PCR的應(yīng)用隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，曾經(jīng)遙不可及的PCR技術(shù)逐步走進(jìn)了高中實(shí)驗(yàn)室。PCR技術(shù)應(yīng)用廣泛，如實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR技術(shù)、重疊延伸PCR、大引物PCR、反向PCR、巢式PCR等，高考試題中有關(guān)PCR的問(wèn)題越來(lái)越多，設(shè)問(wèn)考查深度也明顯提升。各種PCR技術(shù)不是孤立的，它們均以常規(guī)PCR為基礎(chǔ)，為實(shí)現(xiàn)特定目的而進(jìn)行了一定改進(jìn)，但也有各自的局限性，因此在必要時(shí)可同時(shí)使用幾種擴(kuò)增技術(shù)，如多重巢式PCR、反向?qū)崟r(shí)熒光定量PCR等。在高考備考中，要關(guān)注不同擴(kuò)增技術(shù)的本質(zhì)差異，同時(shí)總結(jié)此類試題的解答步驟：一是尋找題圖有效信息，確定所考PCR類型；二是迅速再憶所考PCR的獨(dú)特性，猜測(cè)出題人可能的意圖；三是根據(jù)設(shè)問(wèn)對(duì)前述猜測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證，并領(lǐng)悟出題人挖掘的新考點(diǎn)，進(jìn)而對(duì)知識(shí)框架進(jìn)行完善。1．實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR技術(shù)檢測(cè)病毒核酸病毒感染的常規(guī)檢測(cè)方法是通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增目的基因，需額外添加熒光標(biāo)記探針(一小段單鏈DNA，可與目的基因中部序列特異性結(jié)合)。當(dāng)探針完整時(shí)，不產(chǎn)生熒光。在PCR過(guò)程中，與目的基因結(jié)合的探針被耐高溫的DNA聚合酶水解，R與Q分離后，R發(fā)出的熒光可被檢測(cè)到(如圖甲)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)某冠狀病毒感染時(shí)，檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度變化如圖乙，熒光到達(dá)預(yù)先設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)(Ct值)越小，說(shuō)明病毒核酸濃度越高。2．PCR定點(diǎn)突變——重疊延伸PCR技術(shù)重疊延伸PCR技術(shù)其主要設(shè)計(jì)思路是用具有互補(bǔ)配對(duì)片段的引物(圖中的引物2和3，突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn))，分別進(jìn)行PCR，獲得有重疊鏈的兩種DNA片段，再在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸獲得想要的目的基因。如某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭素基因中的特定位點(diǎn)引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密碼子為AAC、AAU)替換為賴氨酸(密碼子為AAA、AAG)，從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如圖：3．PCR定點(diǎn)突變——大引物PCR技術(shù)大引物PCR需要用到三條引物進(jìn)行兩輪PCR，這三條引物分別是突變上游引物、常規(guī)上游引物和常規(guī)下游引物。第一輪PCR利用突變上游引物和常規(guī)下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到不完整的含有突變位點(diǎn)的DNA片段；第二輪PCR利用第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物中的一條DNA鏈作為下游大引物，它與常規(guī)上游引物一起擴(kuò)增得到完整的含有突變位點(diǎn)的DNA片段。原理如圖。4．反向PCR擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列當(dāng)DNA的某些序列已知，而需要擴(kuò)增已知序列兩端的未知序列時(shí)，可采用反向PCR技術(shù)。原理是：用限制酶消化該DNA，隨后使用DNA連接酶將獲得的酶切產(chǎn)物環(huán)化，這樣就獲得了已知序列兩側(cè)攜帶有未知序列的環(huán)狀DNA分子。以該已知序列為模板設(shè)計(jì)一對(duì)相反方向的特異性引物，該引物對(duì)已知序列反向，但對(duì)未知序列卻是相向的，從而得以擴(kuò)增出未知序列。原理如圖。5．巢式PCR首先將目標(biāo)的DNA模板與第一套引物(外引物)結(jié)合。第一套引物也可能結(jié)合到其他具有相似結(jié)合位點(diǎn)的片段上并擴(kuò)增多種產(chǎn)物。但只有一種產(chǎn)物是目的片段(圖中未顯示可能的多種產(chǎn)物)。然后使用第二套引物(內(nèi)引物)對(duì)第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。由于第二套引物位于第一輪PCR產(chǎn)物內(nèi)部，而非目的片段包含兩套引物結(jié)合位點(diǎn)的可能性極小，因此第二套引物不可能擴(kuò)增非目的片段。這種巢式PCR擴(kuò)增確保第二輪PCR產(chǎn)物幾乎或者完全沒(méi)有引物配對(duì)特異性不強(qiáng)造成的非特異性擴(kuò)增的污染。原理如圖。1．(2023·蘭州高三質(zhì)檢)實(shí)時(shí)熒光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸檢測(cè)，其原理是：在PCR復(fù)性過(guò)程中探針和引物一起與模板結(jié)合，探針兩側(cè)分別帶有熒光基團(tuán)和抑制熒光發(fā)出的淬滅基團(tuán)，新鏈延伸過(guò)程中，DNA聚合酶會(huì)破壞探針，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離而發(fā)出熒光。利用RT－PCR進(jìn)行核酸檢測(cè)的相關(guān)過(guò)程如圖所示。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是()A．做RT－PCR之前，需要先根據(jù)cDNA的核苷酸序列合成引物和探針B．RNA不能作為PCR擴(kuò)增的模板，故需要將樣本中的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后再進(jìn)行擴(kuò)增C．若檢測(cè)結(jié)果有強(qiáng)烈熒光信號(hào)發(fā)出，說(shuō)明被檢測(cè)者沒(méi)有感染病毒D．病毒的檢測(cè)還可以檢測(cè)病毒引發(fā)產(chǎn)生的抗體，其原理是抗原－抗體雜交2．(2023·天水高三模擬)重疊延伸PCR可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)基因誘變，其操作過(guò)程如圖所示(凸起處代表突變位點(diǎn))。下列說(shuō)法正確的是()A．過(guò)程①需要把兩對(duì)引物同時(shí)加入一個(gè)擴(kuò)增體系以提高擴(kuò)增效率B．過(guò)程①需要3輪PCR才能得到圖中所示PCR產(chǎn)物C．過(guò)程②的產(chǎn)物都可以完成延伸過(guò)程D．若過(guò)程④得到16個(gè)突變基因則需要消耗15個(gè)通用引物RP23．(2023·徐州高三三模)農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T－DNA可以轉(zhuǎn)移并隨機(jī)插入到被侵染植物的染色體DNA中。研究者將如圖中被侵染植物的DNA片段連接成環(huán)，并以此環(huán)為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出T－DNA插入位置兩側(cè)的未知序列，以此可確定T－DNA插入的具體位置。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是()A．進(jìn)行PCR擴(kuò)增依據(jù)的是DNA半保留復(fù)制的原理B．進(jìn)行PCR擴(kuò)增需要耐高溫的DNA聚合酶C．利用圖中的引物②③組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列D．通過(guò)與受體細(xì)胞的基因組序列比對(duì)，可確定T－DNA的插入位置4．(2023·天津高三調(diào)研)IKK激酶由IKKα、KKβ和IKKγ三種亞基組成，該酶參與動(dòng)物體內(nèi)免疫細(xì)胞的分化。臨床上發(fā)現(xiàn)某重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)患兒IKKB基因編碼區(qū)第1183位堿基T突變?yōu)镃，導(dǎo)致IKKβ上第395位酪氨酸被組氨酸代替。為研究該患兒發(fā)病機(jī)制，研究人員應(yīng)用大引物PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)培育出SCID模型小鼠，主要過(guò)程如圖1、2。回答下列問(wèn)題：(1)在PCR反應(yīng)體系中，除了需要加入引物和IKKB基因外，還需要加入____________________等。在圖1獲取突變基因過(guò)程中，需要以下3種引物：引物A：5′－CCCCAACCGGAAAGTGTCA－3′(下劃線字母為突變堿基)引物B：5′－TAAGCTTCGAACATCCTA－3′(下劃線部分為限制酶HindⅢ識(shí)別序列)引物C：5′－GTGAGCTCGCTGCCCCAA－3′(下劃線部分為限制酶SacⅠ識(shí)別序列)則PCR1中使用的引物有______________，PCR2中使用的引物有________和圖中大引物的________(填“①”或“②”)鏈。(2)根據(jù)圖2雜交結(jié)果，可以確認(rèn)突變基因已經(jīng)較穩(wěn)定地整合到小鼠細(xì)胞的染色體上，在遺傳時(shí)遵循______________定律。研究人員對(duì)三種基因型小鼠胸腺淋巴細(xì)胞中組成IKK激酶的三種亞基進(jìn)行提純和電泳，結(jié)果如圖3。請(qǐng)依據(jù)此結(jié)果提出SCID患者免疫缺陷產(chǎn)生的機(jī)制：________________________________________________________________________________________________________________________________________________。5．家畜的某些生產(chǎn)性狀(如泌乳、產(chǎn)肉、產(chǎn)毛)會(huì)受到性別的影響，因此性別鑒定和控制技術(shù)在畜牧生產(chǎn)上具有重大的實(shí)踐意義。如圖1為利用PCR擴(kuò)增SRY基因(Y染色體上的性別決定基因)進(jìn)行奶牛胚胎性別鑒定的主要流程。回答下列問(wèn)題：(1)PCR反應(yīng)體系需要加入模板、引物、____________________、____________________、緩沖液、Mg2＋等。(2)對(duì)囊胚進(jìn)行性別鑒定時(shí)，應(yīng)選取________(部位)細(xì)胞，該部位的細(xì)胞將發(fā)育為_(kāi)_______。待得出鑒定結(jié)果后，將胚胎移植至經(jīng)________處理的受體母牛子宮內(nèi)可進(jìn)一步發(fā)育。(3)相比于常規(guī)PCR獲得的產(chǎn)物而言，巢式PCR(原理見(jiàn)圖2)