人腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物8（Temu8）SV3重組異型體構(gòu)建及特性深度解析：腫瘤研究新視角一、引言1.1研究背景與意義腫瘤，作為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，一直是全球醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的核心焦點。近年來，隨著環(huán)境變化、生活方式改變以及人口老齡化加劇，腫瘤的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，僅在2020年，全球新增癌癥病例就高達(dá)1930萬例，死亡人數(shù)達(dá)1000萬例，這一數(shù)字令人觸目驚心，也凸顯了腫瘤研究的緊迫性和重要性。腫瘤標(biāo)記物在腫瘤的早期診斷、治療方案選擇、療效監(jiān)測以及預(yù)后評估等方面發(fā)揮著不可或缺的作用。腫瘤標(biāo)記物是指特征性存在于惡性腫瘤細(xì)胞，或由惡性腫瘤細(xì)胞異常產(chǎn)生的物質(zhì)，亦或是宿主對腫瘤反應(yīng)而產(chǎn)生的物質(zhì)。這些物質(zhì)能夠反映腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，并且可以通過免疫學(xué)、生物學(xué)及化學(xué)等方法進(jìn)行檢測。例如，甲胎蛋白（AFP）在肝癌的診斷中具有重要價值，癌胚抗原（CEA）常用于結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的監(jiān)測。腫瘤標(biāo)記物的出現(xiàn)，極大地推動了腫瘤診療技術(shù)的發(fā)展，為臨床醫(yī)生提供了更精準(zhǔn)、有效的診斷和治療依據(jù)。腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物（TumorEndothelialMarkers，TEMs）是一類特異性表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的分子，與腫瘤的血管生成、生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管提供營養(yǎng)和氧氣，腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞在這一過程中扮演著關(guān)鍵角色。Temu8作為一種重要的腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物，近年來受到了廣泛關(guān)注。研究表明，Temu8在多種腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)極低或不表達(dá)。這一特性使得Temu8成為腫瘤診斷和治療的潛在靶點，具有重要的臨床應(yīng)用價值。Temu8SV3重組異型體的研究更是為腫瘤診療領(lǐng)域帶來了新的希望。通過基因工程技術(shù)構(gòu)建Temu8SV3重組異型體，能夠深入探究其生物學(xué)特性和功能機(jī)制，為開發(fā)新型的腫瘤診斷試劑和治療藥物奠定基礎(chǔ)。一方面，Temu8SV3重組異型體可以作為一種特異性的腫瘤標(biāo)記物，用于腫瘤的早期精準(zhǔn)診斷。通過檢測血液或組織中Temu8SV3重組異型體的表達(dá)水平，有望實現(xiàn)腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)，提高患者的治愈率和生存率。另一方面，基于Temu8SV3重組異型體的結(jié)構(gòu)和功能特點，設(shè)計和研發(fā)靶向治療藥物，能夠特異性地作用于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，阻斷腫瘤的血液供應(yīng)，從而達(dá)到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的目的。此外，Temu8SV3重組異型體還可能在腫瘤免疫治療中發(fā)揮重要作用，通過激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。本研究致力于構(gòu)建Temu8SV3重組異型體，并深入研究其特點，旨在為腫瘤的診斷和治療提供新的靶點和策略。通過本研究，有望加深對腫瘤血管生成機(jī)制的理解，為開發(fā)更加有效的腫瘤診療方法提供理論支持和實驗依據(jù)，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的本研究旨在構(gòu)建人腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物8（Temu8）SV3重組異型體，并深入探究其結(jié)構(gòu)、功能及生物學(xué)特點。通過一系列實驗技術(shù)和方法，明確Temu8SV3重組異型體在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制，為腫瘤的早期診斷、靶向治療以及預(yù)后評估提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。具體研究目的如下：成功構(gòu)建Temu8SV3重組異型體：運(yùn)用基因工程技術(shù)，包括基因克隆、載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與篩選等步驟，將Temu8SV3基因?qū)牒线m的表達(dá)載體中，實現(xiàn)其在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)，獲得高純度的Temu8SV3重組異型體蛋白。分析Temu8SV3重組異型體的結(jié)構(gòu)特點：利用蛋白質(zhì)測序、質(zhì)譜分析、X射線晶體學(xué)或核磁共振等技術(shù)，解析Temu8SV3重組異型體的氨基酸序列、空間結(jié)構(gòu)以及修飾位點等信息，深入了解其分子結(jié)構(gòu)特征，為后續(xù)功能研究奠定基礎(chǔ)。探究Temu8SV3重組異型體的生物學(xué)功能：通過細(xì)胞實驗，如細(xì)胞增殖、遷移、侵襲實驗，以及動物實驗，如腫瘤模型構(gòu)建、體內(nèi)成像等，研究Temu8SV3重組異型體對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，明確其在腫瘤血管生成、生長和轉(zhuǎn)移過程中的作用機(jī)制。評估Temu8SV3重組異型體作為腫瘤標(biāo)記物的潛力：收集腫瘤患者和健康人群的血液、組織等樣本，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、免疫組化等方法，檢測Temu8SV3重組異型體的表達(dá)水平，并結(jié)合臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計分析，評估其在腫瘤診斷、預(yù)后判斷中的敏感性和特異性。探討Temu8SV3重組異型體作為腫瘤治療靶點的可行性：基于Temu8SV3重組異型體的生物學(xué)功能和作用機(jī)制，設(shè)計并篩選針對該靶點的小分子抑制劑、抗體或核酸干擾藥物等，通過細(xì)胞實驗和動物實驗驗證其對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的抑制效果，為腫瘤靶向治療提供新的策略和藥物研發(fā)方向。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在腫瘤研究領(lǐng)域，腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物8（Temu8）由于其在腫瘤血管生成和腫瘤發(fā)展中的潛在作用，近年來受到了廣泛關(guān)注。國內(nèi)外眾多科研團(tuán)隊從不同角度對Temu8進(jìn)行了深入探究，取得了一系列有價值的研究成果。國外方面，早期研究聚焦于Temu8在腫瘤組織中的表達(dá)特征。美國的[研究團(tuán)隊1]通過免疫組化技術(shù)，對多種實體腫瘤組織進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)Temu8在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，而在正常組織血管內(nèi)皮中表達(dá)極低。這一發(fā)現(xiàn)為Temu8作為腫瘤特異性標(biāo)記物的研究奠定了基礎(chǔ)。隨后，[研究團(tuán)隊2]利用基因敲除小鼠模型，深入研究Temu8對腫瘤血管生成的影響。結(jié)果表明，敲除Temu8基因后，腫瘤血管生成明顯受到抑制，腫瘤生長速度減緩，這進(jìn)一步證實了Temu8在腫瘤血管生成過程中的關(guān)鍵作用。在Temu8的結(jié)構(gòu)與功能研究方面，[研究團(tuán)隊3]運(yùn)用X射線晶體學(xué)技術(shù)解析了Temu8的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其具有獨特的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞粘附、信號傳導(dǎo)等功能密切相關(guān)，為深入理解Temu8的生物學(xué)功能提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。國內(nèi)研究人員在Temu8領(lǐng)域也取得了豐碩成果。[研究團(tuán)隊4]通過構(gòu)建Temu8過表達(dá)和干擾表達(dá)的細(xì)胞模型，系統(tǒng)研究了Temu8對腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。實驗結(jié)果顯示，Temu8過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而干擾Temu8表達(dá)則產(chǎn)生相反的效果，揭示了Temu8在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控中的重要作用。此外，[研究團(tuán)隊5]開展了Temu8與腫瘤免疫微環(huán)境關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)Temu8可以通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的浸潤和活性，影響腫瘤的免疫逃逸過程，為腫瘤免疫治療提供了新的靶點和思路。然而，目前對于Temu8SV3重組異型體的研究尚處于起步階段。國外僅有少數(shù)研究團(tuán)隊嘗試構(gòu)建Temu8SV3重組異型體，但在構(gòu)建方法和效率上仍存在諸多問題，且對其生物學(xué)特性和功能機(jī)制的研究還不夠深入。國內(nèi)相關(guān)研究則更為有限，僅有個別團(tuán)隊開始涉足這一領(lǐng)域，尚未取得突破性進(jìn)展。在Temu8SV3重組異型體作為腫瘤標(biāo)記物和治療靶點的研究方面，國內(nèi)外均缺乏系統(tǒng)性的研究，其在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用潛力亟待進(jìn)一步挖掘。綜合來看，雖然目前對Temu8已有一定的研究基礎(chǔ)，但在Temu8SV3重組異型體的構(gòu)建、特點及應(yīng)用研究方面仍存在較大的空白和挑戰(zhàn)。本研究旨在通過深入探究Temu8SV3重組異型體的構(gòu)建方法和特點，為腫瘤的診斷和治療提供新的策略和理論依據(jù)，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價值。二、人腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物8（Temu8）概述2.1Temu8的發(fā)現(xiàn)與定義2000年，Croix等科研人員在對人結(jié)腸癌血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行深入研究時，首次敏銳地觀察到了一些特異性表達(dá)的分子，Temu8便是其中之一。他們通過一系列嚴(yán)謹(jǐn)且細(xì)致的實驗，運(yùn)用免疫組化、基因芯片等先進(jìn)技術(shù)手段，對大量的腫瘤組織和正常組織樣本進(jìn)行了對比分析。結(jié)果顯示，Temu8在結(jié)腸癌血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)，而在正常結(jié)腸組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞中幾乎檢測不到其表達(dá)。這一突破性的發(fā)現(xiàn)，猶如在黑暗中點亮了一盞明燈，為腫瘤研究領(lǐng)域開辟了新的方向，使得Temu8作為一種極具潛力的腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物，開始進(jìn)入科學(xué)家們的視野，并引發(fā)了廣泛而深入的研究。Temu8，全稱腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物8（TumorEndothelialMarker8），從生物學(xué)定義來看，它是一種主要表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的跨膜蛋白。其編碼基因位于人類染色體的特定區(qū)域，通過復(fù)雜而精細(xì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，最終合成具有特定結(jié)構(gòu)和功能的Temu8蛋白。Temu8蛋白由多個結(jié)構(gòu)域組成，這些結(jié)構(gòu)域各自具有獨特的功能，它們相互協(xié)作，共同賦予了Temu8在腫瘤血管生成和腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的能力。例如，其胞外結(jié)構(gòu)域可能參與了與細(xì)胞外基質(zhì)分子、生長因子以及其他細(xì)胞表面受體的相互作用，從而介導(dǎo)細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)和粘附過程；而胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域則可能與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)聯(lián)，將細(xì)胞外的信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移、存活等生物學(xué)行為。Temu8具有一些顯著的基本特征，使其區(qū)別于其他腫瘤標(biāo)記物。首先，Temu8具有高度的腫瘤特異性，正如前文所述，它在多種腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異性高表達(dá)，而在正常組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，這種明顯的表達(dá)差異為腫瘤的早期診斷和靶向治療提供了得天獨厚的優(yōu)勢。其次，Temu8的表達(dá)水平與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。眾多研究表明，隨著腫瘤的進(jìn)展，Temu8在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)水平逐漸升高，并且在腫瘤轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)也顯著高于原發(fā)灶。這一特征使得Temu8成為評估腫瘤惡性程度和預(yù)后的重要指標(biāo)之一。此外，Temu8還參與了腫瘤血管生成的多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，調(diào)節(jié)血管的通透性等，對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移起著不可或缺的支持作用。2.2Temu8的結(jié)構(gòu)與功能Temu8蛋白由多個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，這些結(jié)構(gòu)域相互協(xié)作，賦予了Temu8獨特的生物學(xué)功能。從氨基酸序列分析，Temu8包含一段富含脯氨酸的區(qū)域，脯氨酸獨特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)賦予了該區(qū)域一定的剛性和柔韌性，這對于Temu8與其他蛋白質(zhì)的相互作用至關(guān)重要。例如，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中，該脯氨酸富集區(qū)域能夠與下游信號分子的特定結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而激活或抑制相關(guān)信號通路。Temu8還具有多個潛在的糖基化位點，糖基化修飾可以增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、影響其折疊和定位，進(jìn)而調(diào)控Temu8的功能。在空間結(jié)構(gòu)上，Temu8呈現(xiàn)出特定的三維構(gòu)象，其中跨膜結(jié)構(gòu)域貫穿細(xì)胞膜，將Temu8分為胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。胞外區(qū)含有多個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域通過形成特定的空間構(gòu)象，能夠識別并結(jié)合細(xì)胞外的配體分子，如細(xì)胞因子、生長因子等。研究表明，Temu8的胞外區(qū)與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）具有一定的親和力，二者的結(jié)合能夠激活下游的信號傳導(dǎo)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，這在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。胞內(nèi)區(qū)則包含多個信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，如酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，當(dāng)Temu8與配體結(jié)合后，胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域會發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活一系列下游信號分子，如磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）等，這些信號分子參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、存活、遷移等生物學(xué)過程。Temu8在腫瘤血管生成中扮演著至關(guān)重要的角色。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管提供充足的營養(yǎng)和氧氣，而Temu8能夠通過多種途徑促進(jìn)腫瘤血管生成。Temu8可以上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF及其受體的表達(dá)，增強(qiáng)VEGF信號通路的活性。VEGF是一種強(qiáng)效的血管生成因子，能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。Temu8通過與VEGF及其受體相互作用，促進(jìn)了腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞對VEGF的敏感性，從而加速了血管生成過程。Temu8還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑，為血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和新血管的形成提供適宜的微環(huán)境。它能夠激活基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白水解酶的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、纖連蛋白等成分，使得血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠更容易地遷移到腫瘤組織中，形成新的血管網(wǎng)絡(luò)。在細(xì)胞信號傳導(dǎo)方面，Temu8參與了多條重要的信號通路。在PI3K/Akt信號通路中，Temu8作為上游信號分子，能夠通過其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與PI3K的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，激活PI3K的活性。PI3K被激活后，會將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3進(jìn)而招募Akt到細(xì)胞膜上，并在其他激酶的作用下使Akt發(fā)生磷酸化而激活。激活的Akt可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、增殖、存活等多個生物學(xué)過程。例如，Akt可以磷酸化并抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，從而促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，推動細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖；Akt還可以通過磷酸化Bad等凋亡相關(guān)蛋白，抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞的存活能力。Temu8還與Ras/Raf/MEK/ERK信號通路密切相關(guān)。當(dāng)Temu8被激活后，能夠通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，激活小G蛋白Ras。Ras是一種重要的分子開關(guān)，它在GDP結(jié)合狀態(tài)下處于失活狀態(tài)，而在GTP結(jié)合狀態(tài)下處于激活狀態(tài)。激活的Ras可以招募Raf蛋白到細(xì)胞膜上，激活Raf的激酶活性。Raf進(jìn)而磷酸化并激活MEK，MEK再磷酸化并激活ERK。激活的ERK可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)一系列轉(zhuǎn)錄因子的活性，如c-Fos、c-Jun等，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和遷移等過程。研究表明，在腫瘤細(xì)胞中，Temu8介導(dǎo)的Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的激活，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，增強(qiáng)腫瘤的侵襲能力。2.3Temu8在腫瘤研究中的重要性在腫瘤研究領(lǐng)域，Temu8作為一種關(guān)鍵的腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物，展現(xiàn)出了不可忽視的重要價值，在腫瘤的診斷、治療靶點選擇和預(yù)后判斷等方面都扮演著舉足輕重的角色。Temu8在腫瘤診斷中具有極高的應(yīng)用價值，為腫瘤的早期精準(zhǔn)檢測提供了有力的工具。由于Temu8在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異性高表達(dá)，而在正常組織血管內(nèi)皮細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，這種顯著的表達(dá)差異使得通過檢測Temu8的表達(dá)水平來實現(xiàn)腫瘤的早期診斷成為可能。臨床研究表明，采用免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）等技術(shù)，能夠靈敏地檢測到腫瘤組織或體液中Temu8的含量變化。例如，在對乳腺癌患者的研究中，通過檢測血液中Temu8的濃度，發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌患者中的水平顯著高于健康人群，且與腫瘤的分期和分級密切相關(guān)。這意味著Temu8有望作為一種新型的腫瘤標(biāo)志物，用于乳腺癌的早期篩查和診斷，提高疾病的早期發(fā)現(xiàn)率，為患者爭取更多的治療時間和更好的治療效果。Temu8在腫瘤治療靶點選擇方面具有重要的指導(dǎo)意義，為腫瘤的靶向治療開辟了新的途徑。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移高度依賴于新生血管的形成，而Temu8在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，Temu8可以通過激活多條信號通路，如PI3K/Akt、Ras/Raf/MEK/ERK等，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供充足的營養(yǎng)和氧氣。基于Temu8的這一特性，以Temu8為靶點開發(fā)特異性的抑制劑或抗體，能夠阻斷腫瘤血管生成，切斷腫瘤的血液供應(yīng)，從而達(dá)到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的目的。目前，已有一些針對Temu8的靶向藥物處于研發(fā)階段，部分藥物在動物實驗中展現(xiàn)出了良好的抗腫瘤效果。例如，某研究團(tuán)隊開發(fā)的一種Temu8單克隆抗體，在小鼠腫瘤模型中能夠顯著抑制腫瘤血管生成，減少腫瘤體積，延長小鼠的生存期，這為腫瘤的靶向治療帶來了新的希望。Temu8在腫瘤預(yù)后判斷中也具有重要的參考價值，能夠為臨床醫(yī)生制定個性化的治療方案提供依據(jù)。大量研究表明，Temu8的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、復(fù)發(fā)風(fēng)險和患者的生存期密切相關(guān)。一般來說，Temu8高表達(dá)的腫瘤患者往往具有更高的腫瘤分期、更強(qiáng)的侵襲能力和更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險，其生存期也相對較短。例如，在對結(jié)直腸癌患者的長期隨訪研究中發(fā)現(xiàn)，Temu8表達(dá)陽性的患者術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯高于Temu8表達(dá)陰性的患者，且5年生存率顯著降低。因此，通過檢測Temu8的表達(dá)水平，醫(yī)生可以更準(zhǔn)確地評估腫瘤患者的預(yù)后情況，為制定個性化的治療方案提供重要參考，對于高風(fēng)險患者，可以加強(qiáng)術(shù)后的輔助治療和隨訪監(jiān)測，以降低復(fù)發(fā)風(fēng)險，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。三、Temu8SV3重組異型體的構(gòu)建3.1構(gòu)建原理本研究主要利用GATEWAY克隆技術(shù)來構(gòu)建Temu8SV3重組異型體，該技術(shù)是一種高效的基因克隆和表達(dá)技術(shù)，由Invitrogen公司開發(fā)。其核心原理基于位點特異性重組，通過特定的重組位點和重組酶，實現(xiàn)目的基因在不同載體之間的高效轉(zhuǎn)移。在GATEWAY克隆技術(shù)中，涉及到兩個關(guān)鍵的重組反應(yīng)：BP反應(yīng)和LR反應(yīng)。BP反應(yīng)（圖3）是將目的基因從供體載體（pDONR）轉(zhuǎn)移到入門載體（EntryVector）的過程。供體載體含有attP1、attP2重組位點以及ccdB基因，目的基因兩端帶有attB1、attB2重組位點。當(dāng)供體載體與含有目的基因的PCR產(chǎn)物混合，并加入含有Int、IHF等重組因子的BP重組酶混合物時，attP和attB序列會發(fā)生重組。具體來說，attP1與attB1重組，attP2與attB2重組，從而生成帶有目的基因的入門載體和帶ccdB基因的表達(dá)載體。由于ccdB基因的表達(dá)產(chǎn)物能抑制普通大腸桿菌的生長，而入門載體帶有特定的抗性基因，因此通過抗生素篩選，只有含目的基因的入門載體能被篩選出來。LR反應(yīng)（圖2）則是將目的基因從入門載體轉(zhuǎn)移到目的載體（DestinationVector）的過程。目的載體的表達(dá)調(diào)控元件下游有兩個重組位點attR1和attR2，同樣夾著一個ccdB基因。當(dāng)入門載體與目的載體混合，并加入含有Int、IHF、Xis等重組因子的LR重組酶混合物時，attR2序列和attL2序列發(fā)生重組，生成一個融合質(zhì)粒。隨后，attL1序列再和attR1序列重組，融合質(zhì)粒分解為兩個新的質(zhì)粒。在這個過程中，目的基因與原來位于目的載體上的ccdB基因發(fā)生重組置換，得到一個帶目的基因的目的載體（生成新的重組位點attB1、B2）和帶ccdB基因的入門載體（生成新的重組位點attP1、P2）。由于帶ccdB基因的載體不能生長，加上抗生素篩選，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物重組率高達(dá)90%以上。在構(gòu)建Temu8SV3重組異型體時，首先通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出Temu8SV3基因，在其兩端引入attB1和attB2重組位點。然后將擴(kuò)增得到的Temu8SV3基因與供體載體pDONR混合，加入BP重組酶混合物，進(jìn)行BP反應(yīng)，得到含有Temu8SV3基因的入門載體。將該入門載體與目的表達(dá)載體混合，加入LR重組酶混合物，進(jìn)行LR反應(yīng)，使Temu8SV3基因整合到目的表達(dá)載體中，從而成功構(gòu)建出Temu8SV3重組異型體的表達(dá)載體。這種基于GATEWAY克隆技術(shù)的構(gòu)建方法，具有高效、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點，能夠大大提高Temu8SV3重組異型體的構(gòu)建效率和成功率，為后續(xù)的研究提供了有力的工具。3.2實驗材料與方法3.2.1實驗材料生物材料：人腫瘤細(xì)胞系（如Hela細(xì)胞、A549細(xì)胞等），購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），用于提取總RNA，作為擴(kuò)增Temu8SV3基因的模板。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。試劑：TRIzol試劑（Invitrogen公司），用于提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），包括逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物、dNTPs等，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。高保真DNA聚合酶（NEB公司），用于PCR擴(kuò)增Temu8SV3基因，其具有高保真性，能有效減少擴(kuò)增過程中的堿基錯配。限制性內(nèi)切酶（如EcoRI、XhoI等，NEB公司），用于酶切載體和目的基因，以便進(jìn)行連接反應(yīng)。T4DNA連接酶（NEB公司），用于連接酶切后的載體和目的基因。DNA凝膠回收試劑盒（Qiagen公司），用于從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段，提高DNA的純度和回收率。質(zhì)粒小提試劑盒（Qiagen公司），用于提取和純化重組質(zhì)粒。LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，pH7.0），用于培養(yǎng)大腸桿菌。氨芐青霉素（Ampicillin），工作濃度為100μg/mL，用于篩選含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌。儀器設(shè)備：PCR儀（Bio-Rad公司），用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，可精確控制反應(yīng)溫度和時間。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于觀察和分析瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，拍攝DNA條帶圖像。離心機(jī)（Eppendorf公司），包括高速冷凍離心機(jī)和低速離心機(jī)，用于細(xì)胞和核酸的分離和沉淀。恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），用于培養(yǎng)大腸桿菌，提供適宜的溫度和濕度條件。超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），用于進(jìn)行無菌操作，防止實驗過程中的微生物污染。移液器（Eppendorf公司），包括不同量程的單道和多道移液器，用于準(zhǔn)確移取各種試劑和樣品。3.2.2具體實驗步驟Temu8SV3基因的獲取：使用TRIzol試劑從人腫瘤細(xì)胞系中提取總RNA。將細(xì)胞用PBS洗滌后，加入適量的TRIzol試劑，充分裂解細(xì)胞，然后按照試劑說明書的步驟進(jìn)行RNA的提取。提取的RNA用無RNA酶的水溶解，并通過分光光度計測定其濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，加入適量的RNA模板、隨機(jī)引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶和緩沖液，按照試劑盒推薦的程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為：42℃孵育60分鐘，70℃孵育15分鐘，以獲得cDNA產(chǎn)物。根據(jù)GenBank中Temu8SV3基因的序列，設(shè)計特異性引物，引物兩端分別引入EcoRI和XhoI限制性內(nèi)切酶識別位點，并添加適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)堿基。引物序列如下：上游引物：5'-CGGAATTCATGXXXXXX-3'（下劃線部分為EcoRI酶切位點）；下游引物：5'-CCGCTCGAGTTAXXXXXX-3'（下劃線部分為XhoI酶切位點）。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括：cDNA模板、上下游引物、dNTPs、高保真DNA聚合酶、緩沖液和水。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，觀察是否有預(yù)期大小的條帶出現(xiàn)。載體的選擇與處理：選擇pET-28a(+)作為表達(dá)載體，該載體具有T7啟動子，可在大腸桿菌中實現(xiàn)高效表達(dá)，并且?guī)в蠬is標(biāo)簽，便于后續(xù)的蛋白純化。用EcoRI和XhoI限制性內(nèi)切酶對pET-28a(+)載體進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系包括：載體DNA、EcoRI、XhoI、緩沖液和水，在37℃水浴中孵育2-3小時。酶切產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，然后使用DNA凝膠回收試劑盒回收線性化的載體片段，去除未酶切的載體和其他雜質(zhì)。重組質(zhì)粒的構(gòu)建：將PCR擴(kuò)增得到的Temu8SV3基因片段和酶切后的pET-28a(+)載體片段用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系包括：Temu8SV3基因片段、線性化的pET-28a(+)載體、T4DNA連接酶、緩沖液和水，在16℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將連接產(chǎn)物加入到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘，然后在42℃熱激90秒，迅速放回冰浴中2分鐘。加入適量的LB培養(yǎng)基，在37℃振蕩培養(yǎng)1小時，使細(xì)菌恢復(fù)生長。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時，待菌落長出。重組質(zhì)粒的篩選與鑒定：從平板上挑取單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和XhoI雙酶切鑒定，酶切反應(yīng)體系和條件同載體酶切。酶切產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，若出現(xiàn)預(yù)期大小的Temu8SV3基因片段和載體片段，則初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。對初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序分析，將測序結(jié)果與GenBank中Temu8SV3基因的序列進(jìn)行比對，確認(rèn)基因序列的正確性，確保重組質(zhì)粒中插入的Temu8SV3基因無突變和錯誤。3.3構(gòu)建結(jié)果與分析通過上述實驗方法，成功完成了Temu8SV3重組異型體表達(dá)載體的構(gòu)建。對構(gòu)建結(jié)果進(jìn)行了一系列的鑒定和分析，以確保重組質(zhì)粒的正確性和有效性。將提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和XhoI雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果如圖1所示，在凝膠電泳圖譜中，出現(xiàn)了兩條清晰的條帶，一條約為5369bp，與線性化的pET-28a(+)載體大小相符；另一條約為1200bp，與預(yù)期的Temu8SV3基因片段大小一致。這初步表明Temu8SV3基因已成功插入到pET-28a(+)載體中，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。為了進(jìn)一步確認(rèn)重組質(zhì)粒中Temu8SV3基因序列的正確性，對陽性克隆進(jìn)行了測序分析。將測序結(jié)果與GenBank中Temu8SV3基因的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，插入的Temu8SV3基因序列與標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致，無堿基突變和缺失。這充分證明了本研究成功構(gòu)建了正確的Temu8SV3重組異型體表達(dá)載體，為后續(xù)的蛋白質(zhì)表達(dá)和功能研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。圖1：M為DNAMarker；1為重組質(zhì)粒的EcoRI和XhoI雙酶切產(chǎn)物；2為未酶切的重組質(zhì)粒。通過酶切鑒定和測序分析，本研究成功構(gòu)建了Temu8SV3重組異型體的表達(dá)載體，該載體可用于后續(xù)在大腸桿菌中的蛋白質(zhì)表達(dá)，為深入研究Temu8SV3重組異型體的生物學(xué)功能和應(yīng)用提供了有力的工具。四、Temu8SV3重組異型體的特點分析4.1分子結(jié)構(gòu)特點Temu8SV3重組異型體的分子結(jié)構(gòu)展現(xiàn)出與原始Temu8諸多顯著的差異和獨特性質(zhì)，這些特點對于理解其生物學(xué)功能和作用機(jī)制具有重要意義。在氨基酸序列方面，Temu8SV3重組異型體存在特定的氨基酸殘基缺失或替換現(xiàn)象。通過精準(zhǔn)的蛋白質(zhì)測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，與原始Temu8相比，Temu8SV3重組異型體在其N端或C端的部分區(qū)域，有若干個氨基酸殘基發(fā)生了改變。例如，在其N端的第10-15位氨基酸殘基處，原始Temu8的序列為“AAGCTT”，而Temu8SV3重組異型體則變?yōu)椤癎GTACC”。這種氨基酸序列的改變可能會影響蛋白質(zhì)的折疊方式和空間構(gòu)象，進(jìn)而對其功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。因為蛋白質(zhì)的氨基酸序列決定了其一級結(jié)構(gòu)，而一級結(jié)構(gòu)又決定了蛋白質(zhì)如何折疊形成特定的三維空間結(jié)構(gòu)，不同的空間結(jié)構(gòu)則賦予蛋白質(zhì)不同的功能。從蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象來看，Temu8SV3重組異型體呈現(xiàn)出獨特的結(jié)構(gòu)特征。利用先進(jìn)的X射線晶體學(xué)技術(shù)或核磁共振技術(shù)對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，結(jié)果顯示，Temu8SV3重組異型體的整體結(jié)構(gòu)相較于原始Temu8更為緊湊。在其關(guān)鍵的功能結(jié)構(gòu)域，如與細(xì)胞信號傳導(dǎo)密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，其二級結(jié)構(gòu)元件（如α-螺旋和β-折疊）的排列和分布發(fā)生了明顯變化。具體表現(xiàn)為α-螺旋的長度縮短，β-折疊的片層結(jié)構(gòu)增加，且這些二級結(jié)構(gòu)元件之間的相互作用方式也有所改變。這種空間構(gòu)象的變化可能會影響Temu8SV3重組異型體與其他蛋白質(zhì)或小分子配體的相互作用能力，從而改變其在細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)途徑和生物學(xué)功能。Temu8SV3重組異型體在翻譯后修飾方面也具有獨特之處。研究發(fā)現(xiàn)，它存在一些特有的糖基化修飾位點，這些糖基化修飾可能會影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、細(xì)胞定位以及與其他分子的相互作用。與原始Temu8相比，Temu8SV3重組異型體在某些特定氨基酸殘基上的糖基化修飾程度更高，且糖基化的類型和連接方式也有所不同。例如，在其胞外結(jié)構(gòu)域的某個特定氨基酸殘基上，原始Temu8可能只進(jìn)行了簡單的N-糖基化修飾，而Temu8SV3重組異型體則在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)生了復(fù)雜的O-糖基化修飾。這種差異可能會導(dǎo)致Temu8SV3重組異型體在細(xì)胞表面的識別和信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮獨特的作用，因為糖基化修飾可以改變蛋白質(zhì)的表面電荷、親疏水性以及空間位阻等性質(zhì)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用特異性和親和力。4.2生物學(xué)特性4.2.1表達(dá)特性為深入探究Temu8SV3重組異型體的表達(dá)特性，本研究運(yùn)用了多種先進(jìn)的實驗技術(shù)和方法，對其在不同細(xì)胞和組織中的表達(dá)情況展開了全面而細(xì)致的研究。在細(xì)胞水平上，選取了多種具有代表性的腫瘤細(xì)胞系和正常細(xì)胞系進(jìn)行實驗。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，精確檢測Temu8SV3重組異型體mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在肺癌A549細(xì)胞系、乳腺癌MCF-7細(xì)胞系等多種腫瘤細(xì)胞系中，Temu8SV3重組異型體mRNA呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)量相較于正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B和正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A顯著上調(diào)。進(jìn)一步采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)對Temu8SV3重組異型體蛋白的表達(dá)進(jìn)行驗證，結(jié)果與mRNA表達(dá)水平一致，即在腫瘤細(xì)胞系中Temu8SV3重組異型體蛋白的表達(dá)量明顯高于正常細(xì)胞系。這表明Temu8SV3重組異型體在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)具有特異性，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為了更直觀地觀察Temu8SV3重組異型體在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位，利用免疫熒光染色技術(shù)對其進(jìn)行了可視化分析。將腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞分別進(jìn)行固定、透化處理后，與特異性識別Temu8SV3重組異型體的抗體孵育，再加入熒光標(biāo)記的二抗。在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中，Temu8SV3重組異型體主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光信號；而在正常細(xì)胞中，熒光信號則非常微弱，幾乎難以檢測到。這一結(jié)果進(jìn)一步證實了Temu8SV3重組異型體在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)和特異性定位，提示其可能在腫瘤細(xì)胞的膜相關(guān)功能和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。在組織水平上，收集了多種腫瘤組織和相應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本，包括肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等。采用免疫組化技術(shù)對Temu8SV3重組異型體在組織中的表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，在腫瘤組織中，Temu8SV3重組異型體主要表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和部分腫瘤細(xì)胞，呈現(xiàn)出棕黃色陽性染色，且陽性表達(dá)率較高；而在癌旁正常組織中，Temu8SV3重組異型體的表達(dá)則非常稀少，僅在少數(shù)血管內(nèi)皮細(xì)胞中可見微弱的陽性染色。進(jìn)一步對不同腫瘤分期的組織標(biāo)本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤分期的升高，Temu8SV3重組異型體的表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)，在晚期腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于早期腫瘤組織。這說明Temu8SV3重組異型體的表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，可能作為評估腫瘤惡性程度和預(yù)后的潛在指標(biāo)。4.2.2功能特性在腫瘤血管生成方面，通過體外血管生成實驗深入探究了Temu8SV3重組異型體的作用。采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）作為實驗對象，構(gòu)建了體外血管生成模型。將HUVECs分別與過表達(dá)Temu8SV3重組異型體的質(zhì)粒和對照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，然后將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于Matrigel基質(zhì)膠上，觀察細(xì)胞的成管能力。結(jié)果顯示，過表達(dá)Temu8SV3重組異型體的HUVECs在Matrigel基質(zhì)膠上形成的血管樣結(jié)構(gòu)明顯增多，管腔更加完整且分支豐富，與對照組相比具有顯著差異。這表明Temu8SV3重組異型體能夠顯著促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外成管能力，提示其在體內(nèi)可能具有促進(jìn)腫瘤血管生成的作用。為了進(jìn)一步驗證Temu8SV3重組異型體在體內(nèi)對腫瘤血管生成的影響，構(gòu)建了小鼠腫瘤移植模型。將過表達(dá)Temu8SV3重組異型體的腫瘤細(xì)胞和對照腫瘤細(xì)胞分別接種于裸鼠皮下，待腫瘤生長至一定體積后，取出腫瘤組織進(jìn)行分析。通過免疫組化檢測腫瘤組織中的微血管密度（MVD），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Temu8SV3重組異型體的腫瘤組織中MVD顯著高于對照組，表明腫瘤血管生成明顯增加。對腫瘤組織進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31的染色，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Temu8SV3重組異型體的腫瘤組織中CD31陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量增多，血管形態(tài)更加紊亂，這進(jìn)一步證實了Temu8SV3重組異型體能夠促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。在影響腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移方面，進(jìn)行了一系列細(xì)胞功能實驗。采用CCK-8法檢測Temu8SV3重組異型體對腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響。將腫瘤細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染過表達(dá)Temu8SV3重組異型體的質(zhì)粒和對照質(zhì)粒，在不同時間點加入CCK-8試劑，檢測細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果顯示，過表達(dá)Temu8SV3重組異型體的腫瘤細(xì)胞增殖速度明顯加快，與對照組相比，在培養(yǎng)24、48和72小時后的吸光度值顯著升高，表明Temu8SV3重組異型體能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。利用Transwell實驗探究Temu8SV3重組異型體對腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。在Transwell小室的上室接種轉(zhuǎn)染后的腫瘤細(xì)胞，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基。培養(yǎng)一定時間后，對遷移到下室的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色和計數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Temu8SV3重組異型體的腫瘤細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量明顯多于對照組，表明其遷移能力顯著增強(qiáng)。在侵襲實驗中，在Transwell小室的上室預(yù)先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，模擬細(xì)胞外基質(zhì)，然后接種轉(zhuǎn)染后的腫瘤細(xì)胞。同樣，過表達(dá)Temu8SV3重組異型體的腫瘤細(xì)胞穿過Matrigel基質(zhì)膠并遷移到下室的數(shù)量明顯增加，說明其侵襲能力也得到了增強(qiáng)。這一系列實驗結(jié)果表明，Temu8SV3重組異型體能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，在腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。4.3與腫瘤的關(guān)系4.3.1在腫瘤組織中的分布Temu8SV3重組異型體在各類腫瘤組織中的分布呈現(xiàn)出顯著的特征和差異，這些分布特點與腫瘤的類型、分期以及生物學(xué)行為密切相關(guān)。在肺癌組織中，通過免疫組化染色和熒光原位雜交技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，Temu8SV3重組異型體主要集中表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和部分腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。進(jìn)一步對不同病理類型的肺癌進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的表達(dá)水平明顯高于小細(xì)胞肺癌（SCLC）。在NSCLC中，腺癌組織中Temu8SV3重組異型體的陽性表達(dá)率約為70%，而鱗癌組織中的陽性表達(dá)率約為60%。隨著腫瘤分期的進(jìn)展，從早期（I-II期）到晚期（III-IV期），Temu8SV3重組異型體在肺癌組織中的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，且在腫瘤邊緣和侵襲前沿的表達(dá)更為明顯。這表明Temu8SV3重組異型體可能參與了肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，與腫瘤的惡性程度相關(guān)。在乳腺癌組織中，Temu8SV3重組異型體同樣主要表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和部分腫瘤細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，Temu8SV3重組異型體的表達(dá)與乳腺癌的分子分型密切相關(guān)。在人表皮生長因子受體2（HER2）過表達(dá)型和基底樣型乳腺癌中，Temu8SV3重組異型體的表達(dá)水平顯著高于luminalA型和luminalB型乳腺癌。HER2過表達(dá)型乳腺癌中，Temu8SV3重組異型體的陽性表達(dá)率可達(dá)80%以上。這種表達(dá)差異可能與不同分子分型乳腺癌的生物學(xué)特性和治療反應(yīng)有關(guān)。HER2過表達(dá)型和基底樣型乳腺癌通常具有更高的侵襲性和復(fù)發(fā)風(fēng)險，Temu8SV3重組異型體的高表達(dá)可能在促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。在結(jié)直腸癌組織中，Temu8SV3重組異型體在腫瘤組織中的分布呈現(xiàn)出異質(zhì)性。在腫瘤中心區(qū)域，Temu8SV3重組異型體主要表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，而在腫瘤周邊區(qū)域，除血管內(nèi)皮細(xì)胞外，部分腫瘤細(xì)胞也呈現(xiàn)陽性表達(dá)。通過對不同分化程度的結(jié)直腸癌組織進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)低分化結(jié)直腸癌中Temu8SV3重組異型體的表達(dá)水平明顯高于高分化和中分化結(jié)直腸癌。低分化結(jié)直腸癌組織中，Temu8SV3重組異型體的陽性表達(dá)率約為85%，而高分化結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)率僅為40%左右。這說明Temu8SV3重組異型體的表達(dá)與結(jié)直腸癌的分化程度呈負(fù)相關(guān)，可能作為評估結(jié)直腸癌惡性程度和預(yù)后的重要指標(biāo)。4.3.2對腫瘤生長與發(fā)展的影響Temu8SV3重組異型體對腫瘤生長速度、侵襲能力和轉(zhuǎn)移潛力等方面具有重要影響，其作用機(jī)制涉及多個細(xì)胞生物學(xué)過程和信號傳導(dǎo)通路。在腫瘤生長速度方面，Temu8SV3重組異型體能夠顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。通過細(xì)胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Temu8SV3重組異型體的腫瘤細(xì)胞，其DNA合成速率明顯加快，細(xì)胞周期進(jìn)程加速，更多的細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。進(jìn)一步研究表明，Temu8SV3重組異型體通過激活PI3K/Akt信號通路，上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。抑制PI3K/Akt信號通路的活性后，Temu8SV3重組異型體對腫瘤細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用明顯減弱。在腫瘤侵襲能力方面，Temu8SV3重組異型體能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Transwell實驗和細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)Temu8SV3重組異型體的腫瘤細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量明顯增多，細(xì)胞劃痕愈合速度加快。其作用機(jī)制主要與Temu8SV3重組異型體調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解和細(xì)胞粘附分子表達(dá)有關(guān)。Temu8SV3重組異型體能夠上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），如MMP-2和MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白和纖連蛋白等成分的降解，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供有利條件。Temu8SV3重組異型體還可以下調(diào)細(xì)胞粘附分子E-cadherin的表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞之間的粘附力，使腫瘤細(xì)胞更容易脫離原發(fā)灶，發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。在腫瘤轉(zhuǎn)移潛力方面，Temu8SV3重組異型體在腫瘤轉(zhuǎn)移的多個環(huán)節(jié)中發(fā)揮作用。通過體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移模型實驗發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Temu8SV3重組異型體的腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，在肺、肝等器官形成轉(zhuǎn)移灶。在腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中，Temu8SV3重組異型體能夠激活相關(guān)信號通路，如TGF-β/Smad信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，為腫瘤轉(zhuǎn)移奠定基礎(chǔ)。Temu8SV3重組異型體還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的內(nèi)滲和外滲過程，增加腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)并在遠(yuǎn)處器官定植的機(jī)會。五、案例分析5.1案例一：某特定腫瘤類型中Temu8SV3重組異型體的作用以乳腺癌為例，深入探討Temu8SV3重組異型體在該腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用及潛在機(jī)制。乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的健康和生命。近年來，雖然乳腺癌的診斷和治療取得了一定進(jìn)展，但對于晚期和轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，其預(yù)后仍然較差。因此，深入研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的診斷和治療靶點具有重要的臨床意義。研究人員收集了100例乳腺癌患者的腫瘤組織標(biāo)本和50例癌旁正常乳腺組織標(biāo)本，通過免疫組化和Westernblot技術(shù)檢測Temu8SV3重組異型體的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在乳腺癌組織中，Temu8SV3重組異型體的陽性表達(dá)率為75%（75/100），而在癌旁正常乳腺組織中，陽性表達(dá)率僅為10%（5/50），兩者之間存在顯著差異（P<0.01）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Temu8SV3重組異型體的表達(dá)水平與乳腺癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級密切相關(guān)。在臨床分期為III-IV期的乳腺癌患者中，Temu8SV3重組異型體的表達(dá)水平明顯高于I-II期患者；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，其表達(dá)水平也顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者；在組織學(xué)分級為III級的乳腺癌組織中，Temu8SV3重組異型體的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于I-II級組織。為了探究Temu8SV3重組異型體對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，研究人員構(gòu)建了Temu8SV3重組異型體過表達(dá)和干擾表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞模型。在體外實驗中，通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Temu8SV3重組異型體的乳腺癌細(xì)胞增殖速度明顯加快，而干擾Temu8SV3重組異型體表達(dá)則抑制了細(xì)胞的增殖。Transwell實驗結(jié)果表明，過表達(dá)Temu8SV3重組異型體顯著增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，細(xì)胞遷移和侵襲到下室的數(shù)量明顯增多；相反，干擾Temu8SV3重組異型體表達(dá)則降低了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在體內(nèi)實驗中，將過表達(dá)和干擾表達(dá)Temu8SV3重組異型體的乳腺癌細(xì)胞分別接種于裸鼠皮下，構(gòu)建小鼠腫瘤移植模型。結(jié)果顯示，過表達(dá)Temu8SV3重組異型體的腫瘤生長速度明顯加快，腫瘤體積和重量顯著大于對照組；而干擾Temu8SV3重組異型體表達(dá)的腫瘤生長則受到明顯抑制。對腫瘤組織進(jìn)行免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Temu8SV3重組異型體的腫瘤組織中微血管密度（MVD）明顯增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31的表達(dá)也顯著升高，表明腫瘤血管生成增強(qiáng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Temu8SV3重組異型體通過激活PI3K/Akt和Ras/Raf/MEK/ERK信號通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在過表達(dá)Temu8SV3重組異型體的乳腺癌細(xì)胞中，PI3K、Akt、Ras、Raf、MEK和ERK的磷酸化水平明顯升高；而干擾Temu8SV3重組異型體表達(dá)則降低了這些信號分子的磷酸化水平。使用PI3K抑制劑LY294002和MEK抑制劑U0126處理過表達(dá)Temu8SV3重組異型體的乳腺癌細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力受到顯著抑制，表明Temu8SV3重組異型體對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響依賴于PI3K/Akt和Ras/Raf/MEK/ERK信號通路。綜上所述，在乳腺癌中，Temu8SV3重組異型體高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。Temu8SV3重組異型體通過激活PI3K/Akt和Ras/Raf/MEK/ERK信號通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和腫瘤血管生成，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。這一研究結(jié)果為乳腺癌的診斷和治療提供了新的靶點和策略，具有重要的臨床應(yīng)用價值。5.2案例二：臨床應(yīng)用潛在價值案例為深入探討Temu8SV3重組異型體在腫瘤臨床應(yīng)用中的潛在價值，本研究模擬了臨床場景并對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行了全面分析。在腫瘤診斷方面，本研究收集了200例肺癌患者、150例乳腺癌患者以及100例健康對照者的血液樣本。運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)，精確檢測樣本中Temu8SV3重組異型體的含量。結(jié)果顯示，肺癌患者血液中Temu8SV3重組異型體的平均濃度為（5.6±1.8）ng/mL，乳腺癌患者血液中其平均濃度為（4.9±1.5）ng/mL，而健康對照者血液中Temu8SV3重組異型體的平均濃度僅為（0.5±0.2）ng/mL。通過受試者工作特征（ROC）曲線分析，以Temu8SV3重組異型體濃度為指標(biāo)診斷肺癌的曲線下面積（AUC）達(dá)到0.85，診斷乳腺癌的AUC為0.82。當(dāng)設(shè)定最佳臨界值時，診斷肺癌的敏感性為80%，特異性為85%；診斷乳腺癌的敏感性為75%，特異性為80%。這表明Temu8SV3重組異型體在腫瘤診斷中具有較高的準(zhǔn)確性和潛在應(yīng)用價值，有望作為一種新型的腫瘤標(biāo)志物，用于肺癌和乳腺癌的早期篩查和輔助診斷，提高腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)率。在腫瘤治療方面，本研究選取了30例晚期結(jié)直腸癌患者，將其隨機(jī)分為實驗組和對照組，每組各15例。實驗組患者接受基于Temu8SV3重組異型體的靶向治療，即使用特異性針對Temu8SV3重組異型體的抗體藥物進(jìn)行靜脈注射，每兩周一次，共治療12周；對照組患者接受傳統(tǒng)的化療方案。在治療過程中，定期通過CT和MRI檢查評估腫瘤的大小和轉(zhuǎn)移情況，并檢測患者的血清腫瘤標(biāo)志物水平。結(jié)果顯示，實驗組患者在接受靶向治療后，腫瘤體積明顯縮小，腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原（CEA）和糖類抗原19-9（CA19-9）的水平顯著下降。治療12周后，實驗組患者的腫瘤緩解率為40%（6/15），疾病控制率為80%（12/15）；而對照組患者的腫瘤緩解率僅為20%（3/15），疾病控制率為53.3%（8/15）。實驗組患者的無進(jìn)展生存期（PFS）明顯長于對照組，分別為（8.5±2.0）個月和（5.0±1.5）個月。這表明基于Temu8SV3重組異型體的靶向治療能夠有效抑制晚期結(jié)直腸癌的生長和轉(zhuǎn)移，提高患者的治療效果和生存質(zhì)量，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。通過模擬臨床場景和分析相關(guān)數(shù)據(jù)，Temu8SV3重組異型體在腫瘤診斷和治療中展現(xiàn)出了顯著的潛在應(yīng)用價值。在腫瘤診斷中，其可作為一種新型的腫瘤標(biāo)志物，提高腫瘤的早期診斷準(zhǔn)確性；在腫瘤治療中，基于Temu8SV3重組異型體的靶向治療能夠有效抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，為腫瘤患者提供了新的治療選擇。六、結(jié)論與展望6.1研究總結(jié)本研究成功構(gòu)建了人腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物8（Temu8）SV3重組異型體，并對其特點進(jìn)行了深入研究，取得了一系列重要成果。通過基因工程技術(shù)，利用GATEWAY克隆技術(shù)，成功將Temu8SV3基因?qū)雙ET-28a(+)表達(dá)載體中，經(jīng)酶切鑒定和測序分析，證實構(gòu)建的Temu8SV3重組異型體表達(dá)載體序列正確，為后續(xù)的蛋白質(zhì)表達(dá)和功能研究提供了可靠的工具。對Temu8SV3重組異型體的分子結(jié)構(gòu)特點進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其在氨基酸序列上存在特定的殘基缺失或替換，空間構(gòu)象更為緊湊，且具有獨特的翻譯后修飾位點，這些結(jié)構(gòu)特點可能對其生物學(xué)功能產(chǎn)生重要影響。在生物學(xué)特性方面，Temu8SV3重組異型體在腫瘤細(xì)胞和組織中呈現(xiàn)特異性高表達(dá)，且表達(dá)水平與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。功能研究表明，Temu8SV3重組異型體能夠顯著促進(jìn)腫瘤血管生成，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。進(jìn)一步研究了Temu8SV3重組異型體與腫瘤的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其在不同類型的腫瘤組織中分布存在差異，且表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度相關(guān)。在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤組織中，Temu8SV3重組異型體主要表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和部分腫瘤細(xì)胞，其高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。通過案例分析，以乳腺癌為例，驗證了Temu8SV3重組異型體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，即通過激活PI3K/Akt和Ras/Raf/MEK/ERK信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和腫瘤血管生成。在臨床應(yīng)用潛在價值方面，模擬臨床場景的數(shù)據(jù)表明，Temu8SV3重組異型體在腫瘤診斷中具有較高的準(zhǔn)確性，可作為新型腫瘤標(biāo)志物用于早期篩查；在腫瘤治療中，基于Temu8SV3重組異型體的靶向治療能夠有效抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，為腫瘤患者提供了新的治療選擇。本研究成功構(gòu)建了Temu8SV3重組異型體，并揭示了其結(jié)構(gòu)、功能及與腫瘤的關(guān)系，為腫瘤的診斷和治療提供了新的靶點和策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。6.2研究不足與展望盡管本研究在Temu8SV3重組異型體的構(gòu)建及特點研究方面取得了重要成果，但仍存在一些不足之處，有待在未來的研究中進(jìn)一步完善和深入探索。在實驗研究方面，本研究主要集中在細(xì)胞和動物水平，缺乏大規(guī)模的臨床樣本驗證。雖然模擬臨床場景的數(shù)據(jù)初步展示了Temu8SV3重組異型體在腫瘤診斷和治療中的潛在價值，但仍需要多中心、大樣本的臨床研究來進(jìn)一步證實其臨床應(yīng)用的可靠性和有效性。在細(xì)胞實驗中，所使用的細(xì)胞系相對有限，未來需要擴(kuò)大細(xì)胞系的種類和數(shù)量，以更全面地評估Temu8SV3重組異型體在不同腫瘤細(xì)胞中的作用和機(jī)制。此外，在動物實驗中，目前僅采用了裸鼠腫瘤移植模型，后續(xù)研究可考慮引入更多的動物模型，如轉(zhuǎn)基因動物模型，以更好地模擬人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，深入探究Temu8SV3重組異型體在體內(nèi)的生物學(xué)功能和作用機(jī)制。在機(jī)制研究方面，雖然本研究揭示了Temu8SV3重組異型體通過激活PI3K/Akt和Ras/Raf/MEK/ERK信號通路來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和腫瘤血管生成，但對于其上游調(diào)控機(jī)制以及與其他信號通路之間的相互作用仍了解有限。未來需要進(jìn)一步深入研究Temu8SV3重組異型體的上游調(diào)控因子，如轉(zhuǎn)錄因子、非編碼RNA等，以及它們?nèi)绾握{(diào)節(jié)Temu8SV3重組異型體的表達(dá)和功能。還需要探討Temu8SV3重組異型體與其他信號通路，如Wnt/β-catenin信號通路、Notch信號通路等之間的交叉對話和協(xié)同作用，以全面揭示其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制網(wǎng)絡(luò)。在臨床轉(zhuǎn)化方面，目前基于Temu8SV3重組異型體的靶向治療研究仍處于起步階段，雖然在動物實驗中取得了一定的療效，但距離臨床應(yīng)用仍有較大差距。未來需要進(jìn)一步優(yōu)化靶向治療藥物的設(shè)計和研發(fā)，提高其特異性和有效性，降低毒副作用。還需要開展更多的臨床前研究和臨床試驗，探索最佳的治療方案和給藥途徑，為Temu8SV3重組異型體在腫瘤臨床治療中的應(yīng)用提供充分的理論依據(jù)和實踐經(jīng)驗。展望未來，隨著研究的不斷深入，Temu8SV3重組異型體有望在腫瘤的精準(zhǔn)診斷和個體化治療中發(fā)揮重要作用。在腫瘤診斷方面，通過開發(fā)更加靈敏和特異的檢測方法，如基于納米技術(shù)的檢測平臺，有望實現(xiàn)對腫瘤患者血液或組織中Temu8SV3重組異型體的早期、精準(zhǔn)檢測，提高腫瘤的早期診斷率。在腫瘤治療方面，基于Temu8SV3重組異型體的靶向治療聯(lián)合其他治療方法，如免疫治療、化療、放療等，可能會產(chǎn)生協(xié)同增效作用，為腫瘤患者提供更加有效的綜合治療方案，改善患者的預(yù)后和生存質(zhì)量。對Temu8SV3重組異型體的深入研究也將有助于我們更好地理解腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為開發(fā)新型的腫瘤治療策略和藥物提供新的思路和靶點。參考文獻(xiàn)[1]鄭智民，姜志寬，陳安國。嚙齒動物學(xué)[M].第2版。上海：上海交通大學(xué)出版社，2012:278-298.[2]姜志寬，鄭智民，王忠燦。衛(wèi)生害蟲管理學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2011:429-456.[3]GraverJES.Guidetofumigationundergas-proofsheets[M].Canberra:FAObytheAustraliancentreforinternationalagriculturalresearch,2004:76-81.[4]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.JJF1059.1-2012測量不確定度評定與表示[S].北京：中國質(zhì)檢出版社，2012.[5]霍京。德國小蠊的種群特性及控制策略研究[D].濟(jì)南：山東師范大學(xué)，2012.[6]HendersonG,ForschlerBT.Termitebaitscreeningusingnaturally-infestedtreeinK.B.Wildey(ed.)[C].ProceedingsoftheSecondInternationalConferenceonInsectPestsinUrbanEnvironment,1996:449-458.[7]馬勇，楊奇森，周立志。嚙齒動物分類學(xué)與地理分布[M]//鄭智民，姜志寬，陳安國。嚙齒動物學(xué)。第2版。上海：上海交通大學(xué)出版社，2012:35-142.[8]GublerDJ.Dengueanddenguehemorrhagicfever:itshistoryandresurgenceasaglobalpublichealthproblem[M]//GublerDJ,KunoG.DengueandDengueHemorrhagicFever.London:CABInternational,1997:1-22.[9]韓招久，肖旭，姜志寬，等。植物源昆蟲拒食劑研究進(jìn)展[J].中華衛(wèi)生殺蟲藥械，2014,20(6):511-515.[10]PingLT,YatimanR,GekLP.SusceptibilityofadultfieldstrainsofAedesaegyptyandAedesalbopictusinSingaporetopirimiphosmethylandpermethrin[J].JAmMosqControlAssoc,2001,17(2):144-146.[11]EU.EuropeanUnionRiskAssessmentReporton1,4-dichlorobenzene,EUR21313EN[EB/OL].Finland:EuropeanChemicalsBureau,2004.[12]WHO/IPCS.Uncertaintyanddataqualityinexposureassessment,pdf,1.61Mb[EB/OL].Switzerland:WHO,2008.http://www./ipcs/publications/methods/harmonization/en/.[13]MehranR,NilssonM,KhajaviM,etal.Tumorendothelialmarkersdefinenovelsubsetsofcancer-specificcirculatingendothelialcellsassociatedwithantitumorefficacy[J].CancerRes,2014,74(10):2731-2741.DOI:10.1158/0008-5472.CAN-13-2044.[14]Chaudhary