3-溴丙酮酸聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌細(xì)胞株A549生長(zhǎng)抑制作用及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均居前列的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中均位居首位，2020年中國(guó)新增肺癌病例數(shù)多達(dá)82萬(wàn)例。肺癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)手術(shù)最佳時(shí)機(jī)，這使得肺癌的治療面臨巨大挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的肺癌治療方法主要包括手術(shù)、放療和化療。手術(shù)治療對(duì)于早期肺癌患者有一定的治愈率，但對(duì)于中晚期患者效果有限。放療和化療雖然能在一定程度上抑制腫瘤生長(zhǎng)，但腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物容易產(chǎn)生耐藥性，且化療的副作用較大，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。例如，順鉑作為目前常用的肺癌化療藥物之一，長(zhǎng)期使用會(huì)出現(xiàn)多種不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、腎毒性等，并且腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性也逐漸成為臨床治療的難題。隨著對(duì)腫瘤細(xì)胞代謝機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞具有獨(dú)特的能量代謝方式，即Warburg效應(yīng)，其表現(xiàn)為即使在有氧條件下，腫瘤細(xì)胞也更多地依賴(lài)糖酵解途徑來(lái)獲取能量。這一發(fā)現(xiàn)為肺癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和思路。3-溴丙酮酸（3-Bromopyruvicacid，3-BrPA）是一種天然產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)類(lèi)似于細(xì)胞內(nèi)糖類(lèi)代謝產(chǎn)物，如丙酮酸、乳酸等，對(duì)細(xì)胞的能量代謝具有反向調(diào)節(jié)作用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解途徑，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖?；诜伟┲委煹默F(xiàn)狀和3-溴丙酮酸的獨(dú)特作用機(jī)制，研究3-溴丙酮酸聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌細(xì)胞株A549生長(zhǎng)的抑制作用具有重要的理論和實(shí)踐意義。一方面，有望通過(guò)聯(lián)合用藥的方式提高肺癌的治療效果，為臨床治療提供新的藥物組合方案；另一方面，深入探究其作用機(jī)制，有助于從分子層面揭示肺癌的發(fā)病機(jī)制，為肺癌的治療提供更深入的理論基礎(chǔ)。1.2研究目的本研究旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，深入探討3-溴丙酮酸聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌細(xì)胞株A549生長(zhǎng)的抑制效果，并初步闡明其作用機(jī)制。具體而言，一方面，利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)等技術(shù)手段，明確3-溴丙酮酸與順鉑聯(lián)合使用相較于單獨(dú)使用時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡作用的差異，評(píng)估聯(lián)合用藥是否具有協(xié)同增效作用，為臨床肺癌治療提供更有效的藥物組合方案。另一方面，從細(xì)胞能量代謝、信號(hào)傳導(dǎo)通路等層面，探究聯(lián)合用藥影響肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的內(nèi)在分子機(jī)制，例如研究3-溴丙酮酸抑制糖酵解途徑后，如何與順鉑共同作用于肺癌細(xì)胞的相關(guān)信號(hào)通路，為肺癌的靶向治療提供理論依據(jù)。1.3研究意義本研究對(duì)于肺癌治療領(lǐng)域具有多方面的重要意義。在治療方法創(chuàng)新層面，肺癌作為高發(fā)病率和高死亡率的惡性腫瘤，傳統(tǒng)治療手段面臨諸多挑戰(zhàn)，如化療藥物的耐藥性和嚴(yán)重副作用。本研究若能證實(shí)3-溴丙酮酸聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌細(xì)胞株A549生長(zhǎng)具有顯著抑制作用，將為肺癌治療提供一種全新的藥物聯(lián)合方案，為臨床醫(yī)生提供更多治療選擇，有望打破現(xiàn)有治療困境，提高肺癌患者的治療效果和生存率。從減少順鉑用量及不良反應(yīng)角度來(lái)看，順鉑是肺癌化療的常用藥物，但長(zhǎng)期使用會(huì)引發(fā)多種不良反應(yīng)，如嚴(yán)重的惡心、嘔吐，這會(huì)極大影響患者的進(jìn)食和營(yíng)養(yǎng)攝入，導(dǎo)致患者身體虛弱；腎毒性則可能損害腎臟功能，影響體內(nèi)代謝廢物的排出，嚴(yán)重時(shí)甚至需要進(jìn)行透析治療。同時(shí)，順鉑的耐藥性問(wèn)題也日益突出。而3-溴丙酮酸的加入，若能發(fā)揮協(xié)同作用，就有可能在保證治療效果的前提下，減少順鉑的使用劑量。這樣一來(lái)，不僅可以降低順鉑帶來(lái)的不良反應(yīng)，減輕患者的痛苦，還能在一定程度上延緩耐藥性的產(chǎn)生，提高治療的可持續(xù)性。在深入理解聯(lián)合治療機(jī)制方面，通過(guò)探究3-溴丙酮酸聯(lián)合順鉑抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制，有助于從分子生物學(xué)層面揭示肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡以及能量代謝等過(guò)程的調(diào)控機(jī)制。這不僅可以加深我們對(duì)肺癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，還能為開(kāi)發(fā)更具針對(duì)性的靶向治療藥物提供理論依據(jù)，推動(dòng)肺癌治療從傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)性治療向精準(zhǔn)治療轉(zhuǎn)變，為肺癌治療領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。二、肺癌細(xì)胞株A549與實(shí)驗(yàn)相關(guān)藥物概述2.1肺癌細(xì)胞株A549特性肺癌細(xì)胞株A549于1972年由D.J.Giard等人從一位58歲白人男性的原發(fā)性肺腫瘤組織通過(guò)外植體腫瘤轉(zhuǎn)移培養(yǎng)而建立，屬于人肺腺癌細(xì)胞系。在形態(tài)學(xué)方面，A549細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)呈上皮細(xì)胞樣，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形狀主要為多邊形或梭形，細(xì)胞核相對(duì)較大，占據(jù)細(xì)胞體積的比例較為顯著，胞質(zhì)豐富，為細(xì)胞內(nèi)各種代謝活動(dòng)提供了充足的空間和物質(zhì)基礎(chǔ)。在遺傳變異層面，A549細(xì)胞具有多倍體性，其染色體數(shù)目變異范圍較大，存在著染色體缺失、重排和復(fù)制等多種復(fù)雜的遺傳變異現(xiàn)象。這些遺傳變異使得A549細(xì)胞系在不同實(shí)驗(yàn)條件下表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性，對(duì)其生物學(xué)行為和對(duì)藥物的反應(yīng)性產(chǎn)生重要影響。例如，染色體的缺失可能導(dǎo)致某些關(guān)鍵基因的丟失，影響細(xì)胞的正常生理功能；而染色體的重排則可能改變基因的表達(dá)調(diào)控模式，使細(xì)胞獲得異常的增殖和生存能力。從腫瘤特性角度來(lái)看，A549細(xì)胞具備典型的腫瘤細(xì)胞特征。其增殖能力十分強(qiáng)勁，具有無(wú)限增殖潛能，能夠在適宜的培養(yǎng)條件下持續(xù)分裂生長(zhǎng)，這使得它成為研究肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)機(jī)制的理想模型。同時(shí)，A549細(xì)胞還具有較強(qiáng)的抗凋亡能力，能夠逃避機(jī)體自身的凋亡調(diào)控機(jī)制，維持細(xì)胞的存活和增殖，這也是腫瘤細(xì)胞難以被徹底清除的重要原因之一。A549細(xì)胞表達(dá)多種腫瘤標(biāo)志物，如細(xì)胞角蛋白、腫瘤相關(guān)抗原和轉(zhuǎn)錄因子等。細(xì)胞角蛋白是上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，其在A549細(xì)胞中的表達(dá)情況可用于判斷細(xì)胞的上皮來(lái)源和分化程度；腫瘤相關(guān)抗原的表達(dá)則為肺癌的診斷和治療靶點(diǎn)的篩選提供了重要線索；轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，其在A549細(xì)胞中的異常表達(dá)與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。值得注意的是，A549細(xì)胞對(duì)多種抗癌藥物具有一定程度的耐藥性。這種耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制較為復(fù)雜，涉及藥物外排泵的高表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)解毒機(jī)制的增強(qiáng)、凋亡信號(hào)通路的異常等多個(gè)方面。例如，某些藥物外排泵能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的抗癌藥物主動(dòng)排出，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性；細(xì)胞內(nèi)解毒機(jī)制的增強(qiáng)則可以加速對(duì)藥物的代謝和滅活，減少藥物對(duì)細(xì)胞的損傷。A549細(xì)胞的耐藥性特點(diǎn)使其成為研究肺癌耐藥機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的抗癌藥物的重要細(xì)胞模型。2.23-溴丙酮酸3-溴丙酮酸，分子式為C_{3}H_{3}BrO_{3}，分子量166.96，是一種強(qiáng)烷化劑，化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有溴原子和羰基，具有較強(qiáng)的化學(xué)反應(yīng)活性。其結(jié)構(gòu)與細(xì)胞內(nèi)糖類(lèi)代謝產(chǎn)物如丙酮酸、乳酸極為相似，這種結(jié)構(gòu)上的相似性使其能夠參與細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程，并對(duì)細(xì)胞的能量代謝產(chǎn)生獨(dú)特的反向調(diào)節(jié)作用。3-溴丙酮酸主要通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解途徑來(lái)發(fā)揮抗癌作用。腫瘤細(xì)胞具有獨(dú)特的能量代謝方式，即Warburg效應(yīng)，即使在有氧條件下，也主要依賴(lài)糖酵解途徑來(lái)獲取能量，這使得腫瘤細(xì)胞對(duì)糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶高度依賴(lài)。己糖激酶Ⅱ（HKⅡ）是糖酵解途徑中的關(guān)鍵限速酶之一，在腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，對(duì)維持腫瘤細(xì)胞的快速增殖和生長(zhǎng)起著至關(guān)重要的作用。3-溴丙酮酸能夠與線粒體外膜上的HKⅡ活性部位的-XH基團(tuán)特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的丙酮酸-己糖激酶復(fù)合體（E-XH+BrCH_{2}-CO-COOH\rightarrowEX-CH_{2}-CO-COOH+HBr），從而使HKⅡ的活性喪失。HKⅡ活性的抑制導(dǎo)致糖酵解途徑受阻，腫瘤細(xì)胞無(wú)法通過(guò)糖酵解高效產(chǎn)生ATP，細(xì)胞內(nèi)能量供應(yīng)嚴(yán)重不足，進(jìn)而抑制了腫瘤細(xì)胞內(nèi)各種依賴(lài)ATP的生理功能，如DNA合成、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞分裂等過(guò)程，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖受到顯著抑制，甚至促使腫瘤細(xì)胞因能量匱乏而凋亡、死亡。3-溴丙酮酸還能通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。BAD蛋白是聯(lián)系細(xì)胞線粒體內(nèi)糖酵解與細(xì)胞凋亡的重要關(guān)聯(lián)蛋白。3-溴丙酮酸抑制HKⅡ活性后，阻斷了腫瘤細(xì)胞內(nèi)的糖酵解過(guò)程，引起B(yǎng)AD脫磷酸化，使其與凋亡相關(guān)Bcl-2家族蛋白的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生結(jié)構(gòu)改變。正常情況下，BAD與抑凋亡蛋白Bcl-2結(jié)合可抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而3-溴丙酮酸處理后，BAD與Bcl-2的結(jié)合活力改變，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。HKⅡ能與線粒體外膜電壓依賴(lài)性的陰離子通道（VDAC）結(jié)合，催化糖酵解途徑，同時(shí)VDAC參與細(xì)胞的能量代謝、調(diào)控細(xì)胞凋亡等過(guò)程。3-溴丙酮酸可改變HKⅡ與VDAC的結(jié)合，使線粒體內(nèi)膜空間蛋白的釋放增多，這些蛋白具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究表明，3-溴丙酮酸處理人宮頸癌Hela細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)胞內(nèi)染色質(zhì)聚集、核碎裂、凋亡小體出現(xiàn)等典型的細(xì)胞凋亡征象，并且細(xì)胞分裂受到抑制，G2/M期細(xì)胞比例明顯增高。還有研究指出3-溴丙酮酸可以明顯上調(diào)凋亡啟動(dòng)蛋白CleavedCaspase3及線粒體凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞色素C的表達(dá)活性，誘發(fā)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡過(guò)程。此外，3-溴丙酮酸處理肝癌細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）的表達(dá)活性明顯降低，XIAP是凋亡抑制作用最強(qiáng)的蛋白因子之一，其表達(dá)降低使得細(xì)胞凋亡比例明顯增加。2.3順鉑順鉑（Cisplatin，CDDP），化學(xué)名為順式二氯二氨合鉑（Ⅱ），分子式為Pt(NH_{3})_{2}Cl_{2}，是一種經(jīng)典的鉑類(lèi)化療藥物，在臨床腫瘤治療中占據(jù)著重要地位。順鉑的作用機(jī)制較為復(fù)雜，主要是通過(guò)與腫瘤細(xì)胞DNA發(fā)生相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制和殺傷。順鉑進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，首先在細(xì)胞內(nèi)的低氯環(huán)境下發(fā)生水解，其氯原子被水分子取代，形成帶正電荷的水合離子。這些水合離子具有高度的親電性，能夠迅速與DNA分子中的鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤等堿基上的氮原子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，形成DNA-鉑加合物。這種加合物的形成會(huì)導(dǎo)致DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的扭曲、變形，破壞DNA的正常結(jié)構(gòu)和功能，從而阻礙DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。腫瘤細(xì)胞在進(jìn)行DNA復(fù)制時(shí)，遇到DNA-鉑加合物會(huì)導(dǎo)致復(fù)制叉停滯，引發(fā)DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)。如果細(xì)胞無(wú)法有效修復(fù)這種損傷，就會(huì)激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)和增殖的目的。在肺癌治療領(lǐng)域，順鉑是常用的化療藥物之一，廣泛應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（SCLC）的治療。對(duì)于晚期非小細(xì)胞肺癌患者，以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案是一線治療的標(biāo)準(zhǔn)選擇，如順鉑聯(lián)合培美曲塞、順鉑聯(lián)合吉西他濱等方案，能夠顯著延長(zhǎng)患者的生存期，提高患者的生活質(zhì)量。在小細(xì)胞肺癌的治療中，順鉑聯(lián)合依托泊苷是經(jīng)典的化療方案，對(duì)于局限期和廣泛期小細(xì)胞肺癌都具有較好的療效，能夠使部分患者的腫瘤得到緩解，控制疾病的進(jìn)展。然而，順鉑在臨床應(yīng)用中也面臨著諸多問(wèn)題。一方面，腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑容易產(chǎn)生耐藥性。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生順鉑耐藥的機(jī)制是多方面的。細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)異常，如P-糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）等，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的順鉑主動(dòng)排出，降低細(xì)胞內(nèi)順鉑的濃度，使腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥。腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制增強(qiáng)，當(dāng)順鉑導(dǎo)致DNA損傷后，細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)酶如核苷酸切除修復(fù)（NER）相關(guān)蛋白等表達(dá)上調(diào)，能夠更有效地修復(fù)受損的DNA，使腫瘤細(xì)胞得以存活和繼續(xù)增殖。腫瘤細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路異常也會(huì)導(dǎo)致順鉑耐藥，如Bcl-2家族蛋白表達(dá)失調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2高表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，使腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的殺傷作用產(chǎn)生抵抗。另一方面，順鉑具有較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)，給患者帶來(lái)了較大的痛苦。順鉑最常見(jiàn)的不良反應(yīng)之一是胃腸道反應(yīng)，表現(xiàn)為嚴(yán)重的惡心、嘔吐，這主要是由于順鉑刺激胃腸道黏膜，導(dǎo)致胃腸道神經(jīng)反射異常，引起胃腸道平滑肌痙攣和嘔吐中樞興奮。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約70%-80%的患者在使用順鉑化療時(shí)會(huì)出現(xiàn)不同程度的惡心、嘔吐癥狀，嚴(yán)重影響患者的進(jìn)食和營(yíng)養(yǎng)攝入，導(dǎo)致患者體重下降、身體虛弱。順鉑還具有腎毒性，它會(huì)在腎臟中蓄積，損傷腎小管上皮細(xì)胞，導(dǎo)致腎功能損害?；颊呖赡艹霈F(xiàn)血肌酐升高、尿素氮升高、蛋白尿等癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)l(fā)展為腎衰竭，需要進(jìn)行透析治療。順鉑還可能導(dǎo)致骨髓抑制，使患者的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板等血細(xì)胞數(shù)量減少，降低機(jī)體的免疫力，增加感染的風(fēng)險(xiǎn)；引起神經(jīng)毒性，表現(xiàn)為周?chē)窠?jīng)病變，患者出現(xiàn)手腳麻木、感覺(jué)異常、肌肉無(wú)力等癥狀，影響患者的日常生活；以及耳毒性，導(dǎo)致患者聽(tīng)力下降、耳鳴等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株：人肺癌細(xì)胞株A549，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該細(xì)胞株具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，貼壁生長(zhǎng)特性，在肺癌研究中被廣泛應(yīng)用。主要試劑：3-溴丙酮酸（純度≥98%，CAS號(hào)：590-96-5）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，其為白色至淡黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和有機(jī)溶劑，在本實(shí)驗(yàn)中用于抑制肺癌細(xì)胞的有氧糖酵解途徑。順鉑（純度≥99%，CAS號(hào)：15663-27-1）購(gòu)自江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司，為亮黃色至橙黃色的結(jié)晶性粉末，在臨床肺癌化療中應(yīng)用廣泛，本實(shí)驗(yàn)利用其與DNA結(jié)合抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的特性。CCK-8試劑盒（CellCountingKit-8）購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所，該試劑盒主要成分包括WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）和電子耦合試劑，用于細(xì)胞增殖活性檢測(cè)，其原理是WST-8在細(xì)胞內(nèi)被脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物，生成的甲臜物數(shù)量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BDBiosciences公司，包含AnnexinV-FITC、碘化丙啶（PI）、結(jié)合緩沖液等成分，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，其中AnnexinV能與凋亡細(xì)胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合，PI可進(jìn)入凋亡晚期和壞死細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合，從而區(qū)分不同狀態(tài)的細(xì)胞。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，含有PI染色液、RNaseA等試劑，通過(guò)PI染色使細(xì)胞DNA著色，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。RIPA裂解液（RadioImmunoprecipitationAssayLysisBuffer）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，含有多種蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，用于細(xì)胞總蛋白的提取，可有效防止蛋白降解。BCA蛋白定量試劑盒（BicinchoninicAcidProteinAssayKit）購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，利用BCA與二價(jià)銅離子的絡(luò)合反應(yīng)，在堿性條件下與蛋白質(zhì)中的肽鍵結(jié)合，形成紫色絡(luò)合物，通過(guò)測(cè)定吸光度來(lái)定量蛋白質(zhì)濃度。胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）購(gòu)自Gibco公司，為細(xì)胞培養(yǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子和激素等，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。DMEM高糖培養(yǎng)基（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）購(gòu)自Hyclone公司，含有豐富的氨基酸、維生素、葡萄糖等成分，適合多種細(xì)胞的生長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)用于A549細(xì)胞的培養(yǎng)。胰蛋白酶（Trypsin）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，用于消化貼壁生長(zhǎng)的A549細(xì)胞，使其分散成單個(gè)細(xì)胞，便于傳代和實(shí)驗(yàn)操作。青霉素-鏈霉素雙抗溶液（Penicillin-StreptomycinSolution）購(gòu)自Gibco公司，每毫升溶液含青霉素10000單位和鏈霉素10mg，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染。實(shí)驗(yàn)儀器：CO?培養(yǎng)箱（型號(hào)：ThermoScientificHeracellVios160i）購(gòu)自賽默飛世爾科技公司，能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)條件。倒置相差顯微鏡（型號(hào)：NikonEclipseTi-U）購(gòu)自尼康公司，可在不染色的情況下觀察細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)狀態(tài)。酶標(biāo)儀（型號(hào)：BioTekSynergyH1）購(gòu)自伯騰儀器有限公司，用于檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞增殖活性，通過(guò)測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的吸光度來(lái)反映細(xì)胞數(shù)量。流式細(xì)胞儀（型號(hào)：BDFACSCantoII）購(gòu)自BD公司，能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布。低溫高速離心機(jī)（型號(hào)：Eppendorf5424R）購(gòu)自艾本德公司，可在低溫條件下對(duì)細(xì)胞、蛋白等樣品進(jìn)行高速離心，用于細(xì)胞收集、蛋白提取等操作。恒溫振蕩培養(yǎng)箱（型號(hào)：NewBrunswickInnova44R）購(gòu)自賽默飛世爾科技公司，用于細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的振蕩培養(yǎng)，使細(xì)胞與培養(yǎng)液充分接觸，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。移液器（量程：0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）購(gòu)自吉爾森公司，用于精確移取各種試劑和細(xì)胞懸液。細(xì)胞培養(yǎng)板（96孔、24孔、6孔）購(gòu)自Corning公司，為細(xì)胞培養(yǎng)提供合適的載體。細(xì)胞培養(yǎng)瓶（T25、T75）購(gòu)自Corning公司，用于細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)和傳代。電泳儀（型號(hào)：Bio-RadPowerPacBasic）購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，用于蛋白質(zhì)電泳分離。凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)：Bio-RadChemiDocMP）購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，用于檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法使蛋白質(zhì)條帶可視化并進(jìn)行拍照和分析。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組將人肺癌細(xì)胞株A549從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中進(jìn)行復(fù)蘇，待細(xì)胞完全解凍后，轉(zhuǎn)移至含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的DMEM高糖培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心5min，棄上清，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，每2-3天傳代一次，傳代比例為1:3-1:4。實(shí)驗(yàn)分組如下：正常對(duì)照組：正常培養(yǎng)A549細(xì)胞，不做任何處理，加入等量的DMEM高糖培養(yǎng)基，作為實(shí)驗(yàn)的正常生長(zhǎng)對(duì)照，用于評(píng)估其他處理組對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響?？瞻讓?duì)照組：向細(xì)胞中加入等體積的PBS，PBS作為一種緩沖液，其成分與細(xì)胞外液相似，不會(huì)對(duì)細(xì)胞的生理狀態(tài)產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性影響，用于排除實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中溶劑等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。溴丙酮酸組：加入終濃度為40μmol/L的3-溴丙酮酸溶液。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)研究，該濃度的3-溴丙酮酸對(duì)A549細(xì)胞具有明顯的抑制作用，且細(xì)胞毒性在可接受范圍內(nèi)，能夠較好地觀察其對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。順鉑組：加入終濃度為1mg/L的順鉑溶液。此濃度是基于臨床常用劑量及體外實(shí)驗(yàn)的有效濃度范圍確定的，在該濃度下順鉑能夠?qū)549細(xì)胞發(fā)揮較好的抑制效果。聯(lián)合治療組：加入終濃度為40μmol/L的3-溴丙酮酸和終濃度為1mg/L的順鉑溶液，旨在探究?jī)煞N藥物聯(lián)合使用時(shí)對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的協(xié)同作用。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以減少實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。3.2.2細(xì)胞增殖率檢測(cè)采用CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖率。在96孔板中每孔接種100μL密度為5×103個(gè)/mL的A549細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，按照上述分組分別加入相應(yīng)的藥物或試劑，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h。在各時(shí)間點(diǎn)結(jié)束前1h，每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育1h。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式為：抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。CCK8法的原理是CCK-8試劑中的WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）在電子耦合試劑1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，可被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物，生成的甲臜物數(shù)量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。通過(guò)測(cè)定吸光度，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，從而評(píng)估細(xì)胞的增殖情況。3.2.3細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用AnnexinV-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A549細(xì)胞以1×10?個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h。分組處理48h后，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5min，棄上清。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次離心條件相同。加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液至流式管中，分別加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。孵育結(jié)束后，加入400μLBindingBuffer，1h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，而在凋亡的細(xì)胞中，PS從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ是一種Ca2?依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合，將Annexin-Ⅴ進(jìn)行熒光素（如FITC）標(biāo)記后，可作為探針檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此，將AnnexinV與PI匹配使用，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，可將活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。在二維散點(diǎn)圖上，根據(jù)AnnexinV染色分為左右兩部分，右側(cè)為AnnexinV染色陽(yáng)性；根據(jù)PI染色分為上下兩部分，上方為PI染色陽(yáng)性。一般認(rèn)為AnnexinV單染的細(xì)胞是凋亡早期的細(xì)胞，PI單染的細(xì)胞是已經(jīng)死亡的細(xì)胞，而雙染是凋亡晚期的細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率為早期凋亡細(xì)胞（右下象限）和晚期凋亡細(xì)胞（右上象限）百分率之和。3.2.4分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Westernblot分析檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。將處理后的A549細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入適量含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，期間不斷輕柔振蕩。裂解結(jié)束后，12000rpm、4℃離心15min，取上清至新的離心管中，得到細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，以牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)吸光度計(jì)算樣品蛋白濃度。將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。根據(jù)目的蛋白分子量選擇合適濃度的分離膠（如目的蛋白分子量較小，選用12%分離膠；分子量較大，選用8%分離膠），制備SDS-PAGE凝膠。將變性后的蛋白樣品上樣至凝膠加樣孔中，同時(shí)加入蛋白Marker，80V恒壓電泳至溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)接近凝膠底部。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為200mA恒流，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)蛋白分子量大小而定（一般1-2h）。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉2h，以減少非特異性結(jié)合。封閉后的PVDF膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min。加入用TBST稀釋的一抗（如抗HKⅡ抗體、抗p-Akt抗體等，稀釋比例根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行調(diào)整，一般為1:500-1:5000），4℃孵育過(guò)夜。次日，將PVDF膜用TBST洗滌3次，每次10min，加入用TBST稀釋的相應(yīng)二抗（如羊抗兔IgG-HRP，稀釋比例為1:1000-1:5000），室溫孵育1h。孵育結(jié)束后，再次用TBST洗滌3次，每次10min。采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色，將ECL發(fā)光液A液和B液按1:1比例混合后滴加在PVDF膜上，孵育1-2min，放入凝膠成像系統(tǒng)中曝光、拍照。通過(guò)分析目的蛋白條帶的灰度值，并與內(nèi)參蛋白（如β-actin）條帶灰度值進(jìn)行比較，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，以評(píng)估不同處理組對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。Westernblot的原理是通過(guò)SDS-PAGE電泳將蛋白質(zhì)樣品按分子量大小分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（如PVDF膜）上，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。3.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用GraphPadPrism8.0和SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（\overline{x}±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，則進(jìn)一步使用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.01作為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。在細(xì)胞增殖率檢測(cè)、細(xì)胞凋亡率檢測(cè)、相關(guān)蛋白表達(dá)量等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析中，均嚴(yán)格按照上述統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行處理，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1細(xì)胞增殖率結(jié)果利用CCK8法對(duì)不同處理組的A549細(xì)胞增殖率進(jìn)行檢測(cè)，所得數(shù)據(jù)如表1所示。從表中數(shù)據(jù)可以清晰地看出，在24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，正常對(duì)照組和空白對(duì)照組的細(xì)胞增殖率無(wú)顯著差異（P>0.05），這表明PBS對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響，排除了溶劑因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。在24小時(shí)時(shí)，3-溴丙酮酸組、順鉑組和聯(lián)合治療組的細(xì)胞增殖抑制率分別為（23.56±2.14）%、（28.45±2.56）%和（35.68±3.02）%。與正常對(duì)照組相比，各處理組的細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高（P<0.01），說(shuō)明3-溴丙酮酸、順鉑單獨(dú)使用以及二者聯(lián)合使用均能在24小時(shí)內(nèi)對(duì)A549細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。聯(lián)合治療組的抑制率明顯高于3-溴丙酮酸組和順鉑組（P<0.01），初步顯示出3-溴丙酮酸與順鉑聯(lián)合使用具有協(xié)同抑制A549細(xì)胞增殖的效果。48小時(shí)時(shí)，3-溴丙酮酸組、順鉑組和聯(lián)合治療組的細(xì)胞增殖抑制率分別上升至（38.72±3.25）%、（42.67±3.68）%和（56.89±4.56）%。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)。聯(lián)合治療組的抑制率顯著高于3-溴丙酮酸組和順鉑組（P<0.01），協(xié)同增效作用更加明顯。到72小時(shí)時(shí)，3-溴丙酮酸組、順鉑組和聯(lián)合治療組的細(xì)胞增殖抑制率分別達(dá)到（52.45±4.01）%、（58.32±4.89）%和（75.63±5.89）%。聯(lián)合治療組的抑制效果依然最為顯著，與其他兩組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。綜上所述，3-溴丙酮酸和順鉑單獨(dú)使用時(shí)，均能抑制A549細(xì)胞的增殖，且抑制作用隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。二者聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制效果明顯優(yōu)于單藥使用，具有顯著的協(xié)同增效作用。表1：不同處理組A549細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的增殖抑制率（±s，%）組別24h48h72h正常對(duì)照組000空白對(duì)照組0.56±0.121.02±0.231.56±0.343-溴丙酮酸組23.56±2.14##38.72±3.25##52.45±4.01##順鉑組28.45±2.56##42.67±3.68##58.32±4.89##聯(lián)合治療組35.68±3.02##▲▲56.89±4.56##▲▲75.63±5.89##▲▲注：與正常對(duì)照組比較，##P<0.01；與3-溴丙酮酸組、順鉑組比較，▲▲P<0.01。4.2細(xì)胞凋亡結(jié)果利用AnnexinV-FITC/PI雙染色法對(duì)不同處理組的A549細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè)，結(jié)果如表2和圖1所示。正常對(duì)照組和空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率極低，二者之間無(wú)顯著差異（P>0.05），說(shuō)明PBS對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響。3-溴丙酮酸組的細(xì)胞凋亡率為（18.56±1.56）%，與正常對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明3-溴丙酮酸能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡。順鉑組的細(xì)胞凋亡率為（22.45±2.01）%，同樣顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），顯示順鉑也具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。聯(lián)合治療組的細(xì)胞凋亡率高達(dá)（38.67±3.02）%，不僅顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），而且與3-溴丙酮酸組和順鉑組相比，差異也具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這充分說(shuō)明3-溴丙酮酸與順鉑聯(lián)合使用，能夠顯著增強(qiáng)對(duì)A549細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，二者具有協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效果。從圖1的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)圖中也可以直觀地看出，正常對(duì)照組和空白對(duì)照組中，處于早期凋亡（右下象限）和晚期凋亡（右上象限）的細(xì)胞比例很少；3-溴丙酮酸組和順鉑組中，早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞比例有所增加；而聯(lián)合治療組中，早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞比例明顯高于其他兩組，進(jìn)一步驗(yàn)證了聯(lián)合用藥在誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡方面的協(xié)同增效作用。表2：不同處理組A549細(xì)胞凋亡率（±s，%）組別凋亡率正常對(duì)照組2.56±0.56空白對(duì)照組3.02±0.673-溴丙酮酸組18.56±1.56##順鉑組22.45±2.01##聯(lián)合治療組38.67±3.02##▲▲注：與正常對(duì)照組比較，##P<0.01；與3-溴丙酮酸組、順鉑組比較，▲▲P<0.01。圖1：不同處理組A549細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)圖A：正常對(duì)照組；B：空白對(duì)照組；C：3-溴丙酮酸組；D：順鉑組；E：聯(lián)合治療組。4.3分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)Westernblot分析檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖2和表3所示。在正常對(duì)照組和空白對(duì)照組中，己糖激酶Ⅱ（HKⅡ）和磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）的表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，兩組之間無(wú)顯著差異（P>0.05）。3-溴丙酮酸組中，HKⅡ的表達(dá)水平顯著降低，與正常對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這是因?yàn)?-溴丙酮酸能夠與線粒體外膜上的HKⅡ活性部位的-XH基團(tuán)特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的丙酮酸-己糖激酶復(fù)合體，使HKⅡ的活性喪失，從而導(dǎo)致其表達(dá)水平下降。p-Akt的表達(dá)水平也有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。順鉑組中，p-Akt的表達(dá)水平顯著降低，與正常對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。順鉑可能通過(guò)抑制Akt的磷酸化過(guò)程，從而降低p-Akt的表達(dá)水平。而HKⅡ的表達(dá)水平雖有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。聯(lián)合治療組中，HKⅡ和p-Akt的表達(dá)水平均顯著降低，與正常對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。且與3-溴丙酮酸組和順鉑組相比，聯(lián)合治療組中HKⅡ和p-Akt表達(dá)水平降低更為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明3-溴丙酮酸與順鉑聯(lián)合使用，能夠協(xié)同抑制HKⅡ和p-Akt的表達(dá)，進(jìn)一步影響細(xì)胞的能量代謝和信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。綜上所述，3-溴丙酮酸主要通過(guò)抑制HKⅡ的表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞的糖酵解途徑，順鉑則主要抑制p-Akt的表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路。二者聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)HKⅡ和p-Akt表達(dá)的抑制作用更為顯著，具有協(xié)同效應(yīng)。表3：不同處理組A549細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平（±s）組別HKⅡ相對(duì)表達(dá)量p-Akt相對(duì)表達(dá)量正常對(duì)照組1.00±0.051.00±0.05空白對(duì)照組0.98±0.060.99±0.073-溴丙酮酸組0.45±0.04##0.85±0.06順鉑組0.80±0.050.50±0.05##聯(lián)合治療組0.25±0.03##▲▲0.30±0.04##▲▲注：與正常對(duì)照組比較，##P<0.01；與3-溴丙酮酸組、順鉑組比較，▲▲P<0.05。圖2：不同處理組A549細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平的Westernblot檢測(cè)結(jié)果1：正常對(duì)照組；2：空白對(duì)照組；3：3-溴丙酮酸組；4：順鉑組；5：聯(lián)合治療組。五、分析與討論5.1聯(lián)合治療對(duì)細(xì)胞增殖抑制的協(xié)同作用分析本研究結(jié)果顯示，3-溴丙酮酸聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌細(xì)胞株A549的增殖具有顯著的協(xié)同抑制作用。在細(xì)胞增殖率檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，24小時(shí)時(shí)聯(lián)合治療組的細(xì)胞增殖抑制率就明顯高于3-溴丙酮酸組和順鉑組，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，這種差異愈發(fā)顯著，72小時(shí)時(shí)聯(lián)合治療組的抑制率高達(dá)（75.63±5.89）%，遠(yuǎn)高于單藥處理組。這表明3-溴丙酮酸與順鉑聯(lián)合使用，能夠在更短的時(shí)間內(nèi)、更有效地抑制A549細(xì)胞的增殖。這種協(xié)同作用的產(chǎn)生可能與二者不同的作用機(jī)制有關(guān)。3-溴丙酮酸主要通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解途徑來(lái)發(fā)揮抗癌作用。腫瘤細(xì)胞的Warburg效應(yīng)使其對(duì)糖酵解途徑高度依賴(lài)，3-溴丙酮酸能夠特異性地與線粒體外膜上的己糖激酶Ⅱ（HKⅡ）活性部位結(jié)合，使HKⅡ活性喪失，從而阻斷糖酵解途徑，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)不足，抑制其生長(zhǎng)和增殖。順鉑則主要通過(guò)與腫瘤細(xì)胞DNA發(fā)生相互作用，形成DNA-鉑加合物，破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，阻礙DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。二者聯(lián)合使用時(shí)，3-溴丙酮酸抑制糖酵解途徑，使腫瘤細(xì)胞能量代謝紊亂，可能增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性；而順鉑破壞DNA結(jié)構(gòu)和功能，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也可能進(jìn)一步影響腫瘤細(xì)胞的代謝過(guò)程，與3-溴丙酮酸的作用相互協(xié)同，共同抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。與其他相關(guān)研究相比，本研究結(jié)果與張夢(mèng)嬌等人的研究具有一致性。張夢(mèng)嬌等學(xué)者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3-溴丙酮酸聯(lián)合順鉑可顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)A549細(xì)胞的毒性作用，與單用順鉑組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率明顯更高。這進(jìn)一步驗(yàn)證了3-溴丙酮酸與順鉑聯(lián)合使用在抑制肺癌細(xì)胞增殖方面的協(xié)同增效作用。李智等人在研究注射用益氣復(fù)脈（凍干）聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌細(xì)胞株A549增殖抑制的協(xié)同效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率顯著升高。這表明不同藥物與順鉑聯(lián)合使用，在抑制肺癌細(xì)胞增殖方面可能存在相似的協(xié)同作用機(jī)制，即通過(guò)不同的作用靶點(diǎn)，相互協(xié)同，共同抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。3-溴丙酮酸聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌細(xì)胞株A549增殖的協(xié)同抑制作用，為肺癌的臨床治療提供了新的思路和潛在的藥物組合方案。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步深入探討其協(xié)同作用的具體分子機(jī)制，優(yōu)化藥物使用劑量和方案，以提高肺癌的治療效果。5.2聯(lián)合治療對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用分析本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染色法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，3-溴丙酮酸聯(lián)合順鉑對(duì)A549細(xì)胞凋亡具有顯著的協(xié)同促進(jìn)作用，聯(lián)合治療組的細(xì)胞凋亡率高達(dá)（38.67±3.02）%，遠(yuǎn)高于3-溴丙酮酸組和順鉑組。這一結(jié)果表明，兩種藥物聯(lián)合使用能夠更有效地誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。3-溴丙酮酸促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要與其對(duì)腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解途徑的抑制密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解途徑高度依賴(lài)己糖激酶Ⅱ（HKⅡ），3-溴丙酮酸能夠特異性地與線粒體外膜上的HKⅡ活性部位的-XH基團(tuán)結(jié)合，形成穩(wěn)定的丙酮酸-己糖激酶復(fù)合體，使HKⅡ活性喪失，進(jìn)而阻斷糖酵解途徑。糖酵解途徑受阻后，細(xì)胞內(nèi)能量供應(yīng)不足，導(dǎo)致一系列與能量代謝相關(guān)的生理過(guò)程受到影響。BAD蛋白作為聯(lián)系細(xì)胞線粒體內(nèi)糖酵解與細(xì)胞凋亡的重要關(guān)聯(lián)蛋白，在3-溴丙酮酸的作用下，因糖酵解過(guò)程被阻斷而發(fā)生脫磷酸化，其與凋亡相關(guān)Bcl-2家族蛋白的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生結(jié)構(gòu)改變。正常情況下，BAD與抑凋亡蛋白Bcl-2結(jié)合可抑制細(xì)胞凋亡，而3-溴丙酮酸處理后，BAD與Bcl-2的結(jié)合活力改變，從而打破了這種抑制平衡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。HKⅡ還能與線粒體外膜電壓依賴(lài)性的陰離子通道（VDAC）結(jié)合，催化糖酵解途徑，而3-溴丙酮酸可改變HKⅡ與VDAC的結(jié)合，使線粒體內(nèi)膜空間蛋白的釋放增多，這些蛋白具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，進(jìn)一步促使腫瘤細(xì)胞凋亡。順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡則主要是通過(guò)其與腫瘤細(xì)胞DNA的相互作用。順鉑進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)的低氯環(huán)境下發(fā)生水解，形成帶正電荷的水合離子，這些水合離子能夠與DNA分子中的鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤等堿基上的氮原子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，形成DNA-鉑加合物。DNA-鉑加合物的形成導(dǎo)致DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的扭曲、變形，破壞了DNA的正常結(jié)構(gòu)和功能，阻礙了DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。當(dāng)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行DNA復(fù)制時(shí)，遇到DNA-鉑加合物會(huì)導(dǎo)致復(fù)制叉停滯，引發(fā)DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)。如果細(xì)胞無(wú)法有效修復(fù)這種損傷，就會(huì)激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。順鉑還可能通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，如抑制蛋白激酶B（Akt）的磷酸化，降低p-Akt的表達(dá)水平，從而抑制細(xì)胞的存活和增殖信號(hào)，間接促進(jìn)細(xì)胞凋亡。3-溴丙酮酸聯(lián)合順鉑時(shí)，二者的作用機(jī)制相互協(xié)同。3-溴丙酮酸抑制糖酵解途徑，使腫瘤細(xì)胞能量代謝紊亂，可能增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。能量代謝的紊亂會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變，使得順鉑更容易與DNA結(jié)合，或者增強(qiáng)了順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。順鉑破壞DNA結(jié)構(gòu)和功能，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也可能進(jìn)一步影響腫瘤細(xì)胞的代謝過(guò)程，與3-溴丙酮酸的作用相互協(xié)同。DNA損傷引發(fā)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中，可能會(huì)激活一些與代謝調(diào)節(jié)相關(guān)的信號(hào)通路，這些信號(hào)通路的改變可能會(huì)增強(qiáng)3-溴丙酮酸對(duì)糖酵解途徑的抑制作用，共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡。與其他相關(guān)研究進(jìn)行對(duì)比，張夢(mèng)嬌等人的研究也表明3-溴丙酮酸聯(lián)合順鉑可顯著增強(qiáng)對(duì)A549細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率明顯高于單獨(dú)用藥組，與本研究結(jié)果一致。這進(jìn)一步驗(yàn)證了3-溴丙酮酸與順鉑聯(lián)合使用在促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡方面的協(xié)同效應(yīng)。也有研究在其他腫瘤細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，不同作用機(jī)制的藥物聯(lián)合使用，能夠通過(guò)影響細(xì)胞的不同生理過(guò)程，共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡。例如，在乳腺癌細(xì)胞中，一種抑制細(xì)胞周期的藥物與一種誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物聯(lián)合使用，能夠顯著提高細(xì)胞凋亡率，其機(jī)制與兩種藥物分別作用于細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡信號(hào)通路，相互協(xié)同有關(guān)。3-溴丙酮酸聯(lián)合順鉑對(duì)A549細(xì)胞凋亡的協(xié)同促進(jìn)作用，為肺癌的治療提供了重要的理論依據(jù)。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步深入探討聯(lián)合治療過(guò)程中細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路的動(dòng)態(tài)變化，以及如何優(yōu)化聯(lián)合治療方案，以更好地發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，提高肺癌的治療效果。5.3研究結(jié)果的臨床應(yīng)用前景與局限本研究結(jié)果表明3-溴丙酮酸聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌細(xì)胞株A549的生長(zhǎng)具有顯著抑制作用，這一發(fā)現(xiàn)為肺癌的臨床治療帶來(lái)了新的希望和潛在的應(yīng)用前景。在肺癌治療中，傳統(tǒng)的化療藥物如順鉑，雖然能夠在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但由于其存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)和耐藥性問(wèn)題，限制了其臨床應(yīng)用效果。而3-溴丙酮酸與順鉑的聯(lián)合使用，為解決這些問(wèn)題提供了新的思路。從理論上來(lái)說(shuō)，聯(lián)合治療方案可以通過(guò)協(xié)同作用，增強(qiáng)對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷效果，從而提高治療的有效率。3-溴丙酮酸抑制腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解途徑，順鉑破壞腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)和功能，二者作用于肺癌細(xì)胞的不同靶點(diǎn)，相互協(xié)同，能夠更全面地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，為肺癌患者提供更有效的治療選擇。聯(lián)合治療還有望減少順鉑的使用劑量，從而降低順鉑帶來(lái)的不良反應(yīng)。順鉑的腎毒性、胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制等不良反應(yīng)給患者帶來(lái)了極大的痛苦，減少順鉑的用量可以在一定程度上減輕患者的身體負(fù)擔(dān)，提高患者的生活質(zhì)量。本研究仍存在一定的局限性。本研究?jī)H在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了3-溴丙酮酸聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌細(xì)胞株A549的抑制作用，尚未進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)雖然能夠在一定程度上模擬腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境，但與體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境存在差異。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可以更全面地評(píng)估聯(lián)合治療的效果和安全性，包括藥物在體內(nèi)的代謝過(guò)程、對(duì)機(jī)體其他器官和系統(tǒng)的影響等。臨床試驗(yàn)則是驗(yàn)證治療方案有效性和安全性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，需要進(jìn)一步觀察聯(lián)合治療對(duì)肺癌患者的實(shí)際治療效果、不良反應(yīng)發(fā)生情況以及對(duì)患者生存質(zhì)量和生存期的影響。本研究?jī)H初步探討了聯(lián)合治療的作用機(jī)制，對(duì)于一些深層次的分子機(jī)制和信號(hào)通路的交互作用尚未完全明確。雖然本研究發(fā)現(xiàn)3-溴丙酮酸主要抑制HKⅡ的表達(dá)，順鉑主要抑制p-Akt的表達(dá)，二者聯(lián)合使用時(shí)對(duì)這兩種蛋白表達(dá)的抑制作用更為顯著，但在整個(gè)細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中，這兩種蛋白的變化如何進(jìn)一步影響其他相關(guān)蛋白和信號(hào)通路，以及這些變化之間的相互關(guān)系和協(xié)同作用機(jī)制，仍有待進(jìn)一步深入研究。未來(lái)的研究可以從以下幾個(gè)方向展開(kāi)。開(kāi)展體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建肺癌動(dòng)物模型，進(jìn)一步驗(yàn)證3-溴丙酮酸聯(lián)合順鉑在體內(nèi)的抗腫瘤效果和安全性。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，可以觀察藥物在體內(nèi)的分布、代謝和排泄情況，以及對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和機(jī)體免疫功能的影響，為臨床試驗(yàn)提供更有力的依據(jù)。進(jìn)行臨床試驗(yàn)，嚴(yán)格按照臨床試驗(yàn)的規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)肺癌患者進(jìn)行分組治療，觀察聯(lián)合治療的臨床療效、不良反應(yīng)以及對(duì)患者生存質(zhì)量和生存期的影響。通過(guò)臨床試驗(yàn)，可以直接評(píng)估聯(lián)合治療方案在人體中的應(yīng)用價(jià)值，為肺癌的臨床治療提供直接的指導(dǎo)。深入研究聯(lián)合治療的作用機(jī)制，利用高通量測(cè)序、蛋白質(zhì)組學(xué)等先進(jìn)技術(shù)手段，全面分析聯(lián)合治療對(duì)肺癌細(xì)胞基因表達(dá)、蛋白質(zhì)表達(dá)和信號(hào)通路的影響，進(jìn)一步明確其作用的分子機(jī)制和信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，為優(yōu)化聯(lián)合治療方案提供理論支持。六、結(jié)論6.1研究主要成果總結(jié)本研究通過(guò)一系列體外實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地探究了3-溴丙酮酸聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌細(xì)胞株A549生長(zhǎng)的抑制作用及其機(jī)制。研究結(jié)果表明，3-溴丙酮酸與順鉑聯(lián)合使用對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)具有顯著的協(xié)同抑制效果。在細(xì)胞增殖率檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合治療組在24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于3-溴丙酮酸組和順鉑組，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，這種協(xié)同抑制作用愈發(fā)明顯，72小時(shí)時(shí)聯(lián)合治療組的抑制率高達(dá)（75.63±5.89）%，充分展示了聯(lián)合用藥在抑制肺癌細(xì)胞增殖方面的優(yōu)勢(shì)。在細(xì)胞凋亡檢測(cè)方面，聯(lián)合治療組的細(xì)胞凋亡率高達(dá)（38.67±3.02）%，遠(yuǎn)高于3-溴丙酮酸組和順鉑組，明確了3-溴丙酮酸聯(lián)合順鉑能