融合基因檢測的最終解決方案——NanoporeDirectRNASequencing解鎖融合基因檢測新范式一、引言在精準(zhǔn)醫(yī)療的加速推動(dòng)下，融合基因正成為連接基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用的橋梁。作為多種惡性腫瘤的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，融合基因不僅揭示著細(xì)胞命運(yùn)被改寫的分子起點(diǎn)，也深刻影響著疾病的診斷分型、預(yù)后評估乃至靶向治療的選擇。越來越多的研究和指南表明，融合基因已從科學(xué)概念走向了臨床決策的中心。然而，識別它們，遠(yuǎn)不如命名它們那么簡單。我們是否曾被令人困惑的檢測結(jié)果阻滯判斷？是否曾因一個(gè)結(jié)構(gòu)不清、異構(gòu)體不明的融合轉(zhuǎn)錄本而在功能研究中裹足不前？在現(xiàn)有檢測技術(shù)的邊界內(nèi)，我們往往只能“猜測”融合，而無法“看清”融合。這正是當(dāng)前融合基因檢測領(lǐng)域的最大困境——不是沒有數(shù)據(jù)，而是缺乏結(jié)構(gòu)的真相。NanoporeDirectRNAsequencing（DRS），以其原始讀段跨越融合位點(diǎn)、捕獲完整轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)的能力，為融合基因的精準(zhǔn)解析提供了前所未有的解決方案。它不僅讓融合“被看見”，更讓結(jié)構(gòu)“可驗(yàn)證”，是融合基因研究邁入“全景化”和“真實(shí)可讀”時(shí)代的重要起點(diǎn)。二、融合難見真容：傳統(tǒng)檢測手段的局限與盲區(qū)融合基因，作為兩段原本不相鄰的基因序列融合而成的產(chǎn)物，在癌癥的發(fā)生發(fā)展、診斷、治療指導(dǎo)和預(yù)后判斷中扮演著至關(guān)重要的角色。它們的出現(xiàn)往往伴隨著細(xì)胞功能的異常，可能驅(qū)動(dòng)腫瘤生長，或賦予癌細(xì)胞對特定治療藥物的敏感性或耐藥性。因此，精準(zhǔn)地檢測和解析融合基因，對于推動(dòng)癌癥研究和實(shí)現(xiàn)個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療具有舉足輕重的作用。然而，盡管融合基因的重要性不言而喻，但其檢測之路卻荊棘密布，現(xiàn)有的主流檢測技術(shù)在面對復(fù)雜多變的融合基因時(shí)，普遍暴露出諸多痛點(diǎn)與“盲區(qū)”：短讀長測序的拼接難題：信息碎片化帶來的高風(fēng)險(xiǎn)目前，以二代測序（NGS）為代表的短讀長測序技術(shù)是融合基因檢測的常用手段。但顧名思義，這些技術(shù)生成的序列片段通常較短。當(dāng)融合位點(diǎn)恰好位于短讀長的末端或需要跨越較長的內(nèi)含子區(qū)域時(shí)，就如同將一幅巨大的拼圖拆解成無數(shù)微小的碎片，難以準(zhǔn)確地將融合位點(diǎn)兩側(cè)的序列拼接起來。這種信息碎片化極易導(dǎo)致：高假陽性風(fēng)險(xiǎn)：由于拼接算法的復(fù)雜性和序列重復(fù)區(qū)域的存在，可能出現(xiàn)“拼接錯(cuò)誤”，將原本不融合的序列誤判為融合基因，從而誤導(dǎo)后續(xù)的臨床決策或研究方向。高假陰性風(fēng)險(xiǎn)：對于表達(dá)量較低的融合基因、含有復(fù)雜結(jié)構(gòu)（如大片段插入或缺失）的融合轉(zhuǎn)錄本，或融合位點(diǎn)位于測序盲區(qū)的，短讀長測序可能因覆蓋不足或無法有效拼接而“漏檢”，使患者錯(cuò)失潛在的靶向治療機(jī)會。無法捕獲完整轉(zhuǎn)錄本信息：“管中窺豹”的局限性傳統(tǒng)檢測方法往往只能聚焦于融合基因的斷裂點(diǎn)或融合點(diǎn)，而無法提供融合轉(zhuǎn)錄本的完整外顯子構(gòu)成、剪接異構(gòu)體信息，甚至無法區(qū)分同一基因融合點(diǎn)的不同剪接形式。這種“管中窺豹”式的檢測，使得我們難以全面理解融合基因的：真實(shí)結(jié)構(gòu)：僅僅知道融合點(diǎn)不足以描繪融合基因的全貌，其上下游外顯子的排列、是否存在可變剪接等細(xì)節(jié)都對融合蛋白的功能產(chǎn)生關(guān)鍵影響。生物學(xué)功能：缺乏完整的轉(zhuǎn)錄本信息，就難以準(zhǔn)確推斷融合基因的實(shí)際功能，阻礙了對致病機(jī)制的深入探索。潛在治療靶點(diǎn)：融合轉(zhuǎn)錄本的完整結(jié)構(gòu)信息對于設(shè)計(jì)特異性靶向藥物、評估藥物敏感性至關(guān)重要。其他方法的瓶頸：特異性與通量的雙重挑戰(zhàn)除了短讀長測序的固有缺陷，其他一些常用檢測方法也存在各自的局限性：RT-PCR和FISH：這些方法需要預(yù)設(shè)探針，意味著它們只能檢測已知的融合類型，對于發(fā)現(xiàn)未知或罕見融合基因則無能為力。此外，它們的通量相對較低，難以實(shí)現(xiàn)高效率、全景式的融合基因篩查。文庫制備偏差：大部分基于RNA的測序方法都涉及到逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增步驟。這些步驟可能引入序列偏好性或擴(kuò)增偏差，導(dǎo)致對原始RNA分子豐度的不準(zhǔn)確評估，進(jìn)一步影響融合基因的檢出和定量。面對這些挑戰(zhàn)，現(xiàn)有的融合基因檢測技術(shù)急需一次革新，能夠真正實(shí)現(xiàn)對融合轉(zhuǎn)錄本的精準(zhǔn)、全面、無偏倚解析。三、“長讀長，真融合”：DRS打開全景式結(jié)構(gòu)識別通道融合基因檢測之所以難，并不僅僅是因?yàn)樗鼈兿∮谢蚪Y(jié)構(gòu)復(fù)雜，而是因?yàn)槲覀內(nèi)鄙僖环N可以在單分子水平讀取完整融合轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)的技術(shù)。簡稱DRS以其天然長讀長、無需逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的測序方式，為破解這一難題提供了全新思路。與傳統(tǒng)方法需要重建拼接轉(zhuǎn)錄本不同，DRS直接讀取RNA分子的原始序列，通過單條讀段橫跨融合位點(diǎn)，不依賴拼接算法和預(yù)設(shè)假設(shè)，從而在結(jié)構(gòu)還原的完整性和準(zhǔn)確性上，具有無法比擬的優(yōu)勢。原始長讀段直接跨越融合位點(diǎn)：還原真實(shí)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵DRS技術(shù)的核心優(yōu)勢在于其“全分子讀取”能力。一條reads即為一條天然poly(A)+RNA（即帶有多腺苷酸尾的成熟mRNA）的原始序列，讀長可達(dá)數(shù)千堿基，可以完整跨越融合位點(diǎn)及其上下游多個(gè)外顯子區(qū)域。這種“所見即所得”的數(shù)據(jù)模式，使融合基因的識別不再依賴間接推斷，而是直接觀察。與短讀長技術(shù)相比，DRS在以下幾個(gè)方面實(shí)現(xiàn)了本質(zhì)性突破：消除拼接誤差：傳統(tǒng)短讀長依賴拼接算法將斷裂的reads重構(gòu)成融合結(jié)構(gòu)，常因重復(fù)序列、低質(zhì)量拼接點(diǎn)或算法假設(shè)不足而產(chǎn)生假陽性。而DRS以物理連續(xù)的方式讀取整個(gè)融合轉(zhuǎn)錄本，天然避免拼接錯(cuò)誤。保留上下游結(jié)構(gòu)信息：不僅能夠定位融合點(diǎn)，還能捕獲其前后完整的外顯子組成和剪接變異，如是否存在外顯子跳躍、內(nèi)含子保留、非典型連接等，提供結(jié)構(gòu)層面的全景視圖。支持復(fù)雜融合識別：對于涉及大段插入、缺失、反向連接甚至非編碼區(qū)域的復(fù)雜融合結(jié)構(gòu)，DRS同樣具備強(qiáng)大的解析能力，顯著提升對非典型、復(fù)雜或新型融合的發(fā)現(xiàn)概率。異構(gòu)體解析能力：從“是否融合”到“融合了什么”融合基因往往不僅有一個(gè)版本。由于剪接調(diào)控的多樣性，一個(gè)融合事件可能產(chǎn)生多個(gè)異構(gòu)體（isoforms），不同異構(gòu)體間的功能差異可能非常顯著，甚至決定其是否具有致癌活性或是否構(gòu)成藥物靶點(diǎn)。傳統(tǒng)方法由于讀長受限，難以區(qū)分這些異構(gòu)體，常常只報(bào)告融合事件本身，無法進(jìn)一步解析其結(jié)構(gòu)構(gòu)成。而DRS可在單分子水平上直接讀取每一個(gè)融合轉(zhuǎn)錄本的完整剪接形式：是否包含兩個(gè)基因的啟動(dòng)外顯子？是否發(fā)生了外顯子跳躍或插入？是否包含3′UTR差異或poly(A)尾變化？這一能力使DRS不僅能回答“是否發(fā)生融合”，還能進(jìn)一步解答“融合了什么、怎么融合、融合后表達(dá)的是什么”，為融合功能研究與靶向開發(fā)提供關(guān)鍵基礎(chǔ)。面向低豐度與復(fù)雜背景樣本：保持高捕獲率與低偏倚在真實(shí)樣本中，許多具有潛在臨床意義的融合基因表達(dá)量極低，或只在特定細(xì)胞群體中表達(dá)。短讀長測序往往因覆蓋深度不足而漏檢，或因算法過濾機(jī)制而被自動(dòng)舍棄。DRS天然具備以下優(yōu)勢：單分子信號：即使只存在極少數(shù)融合轉(zhuǎn)錄本，只要被測到，就能以一條reads完整保留；無需擴(kuò)增：避免了低表達(dá)轉(zhuǎn)錄本在PCR步驟中被稀釋或擴(kuò)增偏倚的風(fēng)險(xiǎn)；原始豐度保留：由于沒有逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增過程，DRS所觀測的表達(dá)量更接近真實(shí)生物學(xué)狀態(tài)，有利于進(jìn)行準(zhǔn)確的融合定量分析。此外，DRS還保留了每條RNA分子的天然修飾狀態(tài)與poly(A)尾信息，為下游的功能研究和穩(wěn)定性判斷提供了更多維度的數(shù)據(jù)支持。從測序到機(jī)制推斷：開啟融合研究新路徑融合基因的功能不僅取決于其結(jié)構(gòu)是否存在，更取決于其剪接形式、翻譯能力、修飾狀態(tài)及表達(dá)豐度等多種因素。而這些變量，正是傳統(tǒng)方法無法全面揭示的。DRS的出現(xiàn)，為我們提供了一種一站式融合檢測與機(jī)制推斷平臺：檢出融合事件；分辨異構(gòu)體結(jié)構(gòu)；評估其表達(dá)活躍度；揭示修飾與穩(wěn)定性變化。這種從“看見結(jié)構(gòu)”到“理解功能”的跨越，正是融合基因研究邁向精準(zhǔn)與轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵一步。四、實(shí)錘在手：來自前沿研究與真實(shí)數(shù)據(jù)的驗(yàn)證4.1構(gòu)建完整融合轉(zhuǎn)錄本：DirectRNA測序超越短讀長的核心優(yōu)勢短讀長RNA測序在融合基因檢測中具有覆蓋廣、高通量的優(yōu)勢，然而其最大限制在于無法重構(gòu)融合轉(zhuǎn)錄本的完整結(jié)構(gòu)，僅能提供融合斷點(diǎn)的信息，難以解析融合事件的剪接異構(gòu)體。相比之下，NanoporeDirectRNA測序憑借其長讀長、無擴(kuò)增、單分子測序的特性，能夠跨越整個(gè)融合區(qū)間，直接描繪融合基因的全貌。在2025年發(fā)表于NatureMethods的項(xiàng)目研究中[1]，研究團(tuán)隊(duì)對包括乳腺癌MCF7在內(nèi)的7個(gè)人類細(xì)胞系，使用NanoporeDirectRNA測序開展系統(tǒng)性評估。在融合基因識別方面，研究者共識別出106個(gè)融合基因，其中79個(gè)為已知事件或在短讀長數(shù)據(jù)中也有發(fā)現(xiàn)。為了驗(yàn)證檢測的準(zhǔn)確性，他們選取了MCF7細(xì)胞中的12個(gè)融合基因，利用PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證，全部獲得成功驗(yàn)證，證明DRS在融合事件識別方面具有高度的可信度。更具意義的是，該研究強(qiáng)調(diào)DRS不僅可以發(fā)現(xiàn)融合事件，還能夠重構(gòu)完整的融合轉(zhuǎn)錄本。在每個(gè)融合基因中，DRS平均檢測到了兩個(gè)由full-splice-matchreads支持的異構(gòu)體，這些讀段完整覆蓋了融合轉(zhuǎn)錄本的所有外顯子邊界。這一能力使研究者得以揭示出融合基因上下游結(jié)構(gòu)的多樣性，為理解其功能調(diào)控和蛋白翻譯潛力提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。而這些結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，在短讀長RNA測序中則往往因拼接不完整或reads不連續(xù)而被遺漏。此外，DRS數(shù)據(jù)中也檢測到了融合事件兩側(cè)的野生型（未融合）5′和3′基因的完整轉(zhuǎn)錄本，意味著在一次測序中，研究者便能同時(shí)獲取融合與非融合狀態(tài)的全長表達(dá)信息。這種“一步到位”的數(shù)據(jù)獲取方式，不僅提高了研究效率，也為轉(zhuǎn)錄本水平的融合表達(dá)定量和功能推斷提供了前所未有的便利。綜上所述，這項(xiàng)研究充分展示了NanoporeDirectRNA測序在融合結(jié)構(gòu)重構(gòu)能力方面相較短讀長測序的顯著優(yōu)勢。這種能力使得融合基因的檢測從“是否存在”提升到了“結(jié)構(gòu)全貌+表達(dá)異構(gòu)體+功能推斷”的新層次，為精準(zhǔn)醫(yī)療中的融合基因分析打開了全新窗口。圖1長讀RNA序列數(shù)據(jù)檢測到的融合基因熱圖4.2融合事件的動(dòng)態(tài)表達(dá)：DirectRNA測序同時(shí)提供結(jié)構(gòu)與定量信息DirectRNA測序不僅具備構(gòu)建融合基因完整結(jié)構(gòu)的能力，更可在原始長讀段的基礎(chǔ)上提供每條融合轉(zhuǎn)錄本的真實(shí)表達(dá)量，為融合事件的動(dòng)態(tài)調(diào)控研究打開了新的窗口。在一項(xiàng)發(fā)表于NucleicAcidsResearch的研究中，Schiksnis等人應(yīng)用NanoporeDirectRNA測序技術(shù)，系統(tǒng)分析了秀麗隱桿線蟲在衰老過程中的轉(zhuǎn)錄組變化，成功識別出多個(gè)具有明確表達(dá)量的融合轉(zhuǎn)錄本，并通過RT-PCR和Sanger測序進(jìn)行驗(yàn)證[2]。研究者利用了LongGF工具，在衰老過程的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)篩查融合事件，識別出一批表達(dá)量隨時(shí)間變化而波動(dòng)的融合轉(zhuǎn)錄本，包括來自不同染色體（II與IV）的C18H9.6與clec-173的跨染色體融合。通過時(shí)間序列分析，研究者發(fā)現(xiàn)這些融合事件具有明確的表達(dá)趨勢，提示其可能參與衰老過程中的基因調(diào)控機(jī)制。這一研究展示了DirectRNA-seq在融合基因檢測中的一個(gè)獨(dú)特能力：不僅能發(fā)現(xiàn)融合，還能“看到”融合的表達(dá)動(dòng)態(tài)。相比依賴拼接組裝的短讀長技術(shù)，DRS在不犧牲結(jié)構(gòu)完整性的前提下，直接提供融合異構(gòu)體的表達(dá)量信息，為探索融合事件的調(diào)控邏輯和生物學(xué)功能提供了更具信度的支持。圖2DRS檢測融合基因表達(dá)量隨時(shí)間變化4.3超越邊界，拓展認(rèn)知：DRS賦能新型融合基因發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)短讀長測序在融合基因檢測中，往往受限于對已知基因邊界的依賴，難以有效發(fā)現(xiàn)與重復(fù)序列或轉(zhuǎn)座元件相關(guān)的復(fù)雜融合事件，而這些正是基因組變異和疾病機(jī)制中不可忽視的一部分。DirectRNA測序憑借其無偏倚的長讀長特性，展現(xiàn)了在發(fā)現(xiàn)新型和非典型融合轉(zhuǎn)錄本方面的卓越能力，極大地拓展了融合基因研究的邊界。在2021年發(fā)表于《HumanMolecularGenetics》的研究中[3]，研究團(tuán)隊(duì)通過NanoporeDRS，深入分析了DUX4基因活化的人肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。值得注意的是，該研究專門關(guān)注了與LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（LTRretrotransposons）相關(guān)的融合轉(zhuǎn)錄本，這類融合因其重復(fù)序列的特性，是短讀長測序的傳統(tǒng)“盲區(qū)”和分析難點(diǎn)。DRS的數(shù)據(jù)清晰地揭示了DUX4基因與附近LTR元件（如HERV-K、LITR18A）形成的新型融合轉(zhuǎn)錄本。這些融合不僅包括DUX4與LTR元件的直接融合，還捕獲了這些融合轉(zhuǎn)錄本的多樣化剪接異構(gòu)體。例如，研究者發(fā)現(xiàn)DUX4與多個(gè)不同的LTR元件（如LTR69A、LTR79等）都可以形成融合，并且這些融合轉(zhuǎn)錄本內(nèi)部存在復(fù)雜的選擇性剪接事件，導(dǎo)致DUX4的不同外顯子被納入到融合產(chǎn)物中，產(chǎn)生多種可能的功能性變體。這項(xiàng)研究充分證明，DirectRNA測序能夠：突破重復(fù)序列障礙：傳統(tǒng)短讀長測序在重復(fù)序列區(qū)域的精確比對和拼接面臨巨大挑戰(zhàn)，而DRS的超長讀長能夠完整跨越這些重復(fù)序列區(qū)域，清晰地識別出與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子等重復(fù)元件相關(guān)的融合事件，避免了因重復(fù)序列導(dǎo)致的錯(cuò)誤比對和漏檢。發(fā)現(xiàn)非典型融合模式：DRS不依賴于預(yù)設(shè)的基因邊界，使其能夠發(fā)現(xiàn)任何兩個(gè)轉(zhuǎn)錄片段之間的融合，包括基因與基因間區(qū)域、重復(fù)序列或非編碼RNA之間的融合，從而揭示了基因組內(nèi)更為廣泛和復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄重排事件。解析新型剪接異構(gòu)體：DRS不僅能發(fā)現(xiàn)全新的融合位點(diǎn)，還能進(jìn)一步解析這些新型融合轉(zhuǎn)錄本內(nèi)部的復(fù)雜剪接模式，為理解其潛在功能和生物學(xué)意義提供了寶貴線索。這項(xiàng)前沿研究強(qiáng)有力地證明，NanoporeDirectRNA測序不僅僅是已知融合基因檢測的優(yōu)化工具，更是發(fā)現(xiàn)未知、解析復(fù)雜新型融合轉(zhuǎn)錄本的強(qiáng)大利器。它為我們打開了探索基因組“暗物質(zhì)”中融合事件的全新窗口，對于理解疾病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新型生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有深遠(yuǎn)意義。圖3DRS發(fā)現(xiàn)新融合基因示例4.4復(fù)雜結(jié)構(gòu)融合基因的識別能力：DRS揭示跨越多個(gè)基因的融合轉(zhuǎn)錄本在基因組的復(fù)雜世界里，融合事件并非總是簡單的兩基因拼接。一些更為復(fù)雜的融合轉(zhuǎn)錄本可能橫跨多個(gè)不連續(xù)的基因座，形成傳統(tǒng)短讀長測序難以觸及的“多基因串聯(lián)融合”或“跳躍式融合”。這種復(fù)雜性常常導(dǎo)致現(xiàn)有技術(shù)陷入盲區(qū)，遺漏大量具有潛在生物學(xué)或臨床意義的變異。然而，NanoporeDirectRNA測序憑借其無與倫比的長讀長優(yōu)勢，展現(xiàn)了精準(zhǔn)識別并完整解析這類跨越多個(gè)基因、結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜的融合轉(zhuǎn)錄本的強(qiáng)大能力。在2020年發(fā)表于《NucleicAcidsResearch》的一項(xiàng)開創(chuàng)性研究中[4]，研究團(tuán)隊(duì)利用DRS深入探索了轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性。該研究明確指出，Nanopore讀長成功識別并鑒別出了多種此前未被傳統(tǒng)方法完整捕獲的復(fù)雜融合轉(zhuǎn)錄本。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)有力地證明了DRS在解析非典型、跨基因融合事件方面的突破性能力。具體而言，該研究揭示了如下令人矚目的復(fù)雜融合模式：多源融合轉(zhuǎn)錄本：發(fā)現(xiàn)了源自兩個(gè)離散基因座的多個(gè)融合轉(zhuǎn)錄本。這意味著DRS能夠清晰地捕捉到不止是簡單的A-B融合，而是諸如A-C、B-D等多種排列組合，揭示了融合事件的高度復(fù)雜性。單條讀長貫穿多基因：研究者甚至觀察到，一條單一的Nanopore讀長，能夠完整覆蓋四個(gè)基因位點(diǎn)組成的轉(zhuǎn)錄本。此外，還有讀長同時(shí)覆蓋了兩個(gè)遠(yuǎn)端多外顯子基因以及七個(gè)單外顯子基因的驚人案例。這些實(shí)例直觀地展示了DRS如何憑借其超長讀長，突破了傳統(tǒng)技術(shù)對線性結(jié)構(gòu)和單一基因區(qū)域的依賴，能夠一次性、完整地捕獲并重建這些由染色體復(fù)雜重排導(dǎo)致的、跨度巨大且結(jié)構(gòu)異常的新型融合轉(zhuǎn)錄本。其他復(fù)雜模式：研究還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了覆蓋兩個(gè)重疊基因且剪接模式一致的融合轉(zhuǎn)錄本，以及覆蓋兩個(gè)相鄰基因的反義轉(zhuǎn)錄本，還有不同剪接模式覆蓋兩個(gè)近端基因部分區(qū)域的轉(zhuǎn)錄本。所有這些復(fù)雜轉(zhuǎn)錄本的存在均通過RT-PCR方法得到了驗(yàn)證，再次強(qiáng)調(diào)了DRS數(shù)據(jù)的高可信度。這項(xiàng)前沿研究不僅彌補(bǔ)了傳統(tǒng)測序在復(fù)雜融合事件識別上的空白，更深刻地改變了我們對轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的認(rèn)知。它清晰地表明，NanoporeDRS是精準(zhǔn)解析和發(fā)現(xiàn)跨基因、結(jié)構(gòu)高度復(fù)雜的融合轉(zhuǎn)錄本的終極利器，為深入理解疾病機(jī)制、挖掘新型生物標(biāo)志物及指導(dǎo)精準(zhǔn)醫(yī)療實(shí)踐提供了前所未有的視角和關(guān)鍵數(shù)據(jù)。圖4DRS識別的復(fù)雜結(jié)構(gòu)融合基因4.5融合轉(zhuǎn)錄本不只是“結(jié)構(gòu)存在”，還能翻譯成蛋白發(fā)揮功能在對腺病毒Ad5感染A549細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行DirectRNA測序研究時(shí)[5]，研究者不僅發(fā)現(xiàn)了多達(dá)35個(gè)新的融合轉(zhuǎn)錄本，還首次通過質(zhì)譜驗(yàn)證了部分融合mRNA能夠被翻譯為功能性融合蛋白。研究團(tuán)隊(duì)在原始DRS數(shù)據(jù)中篩選出包含多個(gè)剪接異構(gòu)體的新RNA分子，其中部分融合轉(zhuǎn)錄本跨越了經(jīng)典基因結(jié)構(gòu)邊界，形成截?cái)嗳诤螼RF或新型融合ORF。例如其中一個(gè)融合蛋白由E4orf6的N端與下游DNA-bindingprotein部分融合形成一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的新蛋白，命名為E4orf6/DBP。在蛋白質(zhì)層面，WesternBlot和Massspectrometry數(shù)據(jù)均確認(rèn)該融合蛋白表達(dá)。更值得關(guān)注的是功能實(shí)驗(yàn)表明，敲除該融合蛋白后，病毒復(fù)制中心的形態(tài)發(fā)生顯著異常，病毒傳播能力也顯著下降。這意味著并非所有DRS檢出的融合transcripts都是轉(zhuǎn)錄噪聲，而極有可能具備真實(shí)的功能生物學(xué)意義。這一發(fā)現(xiàn)具有三層重要意義：DRS不再是“只看結(jié)構(gòu)”的工具，它還能引導(dǎo)我們挖掘出真正“被翻譯”的融合蛋白；融合轉(zhuǎn)錄本的功能研究將得到極大推動(dòng)，DRS可結(jié)合質(zhì)譜進(jìn)行多組學(xué)驗(yàn)證；從“轉(zhuǎn)錄融合”到“蛋白功能”路徑已被實(shí)證，為將來精準(zhǔn)醫(yī)療或病毒研究中融合靶點(diǎn)開發(fā)提供堅(jiān)實(shí)依據(jù)。這一案例展示了DirectRNA-seq在融合研究中的一個(gè)非常高階應(yīng)用路徑：不僅重構(gòu)融合結(jié)構(gòu)，揭示異構(gòu)體，還能定位蛋白產(chǎn)物，證明其具有真實(shí)功能。相比短讀長只關(guān)注轉(zhuǎn)錄層面，這種“轉(zhuǎn)錄——翻譯——功能”的閉環(huán)分析，是融合基因研究的終極追求。圖5DRS鑒定的融合基因表達(dá)出功能蛋白4.6融合結(jié)構(gòu)即異構(gòu)體驗(yàn)證：DirectRNA-seq捕捉轉(zhuǎn)錄本加工前的真實(shí)形態(tài)傳統(tǒng)意義上的“融合轉(zhuǎn)錄本”常被看作兩個(gè)原本獨(dú)立基因因重排、轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤或病毒感染等因素而生成的異常連接。然而，DRS所呈現(xiàn)出的融合現(xiàn)象遠(yuǎn)比預(yù)想更豐富，其中相當(dāng)一部分融合結(jié)構(gòu)實(shí)則反映了細(xì)胞內(nèi)天然轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體的加工中間態(tài)。在2020年發(fā)表在GenomeResearch,2020的研究中，作者使用NanoporeDRS對秀麗隱桿線蟲（C.elegans）多個(gè)發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了系統(tǒng)性測序。研究團(tuán)隊(duì)在全長reads中觀察到一類“融合基因”型異構(gòu)體，即單條轉(zhuǎn)錄本覆蓋兩個(gè)本應(yīng)獨(dú)立存在的成熟轉(zhuǎn)錄本。通過系統(tǒng)分析，他們發(fā)現(xiàn)這類reads中將近一半屬于已知的操縱子（operon）成員，即多個(gè)基因天然共轉(zhuǎn)錄而非真正“融合”。這些reads通常捕獲的是轉(zhuǎn)錄本尚未被剪接分割之前的狀態(tài)，因此可視為對已知operon結(jié)構(gòu)的直接驗(yàn)證[6]。更進(jìn)一步，研究者指出，另一半結(jié)構(gòu)雖不歸入已知operon，但很可能代表尚未注釋的新型操縱子，或是尚未完全加工完成的天然中間產(chǎn)物。這提示我們，在標(biāo)準(zhǔn)注釋之外，細(xì)胞仍存在大量復(fù)雜、多樣的異構(gòu)體形式，而DRS提供了首次可讀、可證實(shí)的直接數(shù)據(jù)支持。與傳統(tǒng)短讀長依賴拼接和比對推測不同，DRS以單分子長讀段方式，一次性捕獲整個(gè)剪接上下文，使這些異構(gòu)體結(jié)構(gòu)得以原位確認(rèn)。綜上，該研究展示了DRS在融合異構(gòu)體識別中的另一項(xiàng)核心價(jià)值：不僅能揭示未知結(jié)構(gòu)，更能驗(yàn)證已有異構(gòu)體模型的準(zhǔn)確性與表達(dá)狀態(tài)，是實(shí)現(xiàn)“從預(yù)測走向證實(shí)”的關(guān)鍵技術(shù)平臺。五、結(jié)語：從“可疑拼圖”到“真實(shí)全貌”，融合基因檢測進(jìn)入全新時(shí)代在融合基因成為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)關(guān)鍵支點(diǎn)的當(dāng)下，我們比任何時(shí)候都更需要一種能夠還原其真實(shí)結(jié)構(gòu)、捕捉其表達(dá)異構(gòu)體、解析其動(dòng)態(tài)調(diào)控甚至功能產(chǎn)物的檢測技術(shù)。NanoporeDRS，不再只是測序平臺的進(jìn)化版本，而是融合基因研究范式的重構(gòu)者。它讓“看到融合”從短讀段的推測變?yōu)殚L讀長的實(shí)錘；它讓“解析結(jié)構(gòu)”不再依賴算法重建，而是基于單分子的天然跨度；它讓“理解表達(dá)”不僅停留在是否存在，而是延伸到什么時(shí)候、在哪些細(xì)胞、以何種異構(gòu)體形式存在；它更讓“確認(rèn)功能”成為可能，使融合轉(zhuǎn)錄本從一個(gè)待注釋的序列，走向具有生物學(xué)效應(yīng)的候選靶點(diǎn)。我們正在從“能測到融合”邁入“能讀懂融合”的新階段。DRS是當(dāng)前唯一能夠在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)確認(rèn)、表達(dá)定量與功能關(guān)聯(lián)的測序技術(shù)。它將融合基因檢測從散落的數(shù)據(jù)碎片拼圖，推進(jìn)至原貌重現(xiàn)的整圖洞見。未來，我們對融合基因的理解不應(yīng)僅停留在“是否存在”，更應(yīng)邁向“結(jié)構(gòu)何在、功能為何、干預(yù)可否”。DRS，正在讓這一未來提前到來。參考文獻(xiàn)[1]Y.Chen,J.Goeke,etal.AsystematicbenchmarkofNanoporelong-readRNAsequencingfortranscript-levelanalysisinhumancelllines.NatureMethods.2025./10.1038/s41592-025-02623-4[2]SchiksnisEC,NicastroIA,PasquinelliAE.Full-lengthdirectRNAsequencingrevealsextensiveremodelingofRNAexpression,processingandmodificationin