PARP1在β-拉帕醌殺傷胃癌細(xì)胞中的作用及機(jī)制探究：從分子通路到臨床啟示一、引言1.1研究背景胃癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一，在消化系統(tǒng)腫瘤中，其發(fā)病率和死亡率均位居前列。據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，每年新增胃癌病例數(shù)以百萬計，且由于早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，這極大地限制了治療手段的選擇和治療效果。中晚期胃癌患者往往面臨著腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及對多種治療方式的耐藥問題，導(dǎo)致患者的5年生存率較低，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存預(yù)期。同時，胃癌的治療不僅給患者個人帶來沉重的身心負(fù)擔(dān)，也給家庭和社會造成了巨大的經(jīng)濟(jì)壓力，消耗了大量的醫(yī)療資源。β-拉帕醌（β-lapachone）作為一種具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的天然醌類化合物，近年來在腫瘤治療研究領(lǐng)域備受關(guān)注。它能夠通過多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用，例如誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移等。β-拉帕醌可以在醌氧化還原酶1（NQO1）的催化下發(fā)生氧化還原循環(huán)，產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），從而引發(fā)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞腫瘤細(xì)胞的正常生理功能。由于NQO1在多數(shù)癌細(xì)胞中過表達(dá)，而在正常細(xì)胞中表達(dá)水平較低，使得β-拉帕醌對癌細(xì)胞具有一定的選擇性殺傷作用，這為其作為抗癌藥物的開發(fā)提供了有力的理論基礎(chǔ)。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP1）是一種在DNA損傷修復(fù)過程中起著核心作用的酶。當(dāng)DNA受到損傷時，PARP1能夠迅速識別損傷位點(diǎn)并與之結(jié)合，通過催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）分解，將ADP-核糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移到自身及其他靶蛋白上，形成多聚ADP-核糖（PAR）鏈，從而招募一系列DNA修復(fù)蛋白到損傷部位，啟動DNA修復(fù)過程。在腫瘤細(xì)胞中，由于其基因組的不穩(wěn)定性和高增殖特性，PARP1的表達(dá)和活性常常異常升高，這使得腫瘤細(xì)胞對PARP1介導(dǎo)的DNA修復(fù)途徑產(chǎn)生高度依賴?；诖?，PARP1成為了腫瘤治療的一個極具潛力的靶點(diǎn)，PARP1抑制劑通過抑制PARP1的活性，阻斷DNA損傷修復(fù)，使腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷不斷積累，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。目前，雖然針對胃癌的治療手段包括手術(shù)、化療、放療以及靶向治療等，但總體治療效果仍不盡人意，尤其是對于晚期和耐藥的胃癌患者，迫切需要開發(fā)新的治療策略和藥物。研究β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞的殺傷作用以及PARP1在其中的作用機(jī)制，有望為胃癌的治療提供新的思路和潛在的治療靶點(diǎn)，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探究PARP1在β-拉帕醌殺傷胃癌細(xì)胞過程中的具體作用及潛在分子機(jī)制。通過細(xì)胞實驗和動物實驗，明確β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)行為的影響，以及PARP1的表達(dá)變化和活性改變在其中所起的作用。同時，解析β-拉帕醌與PARP1相互作用涉及的相關(guān)信號通路，為進(jìn)一步揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。從理論意義來看，本研究有助于深化對β-拉帕醌抗腫瘤作用機(jī)制的理解，填補(bǔ)PARP1在β-拉帕醌殺傷胃癌細(xì)胞作用機(jī)制方面的研究空白，豐富了腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)與細(xì)胞死亡調(diào)控的理論體系，為后續(xù)開展針對胃癌及其他腫瘤的相關(guān)研究奠定堅實的理論基礎(chǔ)，為拓展新型抗腫瘤策略提供重要的理論指導(dǎo)。在實踐意義方面，本研究結(jié)果可能為胃癌的臨床治療開辟新的途徑。如果能夠明確PARP1作為β-拉帕醌作用靶點(diǎn)的關(guān)鍵作用，那么可以基于此開發(fā)以PARP1為靶向的胃癌聯(lián)合治療方案，即通過聯(lián)合使用β-拉帕醌與PARP1抑制劑，或利用基因編輯技術(shù)調(diào)控PARP1的表達(dá)，增強(qiáng)β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞的殺傷效果，提高胃癌治療的有效性，為臨床醫(yī)生提供更多的治療選擇，有望改善胃癌患者的預(yù)后，延長患者的生存期，提高患者的生活質(zhì)量。此外，研究成果還可能為開發(fā)新型、高效、低毒的抗腫瘤藥物提供思路，推動抗癌藥物研發(fā)領(lǐng)域的發(fā)展，具有重要的臨床應(yīng)用價值和社會經(jīng)濟(jì)效益。1.3研究創(chuàng)新點(diǎn)本研究在方法、視角等方面具有獨(dú)特之處，有望取得創(chuàng)新性成果。在研究方法上，將綜合運(yùn)用多種前沿技術(shù)，如CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)精確敲除胃癌細(xì)胞中的PARP1基因，構(gòu)建穩(wěn)定的PARP1基因敲除細(xì)胞模型，從基因?qū)用嫔钊胩骄縋ARP1缺失對β-拉帕醌殺傷胃癌細(xì)胞作用的影響，相較于傳統(tǒng)的RNA干擾技術(shù)，該方法能更徹底、穩(wěn)定地抑制基因表達(dá)，避免因基因敲低不完全而產(chǎn)生的干擾，為研究提供更精準(zhǔn)的實驗?zāi)Ｐ?。同時，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)，全面分析β-拉帕醌處理胃癌細(xì)胞前后蛋白質(zhì)和代謝物的變化情況，從整體水平揭示PARP1參與的相關(guān)信號通路和代謝網(wǎng)絡(luò)的改變，這種多組學(xué)聯(lián)合分析的方法能夠更系統(tǒng)、全面地解析β-拉帕醌殺傷胃癌細(xì)胞的分子機(jī)制，挖掘潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，為胃癌的治療提供更豐富的理論依據(jù)。從研究視角來看，目前關(guān)于β-拉帕醌和PARP1的研究多集中在單一作用機(jī)制或?qū)ζ渌[瘤類型的研究上，本研究首次聚焦于PARP1在β-拉帕醌殺傷胃癌細(xì)胞中的作用及機(jī)制，填補(bǔ)了該領(lǐng)域在胃癌研究方面的空白，為胃癌的治療提供了全新的研究方向。此外，深入探討β-拉帕醌誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與PARP1介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)之間的相互關(guān)系，從細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡的角度解析胃癌細(xì)胞死亡的機(jī)制，這種跨機(jī)制的研究視角有助于突破傳統(tǒng)認(rèn)知，為開發(fā)基于β-拉帕醌和PARP1的聯(lián)合治療策略提供新的理論支持，有望為胃癌患者帶來更有效的治療方案，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。二、β-拉帕醌與PARP1的相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1β-拉帕醌概述2.1.1β-拉帕醌的結(jié)構(gòu)與特性β-拉帕醌（β-lapachone），化學(xué)名稱為3,4-二氫-2,2-二甲基-2H-萘并[1,2-B]吡喃-5,6-二酮，其分子式為C_{15}H_{14}O_{3}，分子量為242.27。從結(jié)構(gòu)上看，β-拉帕醌具有獨(dú)特的萘醌結(jié)構(gòu)，由一個萘環(huán)和一個吡喃環(huán)稠合而成，這種稠合結(jié)構(gòu)賦予了它特殊的物理和化學(xué)性質(zhì)。在物理性質(zhì)方面，β-拉帕醌通常為黃色至橙色的粉末狀固體，熔點(diǎn)較高，大于110°C（分解）。它在常溫下相對穩(wěn)定，但對光和熱較為敏感，光照和高溫可能會加速其分解，因此在儲存和使用過程中需要注意避光和低溫保存。在化學(xué)性質(zhì)上，β-拉帕醌的醌結(jié)構(gòu)使其具有較強(qiáng)的氧化還原活性。醌類化合物能夠在氧化態(tài)和還原態(tài)之間進(jìn)行可逆的轉(zhuǎn)化，β-拉帕醌也不例外。在細(xì)胞內(nèi)的生理環(huán)境中，β-拉帕醌可以在醌氧化還原酶1（NQO1）的催化作用下，接受電子被還原為半醌自由基，隨后半醌自由基又可以將電子傳遞給氧氣，生成超氧陰離子等活性氧（ROS），同時自身重新被氧化為β-拉帕醌，從而形成氧化還原循環(huán)。這種氧化還原循環(huán)過程能夠持續(xù)產(chǎn)生大量的ROS，打破細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，對細(xì)胞的正常生理功能產(chǎn)生影響。此外，β-拉帕醌還可以與細(xì)胞內(nèi)的一些親核基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，如與蛋白質(zhì)中的巰基、氨基等基團(tuán)結(jié)合，從而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)一步干擾細(xì)胞的代謝和信號傳導(dǎo)過程。2.1.2β-拉帕醌的抗癌作用機(jī)制β-拉帕醌具有多種抗癌作用機(jī)制，主要通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞增殖和遷移等方式發(fā)揮抗癌活性。在誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡方面，β-拉帕醌可以通過多種途徑觸發(fā)細(xì)胞凋亡信號通路。一方面，如前文所述，β-拉帕醌在NQO1的催化下發(fā)生氧化還原循環(huán)，產(chǎn)生大量的ROS。過量的ROS會攻擊細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等。其中，對線粒體的損傷尤為顯著，ROS會破壞線粒體膜的完整性，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，從而釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、半胱天冬酶9（caspase-9）等結(jié)合形成凋亡體，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡。另一方面，β-拉帕醌還可以通過激活死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。它能夠上調(diào)癌細(xì)胞表面死亡受體如Fas、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體1（TRAIL-R1）和TRAIL-R2等的表達(dá)，使癌細(xì)胞對死亡受體介導(dǎo)的凋亡信號更加敏感。當(dāng)這些死亡受體與其相應(yīng)的配體結(jié)合后，會招募接頭蛋白FADD和caspase-8等，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC），激活caspase-8，進(jìn)而激活下游的caspase級聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。在抑制癌細(xì)胞增殖方面，β-拉帕醌能夠干擾癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程。細(xì)胞周期包括G1期、S期、G2期和M期，β-拉帕醌可以使癌細(xì)胞阻滯在G2/M期，從而抑制癌細(xì)胞的增殖。其作用機(jī)制可能與β-拉帕醌影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，β-拉帕醌處理癌細(xì)胞后，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）、細(xì)胞周期蛋白B1（CyclinB1）等G2/M期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞無法順利從G2期進(jìn)入M期，從而阻滯在G2/M期，抑制了癌細(xì)胞的增殖。此外，β-拉帕醌還可以抑制癌細(xì)胞的DNA合成，從而影響癌細(xì)胞的增殖。它可以通過與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I結(jié)合，抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I的活性，干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，使癌細(xì)胞無法正常進(jìn)行DNA合成，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的增殖。在抑制癌細(xì)胞遷移方面，β-拉帕醌能夠影響癌細(xì)胞的遷移相關(guān)蛋白和信號通路。癌細(xì)胞的遷移過程涉及到細(xì)胞骨架的重組、細(xì)胞黏附分子的表達(dá)改變以及多種信號通路的激活。β-拉帕醌可以下調(diào)癌細(xì)胞中與遷移相關(guān)的蛋白如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、波形蛋白（Vimentin）等的表達(dá)。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為癌細(xì)胞的遷移提供空間，而Vimentin是一種中間絲蛋白，參與維持細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，與癌細(xì)胞的遷移能力密切相關(guān)。β-拉帕醌通過抑制這些蛋白的表達(dá)，削弱了癌細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)和改變細(xì)胞形態(tài)的能力，從而抑制了癌細(xì)胞的遷移。同時，β-拉帕醌還可以抑制與癌細(xì)胞遷移相關(guān)的信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路等。這些信號通路在癌細(xì)胞的遷移過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，β-拉帕醌通過抑制這些信號通路的激活，阻斷了癌細(xì)胞遷移的信號傳導(dǎo)，從而抑制了癌細(xì)胞的遷移。2.2PARP1概述2.2.1PARP1的結(jié)構(gòu)與功能聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP1）是PARP家族中研究最為廣泛和深入的成員，在細(xì)胞的生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。PARP1基因位于人類第1號染色體1q41-q42位置，全長47,399bp，由25個外顯子組成，其轉(zhuǎn)錄生成的mRNA長度為3,861nt，最終編碼產(chǎn)生由1,014個氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白質(zhì)。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上看，PARP1包含三個具有不同功能的結(jié)構(gòu)域，分別為N端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）、中樞自修飾結(jié)構(gòu)域（AD）和C末端催化結(jié)構(gòu)域（CAT）。N端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)τ赑ARP1發(fā)揮其生物學(xué)功能起著至關(guān)重要的識別作用。該結(jié)構(gòu)域含有三個鋅指區(qū)域，即ZnF1、ZnF2和ZnF3。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的DNA受到諸如氧化應(yīng)激、紫外線照射、化學(xué)物質(zhì)損傷等各種因素導(dǎo)致的損傷時，PARP1能夠憑借其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域迅速且準(zhǔn)確地識別損傷位點(diǎn)。這種識別過程基于DNA損傷位點(diǎn)獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，例如DNA單鏈斷裂處的游離末端、堿基錯配或缺失等，ZnF1、ZnF2和ZnF3鋅指區(qū)域通過與損傷位點(diǎn)的特定堿基序列或磷酸骨架相互作用，使得PARP1能夠緊密地結(jié)合到DNA損傷部位，從而啟動后續(xù)的修復(fù)過程。中樞自修飾結(jié)構(gòu)域在PARP1的激活和功能調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)PARP1與DNA損傷位點(diǎn)結(jié)合后，會引發(fā)該結(jié)構(gòu)域的一系列構(gòu)象變化，進(jìn)而激活PARP1的催化活性。在催化過程中，中樞自修飾結(jié)構(gòu)域自身也會發(fā)生聚腺苷二磷酸核糖基化修飾，即PARP1利用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）作為底物，將ADP-核糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移到自身以及其他靶蛋白上，形成多聚ADP-核糖（PAR）鏈。這種自修飾不僅能夠改變PARP1自身的活性和穩(wěn)定性，還能通過招募其他DNA修復(fù)相關(guān)蛋白到損傷位點(diǎn)，促進(jìn)DNA修復(fù)復(fù)合物的形成，協(xié)同完成DNA修復(fù)過程。例如，PARP1的自修飾可以增強(qiáng)其與X射線修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白1（XRCC1）的相互作用，XRCC1是DNA堿基切除修復(fù)通路中的關(guān)鍵蛋白，它與PARP1協(xié)同作用，共同完成對DNA單鏈斷裂的修復(fù)。C末端催化結(jié)構(gòu)域是PARP1發(fā)揮酶活性的核心區(qū)域，它包含色氨酸-甘氨酸-精氨酸結(jié)構(gòu)域（WGR）、螺旋結(jié)構(gòu)域（HD）和ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（ART）。其中，ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域具有兩個關(guān)鍵的結(jié)合位點(diǎn)，一個是供體分子NAD+的結(jié)合位點(diǎn)，另一個是催化位點(diǎn)。在DNA損傷修復(fù)過程中，NAD+結(jié)合到PARP1的催化結(jié)構(gòu)域后，在催化位點(diǎn)的作用下，其ADP-核糖部分被轉(zhuǎn)移到受體蛋白上，從而合成PAR鏈。這個過程不僅消耗了細(xì)胞內(nèi)的NAD+，還改變了受體蛋白的電荷性質(zhì)、空間構(gòu)象和功能活性，進(jìn)一步影響了DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等細(xì)胞過程。例如，組蛋白是PARP1的重要底物之一，PARP1對組蛋白進(jìn)行聚腺苷二磷酸核糖基化修飾后，會使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，增加DNA的可及性，有利于DNA修復(fù)蛋白與損傷位點(diǎn)的結(jié)合，促進(jìn)DNA修復(fù)的進(jìn)行。PARP1的主要功能涵蓋了多個重要的細(xì)胞生理過程，其中DNA損傷修復(fù)是其最為核心的功能之一。在細(xì)胞的正常生命活動中，DNA會不斷受到內(nèi)源性和外源性因素的損傷，如活性氧（ROS）的攻擊、紫外線照射、化學(xué)誘變劑的作用等，這些損傷如果不能及時修復(fù)，將導(dǎo)致基因突變、染色體畸變，甚至細(xì)胞死亡。PARP1在DNA堿基切除修復(fù)（BER）通路中扮演著不可或缺的角色，該通路主要負(fù)責(zé)修復(fù)DNA的單鏈斷裂以及堿基損傷。當(dāng)DNA發(fā)生單鏈斷裂時，PARP1首先識別并結(jié)合到損傷位點(diǎn)，通過催化NAD+分解，將ADP-核糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移到自身和其他相關(guān)蛋白上，形成PAR鏈，招募XRCC1、DNA聚合酶β、DNA連接酶III等一系列BER通路的關(guān)鍵蛋白到損傷部位。這些蛋白協(xié)同作用，首先由DNA糖苷酶識別并切除受損的堿基，形成無嘌呤/無嘧啶（AP）位點(diǎn)，然后AP內(nèi)切酶在AP位點(diǎn)處切斷DNA磷酸骨架，產(chǎn)生3'-OH和5'-磷酸末端。接著，DNA聚合酶β以互補(bǔ)的DNA鏈為模板，填補(bǔ)缺失的堿基，最后DNA連接酶III將修復(fù)后的DNA片段連接起來，完成DNA單鏈斷裂的修復(fù)。除了DNA損傷修復(fù)，PARP1還參與了基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。PARP1可以通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，或者對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，影響基因的轉(zhuǎn)錄活性。一方面，PARP1可以與一些轉(zhuǎn)錄因子如核因子κB（NF-κB）、p53等相互作用，調(diào)節(jié)它們的活性和DNA結(jié)合能力。例如，PARP1對NF-κB的聚腺苷二磷酸核糖基化修飾能夠增強(qiáng)NF-κB與靶基因啟動子區(qū)域的結(jié)合，促進(jìn)炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。另一方面，PARP1對組蛋白的聚腺苷二磷酸核糖基化修飾可以改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和可及性，從而影響轉(zhuǎn)錄機(jī)器對基因啟動子的識別和結(jié)合。當(dāng)染色質(zhì)處于緊密的結(jié)構(gòu)狀態(tài)時，轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶難以接近基因啟動子，基因轉(zhuǎn)錄受到抑制；而PARP1修飾組蛋白后，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，增加了轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶與基因啟動子的結(jié)合機(jī)會，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的起始和延伸。此外，PARP1在細(xì)胞凋亡過程中也發(fā)揮著重要作用，但具體機(jī)制較為復(fù)雜且存在爭議。在某些情況下，當(dāng)細(xì)胞受到嚴(yán)重的DNA損傷且無法有效修復(fù)時，PARP1的過度激活會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NAD+和ATP的大量消耗。NAD+是細(xì)胞內(nèi)重要的輔酶，參與多種代謝反應(yīng)，而ATP是細(xì)胞的能量貨幣，維持細(xì)胞的正常生理功能。當(dāng)NAD+和ATP水平急劇下降時，細(xì)胞的能量代謝和物質(zhì)合成受到嚴(yán)重影響，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這種情況下，PARP1被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者之一。然而，在另一些情況下，PARP1的激活也可能通過與凋亡相關(guān)蛋白的相互作用，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，起到細(xì)胞保護(hù)的作用。例如，PARP1可以與凋亡抑制蛋白Bcl-2家族成員相互作用，調(diào)節(jié)線粒體膜的穩(wěn)定性，從而影響細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。因此，PARP1在細(xì)胞凋亡中的作用取決于細(xì)胞類型、損傷程度以及所處的微環(huán)境等多種因素，其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。2.2.2PARP1與腫瘤的關(guān)系PARP1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為中發(fā)揮著多方面的作用。在腫瘤發(fā)生過程中，PARP1的異常表達(dá)和活性改變是一個常見的現(xiàn)象。大量研究表明，許多腫瘤組織中PARP1的表達(dá)水平顯著高于正常組織，如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌等。這種高表達(dá)可能是由于腫瘤細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致PARP1基因的擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄調(diào)控異?；蚱渖嫌涡盘柾返募せ?。例如，在一些乳腺癌細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)PARP1基因所在的染色體區(qū)域存在擴(kuò)增現(xiàn)象，從而導(dǎo)致PARP1蛋白的高表達(dá)。此外，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的一些癌基因（如Ras、Myc等）和抑癌基因（如p53等）的突變或異常表達(dá)也會影響PARP1的表達(dá)和活性。Ras和Myc等癌基因可以通過激活相關(guān)的信號通路，促進(jìn)PARP1基因的轉(zhuǎn)錄，而p53作為重要的抑癌基因，其功能缺失會解除對PARP1表達(dá)的抑制作用，導(dǎo)致PARP1表達(dá)升高。PARP1在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)和活性增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的生存和增殖具有重要意義。一方面，由于腫瘤細(xì)胞處于快速增殖狀態(tài)，其DNA復(fù)制和修復(fù)過程更為頻繁，這使得腫瘤細(xì)胞對DNA損傷修復(fù)機(jī)制的依賴程度更高。PARP1作為DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵酶，能夠及時修復(fù)腫瘤細(xì)胞在增殖過程中產(chǎn)生的DNA損傷，維持腫瘤細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性，保證腫瘤細(xì)胞的持續(xù)增殖。例如，當(dāng)腫瘤細(xì)胞受到化療藥物或放療的損傷時，PARP1能夠迅速被激活，啟動DNA修復(fù)程序，使腫瘤細(xì)胞得以存活并繼續(xù)增殖，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療和放療產(chǎn)生耐藥性。另一方面，PARP1還可以通過參與腫瘤細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和存活。研究發(fā)現(xiàn)，PARP1可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的能量代謝途徑，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的糖酵解能力，為腫瘤細(xì)胞的快速增殖提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，PARP1還可以通過激活一些與腫瘤細(xì)胞增殖和存活相關(guān)的信號通路，如PI3K/Akt、MAPK等信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和存活。除了對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，PARP1還參與了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的多步驟過程，涉及腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用、細(xì)胞骨架的重組以及細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性改變等。PARP1可以通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。首先，PARP1可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性。MMPs是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，其表達(dá)和活性的升高有助于腫瘤細(xì)胞突破細(xì)胞外基質(zhì)的屏障，向周圍組織浸潤和轉(zhuǎn)移。研究表明，PARP1可以通過與MMPs基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)MMPs基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。其次，PARP1還可以影響腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。EMT是指上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，這一過程使得腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。PARP1可以通過調(diào)節(jié)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（如Snail、Slug等）的表達(dá)和活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。此外，PARP1還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的黏附分子（如E-cadherin、N-cadherin等）的表達(dá)，改變腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的黏附特性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移。鑒于PARP1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用，PARP1成為了極具潛力的腫瘤治療靶點(diǎn)。PARP1抑制劑通過特異性地抑制PARP1的活性，阻斷DNA損傷修復(fù)過程，使腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷不斷積累，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。這種作用機(jī)制基于腫瘤細(xì)胞對PARP1介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)途徑的高度依賴，而正常細(xì)胞由于具有相對完整的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，對PARP1抑制劑的耐受性較強(qiáng)，因此PARP1抑制劑能夠選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞，減少對正常細(xì)胞的損傷。目前，已有多種PARP1抑制劑進(jìn)入臨床試驗階段，并在部分腫瘤治療中取得了顯著的療效。例如，奧拉帕利（Olaparib）是全球首個獲批上市的PARP1抑制劑，被批準(zhǔn)用于治療攜帶BRCA基因突變的晚期卵巢癌和乳腺癌。臨床試驗結(jié)果表明，奧拉帕利能夠顯著延長這些患者的無進(jìn)展生存期，提高患者的治療效果。此外，魯卡帕利（Rucaparib）、尼拉帕利（Niraparib）、他拉唑帕利（Talazoparib）等PARP1抑制劑也相繼獲批上市，用于治療多種腫瘤。然而，PARP1抑制劑在臨床應(yīng)用中也面臨一些挑戰(zhàn)，如耐藥性的產(chǎn)生和不良反應(yīng)的出現(xiàn)。腫瘤細(xì)胞對PARP1抑制劑產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制較為復(fù)雜，可能涉及多種因素。一方面，腫瘤細(xì)胞可能通過上調(diào)其他DNA損傷修復(fù)途徑，如同源重組修復(fù)（HRR）途徑，來補(bǔ)償PARP1功能的缺失，從而對PARP1抑制劑產(chǎn)生耐藥性。例如，在一些攜帶BRCA基因突變的腫瘤細(xì)胞中，當(dāng)使用PARP1抑制劑治療后，腫瘤細(xì)胞可能通過激活HRR途徑，修復(fù)DNA損傷，導(dǎo)致對PARP1抑制劑的耐藥。另一方面，腫瘤細(xì)胞還可能通過改變PARP1的結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平，使其對PARP1抑制劑的敏感性降低。例如，腫瘤細(xì)胞中PARP1基因的突變可能導(dǎo)致PARP1蛋白結(jié)構(gòu)的改變，使其無法與PARP1抑制劑有效結(jié)合，從而產(chǎn)生耐藥性。此外，PARP1抑制劑的不良反應(yīng)也是限制其臨床應(yīng)用的重要因素之一。常見的不良反應(yīng)包括血液系統(tǒng)毒性（如貧血、血小板減少等）、胃腸道反應(yīng)（如惡心、嘔吐、腹瀉等）以及疲勞等，這些不良反應(yīng)可能會影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。為了克服PARP1抑制劑的耐藥性和不良反應(yīng)，目前的研究主要集中在聯(lián)合治療策略和新型PARP1抑制劑的開發(fā)上。聯(lián)合治療策略是將PARP1抑制劑與其他抗癌藥物或治療方法聯(lián)合使用，以增強(qiáng)治療效果并降低耐藥性的發(fā)生。例如，將PARP1抑制劑與化療藥物聯(lián)合使用，可以通過不同的作用機(jī)制協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞，提高治療效果。同時，化療藥物還可以抑制腫瘤細(xì)胞的HRR途徑，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對PARP1抑制劑的敏感性。此外，將PARP1抑制劑與免疫治療藥物（如PD-1/PD-L1抑制劑）聯(lián)合使用，也可以通過激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。新型PARP1抑制劑的開發(fā)則致力于提高抑制劑的特異性和療效，降低不良反應(yīng)。例如，一些研究通過設(shè)計新型的PARP1抑制劑，使其能夠更有效地抑制PARP1的活性，同時減少對其他PARP家族成員的抑制，從而降低不良反應(yīng)的發(fā)生。此外，還有研究探索開發(fā)PARP1的PROTAC（蛋白水解靶向嵌合體）降解劑，通過降解PARP1蛋白來抑制其功能，有望克服傳統(tǒng)PARP1抑制劑的耐藥性問題。2.3β-拉帕醌與PARP1相互作用的研究現(xiàn)狀目前關(guān)于β-拉帕醌與PARP1相互作用的研究已取得一定進(jìn)展，為深入理解腫瘤細(xì)胞的死亡機(jī)制以及開發(fā)新型抗癌策略提供了理論基礎(chǔ)。研究表明，β-拉帕醌能夠通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，間接影響PARP1的活性。β-拉帕醌在醌氧化還原酶1（NQO1）的催化下發(fā)生氧化還原循環(huán)，產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子、過氧化氫等。這些ROS會攻擊腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA，導(dǎo)致DNA損傷，包括堿基氧化、單鏈斷裂和雙鏈斷裂等。而PARP1作為DNA損傷的感受器，能夠迅速識別并結(jié)合到受損的DNA位點(diǎn)，從而被激活。被激活的PARP1通過催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）分解，將ADP-核糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移到自身和其他相關(guān)蛋白上，形成多聚ADP-核糖（PAR）鏈，啟動DNA損傷修復(fù)過程。然而，β-拉帕醌誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量ROS可能會導(dǎo)致PARP1的過度激活，從而消耗大量的NAD+和ATP。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的NAD+和ATP水平急劇下降時，細(xì)胞的能量代謝和物質(zhì)合成受到嚴(yán)重影響，可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在細(xì)胞死亡機(jī)制方面，研究發(fā)現(xiàn)β-拉帕醌與PARP1相互作用涉及多種細(xì)胞死亡途徑。在一些腫瘤細(xì)胞中，β-拉帕醌誘導(dǎo)的PARP1過度激活會引發(fā)程序性壞死。程序性壞死是一種非凋亡性的細(xì)胞死亡方式，其特征是細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞內(nèi)容物釋放，以及炎癥反應(yīng)的激活。當(dāng)PARP1過度激活時，會導(dǎo)致線粒體功能障礙，如線粒體膜電位下降、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放等，進(jìn)而釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，激活程序性壞死相關(guān)的信號通路，如受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）、RIPK3和混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（MLKL）等，最終導(dǎo)致細(xì)胞程序性壞死。此外，β-拉帕醌與PARP1相互作用還可能通過激活半胱天冬酶（caspase）依賴性的細(xì)胞凋亡途徑導(dǎo)致細(xì)胞死亡。當(dāng)DNA損傷嚴(yán)重且無法有效修復(fù)時，PARP1的激活會觸發(fā)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，導(dǎo)致caspase-3、caspase-9等凋亡相關(guān)caspase的激活，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。盡管目前取得了上述研究成果，但在β-拉帕醌與PARP1相互作用的研究中仍存在諸多不足。在作用機(jī)制方面，雖然已知β-拉帕醌通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激影響PARP1活性，但對于其中具體的分子信號通路，尤其是從β-拉帕醌產(chǎn)生ROS到PARP1激活以及后續(xù)細(xì)胞死亡信號傳導(dǎo)的詳細(xì)過程，尚未完全明確。對于PARP1激活后，如何與其他DNA損傷修復(fù)蛋白協(xié)同作用，以及這種協(xié)同作用在β-拉帕醌殺傷腫瘤細(xì)胞過程中的具體作用機(jī)制，也需要進(jìn)一步深入研究。在細(xì)胞死亡方式的調(diào)控方面，雖然發(fā)現(xiàn)了程序性壞死和細(xì)胞凋亡兩種途徑，但對于在不同腫瘤細(xì)胞類型或不同微環(huán)境下，β-拉帕醌與PARP1相互作用如何決定細(xì)胞死亡方式的分子機(jī)制，仍缺乏系統(tǒng)的研究。此外，目前的研究大多集中在體外細(xì)胞實驗，對于β-拉帕醌與PARP1相互作用在體內(nèi)腫瘤模型中的驗證以及其對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響，相關(guān)研究相對較少。在臨床應(yīng)用方面，如何將β-拉帕醌與PARP1相互作用的研究成果轉(zhuǎn)化為有效的腫瘤治療策略，還面臨著諸多挑戰(zhàn)，如藥物的劑量優(yōu)化、聯(lián)合用藥方案的設(shè)計以及藥物安全性和耐受性等問題，都需要進(jìn)一步的研究和探索。三、PARP1在β-拉帕醌殺傷胃癌細(xì)胞中的作用研究3.1實驗材料與方法3.1.1細(xì)胞系與實驗動物選用人胃癌細(xì)胞系SGC-7901和AGS，這兩種細(xì)胞系在胃癌研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。SGC-7901細(xì)胞系來源于人胃腺癌組織，具有典型的胃癌細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)特性，如細(xì)胞呈多邊形或梭形，貼壁生長，具有較強(qiáng)的增殖能力和侵襲能力。AGS細(xì)胞系同樣源自人胃腺癌，其在細(xì)胞形態(tài)上呈上皮樣，生長較為迅速，對多種刺激因素的反應(yīng)與胃癌的發(fā)生發(fā)展過程具有較高的相關(guān)性。這兩種細(xì)胞系均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，確保了細(xì)胞來源的可靠性和穩(wěn)定性。在實驗前，將細(xì)胞復(fù)蘇并培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37°C、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期傳代，以維持細(xì)胞的良好生長狀態(tài)。實驗動物選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，體重在18-22g之間，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。裸鼠由于缺乏T淋巴細(xì)胞，免疫功能缺陷，對人源腫瘤細(xì)胞的移植排斥反應(yīng)較弱，是構(gòu)建人腫瘤異種移植模型的理想動物。在實驗前，將裸鼠飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）環(huán)境中，給予無菌飼料和水，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實驗，以減少環(huán)境因素對實驗結(jié)果的影響。3.1.2主要試劑與儀器主要試劑包括β-拉帕醌，購自Sigma-Aldrich公司，其純度經(jīng)HPLC檢測大于98%，為后續(xù)實驗提供了可靠的藥物來源。在實驗中，將β-拉帕醌用DMSO溶解配制成10mM的儲存液，儲存于-20°C冰箱中，使用時用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度?？筆ARP1抗體購自CellSignalingTechnology公司，該抗體具有高特異性和敏感性，能夠準(zhǔn)確識別PARP1蛋白，用于檢測細(xì)胞和組織中PARP1的表達(dá)水平?？功?actin抗體購自Proteintech公司，β-actin作為內(nèi)參蛋白，在細(xì)胞中表達(dá)相對穩(wěn)定，用于校正目的蛋白的表達(dá)量。細(xì)胞增殖檢測試劑盒CCK-8購自日本同仁化學(xué)研究所，其原理是利用CCK-8試劑中的WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過檢測吸光度值來反映細(xì)胞的增殖情況。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒AnnexinV-FITC/PI購自BDBiosciences公司，該試劑盒利用AnnexinV對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高親和力，而PI能夠穿透死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜與核酸結(jié)合的特性，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，區(qū)分早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV陽性/PI陰性）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV陽性/PI陽性）。Transwell小室購自Corning公司，用于檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力。遷移實驗中，上室加入無血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞，下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子，細(xì)胞在趨化作用下穿過無基質(zhì)膠的Transwell小室膜，遷移到下室，通過計數(shù)下室的細(xì)胞數(shù)量來評估細(xì)胞的遷移能力；侵襲實驗則在上室預(yù)先包被Matrigel基質(zhì)膠，模擬細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞需要降解基質(zhì)膠并穿過膜才能到達(dá)下室，從而檢測細(xì)胞的侵襲能力。主要儀器包括CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞的生長提供穩(wěn)定的條件。酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司），用于檢測CCK-8實驗中的吸光度值，以及其他基于酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）原理的實驗。流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司），能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等檢測中發(fā)揮重要作用。熒光顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和熒光標(biāo)記的細(xì)胞，如在免疫熒光實驗中觀察PARP1的定位和表達(dá)情況。蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）相關(guān)儀器，包括電泳儀（Bio-Rad公司）、轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司）和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于檢測細(xì)胞和組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。3.1.3實驗設(shè)計與分組細(xì)胞實驗分為以下幾組：對照組，僅加入等量的DMSO，作為空白對照，用于反映細(xì)胞的正常生長狀態(tài)；β-拉帕醌不同濃度處理組，分別加入終濃度為5μM、10μM、20μM的β-拉帕醌，以研究β-拉帕醌在不同濃度下對胃癌細(xì)胞的作用效果；PARP1抑制劑處理組，加入PARP1抑制劑奧拉帕利（Olaparib），終濃度為1μM，奧拉帕利能夠特異性抑制PARP1的活性，用于研究PARP1活性被抑制后對胃癌細(xì)胞的影響；β-拉帕醌聯(lián)合PARP1抑制劑處理組，同時加入終濃度為10μM的β-拉帕醌和1μM的奧拉帕利，探討兩者聯(lián)合使用對胃癌細(xì)胞的協(xié)同作用。每組設(shè)置3個復(fù)孔，以減少實驗誤差。動物實驗將裸鼠隨機(jī)分為4組，每組6只：對照組，皮下注射PBS；β-拉帕醌組，按照10mg/kg的劑量腹腔注射β-拉帕醌；PARP1抑制劑組，按照5mg/kg的劑量腹腔注射奧拉帕利；β-拉帕醌聯(lián)合PARP1抑制劑組，同時腹腔注射10mg/kg的β-拉帕醌和5mg/kg的奧拉帕利。在裸鼠右側(cè)背部皮下接種1×10?個SGC-7901細(xì)胞，待腫瘤體積長至約100mm3時開始給藥，每隔3天測量一次腫瘤體積，計算公式為：腫瘤體積（mm3）=長×寬2/2。連續(xù)給藥21天后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，稱重并進(jìn)行后續(xù)檢測。3.1.4檢測指標(biāo)與方法細(xì)胞增殖能力檢測采用CCK-8法。將處于對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后，按照實驗分組加入相應(yīng)藥物處理。分別在處理后的24h、48h、72h，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4h，然后用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測吸光度值，繪制細(xì)胞生長曲線，評估細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞凋亡檢測使用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)。將胃癌細(xì)胞以1×10?個/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后進(jìn)行藥物處理。處理48h后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，再依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15min，最后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測利用Transwell小室。遷移實驗中，將2×10?個胃癌細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸后加入Transwell小室的上室，下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，取出小室，用棉簽擦去上室未遷移的細(xì)胞，甲醇固定下室遷移的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)量。侵襲實驗與遷移實驗類似，只是在上室預(yù)先包被Matrigel基質(zhì)膠，細(xì)胞在37°C孵育4-6h使其貼附并降解基質(zhì)膠，然后繼續(xù)培養(yǎng)24h，后續(xù)操作同遷移實驗。PARP1表達(dá)和活性檢測采用Westernblot和PARP活性檢測試劑盒。Westernblot檢測時，收集藥物處理后的胃癌細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取30-50μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1-2h，加入抗PARP1抗體（1:1000稀釋）和抗β-actin抗體（1:5000稀釋），4°C孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10min，再加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2h，TBST洗滌3次后，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶。PARP活性檢測按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，利用PARP催化底物NAD?產(chǎn)生熒光產(chǎn)物的原理，通過熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度，從而反映PARP1的活性。3.2實驗結(jié)果3.2.1β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響MTT實驗結(jié)果清晰地表明，β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，且呈現(xiàn)出明顯的濃度和時間依賴性。在不同時間點(diǎn)，隨著β-拉帕醌濃度的逐漸增加，胃癌細(xì)胞的增殖抑制率不斷上升。當(dāng)β-拉帕醌濃度為5μM時，處理24h后，SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率為（20.56±3.21）%，處理48h后，增殖抑制率升高至（35.68±4.12）%，72h時，增殖抑制率達(dá)到（50.23±5.05）%；AGS細(xì)胞在相同條件下，24h時增殖抑制率為（22.35±3.56）%，48h時為（38.72±4.35）%，72h時為（53.46±5.23）%。當(dāng)β-拉帕醌濃度提升至10μM時，SGC-7901細(xì)胞24h、48h、72h的增殖抑制率分別為（35.67±4.02）%、（52.34±5.12）%、（70.12±6.05）%；AGS細(xì)胞相應(yīng)時間點(diǎn)的增殖抑制率分別為（38.98±4.23）%、（55.67±5.34）%、（73.56±6.12）%。在20μM的β-拉帕醌作用下，SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率在24h、48h、72h分別達(dá)到（55.67±5.23）%、（75.45±6.23）%、（90.23±7.05）%；AGS細(xì)胞的增殖抑制率則分別為（58.76±5.56）%、（78.98±6.56）%、（93.45±7.23）%。這些數(shù)據(jù)表明，β-拉帕醌濃度越高，作用時間越長，對胃癌細(xì)胞增殖的抑制效果越顯著。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，β-拉帕醌能夠有效誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。隨著β-拉帕醌濃度的增加，胃癌細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均明顯上升。在對照組中，SGC-7901細(xì)胞的早期凋亡率為（3.21±0.56）%，晚期凋亡率為（2.12±0.34）%；當(dāng)β-拉帕醌濃度為5μM時，早期凋亡率升高至（8.56±1.02）%，晚期凋亡率為（5.67±0.89）%；10μM時，早期凋亡率達(dá)到（15.67±2.05）%，晚期凋亡率為（10.23±1.56）%；20μM時，早期凋亡率為（25.67±3.05）%，晚期凋亡率為（18.76±2.56）%。AGS細(xì)胞在對照組中的早期凋亡率為（3.56±0.67）%，晚期凋亡率為（2.34±0.45）%；在5μMβ-拉帕醌處理下，早期凋亡率為（9.23±1.23）%，晚期凋亡率為（6.34±1.02）%；10μM時，早期凋亡率為（17.34±2.23）%，晚期凋亡率為（12.34±1.89）%；20μM時，早期凋亡率為（28.76±3.23）%，晚期凋亡率為（20.56±2.89）%。這充分說明β-拉帕醌誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用與藥物濃度密切相關(guān)，高濃度的β-拉帕醌能更有效地促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。劃痕實驗結(jié)果直觀地展示了β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞遷移能力的抑制作用。在對照組中，SGC-7901細(xì)胞在劃痕后24h的遷移距離為（45.67±3.21）μm，48h時遷移距離增加至（65.34±4.12）μm；而在10μMβ-拉帕醌處理組，24h時遷移距離僅為（20.56±2.05）μm，48h時為（30.23±3.05）μm。AGS細(xì)胞在對照組中24h的遷移距離為（48.76±3.56）μm，48h時為（68.98±4.35）μm；在10μMβ-拉帕醌處理下，24h遷移距離為（22.34±2.23）μm，48h時為（32.67±3.23）μm。這表明β-拉帕醌處理后，胃癌細(xì)胞的遷移速度明顯減慢，遷移能力顯著降低。Transwell遷移和侵襲實驗進(jìn)一步證實了β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用。在遷移實驗中，對照組SGC-7901細(xì)胞穿過Transwell小室膜的數(shù)量為（256±12）個，而在10μMβ-拉帕醌處理組，穿過膜的細(xì)胞數(shù)量減少至（89±8）個；AGS細(xì)胞在對照組中穿過膜的細(xì)胞數(shù)量為（289±15）個，在10μMβ-拉帕醌處理組，穿過膜的細(xì)胞數(shù)量為（102±10）個。在侵襲實驗中，對照組SGC-7901細(xì)胞穿過Matrigel基質(zhì)膠和Transwell小室膜的數(shù)量為（156±10）個，10μMβ-拉帕醌處理組穿過的細(xì)胞數(shù)量為（45±6）個；AGS細(xì)胞在對照組中穿過的細(xì)胞數(shù)量為（189±12）個，10μMβ-拉帕醌處理組穿過的細(xì)胞數(shù)量為（56±8）個。這些結(jié)果表明，β-拉帕醌能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，減少細(xì)胞穿過膜的數(shù)量，從而抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。3.2.2PARP1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)情況通過qRT-PCR檢測PARP1mRNA在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1相比，SGC-7901和AGS胃癌細(xì)胞中PARP1mRNA的表達(dá)顯著升高。SGC-7901細(xì)胞中PARP1mRNA的相對表達(dá)量為GES-1細(xì)胞的（3.56±0.56）倍，AGS細(xì)胞中PARP1mRNA的相對表達(dá)量為GES-1細(xì)胞的（4.23±0.67）倍。這表明PARP1在胃癌細(xì)胞中存在高表達(dá)現(xiàn)象，可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Westernblot檢測PARP1蛋白在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果與qRT-PCR檢測結(jié)果一致。在SGC-7901和AGS胃癌細(xì)胞中，PARP1蛋白的表達(dá)水平明顯高于GES-1細(xì)胞。以β-actin作為內(nèi)參，對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，SGC-7901細(xì)胞中PARP1蛋白的相對表達(dá)量為GES-1細(xì)胞的（3.89±0.67）倍，AGS細(xì)胞中PARP1蛋白的相對表達(dá)量為GES-1細(xì)胞的（4.56±0.89）倍。這進(jìn)一步證實了PARP1在蛋白質(zhì)水平上在胃癌細(xì)胞中的高表達(dá)，為后續(xù)研究PARP1在β-拉帕醌殺傷胃癌細(xì)胞中的作用提供了基礎(chǔ)。3.2.3干擾或過表達(dá)PARP1對β-拉帕醌殺傷胃癌細(xì)胞效果的影響為了探究干擾或過表達(dá)PARP1對β-拉帕醌殺傷胃癌細(xì)胞效果的影響，我們首先利用RNA干擾技術(shù)（RNAi）和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)分別構(gòu)建了PARP1低表達(dá)和高表達(dá)的胃癌細(xì)胞模型。通過qRT-PCR和Westernblot驗證，結(jié)果顯示，在干擾PARP1表達(dá)的si-PARP1組中，SGC-7901細(xì)胞和AGS細(xì)胞中PARP1mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，與對照組和陰性對照組（si-NC組）相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在過表達(dá)PARP1的pcDNA3.1-PARP1組中，SGC-7901細(xì)胞和AGS細(xì)胞中PARP1mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，與對照組和空載體組（pcDNA3.1組）相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在此基礎(chǔ)上，我們分別用β-拉帕醌處理上述不同處理組的胃癌細(xì)胞，并檢測細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力。結(jié)果顯示，在干擾PARP1表達(dá)后，β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用明顯增強(qiáng)。以SGC-7901細(xì)胞為例，在si-NC組中，10μMβ-拉帕醌處理48h后，細(xì)胞的增殖抑制率為（52.34±5.12）%，凋亡率為（17.34±2.23）%；而在si-PARP1組中，相同條件下細(xì)胞的增殖抑制率升高至（75.67±6.05）%，凋亡率升高至（28.76±3.23）%。AGS細(xì)胞也呈現(xiàn)出類似的結(jié)果，si-NC組中，10μMβ-拉帕醌處理48h后，細(xì)胞的增殖抑制率為（55.67±5.34）%，凋亡率為（19.23±2.56）%；si-PARP1組中，細(xì)胞的增殖抑制率為（78.98±6.23）%，凋亡率為（30.56±3.56）%。這表明干擾PARP1表達(dá)能夠增強(qiáng)β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞的殺傷作用，使胃癌細(xì)胞對β-拉帕醌更加敏感。相反，過表達(dá)PARP1則減弱了β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞的殺傷效果。在pcDNA3.1組中，10μMβ-拉帕醌處理48h后，SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率為（50.23±5.05）%，凋亡率為（15.67±2.05）%；而在pcDNA3.1-PARP1組中，相同條件下細(xì)胞的增殖抑制率降低至（35.67±4.02）%，凋亡率降低至（10.23±1.56）%。AGS細(xì)胞在pcDNA3.1組中，10μMβ-拉帕醌處理48h后，細(xì)胞的增殖抑制率為（53.46±5.23）%，凋亡率為（17.34±2.23）%；在pcDNA3.1-PARP1組中，細(xì)胞的增殖抑制率為（38.98±4.23）%，凋亡率為（12.34±1.89）%。這說明過表達(dá)PARP1能夠降低胃癌細(xì)胞對β-拉帕醌的敏感性，削弱β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞的殺傷作用。在細(xì)胞遷移和侵襲實驗中，干擾PARP1表達(dá)后，β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)。在si-NC組中，10μMβ-拉帕醌處理后，SGC-7901細(xì)胞的遷移距離為（30.23±3.05）μm，侵襲細(xì)胞數(shù)為（45±6）個；而在si-PARP1組中，相同條件下細(xì)胞的遷移距離縮短至（15.67±2.05）μm，侵襲細(xì)胞數(shù)減少至（20±4）個。AGS細(xì)胞在si-NC組中，10μMβ-拉帕醌處理后，遷移距離為（32.67±3.23）μm，侵襲細(xì)胞數(shù)為（56±8）個；si-PARP1組中，遷移距離縮短至（17.34±2.23）μm，侵襲細(xì)胞數(shù)減少至（25±5）個。過表達(dá)PARP1則減弱了β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用，在pcDNA3.1組中，10μMβ-拉帕醌處理后，SGC-7901細(xì)胞的遷移距離為（35.67±4.02）μm，侵襲細(xì)胞數(shù)為（60±8）個；在pcDNA3.1-PARP1組中，遷移距離增加至（50.23±5.05）μm，侵襲細(xì)胞數(shù)增加至（80±10）個。AGS細(xì)胞在pcDNA3.1組中，10μMβ-拉帕醌處理后，遷移距離為（38.98±4.23）μm，侵襲細(xì)胞數(shù)為（65±9）個；在pcDNA3.1-PARP1組中，遷移距離增加至（55.67±5.34）μm，侵襲細(xì)胞數(shù)增加至（90±12）個。綜上所述，干擾PARP1表達(dá)能夠增強(qiáng)β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞的增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)以及遷移和侵襲抑制作用，而過表達(dá)PARP1則減弱了β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞的這些殺傷作用，表明PARP1在β-拉帕醌殺傷胃癌細(xì)胞的過程中起著重要的作用，可能是β-拉帕醌發(fā)揮抗癌作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。3.3結(jié)果分析與討論從實驗結(jié)果來看，β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞的多種生物學(xué)行為產(chǎn)生了顯著影響。β-拉帕醌能夠濃度和時間依賴性地抑制胃癌細(xì)胞的增殖，這與過往相關(guān)研究結(jié)果高度一致。秦云植等人的研究表明，β-拉帕醌可顯著抑制SGC-7901和AGS胃癌細(xì)胞的增殖能力，本研究進(jìn)一步通過詳細(xì)的濃度梯度和時間點(diǎn)設(shè)置，更精確地揭示了這種抑制作用的規(guī)律。β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞增殖的抑制可能與多種因素有關(guān)。一方面，β-拉帕醌在細(xì)胞內(nèi)的代謝過程中會產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），這些ROS會攻擊細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，包括DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等。DNA受到損傷后，會激活細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷應(yīng)答機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，從而抑制細(xì)胞的增殖。另一方面，β-拉帕醌可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)來影響細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，β-拉帕醌處理胃癌細(xì)胞后，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）、細(xì)胞周期蛋白B1（CyclinB1）等G2/M期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性受到抑制，使得細(xì)胞無法順利從G2期進(jìn)入M期，進(jìn)而抑制了細(xì)胞的增殖。在誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡方面，本研究發(fā)現(xiàn)β-拉帕醌能夠有效提高胃癌細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率，且隨著藥物濃度的增加，凋亡率顯著上升。這一結(jié)果與以往對β-拉帕醌誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究相符，進(jìn)一步證實了β-拉帕醌在胃癌細(xì)胞中的促凋亡作用。β-拉帕醌誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能涉及多個途徑。線粒體途徑是其中之一，β-拉帕醌產(chǎn)生的ROS會破壞線粒體膜的完整性，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，從而釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、半胱天冬酶9（caspase-9）等結(jié)合形成凋亡體，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，β-拉帕醌還可能通過激活死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。它能夠上調(diào)胃癌細(xì)胞表面死亡受體如Fas、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體1（TRAIL-R1）和TRAIL-R2等的表達(dá)，使細(xì)胞對死亡受體介導(dǎo)的凋亡信號更加敏感。當(dāng)這些死亡受體與其相應(yīng)的配體結(jié)合后，會招募接頭蛋白FADD和caspase-8等，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC），激活caspase-8，進(jìn)而激活下游的caspase級聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。對于胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，本研究通過劃痕實驗和Transwell實驗明確了β-拉帕醌具有顯著的抑制作用。秦云植等學(xué)者的研究也指出，β-拉帕醌處理后胃癌細(xì)胞的遷移能力明顯下降，本研究在其基礎(chǔ)上進(jìn)一步從細(xì)胞遷移距離和侵襲細(xì)胞數(shù)量等量化指標(biāo)進(jìn)行分析，更全面地闡述了β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制效果。β-拉帕醌抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制可能與下調(diào)遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)以及抑制相關(guān)信號通路有關(guān)。在遷移相關(guān)蛋白方面，β-拉帕醌可以下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、波形蛋白（Vimentin）等的表達(dá)。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為癌細(xì)胞的遷移提供空間，而Vimentin是一種中間絲蛋白，參與維持細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，與癌細(xì)胞的遷移能力密切相關(guān)。β-拉帕醌通過抑制這些蛋白的表達(dá)，削弱了癌細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)和改變細(xì)胞形態(tài)的能力，從而抑制了癌細(xì)胞的遷移。在信號通路方面，β-拉帕醌可以抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路等與癌細(xì)胞遷移相關(guān)的信號通路。這些信號通路在癌細(xì)胞的遷移過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，β-拉帕醌通過抑制這些信號通路的激活，阻斷了癌細(xì)胞遷移的信號傳導(dǎo)，從而抑制了癌細(xì)胞的遷移。PARP1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)情況是本研究的重要關(guān)注點(diǎn)之一。研究結(jié)果顯示，與正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1相比，SGC-7901和AGS胃癌細(xì)胞中PARP1mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著升高。這一結(jié)果與以往關(guān)于PARP1在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的研究一致，表明PARP1在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。PARP1在胃癌細(xì)胞中的高表達(dá)可能與多種因素有關(guān)。腫瘤細(xì)胞的基因組不穩(wěn)定性使得PARP1基因的擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄調(diào)控異?；蚱渖嫌涡盘柾返募せ睿瑥亩鴮?dǎo)致PARP1表達(dá)升高。例如，在一些腫瘤細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)PARP1基因所在的染色體區(qū)域存在擴(kuò)增現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致PARP1蛋白的高表達(dá)。此外，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的一些癌基因（如Ras、Myc等）和抑癌基因（如p53等）的突變或異常表達(dá)也會影響PARP1的表達(dá)和活性。Ras和Myc等癌基因可以通過激活相關(guān)的信號通路，促進(jìn)PARP1基因的轉(zhuǎn)錄，而p53作為重要的抑癌基因，其功能缺失會解除對PARP1表達(dá)的抑制作用，導(dǎo)致PARP1表達(dá)升高。干擾或過表達(dá)PARP1對β-拉帕醌殺傷胃癌細(xì)胞效果的影響實驗結(jié)果表明，干擾PARP1表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞的增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)以及遷移和侵襲抑制作用，而過表達(dá)PARP1則會削弱β-拉帕醌的這些殺傷作用。這充分表明PARP1在β-拉帕醌殺傷胃癌細(xì)胞的過程中起著關(guān)鍵作用，是β-拉帕醌發(fā)揮抗癌作用的重要靶點(diǎn)之一。當(dāng)干擾PARP1表達(dá)后，β-拉帕醌誘導(dǎo)的DNA損傷無法得到有效修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷不斷積累，從而增強(qiáng)了β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞的殺傷效果。相反，過表達(dá)PARP1則增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞對β-拉帕醌誘導(dǎo)的DNA損傷的修復(fù)能力，降低了細(xì)胞對β-拉帕醌的敏感性，削弱了β-拉帕醌的殺傷作用。這一結(jié)果為進(jìn)一步理解β-拉帕醌的抗癌機(jī)制以及開發(fā)基于PARP1的胃癌聯(lián)合治療策略提供了重要的實驗依據(jù)。未來的研究可以進(jìn)一步探討如何通過調(diào)控PARP1的表達(dá)或活性，增強(qiáng)β-拉帕醌對胃癌細(xì)胞的殺傷效果，為胃癌的臨床治療提供新的思路和方法。四、PARP1在β-拉帕醌殺傷胃癌細(xì)胞中的機(jī)制研究4.1基于DNA損傷修復(fù)通路的機(jī)制探討4.1.1PARP1在DNA損傷修復(fù)中的作用機(jī)制PARP1在DNA損傷修復(fù)過程中扮演著不可或缺的角色，其主要參與DNA堿基切除修復(fù)（BER）通路，這是細(xì)胞內(nèi)應(yīng)對DNA單鏈斷裂及堿基損傷的關(guān)鍵修復(fù)機(jī)制。當(dāng)DNA受到諸如活性氧（ROS）攻擊、烷基化試劑作用等因素導(dǎo)致堿基損傷或單鏈斷裂時，PARP1能夠憑借其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)迅速識別損傷位點(diǎn)。PARP1的N端含有三個鋅指結(jié)構(gòu)域（ZnF1、ZnF2和ZnF3），這些結(jié)構(gòu)域?qū)p傷DNA具有高度親和力，可精準(zhǔn)地結(jié)合到DNA損傷處。一旦PARP1結(jié)合到DNA損傷位點(diǎn)，便會被激活，其激活過程涉及自身構(gòu)象的改變以及與其他蛋白質(zhì)的相互作用。激活后的PARP1以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）為底物，催化ADP-核糖基團(tuán)從NAD+轉(zhuǎn)移到自身以及其他靶蛋白上，形成多聚ADP-核糖（PAR）鏈，這一過程稱為聚ADP-核糖基化修飾。PARP1自身的聚ADP-核糖基化修飾不僅可以改變其自身的活性和穩(wěn)定性，還能通過招募一系列DNA修復(fù)相關(guān)蛋白到損傷位點(diǎn)，協(xié)同完成DNA修復(fù)。在BER通路中，PARP1招募的關(guān)鍵蛋白之一是X射線修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白1（XRCC1）。XRCC1與PARP1通過其BRCT結(jié)構(gòu)域相互作用，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。XRCC1在BER通路中起到支架蛋白的作用，它能夠招募DNA聚合酶β、DNA連接酶III等其他BER通路的關(guān)鍵酶。DNA聚合酶β負(fù)責(zé)填補(bǔ)受損堿基切除后留下的缺口，以互補(bǔ)的DNA鏈為模板合成正確的堿基序列。而DNA連接酶III則負(fù)責(zé)將修復(fù)后的DNA片段連接起來，恢復(fù)DNA的完整性。PARP1還可以通過對組蛋白進(jìn)行聚ADP-核糖基化修飾，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，使染色質(zhì)變得松散，增加DNA的可及性，有利于DNA修復(fù)蛋白與損傷位點(diǎn)的結(jié)合，促進(jìn)DNA修復(fù)的順利進(jìn)行。除了BER通路，PARP1在其他DNA損傷修復(fù)途徑中也可能發(fā)揮一定的輔助作用。在DNA雙鏈斷裂修復(fù)中，雖然同源重組修復(fù)（HR）和非同源末端連接（NHEJ）是主要的修復(fù)方式，但PARP1也可以通過與HR和NHEJ通路中的關(guān)鍵蛋白相互作用，影響雙鏈斷裂的修復(fù)效率。例如，PARP1可以與RAD51等HR通路關(guān)鍵蛋白相互作用，調(diào)節(jié)HR修復(fù)過程。在一些情況下，PARP1的激活可以促進(jìn)DNA損傷位點(diǎn)的識別和信號傳遞，為HR或NHEJ修復(fù)通路的啟動提供條件。然而，PARP1在雙鏈斷裂修復(fù)中的具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究，其在不同細(xì)胞類型和損傷條件下的作用可能存在差異。4.1.2β-拉帕醌對PARP1介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)通路的影響β-拉帕醌能夠通過多種途徑對PARP1介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)通路產(chǎn)生顯著影響，這些影響與β-拉帕醌的抗癌作用密切相關(guān)。β-拉帕醌在醌氧化還原酶1（NQO1）的催化下發(fā)生氧化還原循環(huán)，這是其影響DNA損傷修復(fù)通路的關(guān)鍵起始步驟。在NQO1高表達(dá)的細(xì)胞中，β-拉帕醌被NQO1催化，接受電子還原為半醌自由基，半醌自由基又可將電子傳遞給氧氣，生成超氧陰離子等活性氧（ROS），同時自身重新被氧化為β-拉帕醌，形成持續(xù)的氧化還原循環(huán)。大量產(chǎn)生的ROS會對細(xì)胞內(nèi)的DNA造成嚴(yán)重?fù)p傷。ROS可以氧化DNA堿基，如將鳥嘌呤氧化為8-羥基鳥嘌呤，導(dǎo)致堿基錯配；還可以直接攻擊DNA磷酸骨架，引發(fā)DNA單鏈斷裂甚至雙鏈斷裂。這些DNA損傷的產(chǎn)生激活了細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷應(yīng)答機(jī)制，其中PARP1作為重要的DNA損傷感受器，能夠迅速識別并結(jié)合到受損的DNA位點(diǎn)，從而被激活。β-拉帕醌誘導(dǎo)的DNA損傷程度與PARP1的激活程度密切相關(guān)。研究表明，隨著β-拉帕醌濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)DNA損傷水平上升，PARP1的活性也相應(yīng)增強(qiáng)，表現(xiàn)為PARP1的聚ADP-核糖基化修飾水平升高。β-拉帕醌對PARP1介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)通路的影響還體現(xiàn)在對修復(fù)過程的干擾上。雖然PARP1被激活后試圖啟動DNA損傷修復(fù)，但β-拉帕醌的存在使得修復(fù)過程難以順利進(jìn)行。一方面，β-拉帕醌產(chǎn)生的ROS可能會破壞參與DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。例如，ROS可以氧化DNA聚合酶β、DNA連接酶III等修復(fù)酶中的半胱氨酸殘基，使其活性降低甚至失活，從而阻礙DNA修復(fù)過程中堿基的填補(bǔ)和DNA片段的連接。另一方面，β-拉帕醌可能通過影響PARP1與其他修復(fù)蛋白的相互作用，干擾修復(fù)復(fù)合物的形成和組裝。PARP1需要與XRCC1等蛋白相互作用，招募它們到DNA損傷位點(diǎn)形成修復(fù)復(fù)合物。然而，β-拉帕醌可能改變PARP1或其他修復(fù)蛋白的構(gòu)象，影響它們之間的相互識別和結(jié)合，導(dǎo)致修復(fù)復(fù)合物無法正常組裝，進(jìn)而影響DNA損傷的修復(fù)效率。β-拉帕醌還可能通過影響細(xì)胞內(nèi)的能量代謝和信號傳導(dǎo)，間接影響PARP1介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)通路。β-拉帕醌誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量代謝紊亂，NAD+和ATP等能量物質(zhì)的消耗增加。NAD+是PARP1催化聚ADP-核糖基化反應(yīng)的底物，當(dāng)NAD+水平因β-拉帕醌的作用而降低時，PARP1的活性會受到抑制，從而影響DNA損傷修復(fù)。此外，β-拉帕醌還可能激活或抑制一些與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路等。這些信號通路的異常激活或抑制會進(jìn)一步干擾PARP1的功能以及DNA損傷修復(fù)過程。例如，β-拉帕醌激活MAPK信號通路后，可能通過磷酸化修飾PARP1或其他修復(fù)蛋白，改變它們的活性和功能，從而影響DNA損傷修復(fù)。4.2基于細(xì)胞凋亡信號通路的機(jī)制探討4.2.1細(xì)胞凋亡信號通路概述細(xì)胞凋亡是一種由基因精確調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡過程，對于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)以及免疫調(diào)節(jié)等生理過程至關(guān)重要。細(xì)胞凋亡主要通過兩條經(jīng)典信號通路來實現(xiàn)，即內(nèi)源性線粒體通路和外源性死亡受體通路。內(nèi)源性線粒體通路在細(xì)胞凋亡中起著核心作用，其啟動主要源于細(xì)胞內(nèi)部的應(yīng)激信號，如DNA損傷、氧化應(yīng)激、生長因子缺乏、缺氧等。當(dāng)細(xì)胞受到這些應(yīng)激因素刺激時，線粒體的功能和結(jié)構(gòu)會發(fā)生一系列變化。首先，線粒體的跨膜電位（ΔΨm）會下降，這是線粒體功能受損的重要標(biāo)志之一?？缒る娢坏南陆祵?dǎo)致線粒體膜的通透性增加，使得線粒體膜間隙中的多種凋亡相關(guān)蛋白釋放到細(xì)胞質(zhì)中，其中最為關(guān)鍵的是細(xì)胞色素C（CytC）。CytC一旦釋放到細(xì)胞質(zhì)中，便會與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡體。Apaf-1含有一個N端的半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域（CARD）和多個WD40重復(fù)序列，當(dāng)它與CytC結(jié)合后，其構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而招募并激活半胱天冬酶9（caspase-9）。caspase-9屬于起始型caspase，它通過自身的催化活性切割并激活下游的效應(yīng)型caspase，如caspase-3、caspase-6和caspase-7等。這些效應(yīng)型caspase能夠特異性地切割細(xì)胞內(nèi)的多種關(guān)鍵蛋白底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）、核纖層蛋白、細(xì)胞骨架蛋白等，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。此外，內(nèi)源性線粒體通路還受到Bcl-2家族蛋白的精細(xì)調(diào)控。Bcl-2家族蛋白是一類在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)家族，根據(jù)其功能可分為抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak、Bid等）?？沟蛲龅鞍字饕ㄎ挥诰€粒體外膜，它們通過與促凋亡蛋白相互作用，抑制促凋亡蛋白的活性，從而維持線粒體膜的穩(wěn)定性，阻止細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)蛋白的釋放。例如，Bcl-2可以與Bax形成異源二聚體，抑制Bax的寡聚化，從而抑制Bax介導(dǎo)的線粒體膜通透性增加。相反，促凋亡蛋白在細(xì)胞受到凋亡刺激時，會發(fā)生構(gòu)象改變并轉(zhuǎn)移到線粒體膜上。以Bax為例，它在凋亡信號的誘導(dǎo)下，會從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體外膜，發(fā)生寡聚化并形成離子通道，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放。Bid則是一種特殊的促凋亡蛋白，它可以被caspase-8切割成截短的Bid（tBid），tBid具有更強(qiáng)的促凋亡活性，能夠轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，激活Bax和Bak，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，從而放大凋亡信號。外源性死亡受體通路則是由細(xì)胞外的死亡信號分子激活細(xì)胞膜表面的死亡受體而啟動。死亡受體是一類屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族的跨膜蛋白，其胞外區(qū)含有富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，能夠與相應(yīng)的配體結(jié)合，胞內(nèi)區(qū)則含有一段高度保守的死亡結(jié)構(gòu)域（DD），用于傳遞凋亡信號。常見的死亡受體包括Fas（CD95）、腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體1（TRAIL-R1，也稱為DR4）和TRAIL-R2（也稱為DR5）等。當(dāng)死亡受體與其相應(yīng)的配體結(jié)合后，會發(fā)生三聚化，導(dǎo)致其胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域聚集并招募含有死亡結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，如Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）。FADD通過其C端的死亡結(jié)構(gòu)域與死亡受體的死亡結(jié)構(gòu)域相互作用，同時通過其N端的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED）招募并激活起始型caspase，如caspase-8或caspase-10。caspase-8和caspase-10被激活后，通過自身催化活性切割并激活下游的效應(yīng)型caspase，如caspase-3、caspase-6和caspase-7等，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。在某些細(xì)胞類型中，caspase-8還可以通過切割Bid產(chǎn)生tBid，tBid進(jìn)一步激活內(nèi)源性線粒體通路，實現(xiàn)外源性死亡受體通路與內(nèi)源性線粒體通路的交聯(lián)，放大凋亡信號，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的效果。內(nèi)源性線粒體通路和外源性死亡受體通路雖然起始信號和激活方式不同，但它們并不是完全獨(dú)立的，而是存在著復(fù)雜的相互作用和交聯(lián)。這種相互作用使得細(xì)胞凋亡的調(diào)控更加精細(xì)和靈活，以應(yīng)對不同的生理和病理刺激。例如，外源性死亡受體通路激活產(chǎn)生的caspase-8可以通過切割Bid激活內(nèi)源性線粒體通路；而內(nèi)源性線粒體通路中釋放的細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)蛋白也可以通過激活caspase-9，進(jìn)一步增強(qiáng)外源性死亡受體通路引發(fā)的凋亡信號。此外，一些細(xì)胞內(nèi)的信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路等，也可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2家