DNA甲基化與臨床應(yīng)用第一頁，共43頁。目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應(yīng)用4引言及概念31甲基化檢測相關(guān)技術(shù)33第二頁，共43頁。為什么熊貓是黑白的？——基因決定命運第三頁，共43頁。

同卵雙生的孿生子具有完全相同的基因組。但他們長大成人后在性格、健康方面往往存在很大差異。第四頁，共43頁。先從表觀遺傳學(xué)談起相同的基因型不同的表型

?

基因環(huán)境表型表觀遺傳學(xué)第五頁，共43頁。現(xiàn)代表觀遺傳學(xué)概念：

基因的DNA序列不發(fā)生改變的情況下，基因的表達水平與功能發(fā)生改變，并產(chǎn)生可遺傳的表型。表觀遺傳學(xué)的現(xiàn)象（基因表達的調(diào)控方式）：DNA甲基化---表觀遺傳學(xué)的核心（最初始的調(diào)控方式）組蛋白修飾MicroRNAGenomicimprinting第六頁，共43頁。不同層次表達調(diào)控第七頁，共43頁。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶：DNMT胞嘧啶：Cytosine5’-甲基胞嘧啶：

5-MethylctosineS-腺苷-甲硫氨酸：SAMS-腺苷-高半胱氨酸：SAHDNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5‘碳位以共價鍵結(jié)合一個甲基基團。DNA甲基化的概念第八頁，共43頁。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)哺乳動物體內(nèi)有三種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶：——DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。DNMT1---持續(xù)性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶；與甲基化相關(guān)，缺乏引起基因組低甲基化，染色體缺失、重排、突變畸形。DNMT3A、DNMT3B---從頭甲基轉(zhuǎn)移酶；與去甲基化相關(guān)，在胚胎干細胞和早期胚胎中高度表達，缺乏引起胚胎死亡，在腫瘤組織中廣泛高表達。第九頁，共43頁。通常啟動子和第一個外顯子區(qū)，CpG序列密度非常高，超過均值5倍以上，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區(qū)。結(jié)構(gòu)基因組中70%～90%的獨立CpG都被甲基化,未甲基化的CpG成簇地聚集形成CpG島約有60％以上基因的啟動子含有CpG島。

—是結(jié)構(gòu)基因啟動子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點。CpG島（CpGisland）預(yù)測軟件

第十頁，共43頁。目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應(yīng)用4引言及概念31甲基化檢測相關(guān)技術(shù)33第十一頁，共43頁。DNA甲基化的生物學(xué)作用在發(fā)育和分化中調(diào)控基因的表達轉(zhuǎn)錄抑制特征性表型基因的表達（膚色、毛發(fā)）

X染色體的失活（X-inactivation）基因印記堿基突變腫瘤代謝第十二頁，共43頁。DNA甲基化作為一種可遺傳的表觀遺傳修飾，在體細胞增殖過程中通過依賴于DNA復(fù)制的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt1穩(wěn)定地傳遞給子細胞。但在胚胎發(fā)育的不同時期，基因組范圍內(nèi)的DNA甲基化水平會發(fā)生劇烈的改變，改變最劇烈的階段為配子形成期與早期胚胎發(fā)育階段，甲基化模式在配子形成時已經(jīng)建立。DNA甲基化與胚胎發(fā)育第十三頁，共43頁。DNA甲基化在動物胚胎和生殖細胞發(fā)育過程中的重編程第十四頁，共43頁。CPGisland的功能：通過甲基化與去甲基化，調(diào)控下游基因的表達

——基因表達的調(diào)控開關(guān)轉(zhuǎn)錄抑制第十五頁，共43頁。影響基因表達直接抑制基因表達或甲基化的CpG雙核苷酸序列可被甲基結(jié)合蛋白家族識別，而后者可通過吸引補充組蛋白去乙酞化酶和組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶等組蛋白修飾蛋白質(zhì)來改變?nèi)旧|(zhì)的活性，以間接方式影響基因表達。第十六頁，共43頁。IAP:intracisternalAparticle去甲基化：灰鼠基因（agouti）僅微量表達甲基化：基因超量表達特征性表型基因的表達第十七頁，共43頁。X染色體的失活X染色體的失活（X-inactivation）：生長發(fā)育過程中，雌性哺乳類動物細胞中的兩條X染色體其中一條失去活性的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)失活的染色體上DNA序列都呈高度甲基化，導(dǎo)致絕大多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄處于關(guān)閉狀態(tài)。避免因擁有兩條X染色體而產(chǎn)生雙倍

基因產(chǎn)物，保持和雄性動物X染色體

數(shù)量及功能上的一致性。第十八頁，共43頁。基因組印記？組織或細胞中，基因的表達具有親本選擇性，即只有一個親本的等位基因表達，而另一親本的等位基因不表達或很少表達的現(xiàn)象，相應(yīng)的基因則稱為印記基因。父系不表達稱父系印記母系不表達稱母系印記基因印記第十九頁，共43頁。差異甲基化區(qū)域差異甲基化區(qū)域(differentiallymethylatedregion，DMR)，是指染色體上甲基化狀態(tài)具有親本特異性的區(qū)域，即來源于不同親本的DNA序列甲基化狀態(tài)不同的區(qū)域

差異甲基化主要發(fā)生在基因的啟動子區(qū)，少數(shù)在外顯子，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的印記基因大多數(shù)具有DMR或受DMR調(diào)控。第二十頁，共43頁。堿基CT突變堿基突變

甲基化突變第二十一頁，共43頁。腫瘤細胞發(fā)生時常出現(xiàn)DNA甲基化模式的變化，主要包括甲基化轉(zhuǎn)移酶表達水平的提高、基因組整體甲基化水平的降低和CpG島局部甲基化水平的異常升高，從而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，如染色質(zhì)構(gòu)象異常、轉(zhuǎn)座子激活、原癌基因激活表達以及抑癌基因被抑制表達等。DNA甲基化與腫瘤第二十二頁，共43頁。目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應(yīng)用4引言及概念31甲基化檢測相關(guān)技術(shù)33第二十三頁，共43頁。A．基因組甲基化水平(MethylationContent)的分析高效液相色譜高效毛細管電泳法B．候選基因(CandidateGene)甲基化分析

甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶-PCR/Southern法重亞硫酸鹽測序法甲基化特異性的PCR甲基化熒光法(MethyLight)焦磷酸測序

結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法甲基化檢測相關(guān)技術(shù)第二十四頁，共43頁。C.基因組范圍的DNA甲基化模式與甲基化譜分析

限制性標(biāo)記基因組掃描甲基化間區(qū)位點擴增甲基化CpG島擴增差異甲基化雜交由連接子介導(dǎo)PCR出的HpaII小片斷富集分析甲基化DNA免疫沉淀法

第二十五頁，共43頁。高效液相色譜法第二十六頁，共43頁。直接測序法第二十七頁，共43頁。焦磷酸測序法

通過檢測CpG對應(yīng)位點上C/T滲入的比例對目標(biāo)位點的甲基化程度進行定量分析，是目前最可靠的甲基化定量分析方法。第二十八頁，共43頁。全基因組甲基化圖譜全基因組甲基化測序（WGBS）第二十九頁，共43頁。芯片平臺

Illumina850K芯片可檢測人全基因組約853,307個CpG位點的甲基化狀態(tài)。850K芯片不但保持了對CpG島，基因啟動子區(qū)的全面覆蓋，還特別加強了增強子區(qū)以及基因編碼區(qū)的探針覆蓋。廣泛應(yīng)用于干細胞研究、腫瘤和其他復(fù)雜疾病研究，是目前最適合表觀基因組全關(guān)聯(lián)分析研究的全基因組DNA甲基化芯片。

Illumina850K芯片技術(shù)流程第三十頁，共43頁。第三十一頁，共43頁。目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應(yīng)用4引言及概念31甲基化檢測相關(guān)技術(shù)33第三十二頁，共43頁。正常生物DNA甲基化DNA甲基化始發(fā)于胚胎早期，隨著組織細胞分化發(fā)育，基因組DNA經(jīng)歷了去甲基化、區(qū)域性的重新甲基化以及組織特異基因選擇性的去甲基化的過程。最后，這種DNA甲基化模式就相對穩(wěn)定下來。第三十三頁，共43頁。腫瘤組織的DNA甲基化腫瘤中普遍存在DNA甲基化狀態(tài)的改變，其特點是總體的甲基化水平降低與局部的甲基化水平升高。腫瘤細胞的特征：癌基因低甲基化→被激活抑癌基因高甲基化→被沉默第三十四頁，共43頁。第三十五頁，共43頁。應(yīng)用前景1--腫瘤的早期診斷抑癌基因發(fā)生異常甲基化是在腫瘤早期就發(fā)生而且一直進行的，導(dǎo)致惡性腫瘤表型的表達優(yōu)點：DNA甲基化檢測具有早期、無創(chuàng)、快捷、靈敏度高等特點。（血液、粘膜上皮標(biāo)本）缺點：特異性不足第三十六頁，共43頁。表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)記開發(fā)2017年3月，張鹍教授團隊在NatureGenetics（NG）雜志發(fā)布了令人振奮的研究成果，利用更靈敏的算法配合組織甲基化模式開發(fā)的無創(chuàng)診斷技術(shù)，可以檢測并定位腫瘤。通過比較腫瘤和正常細胞的DNA甲基化數(shù)據(jù)找到腫瘤特異的甲基化Marker。第三十七頁，共43頁。

燃石醫(yī)學(xué)自主研發(fā)了無創(chuàng)甲基化檢測系統(tǒng)(MERMAID?)，運用多層級甲基化探針設(shè)計策略，可實現(xiàn)在檢測成本可控的情況下同時檢測超過10萬個臨床診斷相關(guān)的甲基化CpG位點，并通過機器學(xué)習(xí)算法建立分類模型，實現(xiàn)對檢測樣本自動分型。

cfDNA無創(chuàng)甲基化檢測系統(tǒng)(MERMAID?)用于肺部占位病變（含肺癌）的早篩可實現(xiàn)99.6%的敏感性和100%的特異性，用于肺部結(jié)節(jié)良惡性判定可實84.8%的敏感性和87.5%的特異性。cfDNA甲基化液體活檢技術(shù)第三十八頁，共43頁。應(yīng)用前景2--腫瘤復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測因子口腔鱗狀細胞癌時存在RECK基因甲基化的患者復(fù)發(fā)率明顯增高甲基化影響生存期膀胱癌中APC、GSTP1和TIG1基因發(fā)生異常甲基化時，患者存活時間明顯縮短LONGNK,etal.HypermethylationoftheRECKgenepredictspoorprognosisinoralsquamouscellcarcinomas[J].OralOncol,2008,44(11):1052-1058.ELLINGERJ,etal.HypermethylationofCell-FreeSerumDNAIndicatesWorseOutcomeinPatientsWithBladderCancer.JUrol,2008,179(1):346-352.第三十九頁，共43頁。應(yīng)用前景3--腫瘤的去甲基化治療DNA甲基化程度依賴于DNMT活性。正常甲基化模式的建立需要DNMT1和DNMT3的共同作用，DNMT1是DNMT3啟動CpG核苷酸從頭甲基化的保證，而DNMT3則使甲基化水平穩(wěn)定在正常需要水平（去甲基化）——抑制DNMT活性藥物是治療腫瘤的新希望第四十頁，共43頁。優(yōu)點：新型抗腫瘤藥物缺點：無基因特異性,不能選擇性地活化沉默的目的基因，從而會引起整體的低甲基化;藥物的活化作用可逆，療效依賴于藥物的持續(xù)存在;大劑量應(yīng)用時會對正常細胞有毒副作用—是否會誘發(fā)第二腫瘤？應(yīng)用前景3--腫瘤的去甲基化治療第四十一頁，共43