海洋生物技術(shù)

第八章細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生物化工學(xué)院蘭欣生命現(xiàn)象的本質(zhì)？

生命活動的規(guī)律？19世紀(jì)：細(xì)胞是生命的基本單位細(xì)胞學(xué)說：細(xì)胞是動植物結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，一切生命現(xiàn)象都是以細(xì)胞為基礎(chǔ)表達(dá)的第八章

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)工作任務(wù)（一）海洋微藻的工業(yè)化培養(yǎng)工作任務(wù)

（二）海洋動物細(xì)胞培養(yǎng)

工作任務(wù)

（二）海洋動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

1、動物細(xì)胞可以生產(chǎn)多種具有較高價值的藥物，特別是疫苗、激素、單克隆抗體和酶等。由動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的酶有膠原酶，血纖蛋白溶酶原活性劑等。2、動物細(xì)胞培養(yǎng)方法：懸浮培養(yǎng)；固定化細(xì)胞培養(yǎng)3、動物細(xì)胞發(fā)酵工藝條件的控制培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程看動畫演示

幼齡動物取動物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細(xì)胞培養(yǎng)單個細(xì)胞細(xì)胞懸液10代細(xì)胞50代細(xì)胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)?多數(shù)組織細(xì)胞固定在表面生長和分裂。隨細(xì)胞增多，細(xì)胞就會停止分裂增殖遺傳物質(zhì)改變遺傳物質(zhì)未改變原代培養(yǎng)：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。有關(guān)概念潛伏期指數(shù)生長期停滯期細(xì)胞計數(shù)及活力測定（動畫）培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。細(xì)胞計數(shù)原理細(xì)胞計數(shù)操作步驟

1、將血球計數(shù)板及蓋片擦試干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。

2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。

3、靜置3分鐘。

4、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：

細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/4×10000

注意：鏡下偶見由兩個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個細(xì)胞計算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。

細(xì)胞活力測定步驟

1、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中。

2、加入0.5ml0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘。

3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。

4、鏡下取幾個任意視野分別計死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計細(xì)胞活力。

死細(xì)胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。

活力測定可以和細(xì)胞計數(shù)合起來進(jìn)行，但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。

在人工條件下（設(shè)定pH、溫度、溶氧等），在細(xì)胞生物反應(yīng)器（bioreactor）中高密度大量培養(yǎng)動物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。目前可大規(guī)模培養(yǎng)的動物細(xì)胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細(xì)胞及人二倍體細(xì)胞、cho（中華倉鼠卵巢）細(xì)胞、BHK-21(倉鼠腎細(xì)胞)、Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎傳代細(xì)胞，貼壁依賴)等。二

動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)：（一）動物細(xì)胞生物反應(yīng)器的類型及

其基本結(jié)構(gòu)1、攪拌式生物反應(yīng)器2、氣升式生物反應(yīng)器3、中空纖維式生物反應(yīng)器4、透析袋或膜式生物反應(yīng)器5、固定床或流化床式生物反應(yīng)器機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器1、攪拌式生物反應(yīng)器氣升式生物反應(yīng)器與攪拌式生物反應(yīng)器相比，剪切力小，混合均一，氧和營養(yǎng)的傳遞好，由于沒有了機(jī)械攪拌的結(jié)構(gòu)，利于設(shè)備的密封，降低了造價。高徑比一般在10：1左右。2、氣升式生物反應(yīng)器中空纖維反應(yīng)器3、中空纖維式生物反應(yīng)器

由數(shù)百乃至數(shù)千根中空纖維集束組成的反應(yīng)器，纖維的材料為聚砜或丙烯共聚物，纖維壁厚為50-100m，呈多孔性，內(nèi)層為超濾膜，內(nèi)腔直徑為200m，兩端用環(huán)氧樹脂等材料將纖維粘和在一起，并使內(nèi)腔開口于外加的塑料圓筒，使形成兩個隔開的腔。①不能重復(fù)使用；②不能耐受高壓滅菌，需用環(huán)氧乙烷或其它消毒劑滅菌；③難以取樣檢測。膜式生物反應(yīng)器在動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，會產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物，如乳酸和氨等，對細(xì)胞的生長和產(chǎn)物的產(chǎn)生會產(chǎn)生抑制作用，因此有些學(xué)者設(shè)計了透析袋或膜式反應(yīng)器，它們可將這些有害代謝產(chǎn)物透析或過濾掉，從而使細(xì)胞生長至更高密度，同時可根據(jù)需要選用不同相對分子質(zhì)量的膜，使產(chǎn)物保留在膜內(nèi)或與細(xì)胞分離開。4、透析袋或膜式生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)較簡單，裝填的材料可以是一切對細(xì)胞無毒、又有利于細(xì)胞貼附的材料，有實心載體和有孔載體兩類。5、固定床或流化床式生物反應(yīng)器(二)動物細(xì)胞生物反應(yīng)器的檢測控制系統(tǒng)

1、培養(yǎng)過程需檢測的物化參數(shù)直接在線檢出取樣離線檢測檢測后計算

2、主要參數(shù)的檢測和控制方法①溫度②pHa在培養(yǎng)初期，偏堿，控制進(jìn)二氧化碳量b當(dāng)細(xì)胞密度提高后控制NaHCO3的量③溶氧④攪拌⑤進(jìn)出液流量思考：2、為什么選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細(xì)胞培養(yǎng)材料？1、動物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨(dú)特之處？3、為什么培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個細(xì)胞？4、動物細(xì)胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個體？主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素和動物血清等