ICS11.220

CCSB41

DH37

山東省地方標準

DB37/TXXXXX—XXXX

鵝星狀病毒感染診斷技術規(guī)范

Diagnostictechnicalspecificationforgooseastrovirusinfection

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB37/TXXXXX—XXXX

-A—

刖B

本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內容可能涉及專利。木文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。

本文件由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織或施。

本文件由山東省畜牧業(yè)標準化技術委員會歸口。

I

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鵝星狀病毒感染診斷技術規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了鵝星狀病毒感染的臨床診斷和實驗室診斷的技術規(guī)范。其中臨床診斷包括流行病學、

臨床癥狀、病理變化；實驗室診斷包括樣品的采集與保存、病毒分離鑒定、反轉錄-聚合酶鏈式反應

（RT-PCR）、實時熒光定量RT-PCR與間接酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。

本文件適用于鵝星狀病毒感染的診斷、檢測、監(jiān)測和流行病學調查。鵝星狀病毒感染的流行病學、

臨床癥狀、病理變化適用「鵝星狀病毒的初步診斷；病毒分離、RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR檢測方法

適用于鵝組織、分泌物、排泄物和病毒培養(yǎng)物中鵝星狀病毒分離鑒定及核酸檢測；間接ELISA抗體檢測

方法適用于鵝星狀病毒感染的抗體特異性血清學診斷。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件,

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489—2008實驗室生物安全通用要求

GB/T27401實驗室質量控制規(guī)范動物檢疫

NY/T541-2016獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

鵝星狀病毒感染gooseastrovirusinfection

由鵝星狀病毒引起的5口齡?25口齡雛鵝內臟器官與關節(jié)發(fā)生嚴重尿酸鹽沉積的疾病。

4實驗室要求

4.1環(huán)境

4.1.1實驗室符合GB19489—2008和GB/T27401要求。

4.1.2從事RT-PCR工作的實驗室應進行分區(qū)，根據條件劃分出前處理區(qū)、核酸提取區(qū)、核酸擴增區(qū)、

電泳檢測區(qū)，形成有效的物理隔離，且為單?流向，不得倒流,特別注意電泳后的瓊嘴凝膠要及時處理，

避免對實驗室造成污染。

4.1.3生物樣品應嚴格控制避免對環(huán)境造成污染，試驗結束后應將相關樣品（如血樣）進行無害化處

理。

4.2人員

1

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5.4.4所有樣品保存溫度在-15°C以下，不超過2wk；-70℃貯存不超過30d。

5.5檢測要求

在每次檢測過程中，需要設置相應的陽性對照和陰性對照。

6臨床診斷

6.1流行病學

鵝群發(fā)病日齡集中于5日齡?20日齡，5日齡左右開始發(fā)病，死亡率逐漸升高，10日齡?15日齡為死

亡高峰，鵝群的死亡率為20%?30%,最高可達50%。

6.2臨床癥狀

患病雛鵝表現為精神沉郁、臥地倦動、采食減少、排白色稀便。

6.3剖檢變化與組織學變化

死亡雛鵝剖檢變化主要表現為內臟器它和關節(jié)腔有大量尿酸鹽沉積，包括心臟、肝臟、腎臟及愉尿

管等，有的病例表現為腎臟出血腫大?；践Z組織學變化主要表現為腎小管上皮細胞壞死、間質出血，腎

小球腫脹，脾臟有大量紅細胞浸潤，肝細胞空泡變性、尿酸鹽沉積。

6.4臨床診斷結果判定

同時符合6.1、6.2、6.3,則判斷為疑似鵝星狀病毒感染。

7病毒分離鑒定

7.1病毒分離

7.1.1儀器設備與材料

7.1.1.1不同溫度的冰箱（2℃-8℃、-20℃、-70℃）o

7.1.1.237c恒溫孵化箱。

7.1.1.34℃離心機。

7.1.1.4打孔器。

7.1.1.51mL注射器。

7.1.1.6石蠟。

7.1.1.7照蛋器。

7.1.1.813口齡鵝星狀病毒III清抗體陰性鵝胚。

7.1.2樣品接種和培養(yǎng)

7.1.2.1將處理后的樣品上清，經絨毛尿囊腔途徑無菌接種13日齡鵝胚，0.2亳升/枚，37c孵育，

連續(xù)觀察6d。

7.1.2.2棄去24h內死亡鵝胚，24h?144h內死亡和存活鵝胚置于4c冰箱過夜或-20C冷凍lh,

分別無菌收集尿囊液并進行無菌檢查，無菌尿囊液宣傳三代。

7.1.3病毒分離結果判定

3

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組織樣品處理液接種鵝胚后，當胚體3d?5d內出現死亡，且胚體尿囊膜增厚，死亡鵝胚全身皮膚

及胚體腹膜有點狀出血斑，肝臟、腎臟、肺臟均呈現點狀出血等變化，可判斷為鵝疑似星狀病毒感染。

7.2病原檢測

7.2.1RT-PCR反應

7.2.11儀器設備

7.2.11.1生物安全柜。

7.2.11.2PCR基因擴增儀。

7.2.11.3臺式低溫高速離心機（最大轉速為15000r/min）.

7.2.11.4無RNA酶離心管（1.5mL）。

7.2.11.5PCR反應管（0.2mL）。

7.2.11.6微量移液器（最大量程分別為10uL、20nL、100uL、1000uL）。

7.2.11.7無RNA酶帶濾芯槍頭。

7.2.11.8核酸電泳儀。

7.2.11.9核酸電泳槽。

7.2.11.10紫外凝膠成像儀。

7.2.11.11電子天平：精度為0.01g。

7.2.11.12電磁爐或微波爐。

7.2.12試劑與材料

7.2.12.1DEPC水。

7.2.12.2商品化RNA提取試劑盒。

7.2.12.3RT反應試劑盒。

7.2.12.4PCR反應試劑。

7.2.12.51.0%瓊脂糖凝膠,見A.2。

7.2.12.61XTAE緩沖液，見A.3。

7.2.12.7核酸染料。

7.2.12.8核酸電泳加樣緩沖液,見A.4。

7.2.12.9DNA分子量標準，要求在100bp?2000bp之間，有5條以上的指示條帶。

7.2.12.10陽性對照標準品,使用鵝星狀病毒SDPY株（03TCCNO:V201808,見附錄C）,或其他背

景清楚的鵝星狀病毒。

7.2.12.11陰性對照標準品，為健康鵝正常組織或未感染鵝星狀病毒鵝胚尿囊液。

7.2.12.12RT-PCR檢測所需引物：

——上游引物引5'-TGGTGGTGYTTYCTCAARA-3'；

——下游引物R：5,-GYCKGTCATCMCCRTARCA-3,,擴增片段長度為601bp,引物濃度為10umol/Lo

7.2.1.3試驗程序

7.2.1.3.1RNA提取

按RNA提取試劑盒說明書提取樣品和對照組的RNA。提取的RNA應立即檢測，否則應置于-70℃凍存。

7.2.1.3.2RT-PCR反應

7.2.1.3.2.1反轉錄體系及程序

4

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RNaseInhibitor0.5uL,M-MLVbuffer2yL,RandomPrimers1.0uL,dNTPs(2.5mmol/L)

1uL,RNaseM-MLV0.5uL,RNA模板5uL,共計10uL反轉錄反應程序為30℃10min,42℃60min,

70℃15min,4℃終止。

7.2.1.3.2.2PCR反應體系及程序

在試劑準備區(qū)配制PCR反應液，在樣品制備區(qū)進行加樣,反應體系如下：10XPCRBuffer2.5uL,

dNTPs(2.5mmol/L)2^L,弓|物F(10umol/L)和R(10umol/L)各0.5uL,模板cDMA3nL,rTaq

DNA聚合酶0.25uL,加DEPC水至25UL。

瞬時離心，置于PCR基因擴增儀內進行擴增，反應程序為：94℃預變性5min；94℃30s,55℃30

s,72℃30s,30個循環(huán);72c延伸10min。

7.2.1.3.2.3瓊脂糖凝膠電泳

1.0與瓊脂糖凝膠板的制備：稱取1g瓊脂糖，加入100磯1XTAE緩沖液中。加熱融化后加5UL核酸

染料溶液，混勻后倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5mm左右。依據樣品數選用適宜的梳子。

待凝膠冷卻凝固后拔出梳子(膠中形成加樣孔)，放入電泳槽中，力口1XTAE緩沖液淹沒膠面。

加樣：取6uL?8uLPCR擴增產物和2口L加樣緩沖液混勻后加入一個加樣孔。每次電泳同時設標

準DNAMarker,陰性對照、陽性對照。

電泳：電壓80v?100V或電流40mA?50mA,電泳30min?40min。最后，由凝膠成像系統觀察并拍

照記錄。

7.2.1.4結果判定

7.2.1.4.1試驗成立的條件

陽性對照出現601bp的擴漕條帶，且陰性對照無擴增條帶時，判定試驗結果成立。

7.2.1.4.2試驗結果的判定

7.2.1.4.2.1在試驗成立的前提下，待檢樣品出現601bp的條帶，判定待檢樣品為鵝星狀病毒PCR陽

性，必要時，對擴增片段進行序列測定。

7.2.1.4.2.2在試驗成立的前提下，待檢樣品無條帶，則為鵝星狀病毒PCR陰性(見B.1)。

7.2.2實時熒光定量RT-PCR

7.2.2.1儀器設備

7.2.2.1.1生物安全柜。

7.2.2.1.2臺式低溫高速離心機(最大轉速為15000r/min)。

7.2.2.1.3無RNA睡的離心管(1.5mL)。

7.2.2.1.4無RNA酶的熒光定量PCR管。

7.2.2.1.5微量移液器(最大量程分別為10PL、20uL、100uL.1000uL),

7.2.2.1.6無RNA酶帶濾芯的槍頭。

7.2.2.1.7熒光定量PCR儀。

7.2.2.2試劑與材料

7.2.2.2.1DEPC水。

7.2.2.2.2商品化RNA提取試劑盒。

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7.2.2.2.3一步法熒光定量RT-PCR試劑盒。

7.2.2.2.4陽性對照標準品，使用鵝星狀病毒SDPY株(CCTCCNO：V201808),或其他背景清楚的鵝星

狀病毒。

7.2.2.2.5陰性對照標準品，為健康鵝正常組織或未感染鵝星狀病毒鵝胚尿囊液。

7.2.2.2.6熒光定量RT-PCR檢測所需引物及探針：

——上游引物F：5'-GGTGGGCTAATAACGGAACTCAG-3'：

——下游引物R：5'-GACCTATTTCCTTGCGGATCAC3；

——探針P：5'FAM-TCGGCTCAACATCGCTGATGGG-BHQ3,擴增片段長度為89bp,引物濃度為10P

mol/Lo

7.2.2.3試驗程序

7.2.2.3.1RNA提取

RNA提取參照7.2.1.3.U

7.2.2.3.2實時熒光定量RT-PCR反應體系及程序

在實驗室潔凈區(qū)域，將試劑盒中預混液、引物和探針取出，置于冰上融化，將下列試劑一次加入到

無RNA酶的熒光定量PCR管中。反應體系如下:2X0neStepRT-PCRBufferIII10uL,TabaraExTaq

HS0.4nL,PrimeScriptRTEnzymeMixII0.4PL,引物F(10nmol/L)和引物R(10ymol/L)各

0.4uL,探針P(10umol/L)0.8uL,模板RNA2uL,力口ddH#至20uL。反應液混勻后置于

LightCycle產96熒光定量PCR儀按照以下程序進行擴增:42c反轉錄5min,95℃10s；95c變性5s,

60℃退火20s(收集信號),進行40個循環(huán)。

7.2.2.4結果判定

7.2.2.4.1試驗成立的條件

陽性對照出現S型擴增曲線，且陰性對照無擴增曲線時，判定檢測結果有效。

7.2.2.4.2試驗結果的判定

7.2.2.4.2.1Ct值＜30,且出現S型擴增曲線，表明樣品中存在鵝星狀病毒，判定為陽性。

7.2.2.4.2.2無Ct值，且無擴增曲線，或Ct值＞35,表明樣品中無鵝星狀病毒，判定為陰性。

7.2.2.4.2.330VCI值＜35的樣品，判定為可疑，需重新檢測(見B.2)。

8病毒抗體檢測(間接ELISA)

8.1儀器設備

8.1.1臺式高速離心機(最大轉速為15()0()rpm)。

8.1.2酶標儀。

8.1.3微量移液器：最大量程分別為10UL、20uL.100pL.1000uL.

8.1.4聚苯乙烯板。

8.1.5水平振蕩器。

8.1.637℃培養(yǎng)箱。

8.2試劑與材料

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8.2.1標準陽性血清，見【）.1。

8.2.2標準陰性血清，見D.2。

8.2.3鵝星狀病毒抗原，見D.3。

8.2.4酶標二抗：兔抗鵝辣杈過氧化物酶標記的IgG,效價應在1:32以匕

8.2.5包被液,見A.5。

8.2.6洗滌液，見A.6。

8.2.7樣品稀釋液（封閉液），見A.7。

8.2.8底物溶液,TMB底物顯色液。

8.2.9終止液（濃度為2M）,見A.8。

8.3操作步驟

8.3.1將0RF2蛋白抗原按照濃度為6.5mg/mL用1X碳酸鹽緩沖液（pH9.6）稀釋2000倍,每孔100u

L加入到96孔聚苯乙烯板中，4℃孵育過夜。孵育后洗滌液洗5次，甩干板上殘余液體。

8.3.2用樣品稀釋液將被檢血清樣品稀釋40倍，注意不要稀釋對照血清。確保每個樣品換一個吸頭,

做好樣品的標記。稀釋的樣品血清充分混勻后，加入包被孔。

8.3.3每孔加入200uL封閉液，37℃溫箱孵育1h,用&3.1方法洗板。

8.3.4在Al、A2孔各加100PL陰性血清對照，A3、A4孔各加100PL陽性血清對照。

8.3.5將100uL稀釋好的待檢血清加入其他各孔，混勻后，37℃孵育1h,用&3.1方法洗板。

8.3.6酶標二抗用樣品稀釋液按1:200倍稀釋，每孔加入100uL,37℃孵育1h,用8.3.1方法洗板。

8.3.7每孔加入100uLTMB顯色液，37℃避光條件下孵育15min。

8.3.8每孔加入50HL終止液，輕輕振蕩，終止反應。

8.3.9將酶標板置于酶標儀中，于450nm測定各孔樣品的吸光值（0D）。

8.4結果判定

8.4.1試驗成立的條件

鵝星狀病毒間接ELISA檢測方法陰性對■照0D均值=（ODA1+0DA2）/2；陽性對照0D均值=（0M+OD.v,）

/2；陽性對照平均值減去陰性對照平均值，其差必須大于0.04；陰性對照平均值必須小于等于（）.17,試

驗條件成立，否則重復測定。

8.4.2試驗結果的判定

8.4.2.1當樣品OD.15O>O.21時，樣品判定為鵝星狀病毒抗體陽性。

8.4.2.2當樣品OD.,5O<O.17,樣品判定為鵝星狀病毒抗體陰性。

8.4.2.3當樣品0.17VOD450Vo.21,判為可疑，需重復測定。

9鵝星狀病毒感染綜合判定

根據第6章、第7章、第8章中的判定結果，可對鵝星狀病毒感染進行綜合判定。

9.1若患鵝與第6章中所描述相符，且第7章、第8章中結果均呈陽性，則可判定為鵝星狀病毒感染。

9.2若患鵝與第6章中所描述部分相符，但第7章、第8章中結果均呈陽性，則可判定為鵝星狀病毒

感染。

9.3若患鵝在第7章中的結果呈陽性，但在第8章中的結果呈陰性，也可判定為鵝星狀病毒感染。反

之則不成立。

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附錄A

(資料性)

相關試劑的配制(試劑要求分析純)

A.1磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01mol/LpH7.4)

NaCl8.0g

KC10.2g

KM。』0.2g

Na2HPO(.12H2O0.2g

水加至1000mL

A.21.0*瓊脂糖凝膠的配制

瓊脂糖LOg

0.5XTAE電泳緩沖液加至100mL

微波爐中完全融化，待冷至50C?60C時加入核酸染料，搖勻。倒入板上凝固后，取下梳子，備

用。

A.31XTAE電泳緩沖液的配制

A.3.1配制0.5mol/L乙二胺四乙酸鈉(EDTA-Na2)溶液(pH8.0)

乙二胺四乙酸鈉(EDTA-Naz.2H.0)18.61g

滅菌雙蒸水80.0mL

氫氧化鈉調pH至8.0

水加至100mL

用于配制A.3.2中的50XTAE電泳緩沖液。

A.3.2配制50XTAE電泳緩沖液

羥基甲基氨基甲烷(Tris)242g

冰醋酸57.1mL

0.5mol/L乙二胺四乙酸鈉(EDTA-Na2)溶液(pH8.0)100mL

滅菌超純水加至1000mL

用于配制A.3.3中的1XTAE電泳緩沖液。

A.3.3配制1XTAE電泳緩沖液

50XTAE電泳緩沖液20mL

水加至1000mL

A.4核酸電泳加樣緩沖液(10X)

聚蔗糖25g

滅菌雙蒸水100mL

濱酚藍0.1g

二甲苯青0.1g

A.5包被液(0.05mol/LpH9.6)

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Na2cOB0.2756g

NaHCOs0.6216g

水加至100ml.

A.6洗滌液

PBS1000mL

Tween-200.5mL

A.7樣品稀釋液（封閉液）

脫脂奶粉5.0g

洗滌液100mL

A.8終止液（2M）

112so4(98%)58mL

水442mL

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附錄B

（資料性）

PCR及熒光定量PCR結果圖

B.1PCR產物大小對照

ZOOObp

lOOObp

750bp

500bp

250bp

lOObp

V為分子量標準；l為陰性對照,2為陽性對照。

圖B.1PCR產物大小對照圖

B.2熒光定量PCR擴增曲線

1為陽性對照，2為陰性對照。

圖B.2熒光定量PCR擴增曲線

10

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附錄C

（資料性）

陽性對照病毒（SDPY）

C.1SDPY鵝星狀病毒的來源

SDPY鵝星狀病毒，是一種鵝源病毒，由山東農業(yè)大學禽病學實驗室分離并鑒定，保藏于中國典型培

養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）,其保藏編號為CCTCCNO:V201808。該病毒可由山東農業(yè)大學禽病學實驗室提

供，由13日齡血清抗體陰性鵝胚接種病毒后，收集死亡胚體尿囊液后離心所得，病毒滴度21（r°ELD5。。

C.2SDPY鵝星狀病毒涉及的專利信息

該病毒株涉及以下專利：

?種防治新型鵝星狀病毒的滅活疫苗及其制備方法。專利號：ZL201810494586.X,專利公布日：

2020.0