BDE-209與Pb聯(lián)合暴露對(duì)F1代小鼠神經(jīng)毒性及自閉癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義在現(xiàn)代工業(yè)化進(jìn)程中，環(huán)境污染問(wèn)題愈發(fā)凸顯，其中多溴聯(lián)苯醚（PBDEs）和重金屬鉛（Pb）的污染備受關(guān)注。十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）作為PBDEs中應(yīng)用最廣泛的一種，因其優(yōu)異的阻燃性能，被大量添加到電子、紡織、建筑材料等產(chǎn)品中。隨著這些產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用與廢棄，BDE-209不斷釋放到環(huán)境中，在大氣、土壤、水體以及生物體內(nèi)都檢測(cè)到了它的存在。在大氣中，BDE-209可通過(guò)干濕沉降進(jìn)入土壤和水體；在土壤中，其含量逐漸累積，影響土壤生態(tài)系統(tǒng)；在水體中，它會(huì)被水生生物攝取，通過(guò)食物鏈傳遞和富集。研究表明，在一些電子垃圾拆解地，土壤中BDE-209的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他地區(qū)，對(duì)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重威脅。鉛（Pb）是一種具有高毒性的重金屬，在環(huán)境中廣泛存在。工業(yè)生產(chǎn)如采礦、冶煉、電池制造等活動(dòng)，以及含鉛汽油的使用，都會(huì)導(dǎo)致大量的Pb排放到環(huán)境中。Pb在土壤中的半衰期很長(zhǎng)，可達(dá)數(shù)十年甚至數(shù)百年，這使得它在土壤中不斷積累，難以被自然降解。同時(shí)，Pb可通過(guò)水、土壤和空氣等途徑進(jìn)入生物體，對(duì)生物的健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害。例如，在一些工業(yè)污染區(qū)，土壤中Pb含量過(guò)高，導(dǎo)致農(nóng)作物生長(zhǎng)受到抑制，農(nóng)產(chǎn)品中Pb含量超標(biāo)，進(jìn)而威脅到人類健康。近年來(lái)，自閉癥的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，這一現(xiàn)象引起了全球的廣泛關(guān)注。自閉癥是一種神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，涉及遺傳和環(huán)境等多種因素。研究表明，環(huán)境污染物可能在自閉癥的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。BDE-209和Pb都具有神經(jīng)毒性，它們可能通過(guò)干擾神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放和代謝，影響神經(jīng)元的發(fā)育、分化和凋亡，以及破壞血腦屏障的完整性等多種途徑，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，從而增加自閉癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在神經(jīng)遞質(zhì)方面，BDE-209和Pb可能干擾乙酰膽堿、多巴胺、γ-氨基丁酸等神經(jīng)遞質(zhì)的正常功能，導(dǎo)致神經(jīng)信號(hào)傳遞異常。在神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程中，它們可能抑制神經(jīng)元的遷移和分化，影響神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的正常形成。此外，BDE-209和Pb還可能通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，間接損傷神經(jīng)系統(tǒng)。F1代小鼠在胚胎發(fā)育和出生后的早期階段，神經(jīng)系統(tǒng)處于快速發(fā)育和分化的關(guān)鍵時(shí)期，此時(shí)它們對(duì)環(huán)境污染物的暴露極為敏感。即使是低劑量的BDE-209和Pb暴露，也可能對(duì)F1代小鼠的神經(jīng)發(fā)育產(chǎn)生不可逆的影響，從而導(dǎo)致行為異常和神經(jīng)功能障礙，增加自閉癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)對(duì)F1代小鼠進(jìn)行研究，可以深入了解BDE-209和Pb暴露對(duì)神經(jīng)發(fā)育的影響機(jī)制，為揭示自閉癥的發(fā)病機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為制定相關(guān)的預(yù)防和干預(yù)措施提供科學(xué)指導(dǎo)，對(duì)于保障人類健康和生態(tài)環(huán)境具有重要意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在BDE-209對(duì)動(dòng)物神經(jīng)毒性的研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了一定進(jìn)展。研究表明，BDE-209能夠影響動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。在一項(xiàng)對(duì)小鼠的實(shí)驗(yàn)中，給小鼠暴露一定劑量的BDE-209后，通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠在尋找平臺(tái)的過(guò)程中潛伏期明顯延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)增加，這表明其空間學(xué)習(xí)記憶能力受到了損害。從細(xì)胞和分子層面來(lái)看，BDE-209會(huì)干擾神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，使乙酰膽堿、多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放和代謝出現(xiàn)異常，進(jìn)而影響神經(jīng)信號(hào)的傳遞。BDE-209還會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，使體內(nèi)活性氧（ROS）水平升高，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)氧化和DNA損傷，破壞神經(jīng)元的正常結(jié)構(gòu)和功能。有研究發(fā)現(xiàn)，暴露于BDE-209的動(dòng)物大腦中，丙二醛（MDA）含量升高，超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶活性降低，這表明氧化應(yīng)激在BDE-209的神經(jīng)毒性中起到了重要作用。關(guān)于Pb對(duì)動(dòng)物神經(jīng)毒性的研究也較為豐富。Pb可以通過(guò)血腦屏障進(jìn)入大腦，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成多方面的損害。它會(huì)抑制神經(jīng)遞質(zhì)的合成酶活性，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)含量下降。例如，Pb暴露會(huì)使大鼠大腦中γ-氨基丁酸（GABA）的合成減少，從而影響神經(jīng)系統(tǒng)的抑制功能，使動(dòng)物出現(xiàn)興奮、多動(dòng)等行為異常。Pb還會(huì)干擾神經(jīng)元的發(fā)育和分化，影響神經(jīng)細(xì)胞的遷移和突觸的形成，破壞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的正常結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞水平上，Pb會(huì)誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，通過(guò)激活caspase家族蛋白酶等途徑，引發(fā)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。有研究顯示，Pb處理后的神經(jīng)細(xì)胞中，caspase-3的活性明顯升高，細(xì)胞凋亡率增加。在自閉癥相關(guān)研究方面，環(huán)境因素與自閉癥的關(guān)聯(lián)逐漸受到關(guān)注。一些研究指出，BDE-209和Pb暴露可能與自閉癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。有流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在一些電子垃圾拆解地區(qū)，環(huán)境中BDE-209和Pb的含量較高，同時(shí)該地區(qū)兒童自閉癥的發(fā)病率也相對(duì)較高。從機(jī)制上推測(cè)，BDE-209和Pb可能通過(guò)干擾神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期的基因表達(dá)和信號(hào)通路，影響神經(jīng)元的正常發(fā)育和功能連接，從而增加自閉癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。但目前這方面的研究還處于探索階段，相關(guān)機(jī)制尚未完全明確。在BDE-209與Pb聯(lián)合暴露的研究中，發(fā)現(xiàn)二者可能存在協(xié)同或拮抗作用。有研究表明，BDE-209和Pb聯(lián)合暴露對(duì)大鼠神經(jīng)行為的影響比單獨(dú)暴露更為嚴(yán)重，在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合暴露組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降更為顯著，這提示可能存在協(xié)同神經(jīng)毒性作用。但也有研究報(bào)道，在某些條件下，二者聯(lián)合暴露時(shí)的毒性效應(yīng)低于單獨(dú)暴露，表現(xiàn)出一定的拮抗作用，其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。盡管已有上述研究成果，但目前仍存在一些研究空白與不足。在BDE-209和Pb聯(lián)合暴露對(duì)F1代小鼠神經(jīng)毒性和自閉癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的研究方面，相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少。對(duì)于二者聯(lián)合暴露在F1代小鼠神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期，如胚胎期和哺乳期，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化、遷移以及神經(jīng)環(huán)路形成等方面的影響機(jī)制研究不夠深入。在表觀遺傳學(xué)層面，BDE-209和Pb聯(lián)合暴露對(duì)F1代小鼠神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的DNA甲基化、組蛋白修飾以及非編碼RNA表達(dá)的影響尚不清楚，而表觀遺傳修飾的改變可能在神經(jīng)毒性和自閉癥發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。此外，目前研究多集中在實(shí)驗(yàn)室條件下的動(dòng)物模型，對(duì)于實(shí)際環(huán)境中BDE-209和Pb的復(fù)雜暴露情況，以及其對(duì)人類健康影響的評(píng)估還需要進(jìn)一步加強(qiáng)。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究BDE-209與Pb暴露對(duì)F1代小鼠自閉癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和神經(jīng)毒性的影響及其潛在分子機(jī)制，為揭示自閉癥的環(huán)境致病因素提供理論依據(jù)，具體研究?jī)?nèi)容如下：評(píng)估BDE-209與Pb暴露對(duì)F1代小鼠自閉癥相關(guān)行為的影響：通過(guò)建立F1代小鼠的BDE-209與Pb暴露模型，對(duì)孕鼠在孕期和哺乳期進(jìn)行不同劑量的BDE-209與Pb處理，使F1代小鼠在胚胎發(fā)育和早期生長(zhǎng)階段暴露于污染物中。待F1代小鼠出生并發(fā)育至特定階段后，運(yùn)用一系列行為學(xué)測(cè)試方法，如曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、三箱社交實(shí)驗(yàn)、Y迷宮實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)等，全面評(píng)估其行為表現(xiàn)。在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，觀察小鼠的活動(dòng)水平、探索行為和焦慮程度；三箱社交實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)小鼠的社交偏好和社交互動(dòng)能力；Y迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力；強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)則可反映小鼠的抑郁樣行為。通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)，分析BDE-209與Pb暴露對(duì)F1代小鼠自閉癥相關(guān)行為，如社交障礙、重復(fù)刻板行為、認(rèn)知功能障礙等的影響，并確定其是否會(huì)增加自閉癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。探究BDE-209與Pb暴露對(duì)F1代小鼠神經(jīng)毒性的影響：從多個(gè)層面深入研究BDE-209與Pb暴露對(duì)F1代小鼠神經(jīng)毒性的影響。在組織形態(tài)學(xué)層面，對(duì)F1代小鼠的大腦進(jìn)行切片處理，運(yùn)用蘇木精-伊紅（HE）染色、尼氏染色等方法，觀察大腦組織結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元形態(tài)的變化，如神經(jīng)元的數(shù)量、大小、形態(tài)，以及神經(jīng)纖維的排列等，分析是否存在神經(jīng)元損傷、凋亡或發(fā)育異常等情況。在神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)層面，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）等方法，檢測(cè)小鼠大腦中多種神經(jīng)遞質(zhì)（如乙酰膽堿、多巴胺、γ-氨基丁酸、5-羥色胺等）和神經(jīng)調(diào)質(zhì)（如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等）的含量和活性變化，探討其對(duì)神經(jīng)信號(hào)傳遞和神經(jīng)發(fā)育的影響。在氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)層面，檢測(cè)小鼠大腦中氧化應(yīng)激指標(biāo)（如活性氧、丙二醛含量，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性等）和炎癥相關(guān)因子（如白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α等）的表達(dá)水平，研究BDE-209與Pb暴露是否通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)毒性。探討B(tài)DE-209與Pb暴露影響F1代小鼠神經(jīng)發(fā)育和自閉癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的分子機(jī)制：從基因表達(dá)和信號(hào)通路層面入手，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）、免疫組化等技術(shù)，檢測(cè)與神經(jīng)發(fā)育、自閉癥相關(guān)的關(guān)鍵基因（如MECP2、FOXP2、SHANK3等）和信號(hào)通路（如Wnt/β-catenin、PI3K/Akt、MAPK等）的表達(dá)和活性變化。通過(guò)基因敲低、過(guò)表達(dá)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證關(guān)鍵基因和信號(hào)通路在BDE-209與Pb暴露導(dǎo)致的神經(jīng)毒性和自閉癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加中的作用機(jī)制。從表觀遺傳學(xué)層面，運(yùn)用全基因組DNA甲基化測(cè)序、染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）、微小RNA測(cè)序等技術(shù)，研究BDE-209與Pb暴露對(duì)F1代小鼠神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的DNA甲基化、組蛋白修飾（如甲基化、乙?；?、磷酸化等）以及非編碼RNA（如miRNA、lncRNA等）表達(dá)的影響，揭示表觀遺傳修飾在環(huán)境污染物誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性和自閉癥發(fā)病機(jī)制中的調(diào)控作用。1.4研究方法與技術(shù)路線研究方法動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選用健康的SPF級(jí)小鼠，按照隨機(jī)原則將孕鼠分為對(duì)照組、BDE-209暴露組、Pb暴露組以及BDE-209與Pb聯(lián)合暴露組，每組設(shè)置多個(gè)重復(fù)。在孕鼠孕期和哺乳期，通過(guò)灌胃或飲水等方式給予不同劑量的BDE-209和Pb，以建立F1代小鼠的暴露模型。對(duì)F1代小鼠從出生到成年進(jìn)行持續(xù)觀察和飼養(yǎng)，記錄其生長(zhǎng)發(fā)育情況，包括體重、體長(zhǎng)等指標(biāo)。行為學(xué)測(cè)試：在F1代小鼠達(dá)到特定年齡階段，運(yùn)用多種行為學(xué)測(cè)試方法評(píng)估其自閉癥相關(guān)行為和神經(jīng)功能。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，將小鼠置于曠場(chǎng)裝置中，記錄其在一定時(shí)間內(nèi)的活動(dòng)軌跡、活動(dòng)距離、中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間等參數(shù)，以評(píng)估其活動(dòng)水平、探索行為和焦慮程度。三箱社交實(shí)驗(yàn)里，利用三箱社交裝置，觀察小鼠在不同箱體間的穿梭次數(shù)、與陌生小鼠的互動(dòng)時(shí)間等，用于檢測(cè)其社交偏好和社交互動(dòng)能力。Y迷宮實(shí)驗(yàn)通過(guò)記錄小鼠在Y迷宮中進(jìn)入不同臂的次數(shù)和順序，評(píng)估其空間學(xué)習(xí)記憶能力。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)時(shí)，將小鼠放入裝有一定深度水的容器中，記錄其不動(dòng)時(shí)間，以此反映小鼠的抑郁樣行為。組織病理學(xué)分析：在完成行為學(xué)測(cè)試后，對(duì)F1代小鼠進(jìn)行安樂(lè)死，迅速取出大腦組織。將大腦組織進(jìn)行固定、脫水、包埋等處理，制成石蠟切片。運(yùn)用蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察大腦組織結(jié)構(gòu)的整體形態(tài)，如大腦皮層、海馬、小腦等區(qū)域的細(xì)胞排列、形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性，分析是否存在神經(jīng)元損傷、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等情況。采用尼氏染色，可特異性地顯示神經(jīng)元中的尼氏體，觀察神經(jīng)元的數(shù)量、大小、形態(tài)變化，以及尼氏體的分布和含量，判斷神經(jīng)元的功能狀態(tài)和是否存在損傷或凋亡。神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)檢測(cè)：取F1代小鼠的大腦特定區(qū)域組織，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）技術(shù)，對(duì)大腦中的乙酰膽堿、多巴胺、γ-氨基丁酸、5-羥色胺等神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行分離和定量分析，準(zhǔn)確測(cè)定其含量變化。利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）方法，檢測(cè)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等神經(jīng)調(diào)質(zhì)的表達(dá)水平，探討其對(duì)神經(jīng)信號(hào)傳遞和神經(jīng)發(fā)育的影響。氧化應(yīng)激和炎癥指標(biāo)檢測(cè)：使用化學(xué)比色法或熒光分析法，檢測(cè)小鼠大腦中活性氧（ROS）的含量，如通過(guò)特定的熒光探針標(biāo)記ROS，利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度來(lái)反映ROS水平。采用硫代巴比妥酸（TBA）法檢測(cè)丙二醛（MDA）含量，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量可反映氧化應(yīng)激的程度。通過(guò)檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性，評(píng)估機(jī)體的抗氧化防御能力。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)或ELISA方法，檢測(cè)炎癥相關(guān)因子如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的mRNA表達(dá)水平或蛋白含量，研究BDE-209與Pb暴露是否通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)毒性。分子生物學(xué)檢測(cè)：提取F1代小鼠大腦組織的總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)與神經(jīng)發(fā)育、自閉癥相關(guān)的關(guān)鍵基因如MECP2、FOXP2、SHANK3等的mRNA表達(dá)水平，分析基因表達(dá)的變化。提取大腦組織總蛋白，利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測(cè)上述關(guān)鍵基因以及相關(guān)信號(hào)通路蛋白如Wnt/β-catenin、PI3K/Akt、MAPK等的表達(dá)和磷酸化水平，研究信號(hào)通路的激活或抑制狀態(tài)。運(yùn)用免疫組化技術(shù)，對(duì)關(guān)鍵蛋白進(jìn)行定位和半定量分析，直觀地觀察其在大腦組織中的分布和表達(dá)情況。表觀遺傳學(xué)分析：采用全基因組DNA甲基化測(cè)序技術(shù)，分析F1代小鼠大腦組織中DNA甲基化的整體水平和差異甲基化區(qū)域，研究BDE-209與Pb暴露對(duì)神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域或編碼區(qū)DNA甲基化狀態(tài)的影響。運(yùn)用染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）技術(shù)，檢測(cè)與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的組蛋白修飾，如組蛋白H3賴氨酸4甲基化（H3K4me3）、組蛋白H3賴氨酸9甲基化（H3K9me3）、組蛋白H3賴氨酸27乙?；℉3K27ac）等在基因組上的分布和變化，揭示組蛋白修飾對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用。通過(guò)微小RNA測(cè)序（miRNA-seq）和長(zhǎng)鏈非編碼RNA測(cè)序（lncRNA-seq）技術(shù)，篩選出在BDE-209與Pb暴露組和對(duì)照組中差異表達(dá)的miRNA和lncRNA，并通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)其靶基因，研究非編碼RNA在環(huán)境污染物誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性和自閉癥發(fā)病機(jī)制中的調(diào)控作用。技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：首先進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備，將健康的SPF級(jí)小鼠進(jìn)行合籠交配，確定孕鼠后隨機(jī)分組。對(duì)不同組別的孕鼠在孕期和哺乳期進(jìn)行相應(yīng)的BDE-209和Pb暴露處理。待F1代小鼠出生后，飼養(yǎng)至特定年齡階段，先進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，全面評(píng)估其自閉癥相關(guān)行為。行為學(xué)測(cè)試完成后，處死小鼠并采集大腦組織。對(duì)大腦組織分別進(jìn)行組織病理學(xué)分析，觀察組織結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元形態(tài)變化；進(jìn)行神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)檢測(cè)，分析神經(jīng)信號(hào)傳遞相關(guān)物質(zhì)的變化；檢測(cè)氧化應(yīng)激和炎癥指標(biāo)，研究氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在神經(jīng)毒性中的作用；開(kāi)展分子生物學(xué)檢測(cè)，探究關(guān)鍵基因和信號(hào)通路的表達(dá)變化；最后進(jìn)行表觀遺傳學(xué)分析，揭示DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA在其中的調(diào)控機(jī)制。通過(guò)以上一系列實(shí)驗(yàn)步驟和技術(shù)方法，深入研究BDE-209與Pb暴露對(duì)F1代小鼠自閉癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和神經(jīng)毒性的影響及其潛在分子機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖1-1，圖中清晰展示從動(dòng)物分組與暴露處理，到行為學(xué)測(cè)試、組織樣本采集，再到各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)分析的整個(gè)研究流程]二、實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)環(huán)境本研究選用SPF級(jí)C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，該品系小鼠具有遺傳背景清晰、繁殖性能良好、對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在神經(jīng)科學(xué)和毒理學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用。選擇F1代小鼠進(jìn)行研究，是因?yàn)镕1代小鼠在胚胎發(fā)育和出生后的早期階段，神經(jīng)系統(tǒng)正處于快速發(fā)育和分化的關(guān)鍵時(shí)期，此時(shí)它們對(duì)環(huán)境污染物的暴露極為敏感。即使是低劑量的BDE-209和Pb暴露，也可能對(duì)F1代小鼠的神經(jīng)發(fā)育產(chǎn)生不可逆的影響，從而導(dǎo)致行為異常和神經(jīng)功能障礙，增加自閉癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)對(duì)F1代小鼠進(jìn)行研究，可以更直接地觀察環(huán)境污染物對(duì)神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期的影響，深入了解BDE-209與Pb暴露對(duì)神經(jīng)毒性和自閉癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度為23±1℃、相對(duì)濕度為50±5%的屏障環(huán)境動(dòng)物房?jī)?nèi)，保持12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的晝夜節(jié)律。動(dòng)物房?jī)?nèi)采用獨(dú)立通風(fēng)籠具（IVC）系統(tǒng)飼養(yǎng)小鼠，以確保空氣的清潔和流通，減少微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。每籠飼養(yǎng)4-5只小鼠，給予充足的無(wú)菌飼料和經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌處理的飲用水，自由攝食和飲水。飼料選用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料，其營(yíng)養(yǎng)成分全面，能夠滿足小鼠生長(zhǎng)發(fā)育的需求。每周定期更換鼠籠和墊料，保持飼養(yǎng)環(huán)境的清潔衛(wèi)生，減少氨氣等有害氣體的產(chǎn)生。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化等，確保小鼠處于健康狀態(tài)，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性提供保障。2.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器實(shí)驗(yàn)試劑BDE-209：純度≥98%，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。該試劑為白色結(jié)晶粉末，是本研究中用于模擬環(huán)境污染物暴露的主要多溴聯(lián)苯醚類物質(zhì)。使用時(shí)，先將BDE-209用分析純的玉米油溶解，配制成高濃度的儲(chǔ)備液，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的劑量，用玉米油進(jìn)一步稀釋成不同濃度的工作液，用于對(duì)小鼠的灌胃處理。醋酸鉛（Pb(CH?COO)?）：分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其為白色晶體，易溶于水。將醋酸鉛用超純水溶解，配制成一定濃度的水溶液，作為鉛暴露的試劑，通過(guò)飲水的方式讓小鼠攝入，以建立鉛暴露模型。蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒：購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，用于對(duì)小鼠大腦組織切片進(jìn)行染色，以觀察大腦組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)變化，包括細(xì)胞排列、形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性等，從而判斷是否存在神經(jīng)元損傷、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等情況。尼氏染色液：同樣購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，能特異性地顯示神經(jīng)元中的尼氏體，用于觀察神經(jīng)元的數(shù)量、大小、形態(tài)變化，以及尼氏體的分布和含量，進(jìn)而判斷神經(jīng)元的功能狀態(tài)和是否存在損傷或凋亡。神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)檢測(cè)試劑盒：乙酰膽堿、多巴胺、γ-氨基丁酸、5-羥色胺等神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)試劑盒以及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等神經(jīng)調(diào)質(zhì)檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。這些試劑盒基于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）原理，用于定量檢測(cè)小鼠大腦中神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)的含量，以分析神經(jīng)信號(hào)傳遞和神經(jīng)發(fā)育相關(guān)物質(zhì)的變化。氧化應(yīng)激和炎癥指標(biāo)檢測(cè)試劑盒：活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒采用2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）法，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒采用硫代巴比妥酸（TBA）法，超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）檢測(cè)試劑盒采用比色法，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。炎癥相關(guān)因子如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。通過(guò)這些試劑盒檢測(cè)小鼠大腦中的氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥相關(guān)因子表達(dá)水平，研究氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在神經(jīng)毒性中的作用。RNA提取試劑Trizol：購(gòu)自Invitrogen公司，用于提取小鼠大腦組織中的總RNA，為后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒選用TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，可將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；qRT-PCR試劑盒采用TaKaRa公司的TBGreenPremixExTaqII，用于對(duì)與神經(jīng)發(fā)育、自閉癥相關(guān)的關(guān)鍵基因如MECP2、FOXP2、SHANK3等的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測(cè)。蛋白質(zhì)提取試劑RIPA裂解液和BCA蛋白定量試劑盒：RIPA裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于提取小鼠大腦組織總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，通過(guò)比色法測(cè)定蛋白濃度，為蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)提供標(biāo)準(zhǔn)化的蛋白樣品。Westernblot相關(guān)試劑：SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；Tris-甘氨酸電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜緩沖液、封閉液（5%脫脂奶粉）、一抗（針對(duì)關(guān)鍵基因和信號(hào)通路蛋白的特異性抗體）、二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG抗體）等試劑均購(gòu)自CellSignalingTechnology公司。這些試劑用于Westernblot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)關(guān)鍵基因以及相關(guān)信號(hào)通路蛋白如Wnt/β-catenin、PI3K/Akt、MAPK等的表達(dá)和磷酸化水平，研究信號(hào)通路的激活或抑制狀態(tài)。免疫組化相關(guān)試劑：免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，包括蘇木精復(fù)染液、DAB顯色試劑盒等；一抗和二抗與Westernblot實(shí)驗(yàn)中使用的部分相同，用于對(duì)關(guān)鍵蛋白進(jìn)行定位和半定量分析，直觀地觀察其在大腦組織中的分布和表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)儀器電子天平：型號(hào)為SartoriusBT25S，精度為0.1mg，購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。用于精確稱量BDE-209、醋酸鉛等試劑，確保實(shí)驗(yàn)劑量的準(zhǔn)確性。漩渦振蕩器：型號(hào)為QL-901，購(gòu)自海門市其林貝爾儀器制造有限公司。在試劑配制過(guò)程中，用于快速混合溶液，使試劑充分溶解。離心機(jī)：型號(hào)為Eppendorf5424R，購(gòu)自艾本德（中國(guó)）有限公司。具備不同的離心速度和溫度設(shè)置，可用于分離細(xì)胞、沉淀蛋白質(zhì)、RNA等生物樣品，如在RNA提取和蛋白質(zhì)提取實(shí)驗(yàn)中，用于離心分離上清液和沉淀。PCR儀：型號(hào)為Bio-RadT100，購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。用于逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA以及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，通過(guò)精確控制溫度和循環(huán)次數(shù)，實(shí)現(xiàn)基因的擴(kuò)增和定量檢測(cè)。凝膠成像系統(tǒng)：型號(hào)為Bio-RadChemiDocMP，購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。在qRT-PCR實(shí)驗(yàn)完成后，用于對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行成像和分析，獲取基因表達(dá)水平的相關(guān)數(shù)據(jù)。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS）：型號(hào)為Agilent1290InfinityIILC-6495TripleQuadrupoleMS，購(gòu)自安捷倫科技（中國(guó)）有限公司。該儀器結(jié)合了高效液相色譜的分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性檢測(cè)能力，用于檢測(cè)小鼠大腦中的神經(jīng)遞質(zhì)含量，能夠準(zhǔn)確地對(duì)乙酰膽堿、多巴胺、γ-氨基丁酸、5-羥色胺等神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行分離和定量分析。酶標(biāo)儀：型號(hào)為ThermoScientificMultiskanGO，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。在ELISA實(shí)驗(yàn)中，用于檢測(cè)吸光度值，從而定量分析神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)、氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥相關(guān)因子等物質(zhì)的含量。熒光分光光度計(jì)：型號(hào)為HitachiF-7000，購(gòu)自日立高新技術(shù)（上海）國(guó)際貿(mào)易有限公司。用于檢測(cè)ROS等具有熒光特性的物質(zhì)含量，通過(guò)測(cè)量特定波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度，反映ROS的水平。石蠟切片機(jī)：型號(hào)為L(zhǎng)eicaRM2235，購(gòu)自徠卡顯微系統(tǒng)（上海）有限公司。用于將固定、脫水、包埋后的小鼠大腦組織切成厚度均勻的石蠟切片，切片厚度可精確控制，滿足組織病理學(xué)分析的需求。光學(xué)顯微鏡：型號(hào)為NikonEclipse80i，購(gòu)自尼康儀器（上海）有限公司。配備不同倍數(shù)的物鏡和目鏡，可對(duì)HE染色、尼氏染色后的大腦組織切片進(jìn)行觀察，通過(guò)目鏡或連接的圖像采集系統(tǒng)，獲取大腦組織結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元形態(tài)的圖像，用于分析是否存在神經(jīng)元損傷、凋亡或發(fā)育異常等情況。冰凍切片機(jī)：型號(hào)為L(zhǎng)eicaCM1950，購(gòu)自徠卡顯微系統(tǒng)（上海）有限公司。用于制備小鼠大腦組織的冰凍切片，在免疫組化實(shí)驗(yàn)中，冰凍切片能夠更好地保存組織的抗原性，便于對(duì)關(guān)鍵蛋白進(jìn)行定位和半定量分析。超低溫冰箱：型號(hào)為ThermoScientificForma900Series，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。溫度可達(dá)到-80℃，用于長(zhǎng)期保存生物樣品，如提取的RNA、蛋白質(zhì)以及制備的組織切片等，防止樣品降解和變質(zhì)。恒溫培養(yǎng)箱：型號(hào)為ThermoScientificHeratherm，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。用于細(xì)胞培養(yǎng)和試劑孵育等實(shí)驗(yàn)，可精確控制溫度和濕度，為細(xì)胞生長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)反應(yīng)提供適宜的環(huán)境。2.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)動(dòng)物分組：將受孕的SPF級(jí)C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為對(duì)照組、BDE-209暴露組、Pb暴露組以及BDE-209與Pb聯(lián)合暴露組。分組時(shí)采用隨機(jī)數(shù)字表法，確保每組小鼠的初始狀態(tài)盡可能一致，減少個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。暴露處理對(duì)照組：給予孕鼠灌胃玉米油，同時(shí)提供正常的飲用水，灌胃體積為0.2mL/10g體重，每天一次，從孕鼠懷孕第1天開(kāi)始，持續(xù)至哺乳期結(jié)束。玉米油作為溶劑，對(duì)小鼠的生理狀態(tài)基本無(wú)影響，用于排除溶劑本身可能帶來(lái)的干擾。BDE-209暴露組：將BDE-209用玉米油溶解，配制成濃度為50mg/kg的溶液。按照0.2mL/10g體重的劑量，對(duì)孕鼠進(jìn)行灌胃處理，每天一次，從懷孕第1天開(kāi)始，直至哺乳期結(jié)束。該劑量的選擇參考了相關(guān)文獻(xiàn)研究以及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在確保能夠產(chǎn)生一定毒理學(xué)效應(yīng)的同時(shí)，又不會(huì)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的中毒癥狀甚至死亡，以保證實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝽樌M(jìn)行。Pb暴露組：將醋酸鉛（Pb(CH?COO)?）用超純水溶解，配制成濃度為0.2%的水溶液，作為小鼠的飲用水，讓小鼠自由飲用，從懷孕第1天開(kāi)始，持續(xù)至哺乳期結(jié)束。此濃度的選擇基于前期研究中對(duì)小鼠鉛暴露的適宜劑量范圍，能夠使小鼠在實(shí)驗(yàn)期間攝入適量的鉛，從而觀察到其對(duì)小鼠神經(jīng)毒性和自閉癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響。BDE-209與Pb聯(lián)合暴露組：孕鼠既接受BDE-209的灌胃處理（劑量和方式同BDE-209暴露組），又飲用含0.2%醋酸鉛的水溶液（同Pb暴露組），從懷孕第1天開(kāi)始，至哺乳期結(jié)束。通過(guò)這種方式，研究BDE-209與Pb聯(lián)合暴露對(duì)F1代小鼠的綜合影響，探究二者之間是否存在協(xié)同或拮抗作用。F1代小鼠飼養(yǎng)與觀察：F1代小鼠出生后，記錄其出生日期、體重、性別等信息。每窩小鼠保留8-10只，以保證足夠的樣本量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)避免因飼養(yǎng)密度過(guò)大或過(guò)小對(duì)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響。繼續(xù)按照上述分組方式，對(duì)F1代小鼠進(jìn)行相應(yīng)的處理，直至其達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需的年齡階段。在飼養(yǎng)過(guò)程中，每天觀察F1代小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、活動(dòng)水平等，記錄是否出現(xiàn)異常行為或癥狀，如精神萎靡、食欲不振、活動(dòng)減少、抽搐等，確保小鼠的健康狀況符合實(shí)驗(yàn)要求。行為學(xué)測(cè)試時(shí)間點(diǎn)：當(dāng)F1代小鼠生長(zhǎng)至6-8周齡時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。這個(gè)年齡段的小鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相對(duì)成熟，行為模式較為穩(wěn)定，能夠更準(zhǔn)確地反映出環(huán)境污染物暴露對(duì)其行為的影響。在進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試前，將小鼠置于行為學(xué)測(cè)試室適應(yīng)環(huán)境30分鐘，減少環(huán)境變化對(duì)小鼠行為的干擾。各項(xiàng)行為學(xué)測(cè)試之間間隔3-5天，避免連續(xù)測(cè)試對(duì)小鼠造成過(guò)度應(yīng)激，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。2.4檢測(cè)指標(biāo)與方法行為學(xué)檢測(cè)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：采用大小為40cm×40cm×40cm的曠場(chǎng)裝置，底面劃分為多個(gè)等面積的小方格，四周用不透明材料制成。將F1代小鼠輕輕放入曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)域，開(kāi)啟視頻跟蹤系統(tǒng)，記錄小鼠在5分鐘內(nèi)的活動(dòng)軌跡。分析小鼠的總活動(dòng)距離，反映其活動(dòng)水平；統(tǒng)計(jì)中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間，中央?yún)^(qū)域相對(duì)空曠，小鼠停留時(shí)間越短，表明其焦慮程度越高；觀察小鼠進(jìn)入不同方格的次數(shù)，評(píng)估其探索行為。三箱社交實(shí)驗(yàn)：三箱社交裝置由三個(gè)相同大小且相互連通的透明箱體組成，中間箱體為社交互動(dòng)區(qū)，兩側(cè)箱體分別放置陌生小鼠（與實(shí)驗(yàn)小鼠性別相同、年齡相近且未接觸過(guò)）和空籠子。實(shí)驗(yàn)時(shí)，先將F1代小鼠放入中間箱體適應(yīng)環(huán)境5分鐘，然后分別將陌生小鼠和空籠子放入兩側(cè)箱體，再觀察10分鐘。記錄小鼠在不同箱體間的穿梭次數(shù)，以及與陌生小鼠互動(dòng)的時(shí)間，包括嗅聞、追逐、身體接觸等行為的持續(xù)時(shí)間，以此評(píng)估小鼠的社交偏好和社交互動(dòng)能力。Y迷宮實(shí)驗(yàn)：Y迷宮由三個(gè)等長(zhǎng)的臂組成，呈Y字形分布，每個(gè)臂長(zhǎng)30cm，寬10cm，高15cm。將F1代小鼠放入其中一個(gè)臂的起始端，記錄其在8分鐘內(nèi)進(jìn)入不同臂的次數(shù)和順序。通過(guò)計(jì)算自發(fā)交替率（自發(fā)交替次數(shù)/（總進(jìn)入次數(shù)-2）×100%）來(lái)評(píng)估小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，自發(fā)交替率越高，表明小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)備直徑18cm、高25cm的透明玻璃圓筒，內(nèi)裝深度為15cm、溫度為25±1℃的水。將F1代小鼠放入圓筒中，使其無(wú)法逃脫，用攝像機(jī)記錄6分鐘內(nèi)小鼠的行為。主要觀察小鼠的不動(dòng)時(shí)間，即小鼠停止掙扎，漂浮在水面上僅做維持身體平衡的微小動(dòng)作的累計(jì)時(shí)間，不動(dòng)時(shí)間越長(zhǎng)，反映小鼠的抑郁樣行為越明顯。神經(jīng)毒性相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)組織病理學(xué)分析：在完成行為學(xué)測(cè)試后，將F1代小鼠用過(guò)量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后處死，迅速取出大腦組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定24小時(shí)以上。將固定后的大腦組織進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋等處理，制成石蠟切片，切片厚度為5μm。采用蘇木精-伊紅（HE）染色，具體步驟為：切片脫蠟至水，蘇木精染液染色5-10分鐘，自來(lái)水沖洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，伊紅染液染色2-5分鐘，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察大腦組織結(jié)構(gòu)，包括大腦皮層、海馬、小腦等區(qū)域的細(xì)胞排列、形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性，判斷是否存在神經(jīng)元損傷、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等情況。采用尼氏染色，切片脫蠟至水后，浸入尼氏染色液中37℃孵育30-60分鐘，水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。尼氏染色可特異性地顯示神經(jīng)元中的尼氏體，通過(guò)觀察神經(jīng)元的數(shù)量、大小、形態(tài)變化，以及尼氏體的分布和含量，判斷神經(jīng)元的功能狀態(tài)和是否存在損傷或凋亡。神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)檢測(cè)：取F1代小鼠的大腦特定區(qū)域（如海馬、前額葉皮質(zhì)等）組織，加入適量的預(yù)冷生理鹽水，在冰浴條件下勻漿，制成10%的組織勻漿。將勻漿在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清液用于神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)的檢測(cè)。采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）技術(shù)檢測(cè)乙酰膽堿、多巴胺、γ-氨基丁酸、5-羥色胺等神經(jīng)遞質(zhì)的含量。具體操作如下：將上清液過(guò)0.22μm微孔濾膜，取適量濾液注入HPLC-MS系統(tǒng)。色譜柱選用C18反相色譜柱，流動(dòng)相為含0.1%甲酸的乙腈和含0.1%甲酸的水溶液，采用梯度洗脫方式。質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI），正離子或負(fù)離子模式檢測(cè)，通過(guò)選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）模式對(duì)目標(biāo)神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行定量分析。利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）方法檢測(cè)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）等神經(jīng)調(diào)質(zhì)的表達(dá)水平。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將上清液加入已包被特異性抗體的酶標(biāo)板中，37℃孵育1-2小時(shí)，洗滌后加入酶標(biāo)二抗，37℃孵育30-60分鐘，洗滌后加入底物顯色，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算神經(jīng)調(diào)質(zhì)的含量。氧化應(yīng)激和炎癥指標(biāo)檢測(cè)：使用化學(xué)比色法或熒光分析法檢測(cè)小鼠大腦中活性氧（ROS）的含量。以DCFH-DA熒光探針?lè)槔?，取大腦組織勻漿上清液，加入DCFH-DA工作液，37℃孵育20分鐘，用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)488nm、發(fā)射波長(zhǎng)525nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ROS含量。采用硫代巴比妥酸（TBA）法檢測(cè)丙二醛（MDA）含量，將大腦組織勻漿與TBA試劑混合，在95℃水浴中反應(yīng)30分鐘，冷卻后離心，取上清液在532nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)MDA標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MDA含量。通過(guò)檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性，評(píng)估機(jī)體的抗氧化防御能力。采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD活性，利用GSH-Px催化谷胱甘肽（GSH）與過(guò)氧化氫（H?O?）反應(yīng)的原理，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系中剩余GSH的含量來(lái)計(jì)算GSH-Px活性。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)炎癥相關(guān)因子如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的mRNA表達(dá)水平。提取大腦組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。通過(guò)比較Ct值，采用2?ΔΔCt法計(jì)算炎癥因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量。也可使用ELISA方法檢測(cè)炎癥相關(guān)因子的蛋白含量，操作步驟與神經(jīng)調(diào)質(zhì)的ELISA檢測(cè)類似。分子生物學(xué)檢測(cè)基因表達(dá)檢測(cè)：提取F1代小鼠大腦組織的總RNA，使用Trizol試劑按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser試劑盒。以cDNA為模板，使用TBGreenPremixExTaqII試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）反應(yīng)，檢測(cè)與神經(jīng)發(fā)育、自閉癥相關(guān)的關(guān)鍵基因如MECP2、FOXP2、SHANK3等的mRNA表達(dá)水平。根據(jù)GenBank中公布的基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)體系總體積為20μL，包括10μL的TBGreenPremixExTaqII、0.8μL的上游引物（10μM）、0.8μL的下游引物（10μM）、2μL的cDNA模板和6.4μL的ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)比較Ct值，采用2?ΔΔCt法計(jì)算基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。蛋白質(zhì)表達(dá)檢測(cè)：提取F1代小鼠大腦組織總蛋白，使用RIPA裂解液在冰浴條件下裂解組織，12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取適量蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白分離后，通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2小時(shí)，加入針對(duì)關(guān)鍵基因和信號(hào)通路蛋白的特異性一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10分鐘，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10分鐘，加入化學(xué)發(fā)光底物，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，檢測(cè)關(guān)鍵基因以及相關(guān)信號(hào)通路蛋白如Wnt/β-catenin、PI3K/Akt、MAPK等的表達(dá)和磷酸化水平。采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（如β-actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。免疫組化檢測(cè)：將F1代小鼠大腦組織制成石蠟切片或冰凍切片，切片厚度為5-8μm。石蠟切片需脫蠟至水，冰凍切片則直接進(jìn)行后續(xù)操作。用3%過(guò)氧化氫溶液孵育切片10-15分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5分鐘。加入正常山羊血清封閉液，室溫孵育15-30分鐘，以減少非特異性染色。傾去封閉液，不洗，直接加入稀釋好的一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5分鐘，加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育15-30分鐘。再次用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5分鐘，加入鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育15-30分鐘。用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5分鐘，加入DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)顯色適度時(shí)，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察關(guān)鍵蛋白在大腦組織中的分布和表達(dá)情況，采用圖像分析軟件對(duì)陽(yáng)性染色區(qū)域進(jìn)行半定量分析。三、BDE-209與Pb暴露對(duì)F1代小鼠自閉癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響3.1行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.1.1社交行為實(shí)驗(yàn)本研究采用社交偏好實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估BDE-209與Pb暴露對(duì)F1代小鼠社交能力的影響。實(shí)驗(yàn)裝置由一個(gè)長(zhǎng)方形的大箱體和兩個(gè)位于箱體兩側(cè)的小隔間組成，大箱體為小鼠的活動(dòng)區(qū)域，兩個(gè)小隔間中，一個(gè)放置陌生小鼠，另一個(gè)放置相同大小的無(wú)生命物體（如塑料玩具）。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，先將F1代小鼠放入大箱體中適應(yīng)環(huán)境5分鐘，使其熟悉實(shí)驗(yàn)空間。隨后，將陌生小鼠和無(wú)生命物體分別放入兩側(cè)小隔間，開(kāi)啟視頻記錄系統(tǒng)，觀察并記錄10分鐘內(nèi)F1代小鼠與陌生小鼠和無(wú)生命物體的互動(dòng)時(shí)間，包括嗅聞、接近、觸碰等行為的持續(xù)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠與陌生小鼠的互動(dòng)時(shí)間顯著長(zhǎng)于與無(wú)生命物體的互動(dòng)時(shí)間（P<0.05），表明正常情況下F1代小鼠具有明顯的社交偏好，更傾向于與同類進(jìn)行社交互動(dòng)。在BDE-209暴露組中，小鼠與陌生小鼠的互動(dòng)時(shí)間明顯減少，與無(wú)生命物體的互動(dòng)時(shí)間相對(duì)增加，社交偏好指數(shù)（與陌生小鼠互動(dòng)時(shí)間/（與陌生小鼠互動(dòng)時(shí)間+與無(wú)生命物體互動(dòng)時(shí)間））顯著低于對(duì)照組（P<0.05），這表明BDE-209暴露導(dǎo)致F1代小鼠的社交能力受損，對(duì)社交刺激的興趣降低。Pb暴露組也呈現(xiàn)出類似的結(jié)果，小鼠的社交偏好指數(shù)顯著低于對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明Pb暴露同樣會(huì)影響F1代小鼠的社交行為，使其社交互動(dòng)減少。在BDE-209與Pb聯(lián)合暴露組中，小鼠的社交偏好指數(shù)下降最為明顯，與對(duì)照組相比具有極顯著差異（P<0.01），且低于BDE-209暴露組和Pb暴露組（P<0.05）。這表明BDE-209與Pb聯(lián)合暴露對(duì)F1代小鼠社交能力的損害具有協(xié)同作用，進(jìn)一步降低了小鼠的社交興趣和互動(dòng)能力，增加了自閉癥相關(guān)社交障礙的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。3.1.2重復(fù)刻板行為實(shí)驗(yàn)本研究通過(guò)觀察F1代小鼠的自我理毛行為和埋珠實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估其重復(fù)刻板行為。在自我理毛行為觀察中，將小鼠置于一個(gè)透明的觀察箱（40cm×40cm×40cm）內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境5分鐘后，開(kāi)啟視頻記錄系統(tǒng)，連續(xù)記錄30分鐘內(nèi)小鼠的行為。采用雙盲原則，由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)人員對(duì)視頻進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)小鼠在不同時(shí)間段內(nèi)的自我理毛次數(shù)和持續(xù)時(shí)間。在埋珠實(shí)驗(yàn)中，使用標(biāo)準(zhǔn)鼠籠，在籠內(nèi)鋪上5cm厚的玉米芯墊料并鋪平，將20個(gè)直徑為10mm的玻璃珠按5×4的規(guī)律分布在墊料上。將F1代小鼠放入籠中，30分鐘后取出小鼠，統(tǒng)計(jì)被埋玻璃珠的數(shù)量（被埋體積大于50%視為被埋）。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，更換新的墊料和玻璃珠，以消除氣味和其他因素的干擾。結(jié)果表明，對(duì)照組小鼠在30分鐘內(nèi)的自我理毛次數(shù)平均為（15.2±3.1）次，埋珠數(shù)量平均為（3.5±1.2）個(gè)。BDE-209暴露組小鼠的自我理毛次數(shù)顯著增加，平均達(dá)到（25.6±4.5）次（P<0.05），埋珠數(shù)量也明顯增多，平均為（7.8±2.0）個(gè)（P<0.05），表明BDE-209暴露導(dǎo)致F1代小鼠出現(xiàn)了更多的重復(fù)刻板行為。Pb暴露組小鼠同樣表現(xiàn)出重復(fù)刻板行為的增加，自我理毛次數(shù)平均為（23.8±4.2）次（P<0.05），埋珠數(shù)量平均為（7.2±1.8）個(gè)（P<0.05）。在BDE-209與Pb聯(lián)合暴露組中，小鼠的自我理毛次數(shù)高達(dá)（35.4±5.6）次（P<0.01），埋珠數(shù)量平均為（12.5±2.5）個(gè)（P<0.01），顯著高于BDE-209暴露組和Pb暴露組（P<0.05）。這說(shuō)明BDE-209與Pb聯(lián)合暴露對(duì)F1代小鼠重復(fù)刻板行為的誘導(dǎo)具有協(xié)同效應(yīng)，極大地增加了小鼠表現(xiàn)出重復(fù)刻板行為的頻率和強(qiáng)度，進(jìn)一步證實(shí)了二者聯(lián)合暴露會(huì)顯著增加自閉癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。3.1.3三箱實(shí)驗(yàn)三箱實(shí)驗(yàn)用于進(jìn)一步評(píng)估BDE-209與Pb暴露對(duì)F1代小鼠社會(huì)交互行為的影響。實(shí)驗(yàn)裝置由三個(gè)大小相同且相互連通的透明箱體組成，中間箱體為社交互動(dòng)區(qū)，兩側(cè)箱體分別放置陌生小鼠1（與實(shí)驗(yàn)小鼠性別相同、年齡相近且未接觸過(guò)）和陌生小鼠2（同樣與實(shí)驗(yàn)小鼠性別相同、年齡相近且未接觸過(guò)，但為不同個(gè)體）。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，先將F1代小鼠放入中間箱體適應(yīng)環(huán)境5分鐘，使其熟悉整個(gè)裝置。然后，同時(shí)將陌生小鼠1和陌生小鼠2分別放入兩側(cè)箱體，開(kāi)啟視頻記錄系統(tǒng)，觀察并記錄10分鐘內(nèi)F1代小鼠在不同箱體間的穿梭次數(shù)以及與兩只陌生小鼠的互動(dòng)時(shí)間，包括嗅聞、追逐、身體接觸等行為的持續(xù)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠在與陌生小鼠1和陌生小鼠2互動(dòng)的時(shí)間段內(nèi)，在兩側(cè)箱體的停留時(shí)間無(wú)顯著差異（P>0.05），且與兩只陌生小鼠的互動(dòng)時(shí)間較為接近，表明對(duì)照組小鼠對(duì)不同陌生小鼠具有相似的社交興趣和互動(dòng)行為。在BDE-209暴露組中，小鼠在兩側(cè)箱體的停留時(shí)間出現(xiàn)差異，與陌生小鼠1的互動(dòng)時(shí)間明顯少于對(duì)照組（P<0.05），對(duì)陌生小鼠2的互動(dòng)時(shí)間也有所減少，且對(duì)兩只陌生小鼠的社交偏好出現(xiàn)異常，表明BDE-209暴露影響了F1代小鼠的社會(huì)交互行為，使其對(duì)社交對(duì)象的識(shí)別和互動(dòng)能力下降。Pb暴露組小鼠同樣表現(xiàn)出與陌生小鼠互動(dòng)時(shí)間減少的情況，對(duì)兩只陌生小鼠的社交偏好也發(fā)生改變，與對(duì)照組相比具有顯著差異（P<0.05）。在BDE-209與Pb聯(lián)合暴露組中，小鼠在兩側(cè)箱體的停留時(shí)間差異更為顯著，與兩只陌生小鼠的互動(dòng)時(shí)間均顯著減少（P<0.01），幾乎不主動(dòng)與陌生小鼠進(jìn)行社交互動(dòng)，社會(huì)交互行為嚴(yán)重受損。這表明BDE-209與Pb聯(lián)合暴露對(duì)F1代小鼠社會(huì)交互行為的破壞作用更為明顯，二者的聯(lián)合效應(yīng)加劇了小鼠的社交障礙，進(jìn)一步增加了自閉癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。3.2自閉癥相關(guān)基因與蛋白表達(dá)分析3.2.1基因表達(dá)檢測(cè)為深入探究BDE-209與Pb暴露影響F1代小鼠自閉癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的潛在分子機(jī)制，本研究采用RT-PCR技術(shù)對(duì)自閉癥相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。選取與自閉癥發(fā)病密切相關(guān)的基因，如MECP2、FOXP2、SHANK3等，這些基因在神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)信號(hào)傳遞以及突觸功能等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MECP2基因編碼的蛋白質(zhì)參與DNA甲基化修飾的調(diào)控，對(duì)神經(jīng)元的成熟和功能維持至關(guān)重要；FOXP2基因與語(yǔ)言和認(rèn)知功能的發(fā)展密切相關(guān)；SHANK3基因則主要參與突觸的形成和穩(wěn)定，對(duì)神經(jīng)環(huán)路的構(gòu)建起著關(guān)鍵作用。提取F1代小鼠大腦組織的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括cDNA模板、特異性引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液。引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中公布的基因序列，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。PCR反應(yīng)條件經(jīng)過(guò)優(yōu)化，包括預(yù)變性、變性、退火和延伸等步驟，以保證目的基因的有效擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，通過(guò)凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離和檢測(cè)，觀察目的基因條帶的亮度和位置，初步判斷基因的表達(dá)情況。隨后，采用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行拍照和分析，利用圖像分析軟件測(cè)定條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參基因，通過(guò)2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，BDE-209暴露組小鼠大腦中MECP2基因的表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05），這可能導(dǎo)致DNA甲基化修飾異常，影響神經(jīng)元的正常發(fā)育和功能。FOXP2基因的表達(dá)也明顯降低（P<0.05），表明BDE-209暴露可能干擾了小鼠的語(yǔ)言和認(rèn)知相關(guān)神經(jīng)通路的發(fā)育。SHANK3基因表達(dá)同樣受到抑制，其相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P<0.05），這可能破壞了突觸的正常結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響神經(jīng)信號(hào)的傳遞和神經(jīng)環(huán)路的形成。在Pb暴露組中，MECP2、FOXP2和SHANK3基因的表達(dá)也均出現(xiàn)不同程度的下調(diào)，與對(duì)照組相比具有顯著差異（P<0.05）。在BDE-209與Pb聯(lián)合暴露組中，這三個(gè)基因的表達(dá)下調(diào)更為明顯，與對(duì)照組相比具有極顯著差異（P<0.01），且低于BDE-209暴露組和Pb暴露組（P<0.05）。這表明BDE-209與Pb聯(lián)合暴露對(duì)自閉癥相關(guān)基因表達(dá)的抑制具有協(xié)同作用，進(jìn)一步擾亂了神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，增加了自閉癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。3.2.2蛋白表達(dá)檢測(cè)為進(jìn)一步從蛋白層面解析BDE-209與Pb暴露導(dǎo)致F1代小鼠自閉癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加的原因，本研究運(yùn)用Westernblot技術(shù)檢測(cè)了MECP2、FOXP2、SHANK3等自閉癥相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。首先提取F1代小鼠大腦組織的總蛋白，采用RIPA裂解液在冰浴條件下充分裂解組織，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)釋放出來(lái)。裂解后的樣品在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清液得到總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液按適當(dāng)比例混合，煮沸變性5分鐘，使蛋白質(zhì)充分變性，便于后續(xù)的電泳分離。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白樣品加入凝膠的加樣孔中，在電場(chǎng)的作用下，蛋白質(zhì)根據(jù)其分子量大小在凝膠中遷移，實(shí)現(xiàn)不同蛋白的分離。電泳結(jié)束后，通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，使蛋白固定在膜上，便于后續(xù)的免疫檢測(cè)。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2小時(shí)，以減少非特異性抗體結(jié)合。封閉后，加入針對(duì)MECP2、FOXP2、SHANK3等蛋白的特異性一抗，4℃孵育過(guò)夜，使一抗與目的蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗，室溫孵育1-2小時(shí)，二抗與一抗特異性結(jié)合，形成抗原-一抗-二抗復(fù)合物。再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的二抗。最后加入化學(xué)發(fā)光底物，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（如β-actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，BDE-209暴露組小鼠大腦中MECP2蛋白的表達(dá)顯著降低（P<0.05），這與基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了BDE-209對(duì)MECP2基因表達(dá)和蛋白合成的抑制作用。FOXP2蛋白的表達(dá)也明顯減少（P<0.05），說(shuō)明BDE-209暴露在蛋白水平上同樣影響了與語(yǔ)言和認(rèn)知功能相關(guān)的蛋白表達(dá)。SHANK3蛋白表達(dá)同樣受到顯著抑制，其相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P<0.05），表明BDE-209暴露對(duì)突觸相關(guān)蛋白的合成產(chǎn)生了負(fù)面影響，可能破壞了突觸的正常功能。在Pb暴露組中，MECP2、FOXP2和SHANK3蛋白的表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的下降，與對(duì)照組相比具有顯著差異（P<0.05）。在BDE-209與Pb聯(lián)合暴露組中，這三種蛋白的表達(dá)下降最為明顯，與對(duì)照組相比具有極顯著差異（P<0.01），且低于BDE-209暴露組和Pb暴露組（P<0.05）。這表明BDE-209與Pb聯(lián)合暴露在蛋白水平上對(duì)自閉癥相關(guān)蛋白表達(dá)的抑制具有協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)一步干擾了神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)信號(hào)傳遞相關(guān)的蛋白質(zhì)功能，從而增加了自閉癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)合基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，從基因和蛋白兩個(gè)層面揭示了BDE-209與Pb暴露對(duì)F1代小鼠自閉癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響機(jī)制，為深入理解自閉癥的發(fā)病機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.3討論本研究通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)檢測(cè)，深入探討了BDE-209與Pb暴露對(duì)F1代小鼠自閉癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響，結(jié)果表明二者聯(lián)合暴露顯著增加了小鼠自閉癥相關(guān)行為的出現(xiàn)頻率和強(qiáng)度，且在基因和蛋白表達(dá)層面呈現(xiàn)出協(xié)同抑制作用。在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，社交偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BDE-209與Pb聯(lián)合暴露組小鼠的社交偏好指數(shù)顯著低于對(duì)照組、BDE-209暴露組和Pb暴露組，表明聯(lián)合暴露對(duì)小鼠社交能力的損害更為嚴(yán)重，這與前人研究中環(huán)境污染物聯(lián)合暴露可導(dǎo)致動(dòng)物社交行為障礙加重的結(jié)果一致。自我理毛行為和埋珠實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，聯(lián)合暴露組小鼠的重復(fù)刻板行為明顯增多，進(jìn)一步證實(shí)了二者聯(lián)合暴露會(huì)加劇小鼠的自閉癥相關(guān)行為。三箱實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合暴露組小鼠與陌生小鼠的互動(dòng)時(shí)間顯著減少，社會(huì)交互行為嚴(yán)重受損，這與自閉癥患者社交障礙的臨床表現(xiàn)相似，說(shuō)明BDE-209與Pb聯(lián)合暴露可能通過(guò)破壞小鼠的社會(huì)交互行為，增加自閉癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。從分子機(jī)制層面來(lái)看，基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，BDE-209與Pb聯(lián)合暴露組小鼠大腦中MECP2、FOXP2、SHANK3等自閉癥相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)程度明顯大于單獨(dú)暴露組。MECP2基因表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致DNA甲基化修飾異常，影響神經(jīng)元的正常發(fā)育和功能；FOXP2基因表達(dá)降低可能干擾小鼠的語(yǔ)言和認(rèn)知相關(guān)神經(jīng)通路的發(fā)育；SHANK3基因表達(dá)受抑制可能破壞突觸的正常結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響神經(jīng)信號(hào)的傳遞和神經(jīng)環(huán)路的形成。蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果與基因表達(dá)結(jié)果一致，聯(lián)合暴露組小鼠大腦中MECP2、FOXP2、SHANK3等蛋白的表達(dá)顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)了聯(lián)合暴露在蛋白水平上對(duì)自閉癥相關(guān)蛋白表達(dá)的抑制具有協(xié)同效應(yīng)。綜上所述，BDE-209與Pb聯(lián)合暴露對(duì)F1代小鼠自閉癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的增加具有協(xié)同作用，這種協(xié)同作用在行為學(xué)和分子生物學(xué)層面均有體現(xiàn)。二者可能通過(guò)共同干擾神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)和蛋白合成，破壞神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)和神經(jīng)環(huán)路的正常功能，從而導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)社交障礙、重復(fù)刻板行為等自閉癥相關(guān)癥狀。本研究結(jié)果為揭示自閉癥的環(huán)境致病因素提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為自閉癥的預(yù)防和干預(yù)提供了新的研究方向。四、BDE-209與Pb暴露對(duì)F1代小鼠神經(jīng)毒性的影響4.1神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)變化4.1.1腦組織病理切片觀察為深入探究BDE-209與Pb暴露對(duì)F1代小鼠神經(jīng)毒性的影響，本研究對(duì)小鼠腦組織進(jìn)行了病理切片觀察。首先，將F1代小鼠用過(guò)量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后處死，迅速取出大腦組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定24小時(shí)以上。固定后的大腦組織經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟、包埋等一系列處理，制成石蠟切片，切片厚度為5μm。采用蘇木精-伊紅（HE）染色，使細(xì)胞核染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)染成紅色，便于在光學(xué)顯微鏡下清晰觀察大腦組織結(jié)構(gòu)。在對(duì)照組小鼠的腦組織切片中，大腦皮層、海馬、小腦等區(qū)域的細(xì)胞排列緊密且規(guī)則，神經(jīng)元形態(tài)完整，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞質(zhì)均勻，未見(jiàn)明顯的細(xì)胞損傷、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或組織結(jié)構(gòu)破壞等異?，F(xiàn)象。這表明正常情況下，F(xiàn)1代小鼠的腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)保持良好，神經(jīng)細(xì)胞功能正常。在BDE-209暴露組中，可見(jiàn)大腦皮層部分區(qū)域的神經(jīng)元數(shù)量減少，細(xì)胞排列紊亂，部分神經(jīng)元出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞核固縮、深染，細(xì)胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，提示神經(jīng)元發(fā)生了損傷和凋亡。海馬區(qū)的CA1、CA3和齒狀回等亞區(qū)也出現(xiàn)了類似的變化，神經(jīng)元形態(tài)異常，突觸結(jié)構(gòu)模糊，可能影響神經(jīng)信號(hào)的傳遞和學(xué)習(xí)記憶功能。此外，還觀察到少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，表明BDE-209暴露引發(fā)了一定程度的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重了神經(jīng)組織的損傷。Pb暴露組小鼠的腦組織同樣出現(xiàn)了明顯的病理變化。大腦皮層神經(jīng)元的形態(tài)和排列受到破壞，部分神經(jīng)元腫脹，細(xì)胞核變形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡，可能是由于細(xì)胞器受損所致。海馬區(qū)的神經(jīng)元也表現(xiàn)出明顯的損傷，樹(shù)突和軸突的形態(tài)異常，突觸數(shù)量減少，這可能導(dǎo)致神經(jīng)環(huán)路的功能障礙，影響小鼠的認(rèn)知和行為能力。同時(shí)，在一些區(qū)域還觀察到血管周圍間隙增寬，可能與血腦屏障的損傷有關(guān)，使得有害物質(zhì)更容易進(jìn)入腦組織，加重神經(jīng)毒性。在BDE-209與Pb聯(lián)合暴露組中，腦組織的病理變化更為嚴(yán)重。大腦皮層和海馬區(qū)的神經(jīng)元大量減少，細(xì)胞排列極度紊亂，呈現(xiàn)出明顯的壞死灶。神經(jīng)元的損傷程度進(jìn)一步加劇，細(xì)胞核碎裂，細(xì)胞質(zhì)溶解，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更為廣泛，炎癥反應(yīng)明顯增強(qiáng)。此外，還觀察到腦組織出現(xiàn)了明顯的萎縮，腦室擴(kuò)張，表明神經(jīng)組織的損傷已經(jīng)影響到了整個(gè)大腦的結(jié)構(gòu)和功能，聯(lián)合暴露對(duì)神經(jīng)毒性的影響具有協(xié)同作用，導(dǎo)致神經(jīng)組織的損害更加嚴(yán)重。通過(guò)對(duì)不同組小鼠腦組織病理切片的觀察分析，可知BDE-209與Pb暴露均會(huì)對(duì)F1代小鼠的神經(jīng)組織形態(tài)產(chǎn)生明顯的破壞作用，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷、炎癥反應(yīng)和組織結(jié)構(gòu)改變等病理變化，且二者聯(lián)合暴露的神經(jīng)毒性效應(yīng)更為顯著。這些病理變化與小鼠的神經(jīng)功能障礙密切相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了BDE-209與Pb暴露對(duì)F1代小鼠具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性。4.1.2神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)觀察為進(jìn)一步揭示BDE-209與Pb暴露對(duì)F1代小鼠神經(jīng)毒性的亞細(xì)胞層面機(jī)制，本研究利用透射電子顯微鏡對(duì)小鼠神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察。首先將F1代小鼠麻醉后斷頭取腦，迅速分離出大腦皮層和海馬等關(guān)鍵腦區(qū)組織，切成1mm3左右的小塊。將組織塊立即放入2.5%戊二醛固定液中，4℃固定2小時(shí)以上，以充分固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)。隨后，用0.1M磷酸緩沖液（PBS）沖洗組織塊3次，每次15分鐘，去除多余的固定液。再用1%鋨酸固定液后固定1-2小時(shí)，進(jìn)一步增強(qiáng)組織的反差，便于在電鏡下觀察。固定后的組織塊經(jīng)過(guò)梯度酒精脫水（50%、70%、80%、90%、95%、100%酒精各15-30分鐘）、丙酮置換（100%丙酮2次，每次15分鐘），最后用環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑進(jìn)行包埋。將包埋好的組織塊制成超薄切片，厚度約為70-90nm。用醋酸鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色，增強(qiáng)切片的對(duì)比度，然后在透射電子顯微鏡下觀察神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)。在對(duì)照組小鼠的神經(jīng)元中，線粒體形態(tài)規(guī)則，呈橢圓形或棒狀，線粒體膜完整，嵴清晰且排列緊密，內(nèi)部基質(zhì)均勻，表明線粒體的功能正常，能夠?yàn)樯窠?jīng)元的活動(dòng)提供充足的能量。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)完整，呈管狀或扁平囊狀，分布均勻，參與蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的合成與運(yùn)輸。細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，核膜清晰，染色質(zhì)均勻分布，核仁明顯，說(shuō)明細(xì)胞核的功能正常，能夠正常調(diào)控基因的表達(dá)。突觸結(jié)構(gòu)完整，突觸前膜和突觸后膜清晰可辨，突觸間隙寬度均勻，突觸小泡數(shù)量豐富且分布均勻，有利于神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和神經(jīng)信號(hào)的傳遞。在BDE-209暴露組中，線粒體出現(xiàn)明顯的腫脹，形態(tài)變得不規(guī)則，部分線粒體膜破損，嵴斷裂、減少甚至消失，內(nèi)部基質(zhì)變得稀疏，這表明線粒體的功能受到嚴(yán)重?fù)p害，能量代謝障礙，可能導(dǎo)致神經(jīng)元因能量供應(yīng)不足而出現(xiàn)功能異常。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、變形，出現(xiàn)空泡化，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能受到干擾，影響蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的合成與運(yùn)輸，進(jìn)而影響神經(jīng)元的正常生理功能。細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚，邊緣化，核膜不連續(xù)，出現(xiàn)破損，可能導(dǎo)致基因表達(dá)異常，影響神經(jīng)元的分化、發(fā)育和功能維持。突觸結(jié)構(gòu)也受到破壞，突觸前膜和突觸后膜模糊不清，突觸間隙增寬或狹窄不均勻，突觸小泡數(shù)量減少且分布不均，部分突觸小泡聚集在一起，這將嚴(yán)重影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和神經(jīng)信號(hào)的傳遞，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙。Pb暴露組的神經(jīng)元同樣出現(xiàn)了超微結(jié)構(gòu)的改變。線粒體腫脹明顯，基質(zhì)電子密度降低，嵴紊亂、減少，甚至出現(xiàn)空泡化，表明線粒體的呼吸功能受損，能量產(chǎn)生減少，影響神經(jīng)元的正常活動(dòng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、脫顆粒，表明蛋白質(zhì)合成受阻，可能導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡，影響神經(jīng)元的正常功能。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)固縮，呈塊狀聚集，核仁縮小或消失，這將影響基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育和功能產(chǎn)生負(fù)面影響。突觸后膜的致密物質(zhì)減少，突觸小泡形態(tài)異常，可能導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和接收出現(xiàn)異常，進(jìn)而影響神經(jīng)信號(hào)的傳遞和整合。在BDE-209與Pb聯(lián)合暴露組中，神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)損傷更為嚴(yán)重。線粒體嚴(yán)重腫脹，幾乎呈球形，膜結(jié)構(gòu)大部分破損，嵴完全消失，基質(zhì)幾乎透明，表明線粒體的功能幾乎完全喪失，神經(jīng)元將面臨嚴(yán)重的能量危機(jī)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)廣泛擴(kuò)張、斷裂，形成大量的空泡，幾乎占據(jù)了整個(gè)細(xì)胞質(zhì)空間，嚴(yán)重破壞了細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)合成和運(yùn)輸系統(tǒng)。細(xì)胞核嚴(yán)重變形，核膜破裂，染色質(zhì)大量凝聚、碎片化，核仁消失，這將導(dǎo)致基因表達(dá)完全紊亂，神經(jīng)元的基本功能無(wú)法維持。突觸結(jié)構(gòu)幾乎完全破壞，突觸前膜和突觸后膜難以辨認(rèn)，突觸間隙消失，突觸小泡幾乎消失殆盡，神經(jīng)信號(hào)傳遞功能完全喪失。通過(guò)對(duì)不同組小鼠神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的觀察分析，可知BDE-209與Pb暴露均會(huì)對(duì)F1代小鼠神經(jīng)元的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核和突觸等超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著的破壞作用，導(dǎo)致細(xì)胞的能量代謝、物質(zhì)合成與運(yùn)輸、基因表達(dá)以及神經(jīng)信號(hào)傳遞等功能受損，且二者聯(lián)合暴露的損傷效應(yīng)具有協(xié)同性，對(duì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的破壞更為嚴(yán)重。這些亞細(xì)胞層面的變化進(jìn)一步揭示了BDE-209與Pb暴露對(duì)F1代小鼠神經(jīng)毒性的作用機(jī)制，為深入理解神經(jīng)毒性的發(fā)生發(fā)展提供了重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)。4.2神經(jīng)遞質(zhì)與神經(jīng)酶活性改變4.2.1神經(jīng)遞質(zhì)水平檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)中起著關(guān)鍵的信號(hào)傳遞作用，其水平的改變可能導(dǎo)致神經(jīng)功能紊亂，進(jìn)而影響行為和認(rèn)知能力。本研究采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）技術(shù)，對(duì)F1代小鼠大腦中多種神經(jīng)遞質(zhì)的含量進(jìn)行了精確檢測(cè)，包括乙酰膽堿（ACh）、多巴胺（DA）、γ-氨基丁酸（GABA）和5-羥色胺（5-HT）等。這些神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)發(fā)育、情緒調(diào)節(jié)、學(xué)習(xí)記憶等方面發(fā)揮著重要作用。ACh是一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與肌肉運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知和記憶等過(guò)程；DA與運(yùn)動(dòng)控制、獎(jiǎng)賞系統(tǒng)和情緒調(diào)節(jié)密切相關(guān)；GABA是主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)維持神經(jīng)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定至關(guān)重要；5-HT則參與情緒、睡眠、食欲等多種生理和心理功能的調(diào)節(jié)。在對(duì)照組小鼠大腦中，各神經(jīng)遞質(zhì)含量處于正常范圍，維持著神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。乙酰膽堿的含量穩(wěn)定，保證了神經(jīng)肌肉接頭處的信號(hào)傳遞正常，使小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)自如；多巴胺水平適宜，有助于小鼠保持正常的運(yùn)動(dòng)活性和對(duì)環(huán)境的探索欲望；γ-氨基丁酸發(fā)揮著抑制性調(diào)節(jié)作用，使神經(jīng)元的活動(dòng)處于平衡狀態(tài)，避免過(guò)度興奮；5-羥色胺維持在正常水平，對(duì)小鼠的情緒穩(wěn)定和睡眠質(zhì)量起到了重要保障作用。BDE-209暴露組小鼠大腦中，乙酰膽堿含量顯著下降（P<0.05），這可能導(dǎo)致神經(jīng)肌肉接頭處的信號(hào)傳遞受阻，影響小鼠的運(yùn)動(dòng)功能，使其出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)遲緩、協(xié)調(diào)性下降等癥狀。多巴胺含量也明顯降低（P<0.05），多巴胺水平的降低可能導(dǎo)致小鼠的獎(jiǎng)賞系統(tǒng)功能受損，使其對(duì)環(huán)境中的刺激缺乏興趣，運(yùn)動(dòng)活性降低，同時(shí)也可能影響情緒調(diào)節(jié)，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)抑郁或焦慮樣行為。γ-氨基丁酸含量有所升高（P<0.05），雖然其升高可能是機(jī)體的一種代償性反應(yīng)，試圖抑制神經(jīng)元的過(guò)度興奮，但過(guò)高的γ-氨基丁酸水平可能會(huì)打破神經(jīng)系統(tǒng)的興奮-抑制平衡，進(jìn)一步影響神經(jīng)信號(hào)的正常傳遞。5-羥色胺含量顯著降低（P<0.05），這可能導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)情緒異常，如焦慮、抑郁等，同時(shí)也會(huì)影響睡眠和食欲等生理功能。Pb暴露組小鼠大腦神經(jīng)遞質(zhì)也出現(xiàn)明顯變化。乙酰膽堿含量同樣顯著降低（P<0.05），這與BDE-209暴露組的結(jié)果相似，表明Pb暴露也會(huì)對(duì)神經(jīng)肌肉接頭處的信號(hào)傳遞產(chǎn)生負(fù)面影響，影響小鼠的運(yùn)動(dòng)能力。多巴胺水平下降（P<0.05），這可能導(dǎo)致小鼠的運(yùn)動(dòng)控制和情緒調(diào)節(jié)功能受損，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙和情緒不穩(wěn)定等癥狀。γ-氨基丁酸含量升高（P<0.05），進(jìn)一步證實(shí)了Pb暴露會(huì)干擾神經(jīng)系統(tǒng)的興奮-抑制平衡，影響神經(jīng)信號(hào)的正常傳導(dǎo)。5-羥色胺含量顯著減少（P<0.05），這可能導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)睡眠障礙、食欲改變以及情緒問(wèn)題，如焦慮和抑郁等。在BDE-209與Pb聯(lián)合暴露組中，小鼠大腦中乙酰膽堿、多巴胺和5-羥色胺含量的下降幅度更為顯著（P<0.01），與BDE-209暴露組和Pb暴露組相比具有明顯差異（P<0.05）。這表明二者聯(lián)合暴露對(duì)這些神經(jīng)遞質(zhì)的抑制作用具有協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)一步加劇了神經(jīng)信號(hào)傳遞的紊亂，導(dǎo)致小鼠的運(yùn)動(dòng)、情緒和認(rèn)知等功能受到更嚴(yán)重的影響。γ-氨基丁酸含量升高更為明顯（P<0.01），說(shuō)明聯(lián)合暴露對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)興奮-抑制平衡的破壞更為嚴(yán)重，神經(jīng)元的活動(dòng)受到更大程度的干擾，可能導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)更嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙。通過(guò)對(duì)F1代小鼠大腦神經(jīng)遞質(zhì)水平的檢測(cè)分析，可知BDE-209與Pb暴露均會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)含量發(fā)生顯著變化，干擾神經(jīng)信號(hào)傳遞，影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，且二者聯(lián)合暴露的神經(jīng)毒性效應(yīng)更為顯著，進(jìn)一步證實(shí)了BDE-209與Pb暴露對(duì)F1代小鼠具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性。這些神經(jīng)遞質(zhì)水平的改變與小鼠的行為異常密切相關(guān)，為深入理解BDE-209與Pb暴露導(dǎo)致的神經(jīng)毒性機(jī)制提供了重要的神經(jīng)化學(xué)依據(jù)。4.2.2神經(jīng)酶活性測(cè)定神經(jīng)酶在神經(jīng)遞質(zhì)的合成、代謝和信號(hào)傳遞過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其活性的改變可能導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，與神經(jīng)毒性及自閉癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。本研究對(duì)F1代小鼠大腦中乙酰膽堿酯酶（AChE）、多巴胺β-羥化酶（DBH）和單胺氧化酶（MAO）等神經(jīng)酶的活性進(jìn)行了測(cè)定，以深入探討B(tài)DE-209與Pb暴露對(duì)神經(jīng)毒性及自閉癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響機(jī)制。乙酰膽堿酯酶（AChE）負(fù)責(zé)催化乙酰膽堿的水解，使其失活，從而終止神經(jīng)信號(hào)傳遞，對(duì)維持神經(jīng)遞質(zhì)的平衡至關(guān)重要。多巴胺β-羥化酶（DBH）參與多巴胺向去甲腎上腺素的轉(zhuǎn)化，影響兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)的代謝和功能。單胺氧化酶（MAO）則主要負(fù)責(zé)降解單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，如多巴胺、5-羥色胺等，調(diào)節(jié)其在體內(nèi)的水平。在對(duì)照組小鼠大腦中，乙酰膽堿酯酶、多巴胺β-羥化酶和單胺氧化酶的活性均處于正常范圍，保證了神經(jīng)遞質(zhì)的正常代謝和信號(hào)傳遞。乙酰膽堿酯酶能夠及時(shí)水解乙酰膽堿，使神經(jīng)信號(hào)傳遞在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候終止，維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能；多巴胺β-羥化酶的活性正常，確保了多巴胺向去甲腎上腺素的轉(zhuǎn)化過(guò)程順利進(jìn)行，維持兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)的平衡；單胺氧化酶能夠有效降解單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，使其水平保持穩(wěn)定，避免神經(jīng)遞質(zhì)的過(guò)度積累或缺乏。BDE-209暴露組小鼠大腦中，乙酰膽堿酯酶活性顯著升高（P<0.05），這會(huì)加速乙酰膽堿的水解，導(dǎo)致乙酰膽堿含量進(jìn)一步降低，從而影響神經(jīng)肌肉接頭處的信號(hào)傳遞，使小鼠出現(xiàn)運(yùn)