外源性DNA殘留量的檢查法第三節(jié)第十章生物制品的生物測定法第三節(jié)外源性DNA殘留量的檢查法一.外源性DNA的測定方法

目前對生物制品中殘留外源性DNA的測定方法主要包括：分子雜交技術(shù)、基于DNA結(jié)合蛋白分析系統(tǒng)及實時定量PCR（Q-PCR）3類檢測技術(shù)，其中以分子雜交技術(shù)最為常用。/video/av23340978/?p=17第三節(jié)外源性DNA殘留量的檢查法1.分子雜交技術(shù)的基本原理

采用DNA探針來檢測固定在硝酸纖維素膜上的變性的宿主細(xì)胞DNA。供試品中的外源性DNA經(jīng)變性成為單鏈，再吸附在固相膜上，在一定溫度下可與相匹配的單鏈DNA復(fù)性而重新結(jié)合成雙鏈DNA，稱為雜交。陽性對照和標(biāo)記探針的DNA可由生產(chǎn)供試品所用的傳代細(xì)胞、工程菌及雜交瘤細(xì)胞提取純化來制備。第三節(jié)外源性DNA殘留量的檢查法2.實驗步驟01用標(biāo)記物來標(biāo)記特異性的單鏈DNA探針與吸附在固相膜上的供試品單鏈DNA雜交02030405使用與標(biāo)記物相對應(yīng)的顯示系統(tǒng)來顯示雜交結(jié)果與已知含量的陽性DNA對照對比測出供試品中外源性DNA的含量，其靈敏度可達(dá)10pg以下第三節(jié)外源性DNA殘留量的檢查法3.注意事項(1)DNA殘留量在1.25～80ng/ml范圍內(nèi)，本法線性較好。(2)供試品首次應(yīng)用本法測定時需要進(jìn)行方法學(xué)驗證，驗證內(nèi)容至少包括精密度試驗和回收率試驗。鼠IgG殘留量的檢查法第四節(jié)第十章生物制品的生物測定法第四節(jié)鼠IgG殘留量的檢查法一.試驗原理

同宿主細(xì)胞（或菌體）蛋白殘留量的檢查法，即利用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）雙抗體夾心法來測定經(jīng)單克隆抗體親和層析方法純化的重組制品中殘留的鼠IgG的含量。第四節(jié)鼠IgG殘留量的檢查法1.實驗步驟

(1)包被抗體：將特異性的抗體（山羊抗鼠IgG抗體）包被在固相載體上，洗滌除去未吸附的抗體和雜質(zhì)。

(2)加待測標(biāo)本并孵育：使標(biāo)本中的待測抗原（供試品溶液）和標(biāo)準(zhǔn)品溶液與上述固相抗體結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，洗滌除去其他未結(jié)合的游離抗原和雜質(zhì)。

(3)加酶標(biāo)抗體孵育：使固相抗原-抗體復(fù)合物中的抗原再與對應(yīng)的經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的綿羊抗鼠IgG抗體相結(jié)合，形成固相抗體-待測抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物（即雙抗體夾心法），洗滌除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體和其他雜質(zhì)。第四節(jié)鼠IgG殘留量的檢查法

(4)加底物顯色：固相上的辣根過氧化物酶催化加入的底物（鄰苯二胺）形成有色產(chǎn)物，根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量檢測。最后加入終止液硫酸來終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在492nm波長處測定吸光度，以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度做出工作曲線，由此可以測出由單克隆抗體親