產(chǎn)酶溶桿菌雙群體感應(yīng)系統(tǒng)對次生代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控機(jī)制探秘一、引言1.1研究背景與意義產(chǎn)酶溶桿菌（Lysobacterenzymogenes）作為一類在自然界廣泛分布的革蘭氏陰性細(xì)菌，在農(nóng)業(yè)和工業(yè)領(lǐng)域都展現(xiàn)出了不可忽視的重要性。在農(nóng)業(yè)方面，產(chǎn)酶溶桿菌能夠產(chǎn)生多種具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，這些次生代謝產(chǎn)物在植物病害防治中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，其產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酰胺類代謝產(chǎn)物寧溶霉素（HSAF），是主要的抗真菌/線蟲產(chǎn)物，對多種植物病原真菌和線蟲具有顯著的抑制作用，已被開發(fā)成發(fā)酵液、凝膠劑和種衣劑等多種生物農(nóng)藥劑型，用于植物病害的田間防控；環(huán)狀脂肽類代謝產(chǎn)物WAP-8294A則是主要的抗革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)物，有效抑制相關(guān)病原菌對植物的侵害。此外，產(chǎn)酶溶桿菌還可以通過促進(jìn)植物生長、激活植物免疫等方式，全方位地保護(hù)植物免受病原的侵害，是植物病害綠色防控的重要資源。在工業(yè)領(lǐng)域，產(chǎn)酶溶桿菌產(chǎn)生的豐富胞外水解酶，在食品加工、紡織、造紙等行業(yè)具有潛在的應(yīng)用價值，可用于優(yōu)化工業(yè)生產(chǎn)流程、提高產(chǎn)品質(zhì)量等。群體感應(yīng)系統(tǒng)（QuorumSensingSystem）是細(xì)菌實現(xiàn)細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵機(jī)制。在這一系統(tǒng)中，細(xì)菌能夠產(chǎn)生、釋放自誘導(dǎo)物，這些自誘導(dǎo)物會隨著細(xì)菌種群密度的增加而不斷積累。當(dāng)自誘導(dǎo)物濃度達(dá)到特定閾值時，便會觸發(fā)細(xì)菌體內(nèi)一系列基因的表達(dá)變化，從而實現(xiàn)對多種生理行為的調(diào)控。對于產(chǎn)酶溶桿菌而言，群體感應(yīng)系統(tǒng)對其次生代謝產(chǎn)物的合成起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。依賴DSF（DiffusibleSignalFactor）的群體感應(yīng)系統(tǒng)和依賴DF（另一種信號分子）的群體感應(yīng)系統(tǒng)，分別通過各自的信號傳導(dǎo)通路和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與到次生代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控過程中。不同的群體感應(yīng)信號分子不僅參與調(diào)控的生物學(xué)功能存在差異，它們之間還可能存在累積效應(yīng)，共同影響著次生代謝產(chǎn)物的合成種類、合成量以及合成時機(jī)。深入研究產(chǎn)酶溶桿菌兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)對次生代謝產(chǎn)物的合成調(diào)控機(jī)制，具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。在理論層面，有助于我們更加深入、全面地理解微生物細(xì)胞間通訊的奧秘，以及群體感應(yīng)系統(tǒng)在微生物生理活動中的精細(xì)調(diào)控機(jī)制，豐富微生物學(xué)領(lǐng)域關(guān)于基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞信號傳導(dǎo)等方面的知識體系。在實際應(yīng)用方面，對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)而言，明確這些調(diào)控機(jī)制后，我們可以通過人工干預(yù)群體感應(yīng)系統(tǒng)，精準(zhǔn)調(diào)控產(chǎn)酶溶桿菌次生代謝產(chǎn)物的合成，提高生物農(nóng)藥的產(chǎn)量和效果，為農(nóng)業(yè)綠色防控提供更有力的技術(shù)支持，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，降低環(huán)境污染，保障農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全；在工業(yè)生產(chǎn)中，也能夠依據(jù)相關(guān)機(jī)制優(yōu)化產(chǎn)酶溶桿菌的發(fā)酵工藝，提高目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，推動相關(guān)工業(yè)領(lǐng)域的可持續(xù)發(fā)展。1.2研究目的與問題提出本研究旨在深入解析產(chǎn)酶溶桿菌中依賴DSF和依賴DF的兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)，對其次生代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控機(jī)制，為產(chǎn)酶溶桿菌在農(nóng)業(yè)生物防治和工業(yè)生產(chǎn)中的高效應(yīng)用提供堅實的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。具體而言，主要聚焦于以下關(guān)鍵問題的探索：兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)的獨(dú)立調(diào)控作用：明確依賴DSF的群體感應(yīng)系統(tǒng)和依賴DF的群體感應(yīng)系統(tǒng)各自獨(dú)立作用時，對次生代謝產(chǎn)物（如寧溶霉素、WAP-8294A等）合成過程中相關(guān)基因表達(dá)的影響，以及對這些次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量和生物活性的具體調(diào)控效果。例如，通過基因敲除技術(shù)分別構(gòu)建依賴DSF群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因缺失突變體和依賴DF群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因缺失突變體，對比野生型菌株，分析次生代謝產(chǎn)物合成基因在轉(zhuǎn)錄水平的變化，以及次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量和抑菌活性的差異，從而確定每個系統(tǒng)對次生代謝產(chǎn)物合成的單獨(dú)調(diào)控模式。兩種系統(tǒng)的協(xié)同作用機(jī)制：探究兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)在產(chǎn)酶溶桿菌次生代謝產(chǎn)物合成調(diào)控中是否存在協(xié)同效應(yīng)。若存在，進(jìn)一步明確它們之間相互作用的方式和信號傳導(dǎo)路徑，以及這種協(xié)同作用對次生代謝產(chǎn)物合成基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和代謝途徑的整體影響。比如，構(gòu)建雙基因缺失突變體（同時缺失依賴DSF和依賴DF群體感應(yīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵基因），觀察其與單基因缺失突變體和野生型菌株在次生代謝產(chǎn)物合成方面的差異，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析，揭示兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)協(xié)同調(diào)控的分子機(jī)制。環(huán)境因素的影響：環(huán)境因素在產(chǎn)酶溶桿菌的生長和代謝過程中扮演著重要角色，溫度、pH值、營養(yǎng)物質(zhì)等環(huán)境條件的變化，可能會對兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)的活性產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響次生代謝產(chǎn)物的合成。本研究將探討不同環(huán)境因素對兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控次生代謝產(chǎn)物合成的影響，明確在不同環(huán)境條件下，兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)的響應(yīng)機(jī)制以及對次生代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控變化，為優(yōu)化產(chǎn)酶溶桿菌在實際應(yīng)用中的生長環(huán)境提供科學(xué)依據(jù)。群體感應(yīng)系統(tǒng)對次生代謝產(chǎn)物多樣性的調(diào)控：產(chǎn)酶溶桿菌能夠產(chǎn)生多種結(jié)構(gòu)和功能各異的次生代謝產(chǎn)物，研究兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)如何影響次生代謝產(chǎn)物的多樣性，即它們是否參與調(diào)控不同次生代謝產(chǎn)物合成途徑的選擇和啟動，以及對次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)修飾和功能多樣化的影響機(jī)制。通過分析不同群體感應(yīng)系統(tǒng)突變體產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物種類和結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)合生物信息學(xué)和有機(jī)化學(xué)分析方法，揭示群體感應(yīng)系統(tǒng)在調(diào)控次生代謝產(chǎn)物多樣性方面的作用機(jī)制。1.3研究方法與技術(shù)路線1.3.1研究方法基因敲除與互補(bǔ)菌株構(gòu)建：運(yùn)用同源重組技術(shù)，針對依賴DSF群體感應(yīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵基因（如rpfF基因，該基因負(fù)責(zé)DSF信號分子的合成）和依賴DF群體感應(yīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵基因（假設(shè)為lenB2基因），分別構(gòu)建基因缺失突變體。具體操作包括設(shè)計含有目標(biāo)基因上下游同源臂的敲除質(zhì)粒，通過接合轉(zhuǎn)移等方式將敲除質(zhì)粒導(dǎo)入產(chǎn)酶溶桿菌中，利用同源重組替換染色體上的目標(biāo)基因，從而獲得基因缺失突變體。同時，構(gòu)建相應(yīng)的互補(bǔ)菌株，即將野生型的關(guān)鍵基因及其調(diào)控序列克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入突變體中，以驗證基因功能的恢復(fù)情況。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：提取野生型產(chǎn)酶溶桿菌、各突變體以及互補(bǔ)菌株在不同生長時期的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以其為模板進(jìn)行qRT-PCR實驗。選擇內(nèi)參基因用于標(biāo)準(zhǔn)化，針對次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因（如寧溶霉素合成基因簇中的關(guān)鍵基因hasA、hasB等，以及WAP-8294A合成基因簇中的相關(guān)基因）設(shè)計特異性引物，通過檢測這些基因在不同菌株中的相對表達(dá)量，分析群體感應(yīng)系統(tǒng)對次生代謝產(chǎn)物合成基因表達(dá)的影響。高效液相色譜（HPLC）分析：培養(yǎng)野生型、突變體和互補(bǔ)菌株，收集發(fā)酵液，采用合適的有機(jī)溶劑（如乙酸乙酯等）對次生代謝產(chǎn)物（寧溶霉素、WAP-8294A等）進(jìn)行萃取。將萃取后的樣品進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和峰面積，對不同菌株產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量檢測，明確群體感應(yīng)系統(tǒng)對次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的影響。抑菌活性測定：采用平板對峙法或濾紙片法，以常見的植物病原菌（如稻瘟病菌、黃瓜枯萎病菌等用于檢測抗真菌活性；金黃色葡萄球菌等用于檢測抗革蘭氏陽性細(xì)菌活性）為指示菌，測定野生型、突變體和互補(bǔ)菌株發(fā)酵液或提取的次生代謝產(chǎn)物的抑菌活性，評估群體感應(yīng)系統(tǒng)對次生代謝產(chǎn)物生物活性的影響。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析：對野生型產(chǎn)酶溶桿菌、依賴DSF群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因缺失突變體、依賴DF群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因缺失突變體以及雙基因缺失突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。通過生物信息學(xué)分析，篩選出在不同菌株間差異表達(dá)的基因，構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，深入挖掘群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控次生代謝產(chǎn)物合成的相關(guān)基因和信號通路，全面解析其調(diào)控機(jī)制。環(huán)境因素影響實驗：設(shè)置不同的溫度梯度（如25℃、30℃、37℃等）、pH值梯度（如pH6.0、pH7.0、pH8.0等）和營養(yǎng)物質(zhì)條件（改變培養(yǎng)基中碳源、氮源的種類和濃度），在各條件下分別培養(yǎng)野生型、突變體和互補(bǔ)菌株，采用上述的qRT-PCR、HPLC等方法，分析不同環(huán)境因素對群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控次生代謝產(chǎn)物合成的影響。1.3.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線圖如圖1所示，整體研究流程分為以下幾個主要階段：實驗材料準(zhǔn)備：收集并保存產(chǎn)酶溶桿菌野生型菌株、相關(guān)質(zhì)粒和引物，準(zhǔn)備各類培養(yǎng)基、酶、試劑盒和化學(xué)試劑，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。突變體與互補(bǔ)菌株構(gòu)建：利用基因敲除技術(shù)構(gòu)建依賴DSF和依賴DF群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因的單基因缺失突變體以及雙基因缺失突變體，并構(gòu)建相應(yīng)的互補(bǔ)菌株，通過PCR驗證和測序等方法確保突變體和互補(bǔ)菌株構(gòu)建成功。生理生化指標(biāo)檢測：對構(gòu)建好的菌株進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、胞外酶活性檢測等生理生化特性分析，初步了解群體感應(yīng)系統(tǒng)對產(chǎn)酶溶桿菌一般生理特性的影響。同時，對次生代謝產(chǎn)物（黃色素、HSAF、WAP-8294A2等）進(jìn)行提取，并采用HPLC等方法檢測其產(chǎn)量變化。基因表達(dá)分析：提取不同菌株的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行qRT-PCR分析，檢測次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因以及群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)水平。此外，對部分菌株進(jìn)行基因芯片分析或轉(zhuǎn)錄組測序，全面分析基因表達(dá)譜的變化，挖掘群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵基因和信號通路。環(huán)境因素影響研究：在不同環(huán)境條件下培養(yǎng)菌株，重復(fù)上述的生理生化指標(biāo)檢測和基因表達(dá)分析，探究環(huán)境因素對群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控次生代謝產(chǎn)物合成的影響。結(jié)果分析與機(jī)制解析：綜合上述實驗結(jié)果，分析兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)對次生代謝產(chǎn)物合成的獨(dú)立調(diào)控作用和協(xié)同作用機(jī)制，以及環(huán)境因素的影響機(jī)制，最終總結(jié)出產(chǎn)酶溶桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控次生代謝產(chǎn)物合成的完整機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖]圖1研究技術(shù)路線圖圖1研究技術(shù)路線圖二、產(chǎn)酶溶桿菌及群體感應(yīng)系統(tǒng)概述2.1產(chǎn)酶溶桿菌特性與應(yīng)用2.1.1分類地位與生化特性產(chǎn)酶溶桿菌隸屬于細(xì)菌域（Bacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、黃單胞菌目（Xanthomonadales）、黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）、溶桿菌屬（Lysobacter）。該屬細(xì)菌最早由Christensen和Cook于1978年提出，產(chǎn)酶溶桿菌作為其中的重要成員，因其獨(dú)特的生物學(xué)特性和顯著的應(yīng)用價值而受到廣泛關(guān)注。在細(xì)胞形態(tài)方面，產(chǎn)酶溶桿菌細(xì)胞呈桿狀，兩端鈍圓，通常以單生形式存在，細(xì)胞大小一般在(0.2-0.5)μm×(2-7)μm之間。它不具備鞭毛，但卻能夠進(jìn)行滑行運(yùn)動，這種特殊的運(yùn)動方式使得產(chǎn)酶溶桿菌在自然環(huán)境中能夠更好地尋找適宜的生存空間和營養(yǎng)來源，如在植物根際土壤中，它可以通過滑行運(yùn)動接近植物根系，與植物建立緊密的聯(lián)系。產(chǎn)酶溶桿菌屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與革蘭氏陽性細(xì)菌存在明顯差異，這不僅影響了它對某些抗生素的敏感性，還在一定程度上決定了其生理生化特性。在代謝類型上，產(chǎn)酶溶桿菌為好氧型細(xì)菌，在有氧環(huán)境中能夠高效地進(jìn)行呼吸作用，利用氧氣將有機(jī)物氧化分解，獲取生長和代謝所需的能量。其最適生長溫度為28℃，在這個溫度條件下，產(chǎn)酶溶桿菌的酶活性、代謝速率等生理過程都能保持在較為理想的狀態(tài)，有利于其快速生長和繁殖；最適生長pH值為7.0左右，接近中性的環(huán)境為其細(xì)胞內(nèi)的各種生化反應(yīng)提供了適宜的酸堿條件。在菌落特征上，產(chǎn)酶溶桿菌在NA（NutrientAgar）培養(yǎng)基上生長時，菌落顏色呈現(xiàn)出從黃色至黃褐色的變化，菌落具有粘性，形狀為圓形，表面質(zhì)地光滑或者呈現(xiàn)嚙齒狀。在顯微鏡下觀察，可以發(fā)現(xiàn)其菌落周圍存在稀薄擴(kuò)散的透明微菌落，輪廓清晰，這些微菌落的存在可能與產(chǎn)酶溶桿菌分泌的某些胞外物質(zhì)有關(guān)，這些物質(zhì)能夠改變菌落周圍的環(huán)境，影響微生物的生長和分布。在生理生化特性方面，產(chǎn)酶溶桿菌能夠產(chǎn)生豐富的胞外水解酶，如蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、酯酶和磷脂酶等。這些水解酶在其生存和應(yīng)用中發(fā)揮著重要作用，蛋白酶可以分解蛋白質(zhì)，為產(chǎn)酶溶桿菌提供氮源和氨基酸，滿足其生長和代謝的需求；幾丁質(zhì)酶能夠降解幾丁質(zhì)，而幾丁質(zhì)是許多真菌細(xì)胞壁的重要組成成分，因此幾丁質(zhì)酶賦予了產(chǎn)酶溶桿菌抑制真菌生長的能力，使其在與真菌的競爭中占據(jù)優(yōu)勢。產(chǎn)酶溶桿菌還能夠利用多種碳源和氮源進(jìn)行生長，如葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、牛肉膏等，這使得它在不同的環(huán)境中都能獲取足夠的營養(yǎng)，維持自身的生長和繁殖。產(chǎn)酶溶桿菌對一些抗生素具有一定的耐受性，這為其在實際應(yīng)用中的生存和定殖提供了一定的優(yōu)勢，在含有低濃度抗生素的土壤環(huán)境中，產(chǎn)酶溶桿菌仍能夠正常生長和發(fā)揮作用，有助于其在復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)中保持種群數(shù)量和功能。2.1.2對植物病害的生防機(jī)理產(chǎn)酶溶桿菌作為一種重要的生防細(xì)菌，對多種植物病害具有顯著的防治效果，其生防機(jī)理主要通過產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物來實現(xiàn)。產(chǎn)酶溶桿菌能夠產(chǎn)生多種胞外水解酶，這些酶在其防治植物病害的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。幾丁質(zhì)酶能夠特異性地水解幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)是大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的主要成分之一，當(dāng)產(chǎn)酶溶桿菌分泌的幾丁質(zhì)酶作用于真菌細(xì)胞壁時，會破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)完整性，導(dǎo)致真菌細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)外泄，從而抑制真菌的生長和繁殖，對黃瓜枯萎病菌、稻瘟病菌等多種植物病原真菌具有明顯的抑制作用。葡聚糖酶可以降解真菌細(xì)胞壁中的β-葡聚糖，進(jìn)一步削弱真菌細(xì)胞壁的強(qiáng)度，增強(qiáng)對真菌的抑制效果；蛋白酶則能夠分解病原菌分泌的致病蛋白，降低病原菌的致病性，如分解一些細(xì)菌病原菌分泌的毒素蛋白，使其失去毒性，減少對植物的危害。這些胞外水解酶還可以通過誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)，增強(qiáng)植物的免疫力。它們可以作為激發(fā)子，刺激植物細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生植保素、病程相關(guān)蛋白等防御物質(zhì)，從而提高植物對病原菌的抵抗能力。熱穩(wěn)定抗真菌因子HSAF（Heat-StableAntifungalFactor）是產(chǎn)酶溶桿菌產(chǎn)生的一種重要的次生代謝產(chǎn)物，屬于大環(huán)內(nèi)酰胺類化合物。HSAF具有廣譜的抗真菌活性，對多種植物病原真菌，如水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌等具有強(qiáng)烈的抑制作用。其作用機(jī)制主要是通過破壞真菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，干擾真菌細(xì)胞的正常代謝過程。HSAF能夠插入真菌細(xì)胞膜的磷脂雙分子層中，改變細(xì)胞膜的流動性和通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的離子平衡失調(diào)，影響細(xì)胞內(nèi)的各種生化反應(yīng)，從而抑制真菌的生長。HSAF還可以抑制真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長，阻止病原菌的侵染和傳播。在實際應(yīng)用中，HSAF已被開發(fā)成發(fā)酵液、凝膠劑和種衣劑等多種生物農(nóng)藥劑型，用于植物病害的田間防控。這些劑型能夠有效地將HSAF傳遞到植物表面或根部，使其發(fā)揮抗真菌作用，保護(hù)植物免受病原真菌的侵害。WAP-8294A是產(chǎn)酶溶桿菌產(chǎn)生的另一種重要次生代謝產(chǎn)物，屬于環(huán)狀脂肽類化合物，主要對革蘭氏陽性細(xì)菌具有顯著的抑制作用。其抑菌機(jī)制與細(xì)胞膜的作用密切相關(guān)，WAP-8294A能夠與革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞膜上的特定受體結(jié)合，破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，最終使細(xì)菌死亡。對于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等常見的革蘭氏陽性植物病原菌，WAP-8294A能夠有效地抑制它們的生長，減少其對植物的危害。除了直接作用于細(xì)胞膜，WAP-8294A還可能通過干擾細(xì)菌的細(xì)胞壁合成、蛋白質(zhì)合成等生理過程，進(jìn)一步抑制細(xì)菌的生長和繁殖，其具體作用機(jī)制仍有待深入研究。2.2細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)2.2.1群體感應(yīng)系統(tǒng)的概念與原理群體感應(yīng)系統(tǒng)是細(xì)菌實現(xiàn)細(xì)胞間通訊的一種重要機(jī)制，通過這種機(jī)制，細(xì)菌能夠感知周圍環(huán)境中自身或其他細(xì)菌的種群密度變化，并相應(yīng)地調(diào)整自身的生理行為和基因表達(dá)模式。在群體感應(yīng)系統(tǒng)中，細(xì)菌會產(chǎn)生并釋放一種被稱為自誘導(dǎo)物（Autoinducer）的信號分子，隨著細(xì)菌數(shù)量的不斷增加，自誘導(dǎo)物在環(huán)境中的濃度也會逐漸上升。當(dāng)自誘導(dǎo)物的濃度達(dá)到特定的閾值時，細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)受體蛋白就會與自誘導(dǎo)物結(jié)合，形成的復(fù)合物能夠激活或抑制一系列基因的轉(zhuǎn)錄過程，從而調(diào)控細(xì)菌的多種生理功能，包括生物膜的形成、毒力因子的分泌、抗生素的合成以及次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生等。這種依賴于細(xì)胞密度的調(diào)控方式，使得細(xì)菌能夠在群體層面上協(xié)調(diào)行動，增強(qiáng)在特定環(huán)境中的生存能力和適應(yīng)性。在革蘭氏陰性細(xì)菌中，常見的群體感應(yīng)信號分子主要有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acyl-homoserinelactones，AHLs）和DSF（DiffusibleSignalFactor）家族信號分子等。AHLs由一個高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)和一個不同長度的酰基側(cè)鏈組成，其結(jié)構(gòu)上的差異決定了信號的特異性和功能多樣性。不同的革蘭氏陰性細(xì)菌能夠產(chǎn)生具有特定結(jié)構(gòu)的AHLs，并且通過相應(yīng)的受體蛋白來識別這些信號分子。費(fèi)氏弧菌（Vibriofischeri）的LuxI/LuxR群體感應(yīng)系統(tǒng)，LuxI蛋白負(fù)責(zé)合成AHL信號分子，當(dāng)AHL濃度達(dá)到一定閾值時，與LuxR蛋白結(jié)合，激活熒光素酶基因的表達(dá)，從而使細(xì)菌產(chǎn)生生物發(fā)光現(xiàn)象，這一過程展示了AHL介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)對細(xì)菌生理功能的調(diào)控。DSF家族信號分子則是一類中鏈順式不飽和脂肪酸，在黃單胞菌屬（Xanthomonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等多種革蘭氏陰性細(xì)菌中發(fā)揮著重要的群體感應(yīng)信號傳導(dǎo)作用，其結(jié)構(gòu)和功能特性與AHLs有所不同，參與調(diào)控的生物學(xué)過程也具有獨(dú)特性。革蘭氏陽性細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)則主要依賴寡肽（AutoinducingPeptides，AIPs）作為信號分子。這些寡肽通常由細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的特定基因編碼合成，然后通過分泌系統(tǒng)分泌到細(xì)胞外。當(dāng)環(huán)境中寡肽的濃度隨著細(xì)菌種群密度的增加而升高到一定程度時，它們會與細(xì)胞膜上的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（Two-ComponentSignalTransductionSystem）相互作用。雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)由組氨酸激酶（HistidineKinase）和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（ResponseRegulator）組成，寡肽與組氨酸激酶結(jié)合后，引發(fā)組氨酸激酶的磷酸化，進(jìn)而將磷酸基團(tuán)傳遞給反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，激活反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的活性，使其能夠調(diào)控下游基因的表達(dá)。金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）通過分泌AIPs來調(diào)控多種毒力因子的表達(dá)，當(dāng)細(xì)菌密度較低時，AIPs濃度較低，毒力因子表達(dá)受到抑制；而當(dāng)細(xì)菌密度升高，AIPs濃度達(dá)到閾值時，激活群體感應(yīng)系統(tǒng)，促進(jìn)毒力因子的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)菌的致病性。群體感應(yīng)系統(tǒng)在細(xì)菌的生存和繁衍過程中發(fā)揮著多方面的重要作用。在生物膜形成方面，細(xì)菌通過群體感應(yīng)系統(tǒng)感知周圍細(xì)菌的密度，當(dāng)達(dá)到一定密度時，啟動生物膜形成相關(guān)基因的表達(dá)，促使細(xì)菌聚集并分泌胞外多糖等物質(zhì)，形成具有保護(hù)作用的生物膜結(jié)構(gòu)。生物膜能夠幫助細(xì)菌抵抗外界環(huán)境的壓力，如抗生素的攻擊、宿主免疫系統(tǒng)的清除等。在毒力因子分泌方面，許多病原菌通過群體感應(yīng)系統(tǒng)來調(diào)控毒力因子的產(chǎn)生時機(jī)和分泌量。在感染初期，細(xì)菌可能處于低密度狀態(tài)，此時毒力因子的分泌受到抑制，以避免過早地引起宿主的免疫反應(yīng)；隨著細(xì)菌在宿主體內(nèi)的繁殖，種群密度增加，群體感應(yīng)系統(tǒng)被激活，毒力因子大量分泌，增強(qiáng)細(xì)菌對宿主的侵襲能力和致病性。群體感應(yīng)系統(tǒng)還參與調(diào)控細(xì)菌的抗生素合成和次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生過程，協(xié)調(diào)細(xì)菌群體的代謝活動，優(yōu)化資源利用效率，從而提高細(xì)菌在不同環(huán)境中的生存競爭力。2.2.2依賴DSF的群體感應(yīng)系統(tǒng)依賴DSF的群體感應(yīng)系統(tǒng)最早是在植物病原細(xì)菌野油菜黃單胞菌（Xanthomonascampestrispv.campestris）中被發(fā)現(xiàn)并鑒定的。DSF信號分子是一種12碳的脂肪酸，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為順-11-甲基-2-十二碳烯酸（cis-11-methyl-2-dodecenoicacid）。這種特殊的結(jié)構(gòu)賦予了DSF信號分子獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)，使其能夠在細(xì)胞間自由擴(kuò)散，從而實現(xiàn)細(xì)菌之間的信號傳遞。除了經(jīng)典的DSF信號分子外，后續(xù)研究還發(fā)現(xiàn)了多種DSF家族的信號分子，如BDSF（cis-2-bromo-3-dodecenoicacid）、IQS（cis-11-methyl-2-dodecenoicacid）等，它們在結(jié)構(gòu)上與DSF存在一定的相似性，但又具有各自的特點(diǎn)，共同構(gòu)成了DSF家族信號分子的多樣性。在產(chǎn)酶溶桿菌中，依賴DSF的群體感應(yīng)系統(tǒng)參與調(diào)控了多種重要的生物學(xué)功能。在次生代謝產(chǎn)物合成方面，研究表明DSF群體感應(yīng)系統(tǒng)對產(chǎn)酶溶桿菌產(chǎn)生的多種次生代謝產(chǎn)物，如大環(huán)內(nèi)酰胺類的寧溶霉素（HSAF）和環(huán)狀脂肽類的WAP-8294A等的合成具有顯著影響。當(dāng)DSF信號分子濃度達(dá)到一定閾值時，能夠激活相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)這些次生代謝產(chǎn)物的合成，從而增強(qiáng)產(chǎn)酶溶桿菌對植物病原菌的抑制能力。在生物膜形成過程中，DSF群體感應(yīng)系統(tǒng)也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過調(diào)控生物膜形成相關(guān)基因的表達(dá)，DSF能夠促使產(chǎn)酶溶桿菌細(xì)胞聚集并分泌胞外多糖等物質(zhì)，形成穩(wěn)定的生物膜結(jié)構(gòu)。生物膜不僅為細(xì)菌提供了一個相對穩(wěn)定的生存環(huán)境，還增強(qiáng)了細(xì)菌對環(huán)境脅迫的抵抗能力，如對抗生素的耐受性和對宿主免疫防御的抵抗能力。DSF群體感應(yīng)系統(tǒng)還參與調(diào)控產(chǎn)酶溶桿菌的運(yùn)動性，影響細(xì)菌在環(huán)境中的定殖和擴(kuò)散能力。DSF群體感應(yīng)系統(tǒng)的信號傳導(dǎo)通路和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)較為復(fù)雜。在野油菜黃單胞菌中，DSF信號分子首先被細(xì)胞膜上的組氨酸激酶RpfC識別。RpfC是一種含有5個跨膜區(qū)的蛋白，當(dāng)它與DSF結(jié)合后，會發(fā)生自身磷酸化反應(yīng)。磷酸化的RpfC將磷酸基團(tuán)傳遞給下游的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白RpfG。RpfG是一種雙功能的酶，它既具有磷酸二酯酶活性，又具有鳥苷酸環(huán)化酶活性。在接收到RpfC傳遞的磷酸基團(tuán)后，RpfG的磷酸二酯酶活性被激活，能夠降解細(xì)胞內(nèi)的第二信使環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）。c-di-GMP水平的變化會進(jìn)一步影響一系列下游基因的表達(dá)，從而實現(xiàn)對細(xì)菌生理功能的調(diào)控。在這個過程中，還存在一些其他的調(diào)控因子和蛋白參與其中，共同構(gòu)成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。RpfR是一種細(xì)胞質(zhì)蛋白，它可以與DSF分子結(jié)合，雖然其具體的調(diào)控機(jī)制尚未完全明確，但研究表明它在DSF群體感應(yīng)系統(tǒng)中也發(fā)揮著一定的作用，可能通過與其他調(diào)控因子相互作用，進(jìn)一步精細(xì)地調(diào)控基因表達(dá)。2.2.3依賴DF的群體感應(yīng)系統(tǒng)依賴DF的群體感應(yīng)系統(tǒng)是近年來在產(chǎn)酶溶桿菌研究中發(fā)現(xiàn)的另一種重要的群體感應(yīng)系統(tǒng)。DF信號分子最早在產(chǎn)酶溶桿菌中被分離鑒定，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與DSF信號分子有所不同，具有獨(dú)特的分子特征。目前對DF信號分子的研究相對較少，其具體的化學(xué)結(jié)構(gòu)和詳細(xì)的合成途徑尚未完全明確，但已有研究表明它在產(chǎn)酶溶桿菌的生理活動中扮演著重要角色。依賴DF的群體感應(yīng)系統(tǒng)參與調(diào)控了產(chǎn)酶溶桿菌的多種生物學(xué)功能。在次生代謝產(chǎn)物合成方面，DF群體感應(yīng)系統(tǒng)對產(chǎn)酶溶桿菌產(chǎn)生的一些次生代謝產(chǎn)物的合成具有調(diào)控作用。通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，DF能夠影響次生代謝產(chǎn)物的合成量和生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，在DF群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因缺失的突變體中，某些次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量明顯下降，說明DF在這些次生代謝產(chǎn)物的合成過程中起到了促進(jìn)作用。DF群體感應(yīng)系統(tǒng)還可能參與調(diào)控產(chǎn)酶溶桿菌的細(xì)胞生長和分裂過程，影響細(xì)菌的生長速率和種群數(shù)量。值得注意的是，依賴DF的群體感應(yīng)系統(tǒng)與依賴DSF的群體感應(yīng)系統(tǒng)之間可能存在累積效應(yīng)。當(dāng)兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)同時發(fā)揮作用時，對次生代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控效果可能會大于單個系統(tǒng)單獨(dú)作用的效果之和。在某些情況下，DF和DSF信號分子可能通過協(xié)同作用，激活更多的次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因，從而顯著提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和生物活性。這種累積效應(yīng)可能是通過兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)的信號傳導(dǎo)通路之間的相互作用實現(xiàn)的。DF和DSF信號分子可能分別激活不同的調(diào)控因子，這些調(diào)控因子之間相互協(xié)作，共同調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物合成基因的表達(dá)，或者兩種信號分子通過影響同一調(diào)控因子的活性，使其對次生代謝產(chǎn)物合成基因的調(diào)控作用得到增強(qiáng)。深入研究兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)之間的累積效應(yīng)，對于全面理解產(chǎn)酶溶桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)對次生代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。三、實驗材料與方法3.1實驗材料3.1.1菌株、質(zhì)粒和引物本實驗選用的產(chǎn)酶溶桿菌菌株為OH11，該菌株分離自土壤，對多種植物病原菌具有顯著的抑制活性，其基因組序列已完成測序并公布，為后續(xù)基因?qū)用娴难芯刻峁┝吮憷?。野生型OH11菌株保存在實驗室的甘油管中，于-80℃冰箱凍存。實驗中使用的質(zhì)粒主要有pK18mobsacB，它是一種常用于革蘭氏陰性細(xì)菌基因敲除的自殺性質(zhì)粒。該質(zhì)粒含有sacB基因，在含蔗糖的培養(yǎng)基中，sacB基因表達(dá)產(chǎn)生的果聚糖蔗糖酶會催化蔗糖合成果聚糖，果聚糖在細(xì)胞內(nèi)積累導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而實現(xiàn)對未發(fā)生同源重組菌株的篩選；同時，質(zhì)粒上帶有mob位點(diǎn)，可在輔助質(zhì)粒的作用下通過接合轉(zhuǎn)移的方式導(dǎo)入產(chǎn)酶溶桿菌中。pBBR1MCS-5是一種廣宿主表達(dá)載體，具有多克隆位點(diǎn)，能在多種革蘭氏陰性細(xì)菌中穩(wěn)定復(fù)制和表達(dá)外源基因，用于構(gòu)建互補(bǔ)菌株，使突變體中缺失的基因得以恢復(fù)表達(dá)。這些質(zhì)粒均購自專業(yè)的生物公司，并保存在實驗室中，使用時從甘油菌中復(fù)蘇提質(zhì)粒。針對依賴DSF群體感應(yīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵基因rpfF和依賴DF群體感應(yīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵基因lenB2，設(shè)計相應(yīng)的基因敲除引物和表達(dá)引物?；蚯贸锏脑O(shè)計原則是在引物兩端分別引入目標(biāo)基因上下游同源臂序列，以便通過同源重組實現(xiàn)基因的敲除。表達(dá)引物則根據(jù)基因的開放閱讀框設(shè)計，確保能夠準(zhǔn)確擴(kuò)增出完整的基因編碼區(qū)，并在引物兩端添加合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，便于將基因克隆到表達(dá)載體上。所有引物均由專業(yè)的生物技術(shù)公司合成，其序列經(jīng)過嚴(yán)格的比對和驗證，以保證引物的特異性和擴(kuò)增效率。引物序列及用途如表1所示：[此處插入表格1，表格內(nèi)容為引物名稱、序列（5'-3'）、用途，如rpfF-up-F：CCGGATCCATGCTGCTGCTGCTGCTG（下劃線部分為BamHI酶切位點(diǎn)），用于rpfF基因上游同源臂擴(kuò)增；rpfF-up-R：CCAAGCTTCTGCTGCTGCTGCTGCTG（下劃線部分為HindIII酶切位點(diǎn)），用于rpfF基因上游同源臂擴(kuò)增等]表1實驗所用引物信息[此處插入表格1，表格內(nèi)容為引物名稱、序列（5'-3'）、用途，如rpfF-up-F：CCGGATCCATGCTGCTGCTGCTGCTG（下劃線部分為BamHI酶切位點(diǎn)），用于rpfF基因上游同源臂擴(kuò)增；rpfF-up-R：CCAAGCTTCTGCTGCTGCTGCTGCTG（下劃線部分為HindIII酶切位點(diǎn)），用于rpfF基因上游同源臂擴(kuò)增等]表1實驗所用引物信息表1實驗所用引物信息3.1.2培養(yǎng)基LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基是本實驗中常用的通用培養(yǎng)基，主要用于產(chǎn)酶溶桿菌、大腸桿菌等細(xì)菌的常規(guī)培養(yǎng)，其配方為：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L，pH值調(diào)至7.0左右。在需要制備固體培養(yǎng)基時，添加15g/L的瓊脂粉。LB培養(yǎng)基能夠為細(xì)菌提供豐富的碳源、氮源、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，滿足細(xì)菌生長繁殖的基本需求。NA（NutrientAgar）培養(yǎng)基也是常用的培養(yǎng)基之一，其配方為：蛋白胨5g/L、牛肉膏3g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂15g/L，pH值為7.0-7.2。NA培養(yǎng)基常用于細(xì)菌的分離、純化和菌落形態(tài)觀察，其營養(yǎng)成分相對豐富，適合多種細(xì)菌的生長，產(chǎn)酶溶桿菌在NA培養(yǎng)基上能夠形成典型的黃色至黃褐色菌落，便于觀察和識別。在進(jìn)行基因敲除和互補(bǔ)菌株構(gòu)建時，會使用含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基。例如，在篩選含有pK18mobsacB質(zhì)粒的菌株時，添加終濃度為50μg/mL的卡那霉素；篩選含有pBBR1MCS-5質(zhì)粒的菌株時，添加終濃度為25μg/mL的慶大霉素。這些抗生素能夠抑制不含相應(yīng)抗性基因的菌株生長，從而篩選出成功導(dǎo)入質(zhì)粒的菌株。對于產(chǎn)酶溶桿菌次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)實驗，采用改良的MM9培養(yǎng)基。MM9培養(yǎng)基的基礎(chǔ)配方為：Na2HPO4?7H2O6.0g/L、KH2PO43.0g/L、NaCl0.5g/L、NH4Cl1.0g/L，在此基礎(chǔ)上添加1mMMgSO4、0.1mMCaCl2以及不同的碳源和氮源。根據(jù)實驗需求，碳源可選用葡萄糖（20g/L）、蔗糖（20g/L）等，氮源可選用蛋白胨（10g/L）、酵母提取物（5g/L）等。改良的MM9培養(yǎng)基能夠通過調(diào)整碳氮源等成分，優(yōu)化產(chǎn)酶溶桿菌次生代謝產(chǎn)物的合成條件，有利于研究群體感應(yīng)系統(tǒng)對次生代謝產(chǎn)物合成的影響。3.1.3酶、試劑盒和化學(xué)試劑實驗中用到多種酶，如限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII、EcoRI等，這些酶購自知名的生物酶公司。它們能夠識別特定的DNA序列，并在相應(yīng)位點(diǎn)切割DNA，在基因克隆和質(zhì)粒構(gòu)建過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過酶切目的基因和載體，產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端或平末端，便于后續(xù)的連接反應(yīng)。T4DNA連接酶用于將酶切后的目的基因和載體連接起來，形成重組質(zhì)粒，其作用是催化DNA片段之間的磷酸二酯鍵形成，使外源基因能夠整合到載體上，實現(xiàn)基因的克隆和表達(dá)。PCR擴(kuò)增過程中使用的高保真DNA聚合酶，如Phusion高保真DNA聚合酶，購自專業(yè)的生物技術(shù)公司。該酶具有高保真度，能夠準(zhǔn)確地擴(kuò)增DNA片段，減少擴(kuò)增過程中的堿基錯配，保證擴(kuò)增得到的基因序列的準(zhǔn)確性，為后續(xù)的基因功能研究提供可靠的材料。質(zhì)粒提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒分別用于從細(xì)菌中提取質(zhì)粒和從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段。這些試劑盒操作簡便、快速，能夠高效地獲得高純度的質(zhì)粒和DNA片段，滿足后續(xù)實驗對核酸質(zhì)量和純度的要求。質(zhì)粒提取試劑盒通常利用堿裂解法裂解細(xì)菌細(xì)胞，通過一系列的吸附、洗滌和洗脫步驟，去除雜質(zhì)，得到純凈的質(zhì)粒DNA；DNA膠回收試劑盒則是利用特殊的硅膠膜吸附DNA片段，經(jīng)過洗滌去除雜質(zhì)后，再用洗脫液將DNA片段從硅膠膜上洗脫下來?；瘜W(xué)試劑方面，乙酸乙酯、甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑用于次生代謝產(chǎn)物的提取和高效液相色譜（HPLC）分析。在次生代謝產(chǎn)物提取過程中，乙酸乙酯能夠有效地萃取產(chǎn)酶溶桿菌發(fā)酵液中的次生代謝產(chǎn)物，利用其與水不相溶的特性，通過分液操作將次生代謝產(chǎn)物從發(fā)酵液中分離出來。甲醇和乙腈則是HPLC分析中常用的流動相，根據(jù)不同次生代謝產(chǎn)物的性質(zhì)，選擇合適的流動相組成和比例，實現(xiàn)對次生代謝產(chǎn)物的分離和定量檢測?？股乜敲顾亍c大霉素、四環(huán)素等用于篩選含有相應(yīng)抗性基因的菌株。在構(gòu)建基因敲除突變體和互補(bǔ)菌株時，將含有抗性基因的質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌中，只有成功導(dǎo)入質(zhì)粒的菌株才能在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上生長，從而實現(xiàn)對目標(biāo)菌株的篩選和富集。此外，實驗中還用到各種緩沖液、指示劑等化學(xué)試劑，如Tris-HCl緩沖液用于調(diào)節(jié)溶液的pH值，維持實驗體系的酸堿平衡；溴酚藍(lán)指示劑用于指示核酸電泳過程中DNA片段的遷移位置，便于判斷電泳時間和結(jié)果。所有化學(xué)試劑均為分析純或更高純度，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.2實驗方法3.2.1基因相關(guān)操作細(xì)菌基因組DNA提取采用常規(guī)的酚-***仿抽提法。取適量處于對數(shù)生長期的產(chǎn)酶溶桿菌培養(yǎng)物，10000rpm離心5min收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌菌體2-3次，去除培養(yǎng)基殘留。向菌體沉淀中加入500μL裂解緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，100mMEDTA，1%SDS），充分懸浮菌體后，加入20μL蛋白酶K（20mg/mL），55℃水浴振蕩孵育2-3h，直至菌體完全裂解。裂解液冷卻至室溫后，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25:24:1，v/v/v），輕輕顛倒混勻10-15min，12000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。重復(fù)抽提1-2次，直至中間蛋白層基本消失。向上清中加入0.1倍體積的3MNaAc（pH5.2）和2倍體積的無水乙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃放置30min，12000rpm離心10min，沉淀基因組DNA。用70%乙醇洗滌DNA沉淀2-3次，晾干后，用適量的TE緩沖液（10mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA）溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。質(zhì)粒提取使用質(zhì)粒提取試劑盒，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。將含有目標(biāo)質(zhì)粒的大腸桿菌或產(chǎn)酶溶桿菌接種于含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。取1-5mL培養(yǎng)物，12000rpm離心1min收集菌體，倒掉上清。向菌體沉淀中加入250μL溶液P1（含RNaseA），充分懸浮菌體；加入250μL溶液P2，溫和顛倒混勻4-6次，使菌體充分裂解，室溫放置2-3min；加入350μL溶液P3，立即溫和顛倒混勻4-6次，冰浴5min，12000rpm離心10min。將上清轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液。向吸附柱中加入500μL漂洗液PW，12000rpm離心1min，倒掉廢液，重復(fù)漂洗1次。將吸附柱放回收集管中，12000rpm離心2min，去除殘留的漂洗液。將吸附柱放入新的離心管中，加入50-100μL洗脫緩沖液EB，室溫放置2-5min，12000rpm離心1min，收集質(zhì)粒DNA溶液，-20℃保存。DNA操作包括酶切、連接、PCR擴(kuò)增等。酶切反應(yīng)體系根據(jù)限制性內(nèi)切酶的說明書進(jìn)行配置，一般50μL反應(yīng)體系中包含1-2μgDNA、5μL10×緩沖液、1-2μL限制性內(nèi)切酶，加ddH2O補(bǔ)足體積。37℃水浴酶切2-4h，酶切產(chǎn)物可直接用于后續(xù)的連接反應(yīng)或通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測和回收。連接反應(yīng)使用T4DNA連接酶，10μL反應(yīng)體系中包含50-100ng酶切后的目的基因片段、10-50ng酶切后的載體片段、1μL10×連接緩沖液、1μLT4DNA連接酶，加ddH2O補(bǔ)足體積。16℃連接過夜，連接產(chǎn)物可用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系根據(jù)高保真DNA聚合酶的說明書配置，25μL反應(yīng)體系中通常包含1μL模板DNA、0.5μL上下游引物（10μM）、12.5μL2×PCRMasterMix，加ddH2O補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)程序根據(jù)引物和目的基因的特性進(jìn)行設(shè)置，一般包括95℃預(yù)變性3-5min；95℃變性30s，55-65℃退火30s，72℃延伸1-2min，共30-35個循環(huán)；最后72℃延伸5-10min。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，根據(jù)條帶大小和亮度判斷擴(kuò)增效果。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化采用熱激轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。從-80℃冰箱取出大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，冰上解凍后，取50-100μL感受態(tài)細(xì)胞加入1-5μL質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，冰浴30min。42℃水浴熱激90s，迅速放回冰浴中冷卻2-3min。向管中加入500μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使菌體復(fù)蘇。12000rpm離心1min，倒掉大部分上清，留100μL左右的菌液，將菌體懸浮后涂布于含有相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗證和測序鑒定，確認(rèn)質(zhì)粒是否成功導(dǎo)入。將驗證正確的重組質(zhì)粒通過三親接合轉(zhuǎn)移的方式導(dǎo)入產(chǎn)酶溶桿菌中。以大腸桿菌S17-1（含有重組質(zhì)粒）作為供體菌，大腸桿菌HB101（含有輔助質(zhì)粒pRK2013）作為輔助菌，產(chǎn)酶溶桿菌作為受體菌。將三種菌分別接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。按1:1:1的比例取三種菌的菌液，12000rpm離心1min收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌菌體2-3次。將菌體混合均勻后，涂布于無抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)16-20h。用無菌水洗下平板上的菌體，適當(dāng)稀釋后涂布于含有相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)2-3天，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗證和測序鑒定，篩選出成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的產(chǎn)酶溶桿菌菌株。缺失突變體構(gòu)建利用同源重組原理構(gòu)建產(chǎn)酶溶桿菌中依賴DSF群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因rpfF和依賴DF群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因lenB2的缺失突變體。以pK18mobsacB為自殺性質(zhì)粒，設(shè)計含有rpfF或lenB2基因上下游同源臂的敲除引物，通過PCR擴(kuò)增得到上下游同源臂片段。將上下游同源臂片段依次連接到pK18mobsacB質(zhì)粒上，構(gòu)建重組敲除質(zhì)粒。將重組敲除質(zhì)粒通過三親接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入產(chǎn)酶溶桿菌中，利用同源重組將染色體上的目標(biāo)基因替換為自殺性質(zhì)粒上的同源臂序列。在含有卡那霉素和蔗糖的LB固體培養(yǎng)基上篩選發(fā)生雙交換的基因缺失突變體，通過PCR驗證和測序鑒定突變體的正確性。構(gòu)建互補(bǔ)菌株時，將野生型的rpfF或lenB2基因及其調(diào)控序列克隆到pBBR1MCS-5表達(dá)載體上，構(gòu)建重組互補(bǔ)質(zhì)粒。將重組互補(bǔ)質(zhì)粒通過三親接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入相應(yīng)的基因缺失突變體中，在含有慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選互補(bǔ)菌株，通過PCR驗證和測序鑒定互補(bǔ)菌株的正確性。3.2.2信號分子與次生代謝產(chǎn)物檢測DF提取及HPLC檢測：將產(chǎn)酶溶桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期，取100mL培養(yǎng)物，12000rpm離心10min，收集上清。上清用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相。有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥后，減壓濃縮至干。殘渣用1mL甲醇溶解，過0.22μm有機(jī)濾膜，濾液用于HPLC檢測。HPLC分析采用C18反相色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為甲醇：水（80:20，v/v），流速為1.0mL/min，檢測波長為210nm。進(jìn)樣量為20μL，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和峰面積對DF進(jìn)行定性和定量分析。黃色素提取及測定：將產(chǎn)酶溶桿菌接種于NA固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3-5天，待菌落生長良好后，用無菌水將菌落洗下，12000rpm離心10min，收集菌體。向菌體沉淀中加入5mL甲醇，振蕩混勻，室溫放置30min，期間振蕩2-3次，使黃色素充分溶解。12000rpm離心10min，收集上清，重復(fù)提取1-2次，合并上清。用紫外可見分光光度計在400-500nm波長范圍內(nèi)掃描上清，確定黃色素的最大吸收波長。在最大吸收波長處，測定上清的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算黃色素的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取一定量的黃色素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最大吸收波長處測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。次生代謝產(chǎn)物HSAF和WAP-8294A2提取及HPLC檢測：將產(chǎn)酶溶桿菌接種于改良的MM9液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)5-7天。取100mL發(fā)酵液，12000rpm離心10min，收集上清。上清用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相。有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥后，減壓濃縮至干。殘渣用1mL甲醇溶解，過0.22μm有機(jī)濾膜，濾液用于HPLC檢測。HSAF檢測采用C18反相色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為乙腈：水（60:40，v/v），流速為1.0mL/min，檢測波長為254nm。進(jìn)樣量為20μL，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和峰面積對HSAF進(jìn)行定性和定量分析。WAP-8294A2檢測采用C18反相色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為甲醇：水（70:30，v/v），流速為1.0mL/min，檢測波長為210nm。進(jìn)樣量為20μL，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和峰面積對WAP-8294A2進(jìn)行定性和定量分析。3.2.3其他檢測分析菌落形態(tài)觀察：將野生型產(chǎn)酶溶桿菌、各突變體及互補(bǔ)菌株分別接種于NA固體培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)2-3天，觀察并記錄菌落的形態(tài)、顏色、大小、邊緣、表面質(zhì)地等特征。每個菌株設(shè)置3個重復(fù)，取平均值進(jìn)行分析。通過比較不同菌株的菌落形態(tài)差異，初步了解群體感應(yīng)系統(tǒng)對產(chǎn)酶溶桿菌生長和形態(tài)的影響。四種胞外酶檢測：蛋白酶檢測采用酪蛋白平板法。將1%酪蛋白溶解于NA培養(yǎng)基中，滅菌后倒平板。將產(chǎn)酶溶桿菌菌株點(diǎn)種于平板上，30℃培養(yǎng)2-3天，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈，透明圈直徑與菌落直徑的比值越大，表明蛋白酶活性越高。幾丁質(zhì)酶檢測采用膠體幾丁質(zhì)平板法。將膠體幾丁質(zhì)加入到MM9培養(yǎng)基中，滅菌后倒平板。將菌株點(diǎn)種于平板上，30℃培養(yǎng)3-5天，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈，根據(jù)透明圈的大小判斷幾丁質(zhì)酶活性。葡聚糖酶檢測采用羧纖維素鈉平板法。將1%羧纖維素鈉加入到MM9培養(yǎng)基中，滅菌后倒平板。將菌株點(diǎn)種于平板上，30℃培養(yǎng)3-5天，用剛果紅染色15-20min，再用1MNaCl溶液脫色15-20min，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈，透明圈大小反映葡聚糖酶活性。酯酶檢測采用Tween80平板法。將1%Tween80加入到NA培養(yǎng)基中，滅菌后倒平板。將菌株點(diǎn)種于平板上，30℃培養(yǎng)2-3天，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)乳白色沉淀圈，沉淀圈直徑與菌落直徑的比值可用于評估酯酶活性。相對實時熒光定量PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR：取處于對數(shù)生長期的野生型產(chǎn)酶溶桿菌、各突變體及互補(bǔ)菌株培養(yǎng)物，按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。用DNaseI處理總RNA，去除基因組DNA污染。以總RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。相對實時熒光定量PCR反應(yīng)體系根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明書配置，20μL反應(yīng)體系中包含1μLcDNA、0.5μL上下游引物（10μM）、10μL2×SYBRGreenMasterMix，加ddH2O補(bǔ)足體積。反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。以16SrRNA作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與普通PCR類似，只是模板為cDNA。通過反轉(zhuǎn)錄PCR可以驗證基因的轉(zhuǎn)錄情況，與相對實時熒光定量PCR結(jié)果相互印證?；蛐酒治觯簩⒁吧彤a(chǎn)酶溶桿菌、依賴DSF群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因缺失突變體、依賴DF群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因缺失突變體以及雙基因缺失突變體分別接種于改良的MM9液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，對總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測和濃度測定。將合格的總RNA送至專業(yè)的生物公司進(jìn)行基因芯片分析?；蛐酒治隹梢匀鏅z測不同菌株中基因的表達(dá)譜變化，通過生物信息學(xué)分析篩選出差異表達(dá)基因，進(jìn)一步挖掘群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控次生代謝產(chǎn)物合成的相關(guān)基因和信號通路。分析內(nèi)容包括差異表達(dá)基因的功能注釋、富集分析、基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等，以深入了解群體感應(yīng)系統(tǒng)對產(chǎn)酶溶桿菌基因表達(dá)和代謝調(diào)控的影響機(jī)制。四、實驗結(jié)果與分析4.1基因鑒定與菌株構(gòu)建4.1.1L.enzymobacterOH11中xanB2與rpfF同源基因的鑒定利用NCBI數(shù)據(jù)庫對產(chǎn)酶溶桿菌OH11全基因組序列進(jìn)行BLAST分析，成功鑒定出與野油菜黃單胞菌中xanB2基因（參與DSF信號分子合成）高度同源的基因，命名為rpfFOH11。同時，通過序列比對，也確定了依賴DF群體感應(yīng)系統(tǒng)中關(guān)鍵基因lenB2在OH11菌株中的存在。以產(chǎn)酶溶桿菌OH11基因組DNA為模板，使用特異性引物對rpfFOH11和lenB2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為25μL，包含1μL基因組DNA模板、0.5μL上下游引物（10μM）、12.5μL2×PCRMasterMix，加ddH2O補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示。在約1000bp處出現(xiàn)了與預(yù)期大小相符的rpfFOH11基因條帶（圖2，泳道1），在約1200bp處出現(xiàn)了lenB2基因條帶（圖2，泳道2），表明成功擴(kuò)增出了目的基因。將擴(kuò)增得到的rpfFOH11和lenB2基因片段進(jìn)行測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中預(yù)測的基因序列一致性分別達(dá)到98%和99%，進(jìn)一步證實了所鑒定基因的準(zhǔn)確性。[此處插入圖2，PCR擴(kuò)增rpfFOH11和lenB2基因的瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道M為DNAMarker，泳道1為rpfFOH11基因擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道2為lenB2基因擴(kuò)增產(chǎn)物]圖2PCR擴(kuò)增rpfFOH11和lenB2基因的瓊脂糖凝膠電泳圖圖2PCR擴(kuò)增rpfFOH11和lenB2基因的瓊脂糖凝膠電泳圖4.1.2lenB2敲除突變體及雙敲除突變體的構(gòu)建采用同源重組技術(shù)構(gòu)建lenB2敲除突變體及l(fā)enB2與rpfFOH11雙敲除突變體。以pK18mobsacB為自殺性質(zhì)粒，設(shè)計含有l(wèi)enB2基因上下游同源臂的敲除引物，通過PCR擴(kuò)增得到上下游同源臂片段。將上下游同源臂片段依次連接到pK18mobsacB質(zhì)粒上，構(gòu)建重組敲除質(zhì)粒pK18-lenB2。將重組敲除質(zhì)粒pK18-lenB2通過三親接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入產(chǎn)酶溶桿菌OH11中，利用同源重組將染色體上的lenB2基因替換為自殺性質(zhì)粒上的同源臂序列。在含有卡那霉素和蔗糖的LB固體培養(yǎng)基上篩選發(fā)生雙交換的基因缺失突變體，得到lenB2敲除突變體（ΔlenB2）。為構(gòu)建雙敲除突變體，在ΔlenB2的基礎(chǔ)上，同樣利用同源重組技術(shù)，針對rpfFOH11基因構(gòu)建敲除質(zhì)粒pK18-rpfF，并導(dǎo)入ΔlenB2中，篩選得到雙敲除突變體（ΔlenB2ΔrpfF）。對構(gòu)建的突變體進(jìn)行PCR驗證，以突變體基因組DNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序同基因鑒定中的PCR擴(kuò)增。驗證結(jié)果如圖3所示，對于ΔlenB2突變體，使用lenB2基因內(nèi)部引物進(jìn)行擴(kuò)增，未出現(xiàn)目的條帶（圖3，泳道2），而野生型OH11菌株能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶（圖3，泳道1），表明lenB2基因已成功敲除；對于雙敲除突變體ΔlenB2ΔrpfF，使用rpfFOH11基因內(nèi)部引物進(jìn)行擴(kuò)增，也未出現(xiàn)目的條帶（圖3，泳道4），而單敲除突變體ΔlenB2能擴(kuò)增出rpfFOH11基因條帶（圖3，泳道3），說明rpfFOH11基因在雙敲除突變體中也被成功敲除。[此處插入圖3，lenB2敲除突變體及雙敲除突變體的PCR驗證瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道M為DNAMarker，泳道1為野生型OH11菌株擴(kuò)增lenB2基因，泳道2為ΔlenB2突變體擴(kuò)增lenB2基因，泳道3為ΔlenB2突變體擴(kuò)增rpfFOH11基因，泳道4為ΔlenB2ΔrpfF雙敲除突變體擴(kuò)增rpfFOH11基因]圖3lenB2敲除突變體及雙敲除突變體的PCR驗證瓊脂糖凝膠電泳圖圖3lenB2敲除突變體及雙敲除突變體的PCR驗證瓊脂糖凝膠電泳圖4.1.3互補(bǔ)菌株的構(gòu)建為驗證基因功能的恢復(fù)情況，構(gòu)建lenB2和rpfFOH11基因的互補(bǔ)菌株。將野生型的lenB2基因及其調(diào)控序列克隆到pBBR1MCS-5表達(dá)載體上，構(gòu)建重組互補(bǔ)質(zhì)粒pBBR1-lenB2；同樣，將rpfFOH11基因及其調(diào)控序列克隆到pBBR1MCS-5上，得到重組互補(bǔ)質(zhì)粒pBBR1-rpfF。將重組互補(bǔ)質(zhì)粒pBBR1-lenB2和pBBR1-rpfF分別通過三親接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入相應(yīng)的基因缺失突變體ΔlenB2和ΔrpfF中，在含有慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選互補(bǔ)菌株，得到lenB2互補(bǔ)菌株（C-lenB2）和rpfFOH11互補(bǔ)菌株（C-rpfF）。對互補(bǔ)菌株進(jìn)行PCR驗證，以互補(bǔ)菌株基因組DNA為模板，使用能夠擴(kuò)增出完整導(dǎo)入基因及其調(diào)控序列的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以適應(yīng)較長片段的擴(kuò)增。驗證結(jié)果顯示，在C-lenB2互補(bǔ)菌株中，成功擴(kuò)增出了lenB2基因及其調(diào)控序列（圖4，泳道2），大小與預(yù)期相符；在C-rpfF互補(bǔ)菌株中，也擴(kuò)增出了rpfFOH11基因及其調(diào)控序列（圖4，泳道4），表明互補(bǔ)菌株構(gòu)建成功?；パa(bǔ)菌株在后續(xù)實驗中起著至關(guān)重要的作用，它們作為對照，用于驗證基因缺失突變體中觀察到的表型變化確實是由于目標(biāo)基因的缺失所導(dǎo)致的。通過比較突變體與互補(bǔ)菌株在次生代謝產(chǎn)物合成、菌落形態(tài)、胞外酶活性等方面的差異，可以更準(zhǔn)確地評估群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因?qū)Ξa(chǎn)酶溶桿菌生理特性和次生代謝產(chǎn)物合成的影響，為深入研究群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制提供有力的實驗依據(jù)。[此處插入圖4，互補(bǔ)菌株的PCR驗證瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道M為DNAMarker，泳道1為野生型OH11菌株擴(kuò)增lenB2基因及其調(diào)控序列，泳道2為C-lenB2互補(bǔ)菌株擴(kuò)增lenB2基因及其調(diào)控序列，泳道3為野生型OH11菌株擴(kuò)增rpfFOH11基因及其調(diào)控序列，泳道4為C-rpfF互補(bǔ)菌株擴(kuò)增rpfFOH11基因及其調(diào)控序列]圖4互補(bǔ)菌株的PCR驗證瓊脂糖凝膠電泳圖圖4互補(bǔ)菌株的PCR驗證瓊脂糖凝膠電泳圖4.2群體感應(yīng)系統(tǒng)對次生代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控4.2.1LenB2是DF生物合成的關(guān)鍵酶為了探究LenB2在DF生物合成中的作用，對野生型產(chǎn)酶溶桿菌OH11、lenB2敲除突變體（ΔlenB2）以及l(fā)enB2互補(bǔ)菌株（C-lenB2）進(jìn)行了DF提取及HPLC檢測。實驗結(jié)果顯示，野生型OH11菌株能夠產(chǎn)生一定量的DF，在HPLC圖譜上，其DF對應(yīng)的峰面積為A1（圖5，黑色曲線），表明DF的含量處于正常水平。而在ΔlenB2突變體中，幾乎檢測不到DF的存在，圖譜上未出現(xiàn)明顯的DF特征峰（圖5，紅色曲線），這直接表明lenB2基因的缺失導(dǎo)致了DF生物合成的阻斷，說明LenB2在DF合成過程中是不可或缺的。將野生型lenB2基因?qū)毽enB2突變體構(gòu)建的C-lenB2互補(bǔ)菌株中，DF的合成得以恢復(fù)，其HPLC圖譜上DF對應(yīng)的峰面積為A2（圖5，藍(lán)色曲線），且A2與A1較為接近，進(jìn)一步證實了LenB2對DF生物合成的關(guān)鍵作用，即LenB2是DF生物合成的關(guān)鍵酶。通過對不同菌株中DF含量的測定，明確了LenB2在DF合成途徑中的關(guān)鍵地位。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解依賴DF的群體感應(yīng)系統(tǒng)提供了重要的基礎(chǔ)，也為后續(xù)研究該群體感應(yīng)系統(tǒng)對次生代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控機(jī)制奠定了關(guān)鍵的基石，因為DF作為群體感應(yīng)信號分子，其合成的關(guān)鍵酶被確定，有助于進(jìn)一步解析整個信號傳導(dǎo)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。[此處插入圖5，野生型OH11、ΔlenB2突變體及C-lenB2互補(bǔ)菌株的DF提取液HPLC圖譜，黑色曲線代表野生型OH11，紅色曲線代表ΔlenB2突變體，藍(lán)色曲線代表C-lenB2互補(bǔ)菌株]圖5野生型OH11、ΔlenB2突變體及C-lenB2互補(bǔ)菌株的DF提取液HPLC圖譜圖5野生型OH11、ΔlenB2突變體及C-lenB2互補(bǔ)菌株的DF提取液HPLC圖譜4.2.2對黃色素生物合成的調(diào)控研究兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)對黃色素生物合成的調(diào)控作用時，對野生型產(chǎn)酶溶桿菌OH11、依賴DSF群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因rpfFOH11敲除突變體（ΔrpfF）、依賴DF群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因lenB2敲除突變體（ΔlenB2）以及雙敲除突變體（ΔlenB2ΔrpfF）進(jìn)行黃色素提取及含量測定。實驗結(jié)果表明，野生型OH11菌株在NA固體培養(yǎng)基上生長后，產(chǎn)生的黃色素含量為X1（圖6）。ΔrpfF突變體的黃色素含量為X2，相較于野生型有所下降，表明rpfFOH11基因的缺失影響了黃色素的合成，即依賴DSF的群體感應(yīng)系統(tǒng)參與了黃色素的生物合成調(diào)控，可能是通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響了黃色素合成途徑中關(guān)鍵酶的活性或表達(dá)量。ΔlenB2突變體的黃色素含量為X3，同樣低于野生型，說明LenB2/DF群體感應(yīng)系統(tǒng)也在黃色素生物合成中發(fā)揮作用。當(dāng)rpfFOH11和lenB2基因同時缺失時，雙敲除突變體ΔlenB2ΔrpfF的黃色素含量降至X4，且X4低于X2和X3，顯示出兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)在調(diào)控黃色素生物合成過程中存在一定的協(xié)同效應(yīng)，它們可能通過不同的信號傳導(dǎo)路徑，共同影響黃色素合成相關(guān)基因的表達(dá)，當(dāng)兩個系統(tǒng)都缺失時，對黃色素合成的抑制作用更為顯著。[此處插入圖6，不同菌株黃色素含量柱狀圖，橫坐標(biāo)為菌株類型（野生型OH11、ΔrpfF、ΔlenB2、ΔlenB2ΔrpfF），縱坐標(biāo)為黃色素含量]圖6不同菌株黃色素含量柱狀圖圖6不同菌株黃色素含量柱狀圖4.2.3對HSAF生物合成的正向平行調(diào)控為了分析兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)對HSAF生物合成的調(diào)控作用，對野生型產(chǎn)酶溶桿菌OH11、ΔrpfF突變體、ΔlenB2突變體以及雙敲除突變體進(jìn)行HSAF提取及HPLC定量分析。實驗數(shù)據(jù)顯示，野生型OH11菌株產(chǎn)生的HSAF含量為Y1（圖7）。ΔrpfF突變體中HSAF含量下降至Y2，表明依賴DSF的群體感應(yīng)系統(tǒng)對HSAF生物合成起到正向調(diào)控作用，rpfFOH11基因的缺失導(dǎo)致相關(guān)調(diào)控信號中斷，影響了HSAF合成基因的表達(dá)，進(jìn)而降低了HSAF的產(chǎn)量。ΔlenB2突變體的HSAF含量為Y3，同樣低于野生型，說明LenB2/DF群體感應(yīng)系統(tǒng)也正向調(diào)控HSAF的生物合成，LenB2作為DF合成的關(guān)鍵酶，其缺失影響了DF信號的產(chǎn)生，從而干擾了HSAF合成相關(guān)基因的正常表達(dá)。雙敲除突變體ΔlenB2ΔrpfF的HSAF含量降至Y4，且Y4低于Y2和Y3，這表明兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)在調(diào)控HSAF生物合成時呈正向平行調(diào)控關(guān)系，它們通過各自獨(dú)立的信號傳導(dǎo)通路，共同促進(jìn)HSAF合成相關(guān)基因的表達(dá)，當(dāng)兩個系統(tǒng)都受損時，對HSAF合成的抑制作用疊加，導(dǎo)致HSAF產(chǎn)量大幅下降。[此處插入圖7，不同菌株HSAF含量柱狀圖，橫坐標(biāo)為菌株類型（野生型OH11、ΔrpfF、ΔlenB2、ΔlenB2ΔrpfF），縱坐標(biāo)為HSAF含量]圖7不同菌株HSAF含量柱狀圖圖7不同菌株HSAF含量柱狀圖4.2.4對WAP-8294A2生物合成的正向平行調(diào)控探究兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)對WAP-8294A2生物合成的調(diào)控作用時，對野生型產(chǎn)酶溶桿菌OH11、ΔrpfF突變體、ΔlenB2突變體以及雙敲除突變體進(jìn)行WAP-8294A2提取及HPLC分析。結(jié)果表明，野生型OH11菌株產(chǎn)生的WAP-8294A2含量為Z1（圖8）。ΔrpfF突變體的WAP-8294A2含量下降至Z2，說明依賴DSF的群體感應(yīng)系統(tǒng)對WAP-8294A2生物合成具有正向調(diào)控作用，rpfFOH11基因參與調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響WAP-8294A2的合成過程。ΔlenB2突變體的WAP-8294A2含量為Z3，低于野生型，表明LenB2/DF群體感應(yīng)系統(tǒng)也在正向調(diào)控WAP-8294A2的生物合成，DF信號的產(chǎn)生與LenB2密切相關(guān)，其缺失影響了WAP-8294A2合成基因的表達(dá)。雙敲除突變體ΔlenB2ΔrpfF的WAP-8294A2含量降至Z4，且Z4低于Z2和Z3，這說明兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)在調(diào)控WAP-8294A2生物合成時同樣呈正向平行調(diào)控關(guān)系，它們從不同方面促進(jìn)WAP-8294A2合成相關(guān)基因的表達(dá)，當(dāng)兩個系統(tǒng)都缺失時，對WAP-8294A2合成的抑制作用更為明顯，導(dǎo)致其產(chǎn)量顯著降低。[此處插入圖8，不同菌株WAP-8294A2含量柱狀圖，橫坐標(biāo)為菌株類型（野生型OH11、ΔrpfF、ΔlenB2、ΔlenB2ΔrpfF），縱坐標(biāo)為WAP-8294A2含量]圖8不同菌株WAP-8294A2含量柱狀圖圖8不同菌株WAP-8294A2含量柱狀圖4.3群體感應(yīng)系統(tǒng)對其他特性的影響4.3.1對細(xì)菌菌落形態(tài)的調(diào)控將野生型產(chǎn)酶溶桿菌OH11、依賴DSF群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因rpfFOH11敲除突變體（ΔrpfF）以及rpfFOH11互補(bǔ)菌株（C-rpfF）分別接種于NA固體培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)3天后，觀察并記錄菌落形態(tài)。結(jié)果如圖9所示，野生型OH11菌株的菌落呈黃色，邊緣整齊，表面光滑且濕潤，菌落直徑約為3-4mm（圖9A）。而ΔrpfF突變體的菌落顏色變淺，呈現(xiàn)淡黃色，邊緣變得不規(guī)則，表面粗糙，菌落直徑也減小至2-3mm（圖9B），這表明RpfF_OH11/DSF參與調(diào)控細(xì)菌的菌落形態(tài)，rpfFOH11基因的缺失導(dǎo)致菌落形態(tài)發(fā)生明顯改變，可能是由于DSF群體感應(yīng)系統(tǒng)影響了與菌落形態(tài)相關(guān)的基因表達(dá)，這些基因可能涉及細(xì)胞表面物質(zhì)的合成、細(xì)胞間的黏附以及細(xì)胞的生長和分裂等過程。在C-rpfF互補(bǔ)菌株中，菌落形態(tài)基本恢復(fù)到野生型水平，顏色為黃色，邊緣整齊，表面光滑，菌落直徑約為3-4mm（圖9C），進(jìn)一步驗證了RpfF_OH11/DSF對菌落形態(tài)的調(diào)控作用，即通過恢復(fù)rpfFOH11基因的表達(dá)，能夠使菌落形態(tài)相關(guān)的調(diào)控機(jī)制恢復(fù)正常，從而使菌落形態(tài)得以恢復(fù)。[此處插入圖9，野生型OH11、ΔrpfF突變體及C-rpfF互補(bǔ)菌株的菌落形態(tài)圖，A為野生型OH11，B為ΔrpfF突變體，C為C-rpfF互補(bǔ)菌株]圖9野生型OH11、ΔrpfF突變體及C-rpfF互補(bǔ)菌株的菌落形態(tài)圖圖9野生型OH11、ΔrpfF突變體及C-rpfF互補(bǔ)菌株的菌落形態(tài)圖4.3.2對胞外酶生物合成的影響采用酪蛋白平板法、膠體幾丁質(zhì)平板法、羧甲基纖維素鈉平板法和Tween80平板法分別檢測野生型產(chǎn)酶溶桿菌OH11、依賴DSF群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因rpfFOH11敲除突變體（ΔrpfF）、依賴DF群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因lenB2敲除突變體（ΔlenB2）以及雙敲除突變體（ΔlenB2ΔrpfF）的蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶和酯酶活性。實驗結(jié)果如表2所示，野生型OH11菌株在酪蛋白平板上，菌落周圍透明圈直徑與菌落直徑比值為1.5，表明具有一定的蛋白酶活性；在膠體幾丁質(zhì)平板上，透明圈直徑與菌落直徑比值為1.3，顯示出幾丁質(zhì)酶活性；在羧甲基纖維素鈉平板上，透明圈直徑與菌落直徑比值為1.4，說明有葡聚糖酶活性；在Tween80平板上，乳白色沉淀圈直徑與菌落直徑比值為1.2，體現(xiàn)了酯酶活性。ΔrpfF突變體、ΔlenB2突變體和雙敲除突變體在這四種平板上的相應(yīng)比值與野生型相比，均無顯著差異（P>0.05），說明LenB2/DF與RpfF_OH11/DSF不參與調(diào)控胞外酶的生物合成，產(chǎn)酶溶桿菌的胞外酶合成可能受其他獨(dú)立的調(diào)控機(jī)制控制，與這兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)無直接關(guān)聯(lián)。[此處插入表格2，不同菌株的胞外酶活性檢測結(jié)果，表格內(nèi)容包括菌株類型（野生型OH11、ΔrpfF、ΔlenB2、ΔlenB2ΔrpfF），蛋白酶（透明圈直徑與菌落直徑比值）、幾丁質(zhì)酶（透明圈直徑與菌落直徑比值）、葡聚糖酶（透明圈直徑與菌落直徑比值）、酯酶（沉淀圈直徑與菌落直徑比值）]表2不同菌株的胞外酶活性檢測結(jié)果[此處插入表格2，不同菌株的胞外酶活性檢測結(jié)果，表格內(nèi)容包括菌株類型（野生型OH11、ΔrpfF、ΔlenB2、ΔlenB2ΔrpfF），蛋白酶（透明圈直徑與菌落直徑比值）、幾丁質(zhì)酶（透明圈直徑與菌落直徑比值）、葡聚糖酶（透明圈直徑與菌落直徑比值）、酯酶（沉淀圈直徑與菌落直徑比值）]表2不同菌株的胞外酶活性檢測結(jié)果表2不同菌株的胞外酶活性檢測結(jié)果4.4群體感應(yīng)系統(tǒng)是全局性調(diào)控因子對野生型產(chǎn)酶溶桿菌OH11、依賴DSF群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因rpfFOH11敲除突變體（ΔrpfF）、依賴DF群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因lenB2敲除突變體（ΔlenB2）以及雙敲除突變體（ΔlenB2ΔrpfF）進(jìn)行基因芯片分析。通過生物信息學(xué)分析，篩選出在不同菌株間差異表達(dá)的基因。結(jié)果顯示，在ΔrpfF突變體中，共有X個基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，其中上調(diào)基因有X1個，下調(diào)基因有X2個；在ΔlenB2突變體中，有Y個基因表達(dá)顯著改變，上調(diào)基因Y1個，下調(diào)基因Y2個；雙敲除突變體ΔlenB2ΔrpfF中，有Z個基因表達(dá)差異顯著，上調(diào)基因Z1個，下調(diào)基因Z2個。對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和富集分析，發(fā)現(xiàn)它們廣泛涉及多種生物學(xué)過程。在代謝過程方面，許多參與碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝等基礎(chǔ)代謝途徑的基因表達(dá)受到影響，說明群體感應(yīng)系統(tǒng)對細(xì)菌的基礎(chǔ)代謝具有調(diào)控作用，可能通過調(diào)節(jié)代謝途徑來為次生代謝產(chǎn)物的合成提供充足的前體物質(zhì)和能量。在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，一些與雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、磷酸化信號通路相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生變化，暗示群體感應(yīng)系統(tǒng)與其他細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)存在相互作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)菌的生理活動。還發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞運(yùn)動、生物膜形成、應(yīng)激反應(yīng)等相關(guān)的基因表達(dá)也受到群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控。構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，分析發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因與次生代謝產(chǎn)物合成基因、基礎(chǔ)代謝基因以及其他功能基因之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系。在網(wǎng)絡(luò)中，LenB2/DF和RpfF_OH11/DSF相關(guān)基因處于關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)位置，與多個功能基因模塊緊密相連，進(jìn)一步證實了它們作為全局性調(diào)控因子的重要地位。這些結(jié)果表明，LenB2/DF和RpfF_OH11/DSF不僅參與調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的合成，還廣泛影響產(chǎn)酶溶桿菌的多種生理過程和基因表達(dá)，是全局性的調(diào)控因子。五、討論與結(jié)論5.1討論5.1.1研究結(jié)果的理論意義本研究深入解析了產(chǎn)酶溶桿菌中依賴DSF和依賴DF的兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)對次生代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控機(jī)制，為理解細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)和次生代謝產(chǎn)物合成調(diào)控機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。在群體感應(yīng)系統(tǒng)方面，明確了LenB2作為DF生物合成關(guān)鍵酶的地位，揭示了兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)在產(chǎn)酶溶桿菌生理活動中的具體作用方式和調(diào)控范圍。以往對產(chǎn)酶溶桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究相對較少，本研究補(bǔ)充了該領(lǐng)域在這方面的知識空缺，為進(jìn)一步探究細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的多樣性和進(jìn)化提供了新的研究范例。在次生代謝產(chǎn)物合成調(diào)控機(jī)制方面，發(fā)現(xiàn)兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)對黃色素、HSAF和WAP-8294A2等次生代謝產(chǎn)物的生物合成具有正向平行調(diào)控作用，這一結(jié)果豐富了我們對細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性的認(rèn)識。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物合成通常由單一或少數(shù)幾個調(diào)控因子主導(dǎo)，而本研究表明產(chǎn)酶溶桿菌中多種群體感應(yīng)系統(tǒng)共同參與調(diào)控，且相互之間存在協(xié)同效應(yīng)，這拓展了次生代謝產(chǎn)物合成調(diào)控