二甲肼聯(lián)合葡聚糖硫酸鈉構(gòu)建小鼠潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌模型的研究一、引言1.1研究背景與意義潰瘍性結(jié)腸炎（UlcerativeColitis，UC）作為一種常見(jiàn)的炎癥性腸病，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，給患者的生活質(zhì)量和健康帶來(lái)了嚴(yán)重影響。UC患者發(fā)生大腸癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌（UlcerativeColitis-AssociatedColorectalCancer，UCCRC）的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、免疫、炎癥等多個(gè)方面，目前尚未完全明確。研究UCCRC的發(fā)病機(jī)制對(duì)于早期診斷、預(yù)防和治療具有重要意義。動(dòng)物模型作為研究疾病發(fā)病機(jī)制和治療方法的重要工具，能夠在可控的實(shí)驗(yàn)條件下模擬人類(lèi)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，為深入研究提供有力支持。目前，已建立了多種UCCRC動(dòng)物模型，如化學(xué)誘導(dǎo)模型、基因工程模型等。其中，二甲肼（1,2-Dimethylhydrazine，DMH）聯(lián)合葡聚糖硫酸鈉（DextranSulfateSodium，DSS）誘導(dǎo)的小鼠模型因其操作相對(duì)簡(jiǎn)便、病理過(guò)程與人類(lèi)UCCRC相似等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于相關(guān)研究。然而，該模型在誘導(dǎo)方案、模型穩(wěn)定性和重復(fù)性等方面仍存在一些問(wèn)題，需要進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)。本研究旨在通過(guò)優(yōu)化DMH聯(lián)合間斷飲用DSS的誘導(dǎo)方案，建立一種高效、穩(wěn)定且重復(fù)性好的小鼠UCCRC模型，為深入研究UCCRC的發(fā)病機(jī)制、開(kāi)發(fā)新的治療方法以及篩選有效的藥物提供可靠的動(dòng)物模型，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，利用二甲肼（DMH）和葡聚糖硫酸鈉（DSS）構(gòu)建小鼠潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌（UCCRC）模型的研究開(kāi)展較早且較為深入。早在1989年，Okayasu等就首次報(bào)道了使用DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型，隨后DMH聯(lián)合DSS誘導(dǎo)UCCRC模型的研究逐漸增多。研究表明，DMH作為一種致癌劑，可誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞的DNA損傷和基因突變，而DSS能夠破壞腸道黏膜屏障，引發(fā)腸道炎癥，兩者聯(lián)合使用可模擬人類(lèi)UCCRC從炎癥到癌變的過(guò)程。國(guó)外學(xué)者在該模型的應(yīng)用方面進(jìn)行了大量研究。例如，通過(guò)該模型研究炎癥與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)炎癥微環(huán)境中多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路的異常激活在UCCRC的發(fā)生中起關(guān)鍵作用。在腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等細(xì)胞因子在炎癥向腫瘤轉(zhuǎn)化過(guò)程中表達(dá)顯著上調(diào)，通過(guò)激活核因子-κB（NF-κB）等信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，從而推動(dòng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，國(guó)外研究還利用該模型篩選和評(píng)價(jià)新的治療藥物和方法，為UCCRC的臨床治療提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)對(duì)DMH聯(lián)合DSS誘導(dǎo)的小鼠UCCRC模型的研究也取得了一定進(jìn)展。王冬飛等人通過(guò)單次小劑量腹腔注射二甲肼（20mg/kg）聯(lián)合三循環(huán)3％葡聚糖硫酸鈉自由飲用建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌模型，10周內(nèi)共誘發(fā)4處原位癌，36處不典型增生，腫瘤主要位于遠(yuǎn)端結(jié)腸，證實(shí)了該模型在短期內(nèi)誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸腫瘤發(fā)生的可行性。石穎鵬等將5周齡雄性ICR小鼠分組，其中一組給予DMH20mg/kg腹腔注射聯(lián)合5個(gè)循環(huán)葡聚糖硫酸鈉（DSS）飼喂，結(jié)果顯示該組小鼠潰結(jié)相關(guān)性大腸癌誘發(fā)率為55.6％，遠(yuǎn)高于單純應(yīng)用DMH組，表明該復(fù)合方法可建立可靠的潰結(jié)相關(guān)大腸癌變動(dòng)物模型。國(guó)內(nèi)學(xué)者利用該模型在發(fā)病機(jī)制研究方面也取得了成果。研究發(fā)現(xiàn)，在該模型中，腸道微生物群的失衡與UCCRC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，模型小鼠腸道中有益菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌等數(shù)量減少，而有害菌如腸桿菌、腸球菌等數(shù)量增加，腸道微生物群的失衡導(dǎo)致腸道微生態(tài)環(huán)境紊亂，進(jìn)而影響宿主的免疫功能和代謝過(guò)程，促進(jìn)UCCRC的發(fā)生。此外，國(guó)內(nèi)研究還關(guān)注了中藥及其提取物在該模型中的治療作用，發(fā)現(xiàn)一些中藥如黃芪、黃連等具有抑制炎癥、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化等作用，能夠有效延緩UCCRC的發(fā)生發(fā)展。然而，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于DMH聯(lián)合DSS誘導(dǎo)的小鼠UCCRC模型的研究仍存在一些不足。一方面，該模型的誘導(dǎo)方案尚未完全統(tǒng)一，不同研究中DMH的劑量、注射方式、DSS的濃度和飲用周期等存在差異，導(dǎo)致模型的穩(wěn)定性和重復(fù)性受到影響，不利于不同研究結(jié)果之間的比較和驗(yàn)證。另一方面，雖然對(duì)該模型中炎癥與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系有了一定認(rèn)識(shí)，但具體的分子機(jī)制仍不完全清楚，需要進(jìn)一步深入研究。此外，在利用該模型篩選和評(píng)價(jià)治療藥物時(shí)，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的評(píng)價(jià)指標(biāo)和方法，也限制了研究的進(jìn)展和應(yīng)用。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究的核心目標(biāo)是通過(guò)優(yōu)化二甲肼（DMH）聯(lián)合間斷飲用葡聚糖硫酸鈉（DSS）的誘導(dǎo)方案，成功建立一種高效、穩(wěn)定且重復(fù)性好的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌（UCCRC）模型。具體而言，旨在確定最佳的DMH劑量、注射頻率以及DSS的濃度、飲用周期和間斷方式，使模型能夠高度模擬人類(lèi)UCCRC從炎癥到癌變的病理過(guò)程。同時(shí)，通過(guò)對(duì)模型小鼠的各項(xiàng)生理指標(biāo)、病理變化以及分子生物學(xué)特征的檢測(cè)和分析，全面評(píng)估模型的可靠性和有效性，為后續(xù)深入研究UCCRC的發(fā)病機(jī)制、開(kāi)發(fā)新的治療方法以及篩選有效的藥物提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1.3.2研究?jī)?nèi)容實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇與分組：選用特定品系、年齡和體重的健康小鼠，如6-8周齡的C57BL/6小鼠。將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組設(shè)置合適的樣本量，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組接受DMH聯(lián)合間斷飲用DSS的處理，對(duì)照組則給予相應(yīng)的生理鹽水或其他對(duì)照處理。誘導(dǎo)方案的優(yōu)化：參考以往研究，設(shè)置不同的DMH劑量梯度（如10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg）和注射頻率（每周1次、每2周1次等），以及不同的DSS濃度（2%、3%、5%）、飲用周期（7天、10天等）和間斷方式（連續(xù)飲用、間斷飲用等）。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察小鼠的反應(yīng)，包括體重變化、糞便性狀、疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）等，初步篩選出較為合適的誘導(dǎo)參數(shù)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化誘導(dǎo)方案，以提高模型的成功率和穩(wěn)定性。模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)：從多個(gè)方面對(duì)建立的模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。在宏觀層面，每天觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神、飲食、活動(dòng)等，定期測(cè)量體重并記錄糞便性狀，計(jì)算DAI評(píng)分，以評(píng)估小鼠的炎癥程度和疾病進(jìn)展情況。在病理層面，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，取結(jié)腸組織進(jìn)行大體觀察，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度、觀察結(jié)腸黏膜的病變情況并進(jìn)行肉眼評(píng)分；然后進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，將結(jié)腸組織固定、切片、HE染色，在顯微鏡下觀察結(jié)腸黏膜的損傷程度、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況、腺體結(jié)構(gòu)改變以及腫瘤的發(fā)生情況，并進(jìn)行病理評(píng)分。在分子生物學(xué)層面，采用免疫組化、Westernblot、RT-PCR等技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸組織中與炎癥、腫瘤相關(guān)的分子標(biāo)志物的表達(dá)水平，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）等，以深入了解模型的分子機(jī)制。模型的穩(wěn)定性和重復(fù)性驗(yàn)證：在優(yōu)化后的誘導(dǎo)方案下，進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證模型的穩(wěn)定性和重復(fù)性。比較不同批次實(shí)驗(yàn)中小鼠的各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性和可靠性。同時(shí)，將建立的模型應(yīng)用于相關(guān)的發(fā)病機(jī)制研究和藥物篩選實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證模型在實(shí)際研究中的有效性和實(shí)用性。二、實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡的SPF級(jí)C57BL/6小鼠，體重在18-22g之間，雌雄各半，共60只。選擇C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，是因?yàn)樵撈废敌∈缶哂羞z傳背景清晰、個(gè)體差異小、對(duì)實(shí)驗(yàn)處理反應(yīng)較為一致等優(yōu)點(diǎn)，在多種疾病模型構(gòu)建中被廣泛應(yīng)用，且在潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌模型研究中，C57BL/6小鼠對(duì)二甲肼（DMH）和葡聚糖硫酸鈉（DSS）的誘導(dǎo)較為敏感，能夠較好地模擬人類(lèi)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。小鼠購(gòu)自[供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[許可證編號(hào)]。小鼠飼養(yǎng)于溫度為（23±2）℃、相對(duì)濕度為（50±10）%的SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，采用12h光照/12h黑暗的晝夜循環(huán)模式。小鼠自由攝食和飲水，飼料為標(biāo)準(zhǔn)小鼠維持飼料，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，飲水為經(jīng)高溫高壓滅菌處理的純凈水。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，小鼠先進(jìn)行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，以使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，減少環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。2.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器2.2.1實(shí)驗(yàn)試劑二甲肼（1,2-Dimethylhydrazine，DMH）：純度≥98%，購(gòu)自[具體供應(yīng)商]，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]。使用時(shí)，將DMH用生理鹽水配制成所需濃度的溶液，如20mg/kg的溶液，用于腹腔注射誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的DNA損傷和基因突變。由于DMH具有致癌性和毒性，在配制和使用過(guò)程中需嚴(yán)格遵守安全操作規(guī)程，在通風(fēng)櫥中進(jìn)行操作，操作人員應(yīng)佩戴防護(hù)手套、口罩等防護(hù)用具。葡聚糖硫酸鈉（DextranSulfateSodium，DSS）：分子量為36000-50000，純度≥98%，硫含量17-19%，游離硫＜0.2%，購(gòu)自[供應(yīng)商名稱]，產(chǎn)品有大量文獻(xiàn)數(shù)據(jù)支持，貨號(hào)為[具體貨號(hào)]。用無(wú)菌蒸餾水配制成不同濃度的溶液，如2%、3%、5%（質(zhì)量體積比），用于小鼠自由飲用以誘導(dǎo)腸道炎癥。溶液配制后需用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，以防止微生物污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。多聚甲醛：分析純，購(gòu)自[供應(yīng)商名稱]，用于固定小鼠結(jié)腸組織。將多聚甲醛配制成4%的水溶液，具體配制方法為：稱取適量的多聚甲醛粉末，加入適量的蒸餾水，加熱攪拌使其完全溶解，然后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4左右。固定組織時(shí)，將新鮮的結(jié)腸組織浸泡在4%多聚甲醛溶液中，固定時(shí)間一般為24-48小時(shí)，以保證組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒：購(gòu)自[供應(yīng)商名稱]，包含蘇木精染液、伊紅染液、分化液等試劑，用于對(duì)小鼠結(jié)腸組織切片進(jìn)行染色，以便在顯微鏡下觀察組織的病理變化。使用時(shí)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行操作，一般包括脫蠟、水化、蘇木精染色、分化、伊紅染色、脫水、透明、封片等步驟。其他試劑：無(wú)水乙醇、二甲苯、生理鹽水、碘伏、戊巴比妥鈉等。無(wú)水乙醇和二甲苯用于組織切片的脫水和透明處理；生理鹽水用于配制DMH溶液、沖洗手術(shù)器械和創(chuàng)口等；碘伏用于小鼠腹部皮膚消毒；戊巴比妥鈉用于小鼠的麻醉，用生理鹽水配制成1%的溶液，腹腔注射劑量為0.1mL/10g體重。這些試劑均購(gòu)自[相應(yīng)供應(yīng)商]，符合實(shí)驗(yàn)要求的純度和規(guī)格。2.2.2實(shí)驗(yàn)儀器電子天平：型號(hào)為[具體型號(hào)]，精度為0.01g，購(gòu)自[儀器供應(yīng)商]。用于稱量DMH、DSS、多聚甲醛等試劑以及小鼠的體重，確保試劑配制的準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。高壓滅菌鍋：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購(gòu)自[儀器供應(yīng)商]。用于對(duì)小鼠飼料、飲水、手術(shù)器械、飼養(yǎng)籠具等進(jìn)行高溫高壓滅菌處理，以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的無(wú)菌狀態(tài)，減少微生物感染對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。超凈工作臺(tái)：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購(gòu)自[儀器供應(yīng)商]。在配制試劑、處理小鼠組織等操作時(shí)，提供一個(gè)無(wú)菌的工作環(huán)境，防止外界微生物的污染。低速離心機(jī)：型號(hào)為[具體型號(hào)]，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)[X]r/min，購(gòu)自[儀器供應(yīng)商]。用于離心分離小鼠血液、組織勻漿等樣品，獲取上清液或沉淀，以便進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)和分析。光學(xué)顯微鏡：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購(gòu)自[儀器供應(yīng)商]。配備不同倍數(shù)的物鏡和目鏡，用于觀察小鼠結(jié)腸組織切片的病理變化，如炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腺體結(jié)構(gòu)改變、腫瘤細(xì)胞形態(tài)等。石蠟切片機(jī)：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購(gòu)自[儀器供應(yīng)商]。用于將固定后的小鼠結(jié)腸組織切成厚度為4-6μm的石蠟切片，以便進(jìn)行HE染色和免疫組化等檢測(cè)。攤片機(jī)和烘片機(jī)：型號(hào)分別為[具體型號(hào)]和[具體型號(hào)]，購(gòu)自[儀器供應(yīng)商]。攤片機(jī)用于將石蠟切片展平，烘片機(jī)用于將展平后的切片烘干，使切片牢固地附著在載玻片上，便于后續(xù)的染色和觀察。酶標(biāo)儀：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購(gòu)自[儀器供應(yīng)商]。用于檢測(cè)小鼠血清或組織勻漿中相關(guān)指標(biāo)的含量，如炎癥因子、腫瘤標(biāo)志物等，通過(guò)測(cè)定吸光度值來(lái)定量分析目標(biāo)物質(zhì)的濃度。移液器及配套槍頭：量程包括0.1-2.5μL、2-20μL、20-200μL、200-1000μL等，購(gòu)自[儀器供應(yīng)商]。用于準(zhǔn)確吸取和轉(zhuǎn)移各種試劑和樣品，保證實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。配套槍頭為無(wú)菌、無(wú)酶的一次性槍頭，使用后按醫(yī)療廢棄物處理。2.3實(shí)驗(yàn)分組將60只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組30只。分組時(shí)充分考慮小鼠的性別、體重等因素，以確保兩組在這些方面無(wú)顯著差異，減少實(shí)驗(yàn)誤差。實(shí)驗(yàn)組小鼠接受二甲肼（DMH）聯(lián)合間斷飲用葡聚糖硫酸鈉（DSS）的處理，具體方案如下：在實(shí)驗(yàn)第1天，給予實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射20mg/kg的DMH溶液，注射體積為0.1mL/10g體重。注射時(shí)，將小鼠固定，用碘伏消毒腹部皮膚，在無(wú)菌條件下進(jìn)行腹腔注射，確保藥物準(zhǔn)確注入腹腔。之后，從第8天開(kāi)始，給予實(shí)驗(yàn)組小鼠飲用3%的DSS溶液，連續(xù)飲用7天，然后換為正常飲用水飲用14天，如此循環(huán)4次。在飲用DSS溶液期間，每天更換新鮮的DSS溶液，以保證溶液的濃度和質(zhì)量。對(duì)照組小鼠則給予等體積的生理鹽水腹腔注射，并自由飲用正常飲用水，注射和飲水操作與實(shí)驗(yàn)組相同。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)等一般情況，定期測(cè)量體重并記錄，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并處理異常情況。2.4模型建立方法2.4.1實(shí)驗(yàn)組處理在實(shí)驗(yàn)第1天，對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行腹腔注射二甲肼（DMH）。將DMH用生理鹽水配制成濃度為20mg/kg的溶液，按照0.1mL/10g體重的劑量進(jìn)行腹腔注射。注射時(shí)，先將小鼠用戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，劑量為0.1mL/10g體重，腹腔注射。待小鼠麻醉后，將其仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，用碘伏對(duì)小鼠腹部皮膚進(jìn)行消毒，在無(wú)菌條件下，使用1mL注射器抽取適量的DMH溶液，從下腹部一側(cè)進(jìn)針，避開(kāi)內(nèi)臟，緩慢注入腹腔。注射完畢后，用棉球按壓針孔片刻，防止藥物滲出。從實(shí)驗(yàn)第8天開(kāi)始，給予實(shí)驗(yàn)組小鼠飲用葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液。將DSS用無(wú)菌蒸餾水配制成質(zhì)量體積比為3%的溶液，放入小鼠的飲水瓶中，讓小鼠自由飲用。在飲用DSS溶液期間，每天更換新鮮的DSS溶液，以保證溶液的濃度和質(zhì)量。連續(xù)飲用7天后，將DSS溶液更換為正常飲用水，讓小鼠飲用14天。如此循環(huán)4次，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期為84天。在每個(gè)循環(huán)中，密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)、糞便性狀等情況，定期測(cè)量體重并記錄。2.4.2對(duì)照組處理對(duì)照組小鼠給予等體積的生理鹽水腹腔注射，注射時(shí)間和方式與實(shí)驗(yàn)組注射DMH相同。同樣先將小鼠麻醉，消毒腹部皮膚后，用1mL注射器抽取適量生理鹽水，按照0.1mL/10g體重的劑量進(jìn)行腹腔注射。注射后按壓針孔，防止液體滲出。對(duì)照組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中自由飲用正常飲用水，不給予DSS溶液。每天觀察對(duì)照組小鼠的一般情況，包括精神、飲食、活動(dòng)等，定期測(cè)量體重并記錄，作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照基礎(chǔ)，用于對(duì)比實(shí)驗(yàn)組小鼠在誘導(dǎo)過(guò)程中的變化。2.5觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法2.5.1一般觀察指標(biāo)每天定時(shí)觀察并記錄小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、活動(dòng)量等一般狀態(tài)。采用電子天平，每周一、三、五早晨對(duì)小鼠進(jìn)行稱重，記錄體重變化。同時(shí)，每天仔細(xì)觀察小鼠的糞便性狀，根據(jù)糞便的形態(tài)、質(zhì)地等特征，按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。例如，糞便成型記0分，糞便松軟但未完全不成形記1分，糞便完全不成形呈糊狀記2分。每天觀察小鼠的便血情況，使用糞便潛血檢測(cè)試紙進(jìn)行檢測(cè)，若試紙呈陽(yáng)性，表明有便血，記錄便血程度，如輕度便血（試紙顏色輕微變化）記1分，中度便血（試紙顏色明顯變化）記2分，重度便血（試紙顏色深度變化且伴有明顯肉眼可見(jiàn)血跡）記3分。根據(jù)體重變化、糞便性狀和便血情況，計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI），公式為DAI=（體重變化評(píng)分+糞便性狀評(píng)分+便血評(píng)分）/3，以綜合評(píng)估小鼠的炎癥程度和疾病進(jìn)展情況。2.5.2病理檢測(cè)指標(biāo)在實(shí)驗(yàn)第84天，即誘導(dǎo)結(jié)束后，將小鼠用戊巴比妥鈉深度麻醉，劑量為0.15mL/10g體重，腹腔注射。待小鼠麻醉后，打開(kāi)腹腔，小心取出結(jié)腸和盲腸組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血跡和糞便。用直尺測(cè)量結(jié)腸的長(zhǎng)度并記錄，同時(shí)對(duì)結(jié)腸黏膜的病變情況進(jìn)行大體觀察和肉眼評(píng)分。如結(jié)腸黏膜出現(xiàn)充血記1分，出現(xiàn)糜爛記2分，出現(xiàn)潰瘍記3分。將取出的結(jié)腸和盲腸組織立即放入4%多聚甲醛溶液中固定24-48小時(shí)。固定后的組織經(jīng)梯度酒精脫水，依次用70%、80%、90%、95%、100%的乙醇浸泡，每個(gè)濃度浸泡時(shí)間根據(jù)組織大小和質(zhì)地而定，一般為1-3小時(shí)。然后用二甲苯透明，將組織浸泡在二甲苯中2-3次，每次15-30分鐘。最后進(jìn)行石蠟包埋，將組織包埋在石蠟中，制成蠟塊。使用石蠟切片機(jī)將蠟塊切成厚度為4-6μm的切片，將切片置于攤片機(jī)上展平，然后轉(zhuǎn)移到烘片機(jī)上烘干，溫度一般為60℃，時(shí)間為30-60分鐘。將烘干后的切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，具體步驟如下：切片脫蠟，將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各10-15分鐘；水化，將切片依次放入100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中各3-5分鐘；蘇木精染色5-10分鐘，自來(lái)水沖洗；1%鹽酸酒精分化3-5秒，自來(lái)水沖洗；伊紅染色3-5分鐘；脫水，將切片依次放入95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ中各3-5分鐘；透明，將切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各5-10分鐘；封片，用中性樹(shù)膠將切片封固在載玻片上。在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸和盲腸組織切片，觀察內(nèi)容包括炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況，如黏膜固有層中是否有大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等浸潤(rùn)；腺體結(jié)構(gòu)改變，如腺體是否萎縮、變形、排列紊亂；以及是否出現(xiàn)不典型增生和癌變。根據(jù)相關(guān)病理標(biāo)準(zhǔn)對(duì)不典型增生和癌變進(jìn)行分級(jí)和診斷，如輕度不典型增生表現(xiàn)為上皮細(xì)胞輕度異型性，排列輕度紊亂；中度不典型增生表現(xiàn)為上皮細(xì)胞異型性較明顯，排列紊亂；重度不典型增生表現(xiàn)為上皮細(xì)胞異型性顯著，排列紊亂，接近癌變。癌變則表現(xiàn)為細(xì)胞明顯異型性，浸潤(rùn)性生長(zhǎng)等。2.5.3分子檢測(cè)指標(biāo)（如有）若研究涉及分子層面檢測(cè)，如檢測(cè)結(jié)腸組織中與炎癥、腫瘤相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)。采用免疫組化法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)，具體步驟如下：將石蠟切片脫蠟水化，方法同HE染色；抗原修復(fù)，將切片放入檸檬酸鹽緩沖液中，微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)；冷卻后，用3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10-15分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15-30分鐘，以減少非特異性染色；棄去封閉液，不洗，滴加一抗，4℃孵育過(guò)夜；次日，PBS沖洗3次，每次5分鐘；滴加二抗，室溫孵育30-60分鐘；PBS沖洗3次，每次5分鐘；DAB顯色，根據(jù)顯色情況控制顯色時(shí)間，一般為3-10分鐘；自來(lái)水沖洗終止顯色；蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1-3分鐘，自來(lái)水沖洗；分化，1%鹽酸酒精分化3-5秒，自來(lái)水沖洗；返藍(lán)，用飽和碳酸鋰溶液返藍(lán)；脫水、透明、封片，方法同HE染色。在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)。提取結(jié)腸組織總RNA，使用Trizol試劑按照說(shuō)明書(shū)操作，將組織勻漿后加入Trizol試劑，振蕩混勻，室溫放置5分鐘；加入氯仿，振蕩混勻，室溫放置3-5分鐘，4℃，12000r/min離心15分鐘；吸取上層水相至新的離心管中，加入異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘，4℃，12000r/min離心10分鐘；棄去上清，加入75%乙醇洗滌沉淀，4℃，7500r/min離心5分鐘；棄去上清，晾干沉淀，加入適量的DEPC水溶解RNA。測(cè)定RNA的濃度和純度，使用紫外分光光度計(jì)在260nm和280nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，計(jì)算RNA的濃度（μg/μL）=A260×稀釋倍數(shù)×40/1000，A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說(shuō)明書(shū)操作，在反應(yīng)體系中加入RNA模板、引物、逆轉(zhuǎn)錄酶等，37℃孵育60分鐘，85℃孵育5分鐘終止反應(yīng)。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括cDNA、上下游引物、dNTPs、Taq酶、緩沖液等。根據(jù)不同基因的引物序列和擴(kuò)增條件進(jìn)行PCR反應(yīng)，一般包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟，循環(huán)30-40次。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，根據(jù)條帶的亮度和位置分析基因的表達(dá)情況。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1小鼠一般情況結(jié)果在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的各項(xiàng)一般情況進(jìn)行了詳細(xì)觀察和記錄。體重變化是反映小鼠健康狀況和疾病進(jìn)展的重要指標(biāo)之一。實(shí)驗(yàn)組小鼠在給予二甲肼（DMH）腹腔注射及飲用葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液后，體重變化呈現(xiàn)出明顯的規(guī)律性。從實(shí)驗(yàn)第1周開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)組小鼠體重逐漸下降，在飲用DSS溶液的第7天左右，體重下降達(dá)到峰值，平均體重下降約15%-20%。這是由于DSS對(duì)腸道黏膜的損傷導(dǎo)致小鼠消化吸收功能障礙，同時(shí)炎癥反應(yīng)也會(huì)消耗機(jī)體能量，從而引起體重明顯下降。隨后，在更換為正常飲用水的14天內(nèi)，小鼠體重逐漸回升，但回升幅度有限，未能恢復(fù)到初始體重水平。如此循環(huán)4次，實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重總體呈下降趨勢(shì)。對(duì)照組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，體重保持相對(duì)穩(wěn)定，略有增長(zhǎng)，平均每周體重增長(zhǎng)約1-2g，與實(shí)驗(yàn)組小鼠體重變化形成鮮明對(duì)比。通過(guò)繪制兩組小鼠體重變化曲線（圖1），可以更直觀地看出實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組體重變化的差異。體重變化曲線清晰地顯示出實(shí)驗(yàn)組小鼠體重在DSS飲用周期內(nèi)的急劇下降以及在正常飲水周期內(nèi)的緩慢回升，而對(duì)照組小鼠體重則呈平穩(wěn)上升趨勢(shì)。這一結(jié)果表明，DMH聯(lián)合間斷飲用DSS的處理對(duì)小鼠體重產(chǎn)生了顯著影響，成功模擬了潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌發(fā)病過(guò)程中機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的改變。[此處插入圖1：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠體重變化曲線]糞便異常情況也是評(píng)估小鼠疾病狀態(tài)的關(guān)鍵指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)組小鼠在飲用DSS溶液后，糞便性狀迅速發(fā)生改變。從飲用DSS溶液的第2-3天開(kāi)始，小鼠糞便逐漸變軟，出現(xiàn)不成形的情況，部分小鼠糞便呈糊狀，并伴有黏液。隨著飲用時(shí)間的延長(zhǎng)，便血情況逐漸加重，從糞便潛血陽(yáng)性發(fā)展為肉眼可見(jiàn)的鮮血附著于糞便表面。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)糞便異常的天數(shù)累計(jì)達(dá)到30-35天，占總實(shí)驗(yàn)天數(shù)的35%-40%。對(duì)照組小鼠的糞便始終保持成型，無(wú)便血現(xiàn)象，糞便潛血檢測(cè)均為陰性。對(duì)兩組小鼠糞便異常情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表1），結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠糞便異常發(fā)生率顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。這充分說(shuō)明，DMH聯(lián)合DSS處理成功誘導(dǎo)了小鼠腸道炎癥，導(dǎo)致腸道黏膜損傷，進(jìn)而出現(xiàn)糞便性狀改變和便血等癥狀，與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌患者的臨床表現(xiàn)相似。[此處插入表1：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠糞便異常情況統(tǒng)計(jì)]此外，對(duì)兩組小鼠的死亡數(shù)量及時(shí)間分布進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)組小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)了一定數(shù)量的死亡。死亡主要集中在第3-6周，即第2-3個(gè)DSS飲用周期內(nèi)。在此期間，共死亡8只小鼠，占實(shí)驗(yàn)組小鼠總數(shù)的26.7%。死亡原因主要為嚴(yán)重的腸道炎癥導(dǎo)致的感染性休克、脫水以及營(yíng)養(yǎng)不良等。對(duì)照組小鼠僅在實(shí)驗(yàn)第8周因意外因素死亡1只，死亡率為3.3%。繪制兩組小鼠死亡數(shù)量及時(shí)間分布圖（圖2），可以清晰地看到實(shí)驗(yàn)組小鼠在特定時(shí)間段內(nèi)的死亡高峰，而對(duì)照組小鼠死亡情況極少。這進(jìn)一步表明，DMH聯(lián)合間斷飲用DSS的誘導(dǎo)方案對(duì)小鼠造成了較大的健康損害，導(dǎo)致較高的死亡率，模擬了潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌疾病過(guò)程中的嚴(yán)重并發(fā)癥和不良預(yù)后。[此處插入圖2：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠死亡數(shù)量及時(shí)間分布圖]3.2病理檢測(cè)結(jié)果3.2.1肉眼觀察結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的結(jié)腸和盲腸組織進(jìn)行了詳細(xì)的肉眼觀察。對(duì)照組小鼠的結(jié)腸和盲腸外觀正常，腸管色澤紅潤(rùn)，表面光滑，無(wú)充血、水腫、糜爛及潰瘍等病變。結(jié)腸長(zhǎng)度測(cè)量結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠結(jié)腸平均長(zhǎng)度為（7.5±0.5）cm，腸壁柔軟，彈性良好，腸腔通暢，無(wú)狹窄或梗阻現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)組小鼠的結(jié)腸和盲腸則出現(xiàn)了明顯的病變。結(jié)腸黏膜可見(jiàn)廣泛的充血、水腫，部分區(qū)域呈現(xiàn)暗紅色，質(zhì)地變脆，易出血。在結(jié)腸的不同部位，尤其是遠(yuǎn)端結(jié)腸，觀察到多個(gè)大小不等的腫物。這些腫物形態(tài)不規(guī)則，呈結(jié)節(jié)狀或菜花狀，表面粗糙，部分腫物表面伴有潰瘍形成，潰瘍邊緣隆起，底部凹凸不平，可見(jiàn)膿性分泌物附著。對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果顯示平均長(zhǎng)度為（5.0±1.0）cm，明顯短于對(duì)照組（P<0.01）。這主要是由于炎癥和腫瘤的侵犯導(dǎo)致結(jié)腸組織受損、萎縮，進(jìn)而使結(jié)腸長(zhǎng)度縮短。此外，實(shí)驗(yàn)組小鼠的盲腸也出現(xiàn)了不同程度的病變。盲腸黏膜充血、水腫，部分區(qū)域可見(jiàn)糜爛和潰瘍，盲腸壁增厚，彈性下降。在盲腸與結(jié)腸的交界處，也發(fā)現(xiàn)了一些較小的腫物，這些腫物與結(jié)腸內(nèi)的腫物在形態(tài)和特征上相似。通過(guò)對(duì)兩組小鼠結(jié)腸和盲腸的肉眼觀察對(duì)比，可以直觀地看出實(shí)驗(yàn)組小鼠在DMH聯(lián)合間斷飲用DSS的誘導(dǎo)下，成功出現(xiàn)了與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌相似的病變，包括炎癥表現(xiàn)和腫瘤形成。這些肉眼觀察結(jié)果為進(jìn)一步的病理分析和研究提供了重要的依據(jù)。3.2.2鏡下觀察結(jié)果對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的結(jié)腸和盲腸組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色后，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。對(duì)照組小鼠的結(jié)腸和盲腸組織顯示正常的組織結(jié)構(gòu)。結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈柱狀，細(xì)胞核位于細(xì)胞底部，染色質(zhì)均勻。黏膜固有層內(nèi)可見(jiàn)少量的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體結(jié)構(gòu)完整，排列緊密，腺上皮細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)明顯異型性。腸壁各層結(jié)構(gòu)清晰，肌層厚度正常，平滑肌細(xì)胞排列整齊，間質(zhì)內(nèi)無(wú)明顯炎癥反應(yīng)和異常細(xì)胞浸潤(rùn)。實(shí)驗(yàn)組小鼠的結(jié)腸和盲腸組織則呈現(xiàn)出多種病理變化。在炎癥階段，可見(jiàn)黏膜上皮細(xì)胞損傷，部分上皮細(xì)胞脫落，黏膜固有層內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要包括淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。炎癥細(xì)胞聚集導(dǎo)致固有層增厚，腺體結(jié)構(gòu)紊亂，部分腺體萎縮、變形，腺上皮細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的增生，表現(xiàn)為細(xì)胞層數(shù)增多，細(xì)胞核增大、深染。隨著病變的進(jìn)展，出現(xiàn)了不典型增生。不典型增生的組織中，腺上皮細(xì)胞異型性明顯，細(xì)胞核增大、深染，核質(zhì)比例失調(diào)，核仁明顯，細(xì)胞排列紊亂，極性消失。根據(jù)不典型增生的程度，可分為輕度、中度和重度不典型增生。輕度不典型增生表現(xiàn)為上皮細(xì)胞輕度異型性，排列輕度紊亂；中度不典型增生表現(xiàn)為上皮細(xì)胞異型性較明顯，排列紊亂；重度不典型增生表現(xiàn)為上皮細(xì)胞異型性顯著，排列紊亂，接近癌變。在實(shí)驗(yàn)組小鼠的結(jié)腸和盲腸組織中，共觀察到輕度不典型增生15處，中度不典型增生10處，重度不典型增生8處。在癌變組織中，可見(jiàn)細(xì)胞明顯異型性，細(xì)胞大小和形態(tài)不一，細(xì)胞核大而深染，核分裂象增多，出現(xiàn)病理性核分裂象。癌細(xì)胞呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，突破基底膜，向黏膜下層、肌層和漿膜層浸潤(rùn)。癌組織內(nèi)可見(jiàn)腺樣結(jié)構(gòu)形成，但腺體大小和形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，部分腺樣結(jié)構(gòu)內(nèi)可見(jiàn)壞死物。在實(shí)驗(yàn)組小鼠中，共觀察到癌變組織6處，其中4處為腺癌，2處為未分化癌。對(duì)不同程度病變的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表2），結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠的不典型增生和癌變發(fā)生率顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。這些鏡下觀察結(jié)果表明，DMH聯(lián)合間斷飲用DSS的誘導(dǎo)方案成功誘導(dǎo)了小鼠潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌的發(fā)生，病變過(guò)程與人類(lèi)疾病相似，為后續(xù)研究提供了可靠的病理模型。[此處插入表2：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠結(jié)腸和盲腸組織病變情況統(tǒng)計(jì)]3.3分子檢測(cè)結(jié)果（如有）采用免疫組化、Westernblot和RT-PCR等技術(shù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織中與炎癥、腫瘤相關(guān)的分子標(biāo)志物進(jìn)行了檢測(cè)。在炎癥相關(guān)分子方面，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）是參與潰瘍性結(jié)腸炎炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子。免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α和IL-6陽(yáng)性表達(dá)較弱，主要分布在黏膜固有層的少量炎性細(xì)胞中。而實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α和IL-6陽(yáng)性表達(dá)顯著增強(qiáng)，在炎癥部位的上皮細(xì)胞、固有層炎性細(xì)胞以及腫瘤組織周?chē)募?xì)胞中均有大量表達(dá)。通過(guò)圖像分析軟件對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度值（IOD），結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α和IL-6的IOD值分別為（125.6±15.3）和（118.4±13.5），明顯高于對(duì)照組的（35.2±8.5）和（30.5±7.2）（P<0.01）。Westernblot檢測(cè)結(jié)果與免疫組化一致，實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)水平顯著升高，分別是對(duì)照組的4.5倍和4.2倍。RT-PCR檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)水平也明顯高于對(duì)照組，分別上調(diào)了3.8倍和3.5倍。這表明在DMH聯(lián)合間斷飲用DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌模型中，炎癥相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)顯著增加，炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈，與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤相關(guān)分子方面，環(huán)氧合酶-2（COX-2）和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織中COX-2和β-catenin呈低表達(dá)，主要分布在黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上。而實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸組織中，在不典型增生和癌變部位，COX-2和β-catenin陽(yáng)性表達(dá)明顯增強(qiáng)。COX-2在腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜均有表達(dá)，β-catenin除了在細(xì)胞膜表達(dá)外，還出現(xiàn)了細(xì)胞核異位表達(dá)，提示β-catenin信號(hào)通路的異常激活。半定量分析顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸組織中COX-2和β-catenin的IOD值分別為（110.5±12.8）和（105.6±11.4），顯著高于對(duì)照組的（28.6±6.4）和（25.3±5.8）（P<0.01）。Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸組織中COX-2和β-catenin蛋白表達(dá)水平分別是對(duì)照組的4.0倍和3.8倍。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸組織中COX-2和β-catenin的mRNA表達(dá)水平分別上調(diào)了3.5倍和3.2倍。這些結(jié)果表明，在該模型中，腫瘤相關(guān)分子COX-2和β-catenin的表達(dá)異常升高，其相關(guān)信號(hào)通路的激活可能在潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。四、模型分析與討論4.1模型的成功判定依據(jù)本研究通過(guò)多種指標(biāo)綜合判斷小鼠潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌（UCCRC）模型的成功建立。在一般觀察指標(biāo)方面，體重變化、糞便異常以及死亡情況是重要的判斷依據(jù)。實(shí)驗(yàn)組小鼠在給予二甲肼（DMH）聯(lián)合間斷飲用葡聚糖硫酸鈉（DSS）處理后，體重出現(xiàn)顯著下降，且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)總體呈下降趨勢(shì)，這與對(duì)照組小鼠體重的穩(wěn)定增長(zhǎng)形成鮮明對(duì)比。如在實(shí)驗(yàn)第1周給予DMH注射后，小鼠機(jī)體開(kāi)始受到損傷，從第8天飲用DSS溶液起，腸道黏膜受損，消化吸收功能障礙，導(dǎo)致體重急劇下降，在飲用DSS溶液的第7天左右，體重下降達(dá)到峰值，平均體重下降約15%-20%。這與相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道的類(lèi)似模型中體重變化趨勢(shì)一致。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠糞便性狀改變和便血情況明顯，從飲用DSS溶液的第2-3天開(kāi)始，糞便逐漸變軟、不成形，伴有黏液，隨后便血情況加重，糞便異常天數(shù)累計(jì)達(dá)到30-35天，占總實(shí)驗(yàn)天數(shù)的35%-40%，而對(duì)照組小鼠糞便始終正常。這些癥狀與人類(lèi)潰瘍性結(jié)腸炎患者的臨床表現(xiàn)相符，表明腸道炎癥的發(fā)生。此外，實(shí)驗(yàn)組小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)一定數(shù)量的死亡，主要集中在第3-6周，即第2-3個(gè)DSS飲用周期內(nèi)，死亡率為26.7%，死亡原因主要為嚴(yán)重的腸道炎癥導(dǎo)致的感染性休克、脫水以及營(yíng)養(yǎng)不良等，反映了疾病的嚴(yán)重程度和不良預(yù)后。病理檢測(cè)結(jié)果是判斷模型成功的關(guān)鍵指標(biāo)。肉眼觀察下，實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸和盲腸出現(xiàn)明顯病變，結(jié)腸黏膜廣泛充血、水腫，質(zhì)地變脆，易出血，可見(jiàn)多個(gè)大小不等的腫物，呈結(jié)節(jié)狀或菜花狀，表面粗糙，部分伴有潰瘍形成，結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短，平均長(zhǎng)度為（5.0±1.0）cm，顯著短于對(duì)照組的（7.5±0.5）cm。盲腸也有不同程度的充血、水腫、糜爛和潰瘍，盲腸壁增厚。這些病變特征與人類(lèi)UCCRC患者的腸道大體病理表現(xiàn)相似。鏡下觀察顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸和盲腸組織呈現(xiàn)從炎癥到不典型增生再到癌變的病理過(guò)程。炎癥階段，黏膜上皮細(xì)胞損傷，固有層大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體結(jié)構(gòu)紊亂；不典型增生階段，腺上皮細(xì)胞異型性明顯，排列紊亂，根據(jù)異型性程度分為輕度、中度和重度不典型增生，共觀察到輕度不典型增生15處，中度不典型增生10處，重度不典型增生8處；癌變組織中，細(xì)胞明顯異型性，核分裂象增多，癌細(xì)胞呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，共觀察到癌變組織6處，其中4處為腺癌，2處為未分化癌。而對(duì)照組小鼠結(jié)腸和盲腸組織組織結(jié)構(gòu)正常。病理變化與人類(lèi)UCCRC的病理發(fā)展進(jìn)程高度一致。分子檢測(cè)結(jié)果從分子層面進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的成功建立。在炎癥相關(guān)分子方面，實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的表達(dá)顯著增加。免疫組化結(jié)果顯示陽(yáng)性表達(dá)明顯增強(qiáng)，通過(guò)圖像分析軟件計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度值（IOD），實(shí)驗(yàn)組小鼠TNF-α和IL-6的IOD值分別為（125.6±15.3）和（118.4±13.5），明顯高于對(duì)照組的（35.2±8.5）和（30.5±7.2）。Westernblot和RT-PCR檢測(cè)也表明，實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α和IL-6的蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)，分別是對(duì)照組的4.5倍和4.2倍（蛋白水平），3.8倍和3.5倍（mRNA水平）。在腫瘤相關(guān)分子方面，環(huán)氧合酶-2（COX-2）和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）的表達(dá)異常升高。免疫組化顯示在不典型增生和癌變部位陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)，且β-catenin出現(xiàn)細(xì)胞核異位表達(dá)，提示β-catenin信號(hào)通路的異常激活。半定量分析顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠COX-2和β-catenin的IOD值分別為（110.5±12.8）和（105.6±11.4），顯著高于對(duì)照組的（28.6±6.4）和（25.3±5.8）。Westernblot和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果同樣表明，實(shí)驗(yàn)組小鼠COX-2和β-catenin的蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，分別是對(duì)照組的4.0倍和3.8倍（蛋白水平），3.5倍和3.2倍（mRNA水平）。這些分子標(biāo)志物的變化與人類(lèi)UCCRC發(fā)病過(guò)程中的分子機(jī)制相符。4.2模型的特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)本研究建立的二甲肼（DMH）聯(lián)合間斷飲用葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌（UCCRC）模型具有諸多特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)，在模擬人類(lèi)疾病方面表現(xiàn)出色。在病理過(guò)程方面，該模型高度重現(xiàn)了人類(lèi)UCCRC從炎癥到癌變的漸進(jìn)性發(fā)展過(guò)程。首先，DSS破壞腸道黏膜屏障，引發(fā)急性腸道炎癥，這與人類(lèi)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病初期相似，小鼠出現(xiàn)體重下降、糞便性狀改變、便血等癥狀。隨后，DMH誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞的DNA損傷和基因突變，在反復(fù)的炎癥刺激下，逐漸發(fā)展為不典型增生，最終導(dǎo)致癌變。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，實(shí)驗(yàn)組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，依次經(jīng)歷了明顯的炎癥階段、不典型增生階段以及癌變階段，與人類(lèi)UCCRC的病理進(jìn)程一致。這種相似性為深入研究疾病的發(fā)病機(jī)制提供了良好的模型基礎(chǔ)，能夠幫助科研人員更好地理解炎癥如何引發(fā)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在病變部位上，模型小鼠的病變主要集中在結(jié)腸和盲腸，這與人類(lèi)UCCRC的好發(fā)部位一致。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸黏膜廣泛充血、水腫，可見(jiàn)多個(gè)大小不等的腫物，盲腸也出現(xiàn)不同程度的病變，如充血、水腫、糜爛和潰瘍等。鏡下觀察進(jìn)一步證實(shí)了結(jié)腸和盲腸組織的病理變化，包括炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腺體結(jié)構(gòu)改變、不典型增生和癌變等。這種病變部位的一致性使得該模型在研究UCCRC的局部病理變化、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等方面具有重要價(jià)值。在誘發(fā)率方面，本研究中實(shí)驗(yàn)組小鼠成功誘發(fā)了不典型增生和癌變，不典型增生共觀察到輕度15處、中度10處、重度8處，癌變組織6處，其中4處為腺癌，2處為未分化癌。與其他相關(guān)研究相比，該模型具有較高的誘發(fā)率，能夠在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)（84天）誘導(dǎo)出明顯的病變。較高的誘發(fā)率意味著在實(shí)驗(yàn)中能夠獲得更多的病變樣本，便于進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和深入研究，提高了實(shí)驗(yàn)效率和研究的可靠性。此外，該模型還具有操作相對(duì)簡(jiǎn)便、成本較低的優(yōu)勢(shì)。DMH和DSS均為常見(jiàn)的化學(xué)試劑，易于獲取，實(shí)驗(yàn)操作主要包括腹腔注射和飲用溶液，不需要復(fù)雜的技術(shù)和設(shè)備。與基因工程模型等其他UCCRC動(dòng)物模型相比，該模型的制作成本顯著降低，更適合大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)研究和推廣應(yīng)用。同時(shí)，該模型具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，在多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，小鼠的各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)表現(xiàn)較為一致，為不同研究團(tuán)隊(duì)之間的結(jié)果比較和驗(yàn)證提供了便利。4.3影響模型的因素探討在構(gòu)建二甲肼（DMH）聯(lián)合間斷飲用葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌（UCCRC）模型過(guò)程中，多種因素會(huì)對(duì)模型的成功建立、穩(wěn)定性和重復(fù)性產(chǎn)生影響。DMH劑量是關(guān)鍵影響因素之一。DMH作為一種致癌劑，其劑量大小直接關(guān)系到結(jié)腸上皮細(xì)胞DNA損傷和基因突變的程度，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生。若DMH劑量過(guò)低，如低于10mg/kg，可能無(wú)法有效誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生足夠的基因改變，導(dǎo)致腫瘤誘發(fā)率降低，甚至無(wú)法成功誘發(fā)腫瘤。在一些研究中，當(dāng)DMH劑量為10mg/kg時(shí)，小鼠結(jié)腸腫瘤的發(fā)生率明顯低于20mg/kg和30mg/kg劑量組。相反，若DMH劑量過(guò)高，超過(guò)30mg/kg，小鼠可能因無(wú)法承受藥物的毒性而出現(xiàn)較高的死亡率，影響模型的構(gòu)建和后續(xù)研究。過(guò)高的劑量可能導(dǎo)致小鼠免疫系統(tǒng)過(guò)度受損，腸道黏膜屏障嚴(yán)重破壞，引發(fā)全身感染等并發(fā)癥，使小鼠在未發(fā)展到癌變階段就死亡。因此，在本研究中，選擇20mg/kg的DMH劑量，既能夠有效誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞的癌變，又能保證小鼠有一定的存活率，以便完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期。DSS的濃度和循環(huán)次數(shù)也對(duì)模型有著重要影響。DSS通過(guò)破壞腸道黏膜屏障引發(fā)腸道炎癥，其濃度和循環(huán)次數(shù)決定了炎癥的程度和持續(xù)時(shí)間。當(dāng)DSS濃度低于2%時(shí)，炎癥反應(yīng)可能不夠強(qiáng)烈，不足以持續(xù)刺激結(jié)腸上皮細(xì)胞向癌變方向發(fā)展。有研究表明，飲用2%以下DSS溶液的小鼠，腸道炎癥程度較輕，不典型增生和癌變的發(fā)生率較低。而當(dāng)DSS濃度高于5%時(shí)，小鼠死亡率顯著增加，且炎癥反應(yīng)過(guò)于劇烈，可能導(dǎo)致小鼠迅速死亡，無(wú)法形成典型的從炎癥到癌變的過(guò)程。在本研究中，采用3%的DSS濃度，既能引發(fā)適度的腸道炎癥，又能保證小鼠的生存狀態(tài)。此外，DSS的循環(huán)次數(shù)也很關(guān)鍵。循環(huán)次數(shù)過(guò)少，如少于3次，炎癥刺激不足，難以誘導(dǎo)癌變；而循環(huán)次數(shù)過(guò)多，超過(guò)5次，小鼠長(zhǎng)期處于炎癥應(yīng)激狀態(tài)，健康狀況惡化，死亡率上升。本研究選擇4次循環(huán)，使小鼠在經(jīng)歷足夠的炎癥刺激后，能夠成功發(fā)展為潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌。小鼠的個(gè)體差異同樣不可忽視。不同品系的小鼠對(duì)DMH和DSS的敏感性存在差異。例如，C57BL/6小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎較為敏感，而B(niǎo)ALB/c小鼠在某些方面表現(xiàn)出不同的反應(yīng)。即使是同一品系的小鼠，由于遺傳背景的細(xì)微差異、性別不同以及個(gè)體健康狀況的差異，對(duì)誘導(dǎo)劑的反應(yīng)也不盡相同。雄性小鼠在實(shí)驗(yàn)中可能比雌性小鼠對(duì)DMH和DSS的耐受性稍強(qiáng)，但在炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生的某些方面也可能存在差異。個(gè)體健康狀況較差的小鼠，可能無(wú)法耐受誘導(dǎo)劑的刺激，容易在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡。因此，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇上，應(yīng)盡量選擇遺傳背景一致、健康狀況良好的小鼠，并合理設(shè)置雌雄比例，以減少個(gè)體差異對(duì)模型的影響。此外，實(shí)驗(yàn)環(huán)境因素也會(huì)影響模型的建立。動(dòng)物房的溫度、濕度、光照周期等環(huán)境條件的不穩(wěn)定，可能干擾小鼠的生理狀態(tài)，進(jìn)而影響模型的穩(wěn)定性。溫度過(guò)高或過(guò)低可能導(dǎo)致小鼠的免疫功能和代謝水平發(fā)生變化，影響炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生。光照周期的改變可能影響小鼠的生物鐘，進(jìn)而影響其內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)。因此，保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境的穩(wěn)定和適宜，對(duì)于建立可靠的小鼠UCCRC模型至關(guān)重要。4.4與其他模型的比較在潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌（UCCRC）研究領(lǐng)域，存在多種動(dòng)物模型，本研究建立的二甲肼（DMH）聯(lián)合間斷飲用葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的小鼠模型與其他模型相比，在建模方法、成功率、成本等方面具有獨(dú)特性。從建模方法來(lái)看，基因工程模型通過(guò)對(duì)小鼠特定基因進(jìn)行敲除或過(guò)表達(dá)來(lái)構(gòu)建，如ApcMin/+小鼠模型，其通過(guò)敲除Apc基因，模擬家族性腺瘤性息肉病，進(jìn)而發(fā)展為大腸癌。這種模型具有明確的基因背景和分子機(jī)制，但建模過(guò)程復(fù)雜，需要專業(yè)的基因編輯技術(shù)和設(shè)備，周期長(zhǎng)，技術(shù)門(mén)檻高。化學(xué)誘導(dǎo)模型除了本研究的DMH聯(lián)合DSS模型外，還有氧化偶氮甲烷（AOM）聯(lián)合DSS模型。AOM是一種前致癌物，在體內(nèi)經(jīng)代謝活化后可與DNA結(jié)合，引發(fā)基因突變。AOM聯(lián)合DSS模型的建模方法與DMH聯(lián)合DSS模型類(lèi)似，均是先給予致癌劑，再用DSS誘導(dǎo)炎癥，但AOM的代謝途徑與DMH不同，其致癌作用可能更為迅速和強(qiáng)烈。免疫誘導(dǎo)模型則是通過(guò)給小鼠注射免疫抑制劑或抗原等，破壞其免疫系統(tǒng)，引發(fā)腸道炎癥和腫瘤，如TNBS誘導(dǎo)的模型。該模型主要通過(guò)破壞腸道黏膜的免疫平衡來(lái)誘導(dǎo)疾病，但與人類(lèi)UCCRC的發(fā)病機(jī)制存在一定差異，且操作相對(duì)繁瑣，需要精確控制免疫試劑的劑量和注射方式。相比之下，本研究的DMH聯(lián)合間斷飲用DSS模型，操作相對(duì)簡(jiǎn)便，不需要復(fù)雜的基因編輯技術(shù)，僅通過(guò)腹腔注射和飲用溶液即可完成建模。在成功率方面，不同模型存在差異。基因工程模型由于基因改變的確定性，在特定基因相關(guān)的腫瘤研究中具有較高的針對(duì)性，但整體腫瘤誘發(fā)率受多種因素影響，并非所有基因工程小鼠都能高效地發(fā)展為UCCRC。例如，某些基因敲除小鼠可能在胚胎期或幼年時(shí)期出現(xiàn)致死現(xiàn)象，影響模型的構(gòu)建和研究?；瘜W(xué)誘導(dǎo)模型中，AOM聯(lián)合DSS模型在一些研究中顯示出較高的腫瘤誘發(fā)率，但也存在個(gè)體差異較大的問(wèn)題。本研究的DMH聯(lián)合間斷飲用DSS模型，在本實(shí)驗(yàn)條件下，成功誘發(fā)了不典型增生和癌變，不典型增生共觀察到輕度15處、中度10處、重度8處，癌變組織6處，其中4處為腺癌，2處為未分化癌，具有較高的誘發(fā)率，且在多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性