2015年第6章植物內(nèi)生菌資源第一頁，共36頁。第一節(jié)植物內(nèi)生菌的發(fā)現(xiàn)及其研究意義一、內(nèi)生菌現(xiàn)象及概念1879年DeBary對這一現(xiàn)象進(jìn)行了描述。Stone的定義：植物內(nèi)生菌（endophyte)指這樣一類微生物，即被它們所感染的宿主植物不會或至少暫時不會表現(xiàn)出明顯的癥狀，能超乎在植物組織內(nèi)觀察到或是從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離得到，抑或是從植物組織中直接擴(kuò)增到其核酸DNA。這一概念為目前比較接受，即教材所說：一切生活在植物體內(nèi)的腐生、寄生或共生的真菌、細(xì)菌、放線菌等，也包括了那些潛伏在宿主體內(nèi)的病原微生物。第二頁，共36頁。第一節(jié)植物內(nèi)生菌的發(fā)現(xiàn)及其研究意義Petrini1991:內(nèi)生微生物的定義應(yīng)該強(qiáng)調(diào)，感染寄主時不表現(xiàn)出癥狀，但是經(jīng)過一段潛伏期后，可能也會引起病害。Hirsch&Braun1992：定殖于于活體植物組織內(nèi)，且不引起任何即時的、明顯的負(fù)面影響的真菌。因此：目前內(nèi)生微生物的定義涵蓋性上看，實質(zhì)上包括了定殖于植物組織內(nèi)部的任何微生物。第三頁，共36頁。第一節(jié)植物內(nèi)生菌的發(fā)現(xiàn)及其研究意義二、研究意義生態(tài)學(xué)意義：多種營養(yǎng)形式，影響到植物與食草動物之間的關(guān)系。相關(guān)的研究方向（請掌握）：群落組成、生物學(xué)特性、生物多樣性、種群生態(tài)學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)、內(nèi)生菌與宿主及草食動物的相互作用及它們所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物多樣性。巨大的遺傳多樣性寶庫，大量豐富新物種的來源。第四頁，共36頁。第二節(jié)植物內(nèi)生菌的分離本節(jié)為重點(diǎn)掌握內(nèi)容。第五頁，共36頁。2.1樣品的采集1.植物樣品的鑒定與采集地點(diǎn)的具體定位與記錄；2.根據(jù)研究目的與經(jīng)驗采集植物的不同部位；3.樣品的預(yù)處理：①修剪成長短適宜的組織塊，用75%乙醇擦拭樣品表面，或短時間浸泡、灼燒，使表面干燥后，用石蠟封住切口，放入無菌塑料袋，并保存于低溫盒中帶回實驗室；②將乙醇初步處理后的樣品保存于磷酸緩沖液中。4.樣品的保存：通常保存于4℃中，并盡量縮短從采樣到分離操作的時間，減少組織表面腐生菌對內(nèi)生菌的影響。第六頁，共36頁。2.2表面消毒1.Samish等總結(jié)比較總結(jié)不同的消毒技術(shù)后，推薦的標(biāo)準(zhǔn)消毒技術(shù)程序：首先用自來水或商品凈化劑反復(fù)沖洗植物材料表面，按照材料的不同決定不同次氯酸鈉、乙醇或是升汞的最佳消毒時間，再用無菌水沖洗，最后，用無菌濾紙吸干水分。其中次氯酸鈉與乙醇聯(lián)用，是最常用的表面消毒程序。2.特殊的處理：吐溫20、吐溫80和TritonX-100等表面活性劑，可以減少溶劑的表面張力，使其充分作用于植物表面的凹陷處3.檢驗表面消毒效果的方法：3種方法（教材208頁）第七頁，共36頁。2.3樣品預(yù)處理（一）組織塊分離法（二）組織浸漬法（三）組織離心法（四）真空與壓力抽取植物體液（五）其他方法第八頁，共36頁。2.4分離培養(yǎng)基（一）細(xì)菌分離培養(yǎng)基TSA：大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基。酪蛋白胰酶消化物15g大豆粉木瓜蛋白酶消化物5g氯化鈉5g瓊脂15g純化水1000ml第九頁，共36頁。R2A培養(yǎng)基也是沉降法檢測環(huán)境微生物的標(biāo)準(zhǔn)配方第十頁，共36頁。第十一頁，共36頁。第十二頁，共36頁。http://第十三頁，共36頁。2.4分離培養(yǎng)基（二）放線菌分離培養(yǎng)基在內(nèi)生放線菌的分離中，由于放線菌的生長緩慢，通常培養(yǎng)一個月左右才在植物表面有菌落長出。因此，想獲得盡可能多的放線菌，既要盡量抑制真菌和其他細(xì)菌的生長，同時也要盡可能避免影響內(nèi)生放線菌的生長。許多研究者認(rèn)為，一些貧營養(yǎng)的培養(yǎng)基和土壤放線菌分離常用的部分經(jīng)典培養(yǎng)基，在內(nèi)生放線菌的分離中均取得了較好的效果。第十四頁，共36頁。2.4分離培養(yǎng)基（三）真菌分離培養(yǎng)基（四）特殊目的菌選擇性分離培養(yǎng)基（五）添加抑制劑第十五頁，共36頁。第三節(jié)植物內(nèi)生菌資源和種類與分布推測地球上每一種植物，無論是單子葉還是雙子葉植物都有內(nèi)生菌存在。植物內(nèi)生菌資源的研究主要采用純培養(yǎng)（culture-dependent)和免培養(yǎng)（culture-ihdependent)技術(shù)與手段。第十六頁，共36頁。3.1植物內(nèi)生真菌依據(jù)其宿主類別、定殖方式、生態(tài)功能、進(jìn)化關(guān)系可將其分為兩大類：即麥角類內(nèi)生真菌（clavicipitaceousendophyte)和非麥角內(nèi)生真菌（nonclavicipitaceousendophyte)。麥角類內(nèi)生真菌：一些與禾草、牧草等共生的內(nèi)生真菌；（分泌麥角堿，致人畜中毒，無癥狀、系統(tǒng)和、種子攜帶）非麥角類內(nèi)生真菌：能從無癥狀的非維管植物及蕨類、裸子和被子植物等維管植物中分離獲得的內(nèi)生真菌。第十七頁，共36頁。3.1植物內(nèi)生真菌（一）麥角類內(nèi)生真菌一小部分進(jìn)化上相關(guān)的麥角菌物種，比較難于培養(yǎng)，且僅與一些冷暖型草種共生，通常能在植物的莖內(nèi)形成細(xì)胞間的系統(tǒng)性感染，主要通過垂直形式傳播，從植物母體通過種子傳播給下一代。Clay&Schardl又將這一類內(nèi)生真菌分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。（含義掌握）通常這類內(nèi)生真菌可以促進(jìn)植物生物量的積累，提高其耐旱能力，產(chǎn)生一些對動物有毒害的化學(xué)物質(zhì)。第十八頁，共36頁。3.1植物內(nèi)生真菌（二）非麥角類內(nèi)生真菌至今有超過1000篇文獻(xiàn)對非麥角類內(nèi)生真菌的報道分為三類：1）包含豐富物種，通常能在植物體根、莖、葉部位形成廣泛的定殖；通過種種或地下莖傳播；在根際分布少；可賦予植物非環(huán)境適應(yīng)性和環(huán)境適應(yīng)性；生長于惡劣環(huán)境中的植物被此類內(nèi)生真菌感染的頻率高達(dá)90%~100%。第十九頁，共36頁。3.1植物內(nèi)生真菌2）主要或只在植物地上部分的組織內(nèi)在在水平傳播；形成高局部性的感染；對宿主植物的有益或有害作用不存在環(huán)境特殊性；多樣性水平高。第二十頁，共36頁。3.1植物內(nèi)生真菌3）專指深色有隔內(nèi)生真菌。即一群定殖于植物根內(nèi)的小型土壤真菌，包括功能和分類上都不確切的多種真菌。這類真菌在定殖模式在不同的植物中相似，即菌絲顏色較深、具有明顯的橫隔，廣泛存在于健康植物根的表皮、皮層、甚至維管束組織的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙，能夠在植物細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙形成“微菌核”，但不會在根組織內(nèi)形成病原菌所引起的病理學(xué)特征。第二十一頁，共36頁。3.2植物內(nèi)生細(xì)菌（一）植物內(nèi)生細(xì)菌分布（典型的植物、典型的部位，216頁，表6-1）（二）內(nèi)生固氮細(xì)菌（一些不形成根瘤的類別）（三）潛在人體病原菌（植物組織中分離到病原細(xì)菌,如蠟狀芽孢桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、黏質(zhì)沙雷氏菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌；1995年由紫花苜蓿幼苗內(nèi)的沙門氏菌引起的疾病爆發(fā)，種子已經(jīng)感染）第二十二頁，共36頁。3.3植物內(nèi)生放線菌云南大學(xué)云南省微生物所放線菌研究室開展藥用植物內(nèi)生放線菌的資源研究。部分成果見教材。研究進(jìn)展討論（基于16sRNA，基因的免培養(yǎng)技術(shù)；馬鈴薯、水稻、滇南美登木等，放線菌。）第二十三頁，共36頁。3.4影響內(nèi)生菌分布的因素（一）地理環(huán)境（一個實驗；兩個地理區(qū)域中分布最多的物種：惡臭假單孢菌、巨大芽孢桿菌；同種菌在不同環(huán)境遺傳特征已經(jīng)發(fā)生變化，體現(xiàn)了菌株的適應(yīng)性與遺傳變遷）（二）植物物種（植物物種不同意味著根構(gòu)型、表面結(jié)構(gòu)、根分泌物成分及菌根化損傷等非植物體因素也不相同，直接導(dǎo)致最初從根部入侵的細(xì)菌種類。）（三）植物基因型（不同基因型的宿主植的生物化學(xué)成分的差異，直接影響到其內(nèi)生細(xì)菌的群落組成。）第二十四頁，共36頁。思考題1、說明內(nèi)生菌分離純化時，樣品采集及表面消毒時的主要處理方法要求。2、植物內(nèi)生菌樣品預(yù)處理的基本方式有哪些（列舉即可）3、查網(wǎng)絡(luò)資源，寫出下列培養(yǎng)基的配方。TSA;R2A;SNA附SNA：SNA培養(yǎng)基是syntheticlownutrientagar的縮寫，即合成低營養(yǎng)瓊脂，是用來培養(yǎng)串珠鐮刀菌的。在SNA上培養(yǎng)產(chǎn)生小型分生孢子，成鏈狀或假頭狀。配方：磷酸二氫鉀1.0g/L，硝酸鉀1.0g/L，七水硫酸鎂0.5g/L，氯化鉀0.5g/L，葡萄糖0.2g/L，蔗糖0.2g/L，瓊脂15g/L。使用：將菌株接種到SNA平板上，持續(xù)的黑光燈（PhilipsTL40W/08），17℃培養(yǎng)。經(jīng)過10~14天后檢查：取1平方厘米左右的帶菌培養(yǎng)基涂片，在顯微鏡下觀察。記載小孢子產(chǎn)生與否及其產(chǎn)生方式，大型分生孢子的形狀和大小，足孢有無，頂細(xì)胞特點(diǎn)以及產(chǎn)孢細(xì)胞的性狀，子囊殼的產(chǎn)生及色澤等，按其分種檢索特征初步鑒定到“種”。第二十五頁，共36頁。第四節(jié)植物內(nèi)生菌資源的利用4.1植物內(nèi)生菌的天然產(chǎn)物4.2植物內(nèi)生菌在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用4.3內(nèi)生菌在環(huán)境植物修復(fù)（phytoremediation)中的應(yīng)用4.4植物內(nèi)生菌在生物能源開發(fā)中的應(yīng)用第二十六頁，共36頁。4.1植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的天然產(chǎn)物植物內(nèi)生菌與宿主相互作用及應(yīng)用情況圖（222頁）（一）選擇植物來源Strobel：理性進(jìn)行內(nèi)生菌分離和天然產(chǎn)物開發(fā)的策略應(yīng)該注意四個方面：第二十七頁，共36頁。4.1植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的天然產(chǎn)物①生物于獨(dú)特甚至極端環(huán)境條件下，并擁有自身獨(dú)特的生存機(jī)制的植物；②具有民族、土著藥用歷史的植物，以及藥用化學(xué)成分已經(jīng)被詳細(xì)研究過的植物，其內(nèi)生菌有可能產(chǎn)物和宿主細(xì)胞相同或類似或比植物本身活性更強(qiáng)的活性化合物；③本土植物，擁有較長的生長時期，或者生長在某個較為古老的地帶；④生物多樣性豐富地區(qū)的植物，如生長于熱帶或亞熱帶地區(qū)的植物各類比生長于干旱和寒冷地區(qū)的植物各類豐富，其內(nèi)生菌的多樣性也相對較高。第二十八頁，共36頁。4.1植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的天然產(chǎn)物（二）抗生素類物質(zhì)植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的抗生素不僅對大量植物病原菌具有抑制或致死作用，同時對許多引起人類和動物疾病的細(xì)菌、真菌、病毒和原生動物也同樣有防治作用。例：內(nèi)生真菌-雷公藤中分離的內(nèi)生真菌、佛羅里達(dá)榧樹中分離到的小孢擬盤多毛孢、卷柏、青蒿、玉米；內(nèi)生細(xì)菌-綠黃假單孢菌、赤楊、蛇藤、銀樺、蓬萊蕉、姜科植物……（三）抗腫瘤物質(zhì)最典型的例子：1993年美國學(xué)者Stierle等首次從短葉紫杉的樹皮中分離獲得一株能產(chǎn)紫杉醇(taxol)和其他紫杉烷類化合物的內(nèi)生菌新物種-安德紫杉菌。這一發(fā)現(xiàn)的意義在于，為利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇，并為解決紫杉醇藥源危機(jī)提供了一條新途徑，由此掀起了從藥用植物中分離內(nèi)生菌的熱潮。第二十九頁，共36頁。4.1植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的天然產(chǎn)物紫杉醇類：紅豆杉屬植物、落羽松等中廣泛存在紫杉醇產(chǎn)生菌，同時這些菌也分屬許多不同的屬中。（教材225頁）生物堿類：主要從傳統(tǒng)藥用植物中提取，如雷公藤、長春花、喜樹、……，也還包括一些內(nèi)生放線菌。（四）其他類活性物質(zhì)第三十頁，共36頁。4.2植物內(nèi)生菌在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用（一）促生作用內(nèi)生菌促進(jìn)植物生長的機(jī)制多樣化，包括促進(jìn)礦物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，釋放促進(jìn)植物生長的激素，調(diào)節(jié)植物自身激素的合成，提供氮、磷元素，或協(xié)助增強(qiáng)植物與菌根真菌或根瘤菌的共生作用。提高植物對病原菌的抵抗能力，對環(huán)境壓力的護(hù)等也最張達(dá)到促進(jìn)植物生長的效果。1）提高營養(yǎng)狀況2）發(fā)酵提取物3）產(chǎn)生促進(jìn)植物生長的物質(zhì)（含某些小分子的代謝物）第三十一頁，共36頁。4.2植物內(nèi)生菌在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用（二）生防作用1.內(nèi)生真菌在生防中的應(yīng)用2.內(nèi)生細(xì)菌在生防中的應(yīng)用（1）產(chǎn)生抗菌物質(zhì)（2）酶解活性（3）競爭優(yōu)勢（4）誘導(dǎo)宿主系統(tǒng)抗性（三）增強(qiáng)宿主抗逆性（四）植物生長抑制劑第三十二頁，共36頁。4.3內(nèi)生菌在環(huán)境植物修復(fù)中的應(yīng)用（一）內(nèi)生菌協(xié)助植物修復(fù)有機(jī)污染環(huán)境注意：利用基因工程改造的內(nèi)生菌回接植物組織從而提高植物修復(fù)效率的策略（圖6-4）（二）內(nèi)生菌協(xié)助植物修復(fù)有毒金屬污染環(huán)境（三）協(xié)助植物修復(fù)復(fù)合污染環(huán)境第三十三頁，共36頁。4.4植物內(nèi)生菌在生物能源開發(fā)中的應(yīng)用前景2008年11月微生物學(xué)雜志報道了美國蒙大拿州立大學(xué)Strobel教授的研究成果：從巴塔哥尼亞北部植物心葉船型果木中分離到一株粉紅黏帚菌（G.roseum)可以產(chǎn)生數(shù)十種中等