α-Arbutinandother3kindsofcomponentsincosmetic

1范圍

本方法規(guī)定了高效液相色譜法測定化妝品中α-熊果苷、熊果苷、氫醌和苯酚的含量。

本方法適用于液態(tài)水基類、膏霜乳液類、凝膠類、面膜類、粉類化妝品中α-熊果苷、熊果

苷、氫醌和苯酚含量的測定。

2方法提要

樣品經甲醇超聲提取后，采用高效液相色譜系統(tǒng)分離，熒光檢測器檢測，根據保留時間定

性，峰面積定量，以標準曲線法計算含量。如有陽性結果，應用液相色譜-串聯質譜法、氣相

色譜-串聯質譜法進行定性確證。

本方法中α-熊果苷、熊果苷、氫醌和苯酚的檢出限、定量下限及取樣量為1.0g時檢出濃度

和最低定量濃度見表1。

表1α-熊果苷、熊果苷、氫醌和苯酚的檢出限、定量下限、檢出濃度和最低定量濃度

檢出限定量下限檢出濃度最低定量濃度

序號原料名稱

（ng）（ng）（μg/g）（μg/g）

1α-熊果苷1.02.52.05.0

2熊果苷1.02.52.05.0

3氫醌0.100.300.200.60

4苯酚0.100.300.200.60

注：本方法中的熊果苷即指β-熊果苷。

3試劑和材料

除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。

3.1甲醇，色譜純。

3.2微孔濾膜（0.45μm）。

3.3標準品：α-熊果苷等4種原料的標準品信息詳見附錄A。

3.4標準儲備溶液：分別稱取α-熊果苷等4種原料標準品（3.3）各10mg（精確至0.00001g），

置于不同10mL容量瓶中，用甲醇（3.1）溶解并定容至刻度，配制成濃度均為1mg/mL的標準

儲備溶液。

4儀器和設備

4.1高效液相色譜儀，熒光檢測器。

4.2天平。

4.3離心機，轉速不低于14000r/min。

4.4超聲波清洗器。

4.5渦旋振蕩器。

5分析步驟

5.1混合標準溶液的制備

分別準確量取α-熊果苷標準儲備溶液（3.4）1mL、熊果苷標準儲備溶液（3.4）1mL、氫

醌標準儲備溶液（3.4）0.1mL和苯酚標準儲備溶液（3.4）0.2mL，置同一個10mL容量瓶中，

用甲醇（3.1）定容至刻度，配制成α-熊果苷、熊果苷、氫醌和苯酚濃度分別為100、100、10、

20μg/mL的混合標準溶液。

5.2混合標準系列溶液的制備

準確量取不同體積的混合標準溶液（5.1），用甲醇（3.1）配制成濃度如表2所示的混合標

準系列溶液。

表2標準儲備溶液濃度及混合標準系列溶液濃度

標準儲備溶液濃度混合標準溶液濃度混合標準系列溶液濃度

序號原料名稱

（μg/mL）（μg/mL）（μg/mL）

1α-熊果苷10001000.250.512820

2熊果苷10001000.250.512820

3氫醌1000100.0250.050.10.20.82

4苯酚1000200.050.10.20.41.64

5.3樣品處理

稱取樣品1.0g（精確至0.001g），置10mL具塞比色管中，加入甲醇（3.1）至刻度，渦旋

振蕩30s，使樣品與提取溶劑充分混勻。密塞，超聲提取20min，放置至室溫，取適量樣品溶

液離心（轉速14000r/min）5min，取上清液經微孔濾膜（0.45μm）（3.2）過濾，取續(xù)濾液作

為待測溶液。必要時用適量甲醇（3.1）稀釋。

5.4參考色譜條件

色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm），或等效色譜柱；

流動相：A：水，B：甲醇（3.1）；梯度洗脫程序詳見表3；

柱溫：20℃；

流速：0.5mL/min；

進樣量：5μL；

檢測波長詳見表4。

表3流動相梯度洗脫程序

時間/minV（A）/%V（B）/%

0.0955

21.0955

22.05545

43.05050

48.05050

48.10100

50.00100

50.1955

60.0955

表4α-熊果苷、熊果苷、氫醌和苯酚的檢測波長

序號原料名稱激發(fā)波長（nm）發(fā)射波長（nm）

1α-熊果苷292337

2熊果苷292337

3氫醌298345

4苯酚280318

5.5測定

在“5.4”色譜條件下，取混合標準系列溶液（5.2）分別進樣，進行色譜分析，以標準系

列溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

取“5.3”項下的待測溶液進樣，根據保留時間定性，測得峰面積，根據標準曲線得到待

測溶液中α-熊果苷、熊果苷、氫醌和苯酚的濃度。按“6”計算樣品中α-熊果苷、熊果苷、氫

醌和苯酚的含量。必要時按附錄B方法進行定性確證。

6分析結果的表述

6.1計算

VD

m

式中：ω——樣品中待測原料的含量，μg/g；

ρ——從標準曲線得到待測原料的濃度，μg/mL；

V——樣品定容體積，mL；

m——樣品取樣量，g；

D——稀釋倍數（如未稀釋則為1）。

在重復性條件下獲得的兩次獨立測試結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。

6.2回收率和精密度

多家實驗室驗證的回收率為84.7%～114.4%，相對標準偏差小于10%（n=6）。

7圖譜

圖1混合標準溶液的液相色譜圖

1：熊果苷；2：α-熊果苷；3：氫醌；4：苯酚

附錄A

（資料性附錄）

表A.1α-熊果苷等4種原料標準品信息表

序號原料名稱CAS號分子式相對分子質量

1α-熊果苷84380-01-8C12H16O7272.25

2熊果苷497-76-7C12H16O7272.25

3氫醌123-31-9C6H6O2110.11

4苯酚108-95-2C6H6O94.11

附錄B

（資料性附錄）

α-熊果苷、熊果苷、氫醌和苯酚結果的定性確證

B.1α-熊果苷和熊果苷的液相色譜-串聯質譜法確證

B.1.1試劑和材料

B.1.1.1微孔濾膜（0.22μm）。

B.1.2儀器和設備

B.1.2.1液相色譜-串聯質譜聯用儀，帶電噴霧離子源（ESI源）。

B.1.2.2高速離心機，轉速不低于14000r/min。

B.1.3樣品處理

取正文“5.3樣品處理”項下待測溶液，加適量水稀釋至α-熊果苷、熊果苷的濃度在20～

200ng/mL之間，離心（轉速14000r/min）5min，取上清液，用微孔濾膜（B.1.1.1）過濾，取

續(xù)濾液作為待測溶液。

B.1.4參考色譜條件

色譜柱：C18柱（4.6mm×100mm，2.7μm），或等效色譜柱；

柱溫：20℃；

進樣量：2μL；

流動相：A：水，B：甲醇；梯度洗脫程序詳見表B.1；

流速：0.3mL/min。

表B.1流動相梯度洗脫程序

時間/minV（A）/%V（B）/%

0.0955

10.0955

12.0595

15.0595

15.1955

20.0955

B.1.5參考質譜條件（可根據儀器情況進行調整）

離子源：ESI源；

監(jiān)測模式：負離子多反應監(jiān)測模式，監(jiān)測離子對及相關電壓參數設定見表B.2。

表B.2質譜監(jiān)測離子對及相關電壓參數設定表

碰撞能量

序號原料名稱母離子（m/z）子離子（m/z）

（eV）

151.0?18

1α-熊果苷271.0

108.0?30

161.0?12

2熊果苷271.0

108.0?24

B.1.6定性判定

用液相色譜-串聯質譜法對樣品進行定性判定，在相同試驗條件下，樣品中應呈現兩個監(jiān)

測離子的色譜峰，樣品中各離子的保留時間應與相應標準溶液中各離子的保留時間一致；樣品

色譜圖中所選擇的監(jiān)測離子的相對豐度比與相當濃度標準溶液的離子相對豐度比的偏差不超過

表B.3規(guī)定范圍，則可以判斷樣品中存在相應待測物。

表B.3定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差

相對離子豐度（k）k>50%50%≥k>20%20%≥k>10%k≤10%

允許的最大偏差±20%±25%±30%±50%

B.1.7圖譜

圖B.1α-熊果苷、熊果苷混合標準溶液HPLC-MS/MS色譜圖

1：熊果苷；2：α-熊果苷

B.2氫醌的液相色譜-串聯質譜法確證

B.2.1試劑和材料

B.2.1.1甲醇（色譜純）。

B.2.1.2維生素C。

B.2.1.3氯化鈉。

B.2.1.4固相萃取小柱（60mg/3mL），吸附劑為含吡咯烷酮基的聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物。

B.2.1.5微孔濾膜（0.22μm）。

B.2.1.6進樣小瓶內襯管。

B.2.1.715%甲醇溶液：量取甲醇（B.2.1.1）15mL，用水稀釋至100mL。

B.2.1.8維生素C溶液：取維生素C（B.2.1.2）適量，用水溶解并配成濃度為100mg/mL的溶液。

B.2.2儀器和設備

B.2.2.1液相色譜-串聯質譜聯用儀，帶電噴霧離子源（ESI源）。

B.2.2.2旋轉蒸發(fā)儀。

B.2.2.3高速離心機，轉速不低于14000r/min。

B.2.3樣品處理

稱取樣品1.0g，準確加入15%甲醇溶液（B.2.1.7）10mL、維生素C溶液（B.2.1.8）0.2mL，

渦旋振蕩1min，再加入氯化鈉（B.2.1.3）2g，渦旋振蕩1min，離心（轉速14000r/min）15

min，取5mL上清液，待凈化。取固相萃取小柱（B.2.1.4），依次預先用甲醇（B.2.1.1）3mL、

水10mL進行活化。將待凈化液倒入小柱中，自然流盡后，用10mL水清洗小柱，待清洗液自

然流盡后，加甲醇（B.2.1.1）6mL洗脫，收集洗脫液于尖底燒瓶中，用旋轉蒸發(fā)儀（水浴溫度

35℃）減壓濃縮至近干，加甲醇（B.2.1.1）0.2mL，渦旋振蕩30s，用微孔濾膜（B.2.1.5）過

濾至內襯管中（B.2.1.6），作為待測溶液。

B.2.4參考色譜條件

色譜柱：C18柱（4.6mm×100mm，2.7μm），或等效色譜柱；

柱溫：20℃；

進樣量：5μL；

流動相：A：水，B：甲醇；梯度洗脫程序詳見表B.4；

流速：0.2mL/min。

表B.4流動相梯度洗脫程序

時間/minV（A）/%V（B）/%

0.09010

5.09010

10.07525

15.07228

16.02080

20.02080

20.19010

26.09010

B.2.5參考質譜條件（可根據儀器情況進行調整）

離子源：ESI源；

監(jiān)測模式：負離子多反應監(jiān)測模式，監(jiān)測離子對及相關電壓參數設定見表B.5。

表B.5質譜監(jiān)測離子對及相關電壓參數設定表

原料名稱母離子（m/z）子離子（m/z）碰撞能量（eV）

81.0?17

氫醌109.0

53.0?18

B.2.6定性判定

用液相色譜-串聯質譜法對樣品進行定性判定，在相同試驗條件下，樣品中應呈現兩個監(jiān)

測離子的色譜峰，樣品中各離子的保留時間應與相應標準溶液中各離子的保留時間一致；樣品

色譜圖中所選擇的監(jiān)測離子的相對豐度比與相當濃度標準溶液的離子相對豐度比的偏差不超過

表B.6規(guī)定范圍，則可以判斷樣品中存在相應待測物。

表B.6定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差

相對離子豐度（k）k>50%50%≥k>20%20%≥k>10%k≤10%

允許的最大偏差±20%±25%±30%±50%

B.2.7圖譜

圖B.2氫醌標準溶液HPLC-MS/MS色譜圖

1：氫醌

B.3苯酚的氣相色譜-串聯質譜法確證

B.3.1試劑和材料

B.3.1.1無水硫酸鈉。

B.3.1.2微孔濾膜（0.22μm）。

B.3.2儀器

氣相色譜-串聯質譜聯用儀，帶電子轟擊離子源（EI源）。

B.3.3樣品處理

取正文“5.3樣品處理”項下待測溶液5mL，加入無水硫酸鈉（B.3.1）2g，振搖，靜置1h，

取上清液，用微孔濾膜（B.3.1.2）過濾，取濾液作為待測溶液。

B.3.4參考氣相色譜-質譜條件（可根據儀器情況進行調整）

色譜柱：聚乙二