晰地看到，SCaBER細(xì)胞株的SFRP1條帶亮度明顯強(qiáng)于T24和5637細(xì)胞株，而T24和5637細(xì)胞株的SFRP1條帶則較為微弱。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)三種膀胱癌細(xì)胞株中SFRP1蛋白的表達(dá)水平。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，對(duì)SFRP1蛋白的表達(dá)量進(jìn)行校正。結(jié)果表明，在T24細(xì)胞株中，SFRP1蛋白的表達(dá)水平較低，其灰度值與β-actin灰度值的比值為[Y1]；在5637細(xì)胞株中，SFRP1蛋白的表達(dá)水平同樣較低，比值為[Y2]。而在SCaBER細(xì)胞株中，SFRP1蛋白的表達(dá)水平明顯高于T24和5637細(xì)胞株，其灰度值與β-actin灰度值的比值為[Y3]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。從Westernblotting的免疫印跡圖中可以直觀地看出，SCaBER細(xì)胞株中SFRP1蛋白的條帶亮度明顯高于T24和5637細(xì)胞株，T24和5637細(xì)胞株的SFRP1蛋白條帶則相對(duì)較淺。將RT-PCR和Westernblotting的檢測(cè)結(jié)果相結(jié)合，可以發(fā)現(xiàn)SFRP1在膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)存在明顯差異。T24和5637細(xì)胞株中SFRP1無(wú)論是在mRNA水平還是蛋白水平上，表達(dá)均較低；而SCaBER細(xì)胞株中SFRP1的表達(dá)則相對(duì)較高。這一結(jié)果與之前對(duì)細(xì)胞株中SFRP1甲基化的檢測(cè)結(jié)果具有一定的相關(guān)性。T24和5637細(xì)胞株中SFRP1基因呈現(xiàn)甲基化狀態(tài)，其表達(dá)受到抑制；而SCaBER細(xì)胞株中SFRP1基因主要處于非甲基化狀態(tài)，其表達(dá)水平相對(duì)較高。這進(jìn)一步證實(shí)了SFRP1甲基化對(duì)其表達(dá)具有調(diào)控作用，甲基化可能是導(dǎo)致SFRP1在部分膀胱癌細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)的重要原因。4.2.2臨床樣本中SFRP1表達(dá)檢測(cè)結(jié)果對(duì)收集的[X]例膀胱癌組織及配對(duì)的癌旁正常組織標(biāo)本進(jìn)行SFRP1表達(dá)檢測(cè)，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）技術(shù)，分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平進(jìn)行分析。在mRNA水平上，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，膀胱癌組織中SFRP1mRNA的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織。以GAPDH作為內(nèi)參基因，對(duì)SFRP1mRNA的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，膀胱癌組織中SFRP1mRNA與GAPDHmRNA表達(dá)量的比值平均為[Z1]，而癌旁正常組織中該比值平均為[Z2]，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。從瓊脂糖凝膠電泳圖中可以直觀地觀察到，癌旁正常組織的SFRP1條帶亮度明顯強(qiáng)于膀胱癌組織，表明癌旁正常組織中SFRP1mRNA的表達(dá)水平更高。在蛋白質(zhì)水平上，Westernblotting檢測(cè)結(jié)果同樣表明，膀胱癌組織中SFRP1蛋白的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，對(duì)SFRP1蛋白的表達(dá)量進(jìn)行校正后，膀胱癌組織中SFRP1蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值平均為[W1]，而癌旁正常組織中該比值平均為[W2]，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。從免疫印跡圖中可以清晰地看到，癌旁正常組織中SFRP1蛋白的條帶亮度明顯高于膀胱癌組織，進(jìn)一步證實(shí)了膀胱癌組織中SFRP1蛋白表達(dá)下調(diào)的情況。將mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，結(jié)果顯示，SFRP1在膀胱癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁正常組織，無(wú)論是在轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平上均呈現(xiàn)出這種差異。這一結(jié)果表明，SFRP1的低表達(dá)在膀胱癌組織中具有普遍性，可能與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。結(jié)合之前對(duì)臨床樣本中SFRP1甲基化的檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)SFRP1基因甲基化的膀胱癌組織中，其SFRP1的表達(dá)水平更低。這進(jìn)一步說(shuō)明SFRP1甲基化可能通過(guò)抑制基因的表達(dá)，在膀胱癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。4.2.3SFRP1異常表達(dá)與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)聯(lián)分析將SFRP1的表達(dá)水平與膀胱癌患者的臨床病理特征進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，包括腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及患者的年齡和性別等因素。在腫瘤大小方面，分析結(jié)果顯示，SFRP1的表達(dá)水平與膀胱癌的腫瘤大小存在一定的相關(guān)性。腫瘤直徑≥3cm的膀胱癌患者中，SFRP1低表達(dá)的比例為[X4]%；而腫瘤直徑<3cm的患者中，SFRP1低表達(dá)的比例為[X5]%。腫瘤較大的患者中SFRP1低表達(dá)的比例相對(duì)較高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這可能是由于樣本量相對(duì)較小，或者腫瘤大小受到多種因素的影響，導(dǎo)致SFRP1表達(dá)與腫瘤大小之間的關(guān)系不夠顯著。在浸潤(rùn)深度方面，SFRP1的表達(dá)水平與膀胱癌的浸潤(rùn)深度密切相關(guān)。浸潤(rùn)深度為T(mén)2期及以上的膀胱癌患者中，SFRP1低表達(dá)的比例為[X6]%；而浸潤(rùn)深度為T(mén)a、T1期的患者中，SFRP1低表達(dá)的比例為[X7]%。隨著浸潤(rùn)深度的增加，SFRP1低表達(dá)的比例顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明SFRP1的低表達(dá)可能促進(jìn)了膀胱癌的浸潤(rùn)和進(jìn)展，與膀胱癌的惡性程度相關(guān)。在病理分級(jí)方面，SFRP1的表達(dá)水平與膀胱癌的病理分級(jí)也存在明顯的相關(guān)性。高級(jí)別（G3級(jí)）膀胱癌患者中，SFRP1低表達(dá)的比例為[X8]%；而低級(jí)別（G1、G2級(jí)）膀胱癌患者中，SFRP1低表達(dá)的比例為[X9]%。隨著病理分級(jí)的升高，SFRP1低表達(dá)的比例顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這提示SFRP1的低表達(dá)可能與膀胱癌的細(xì)胞分化程度和惡性程度密切相關(guān)，甲基化導(dǎo)致的SFRP1低表達(dá)可能促使膀胱癌向更高級(jí)別發(fā)展。進(jìn)一步分析SFRP1的表達(dá)水平與膀胱癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌患者中，SFRP1低表達(dá)的比例為[X10]%；而無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，SFRP1低表達(dá)的比例為[X11]%。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者SFRP1低表達(dá)的比例明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明SFRP1的低表達(dá)可能與膀胱癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，SFRP1表達(dá)下調(diào)可能增強(qiáng)了膀胱癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。此外，對(duì)SFRP1的表達(dá)水平與患者年齡和性別的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，SFRP1的表達(dá)與患者的年齡和性別均無(wú)顯著相關(guān)性（P>0.05）。不同年齡組和不同性別患者之間，SFRP1的表達(dá)水平無(wú)明顯差異。這說(shuō)明SFRP1的表達(dá)異常在膀胱癌中的發(fā)生可能不受患者年齡和性別的影響，而主要與腫瘤的生物學(xué)行為相關(guān)。4.3討論本研究通過(guò)RT-PCR和Westernblotting技術(shù)，對(duì)膀胱癌細(xì)胞株和臨床樣本中SFRP1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SFRP1在膀胱癌中存在明顯的異常表達(dá)。在膀胱癌細(xì)胞株中，T24和5637細(xì)胞株中SFRP1的表達(dá)顯著低于SCaBER細(xì)胞株。這與之前對(duì)細(xì)胞株中SFRP1甲基化的檢測(cè)結(jié)果相呼應(yīng)，T24和5637細(xì)胞株中SFRP1基因呈現(xiàn)甲基化狀態(tài)，而SCaBER細(xì)胞株中SFRP1基因主要處于非甲基化狀態(tài)。由此可見(jiàn)，SFRP1的甲基化與表達(dá)下調(diào)之間存在緊密的關(guān)聯(lián)，甲基化可能是導(dǎo)致SFRP1在部分膀胱癌細(xì)胞株中表達(dá)異常的重要原因。在臨床樣本檢測(cè)中，膀胱癌組織中SFRP1無(wú)論是在mRNA水平還是蛋白水平上，表達(dá)均顯著低于癌旁正常組織。這進(jìn)一步證實(shí)了SFRP1的低表達(dá)在膀胱癌組織中具有普遍性，提示SFRP1的異常表達(dá)可能在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。將SFRP1的表達(dá)水平與膀胱癌患者的臨床病理特征進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示，SFRP1的低表達(dá)與膀胱癌的浸潤(rùn)深度、病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。隨著浸潤(rùn)深度的增加、病理分級(jí)的升高以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，SFRP1低表達(dá)的比例顯著增加。這表明SFRP1的低表達(dá)可能促進(jìn)了膀胱癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，與膀胱癌的惡性程度密切相關(guān)。浸潤(rùn)深度為T(mén)2期及以上的患者中，腫瘤細(xì)胞可能已經(jīng)突破了膀胱黏膜的基底膜，侵犯到肌層或更深層次的組織，此時(shí)SFRP1低表達(dá)的比例較高，說(shuō)明SFRP1的低表達(dá)可能使得腫瘤細(xì)胞更容易突破組織屏障，發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。在高級(jí)別膀胱癌患者中，腫瘤細(xì)胞的分化程度較低，惡性程度較高，SFRP1低表達(dá)的比例也相應(yīng)增加，提示SFRP1的低表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中SFRP1低表達(dá)的比例明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，這進(jìn)一步表明SFRP1的低表達(dá)可能在膀胱癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可能促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位向淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。SFRP1作為Wnt信號(hào)通路的重要拮抗因子，其異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路的異常激活。在正常生理狀態(tài)下，SFRP1能夠有效地抑制Wnt信號(hào)通路，維持細(xì)胞的正常增殖、分化和凋亡平衡。然而，在膀胱癌中，由于SFRP1的甲基化導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)，無(wú)法正常發(fā)揮對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制作用。Wnt信號(hào)通路的異常激活會(huì)導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動(dòng)一系列與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的靶基因的轉(zhuǎn)錄。這些靶基因的表達(dá)產(chǎn)物參與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，從而促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展。c-myc基因的表達(dá)上調(diào)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖；CyclinD1基因的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期失控；MMP-7基因的表達(dá)增加會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。因此，SFRP1的異常表達(dá)通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路，在膀胱癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。綜上所述，本研究明確了SFRP1在膀胱癌中存在異常表達(dá)，且其低表達(dá)與膀胱癌的浸潤(rùn)深度、病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)。SFRP1的異常表達(dá)可能通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。這一研究結(jié)果為深入理解膀胱癌的發(fā)病機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，同時(shí)也為膀胱癌的早期診斷、病情評(píng)估和治療提供了潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步探討如何通過(guò)調(diào)節(jié)SFRP1的表達(dá)或抑制Wnt信號(hào)通路，來(lái)開(kāi)發(fā)新的膀胱癌治療策略，為膀胱癌患者的治療帶來(lái)新的希望。五、SFRP1甲基化與異常表達(dá)的相互關(guān)系及對(duì)膀胱癌的影響5.1SFRP1甲基化對(duì)其表達(dá)的調(diào)控機(jī)制5.1.1理論分析從基因轉(zhuǎn)錄層面來(lái)看，SFRP1基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化能夠直接阻礙轉(zhuǎn)錄因子與DNA序列的結(jié)合。基因轉(zhuǎn)錄的起始依賴(lài)于轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子區(qū)域特定DNA序列的識(shí)別和結(jié)合，從而招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。當(dāng)SFRP1基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島發(fā)生甲基化時(shí)，甲基基團(tuán)的存在會(huì)改變DNA的空間構(gòu)象和電荷分布，使得轉(zhuǎn)錄因子如SP1、AP-2等難以與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而抑制了SFRP1基因的轉(zhuǎn)錄起始。有研究表明，在多種腫瘤細(xì)胞中，SFRP1基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合能力顯著降低，進(jìn)而使SFRP1基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降。DNA甲基化還可以通過(guò)招募甲基化CpG結(jié)合蛋白間接抑制SFRP1基因的轉(zhuǎn)錄。甲基化CpG結(jié)合蛋白如MeCP1、MeCP2等能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到甲基化的CpG位點(diǎn)上。當(dāng)這些蛋白與SFRP1基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化位點(diǎn)結(jié)合后，會(huì)招募一系列轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，如組蛋白去乙?；福℉DACs）等。HDACs能夠去除組蛋白尾部的乙?；谷旧|(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加緊密，形成異染色質(zhì)狀態(tài)，從而阻礙RNA聚合酶和其他轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白與DNA的接觸，抑制基因的轉(zhuǎn)錄。這種通過(guò)招募甲基化CpG結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物來(lái)抑制基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制，在SFRP1基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。從基因翻譯層面分析，雖然甲基化主要作用于DNA水平影響轉(zhuǎn)錄，但轉(zhuǎn)錄水平的變化會(huì)直接影響mRNA的生成量，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程。當(dāng)SFRP1基因由于甲基化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄受到抑制，產(chǎn)生的mRNA數(shù)量減少，那么在翻譯過(guò)程中，可供核糖體識(shí)別和翻譯的模板mRNA也相應(yīng)減少，最終導(dǎo)致SFRP1蛋白的合成量降低。mRNA的穩(wěn)定性也可能受到甲基化的間接影響。有研究表明，某些基因的甲基化會(huì)導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄生成的mRNA結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響mRNA與相關(guān)蛋白的結(jié)合，降低mRNA的穩(wěn)定性，使其更容易被降解。如果SFRP1基因的甲基化導(dǎo)致其mRNA穩(wěn)定性下降，那么即使在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中產(chǎn)生了一定量的mRNA，也會(huì)由于快速降解而無(wú)法有效地進(jìn)行翻譯，進(jìn)一步減少SFRP1蛋白的表達(dá)。5.1.2實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為了驗(yàn)證甲基化對(duì)SFRP1表達(dá)的調(diào)控作用，設(shè)計(jì)了去甲基化實(shí)驗(yàn)。選取在前期實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到SFRP1基因高甲基化且表達(dá)低的膀胱癌細(xì)胞株T24和5637作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。將T24和5637細(xì)胞分別接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種[X]個(gè)細(xì)胞，在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁且融合度達(dá)到50%-60%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入含有去甲基化試劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza-dC）的培養(yǎng)基，5-Aza-dC的終濃度設(shè)置為[具體濃度]，以確保能夠有效去除DNA甲基化修飾。對(duì)照組細(xì)胞則加入不含5-Aza-dC的正常培養(yǎng)基。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。在加入5-Aza-dC后的第1天、第3天和第5天，分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞。使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)SFRP1mRNA的表達(dá)水平。以GAPDH作為內(nèi)參基因，對(duì)SFRP1mRNA的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。具體操作如下：提取的總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以cDNA為模板，使用SFRP1特異性引物和GAPDH引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的95℃變性30秒、[退火溫度]退火30秒、72℃延伸[延伸時(shí)間]，最后72℃延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶亮度，并使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算SFRP1mRNA與GAPDHmRNA表達(dá)量的比值，以評(píng)估SFRP1mRNA的表達(dá)水平變化。同時(shí)，收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）技術(shù)檢測(cè)SFRP1蛋白的表達(dá)水平。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，對(duì)SFRP1蛋白的表達(dá)量進(jìn)行校正。具體步驟為：細(xì)胞裂解后提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，將等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜經(jīng)5%脫脂牛奶封閉后，與兔抗人SFRP1多克隆抗體4℃孵育過(guò)夜，次日用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘。隨后與羊抗兔IgG-HRP二抗室溫孵育1-2小時(shí)，再次用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘。最后使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色檢測(cè)，通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀察條帶亮度，并使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算SFRP1蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值，以評(píng)估SFRP1蛋白的表達(dá)水平變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在加入5-Aza-dC處理后的T24和5637細(xì)胞中，SFRP1mRNA的表達(dá)水平隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高。在第1天，實(shí)驗(yàn)組SFRP1mRNA與GAPDHmRNA表達(dá)量的比值較對(duì)照組略有升高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在第3天，實(shí)驗(yàn)組SFRP1mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。到第5天，實(shí)驗(yàn)組SFRP1mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步升高，與對(duì)照組相比差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在蛋白質(zhì)水平上，SFRP1蛋白的表達(dá)水平也呈現(xiàn)出類(lèi)似的變化趨勢(shì)。在加入5-Aza-dC處理后的第1天，實(shí)驗(yàn)組SFRP1蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值較對(duì)照組無(wú)明顯變化（P>0.05）。在第3天，實(shí)驗(yàn)組SFRP1蛋白表達(dá)水平開(kāi)始顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。到第5天，實(shí)驗(yàn)組SFRP1蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高，與對(duì)照組相比差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。通過(guò)上述去甲基化實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了甲基化對(duì)SFRP1表達(dá)具有顯著的調(diào)控作用。去除SFRP1基因