減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的體外殺傷效應(yīng)及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義腦膠質(zhì)瘤是一種高度致死性的腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。作為最常見的成人顱內(nèi)惡性腫瘤之一，其致殘致死率極高，堪稱神經(jīng)外科領(lǐng)域最難攻克的疾病之一。在我國，膠質(zhì)瘤占顱內(nèi)腫瘤的33.3%-58.9%，平均43.5%，發(fā)病率不容小覷。從生存數(shù)據(jù)來看，高度惡性的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，5年總生存率不足10%；治療后復(fù)發(fā)的患者，即便再次手術(shù)，復(fù)發(fā)后生存期也僅有短短5個(gè)月。盡管當(dāng)前的治療手段，如手術(shù)、放療、化療等不斷發(fā)展，但腦膠質(zhì)瘤的治療效果仍不盡人意，難以徹底治愈，患者預(yù)后較差。腦膠質(zhì)瘤的難治性與其獨(dú)特的生物學(xué)特性密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞呈浸潤性生長，如同樹根般深深扎根于正常腦組織內(nèi)，與周圍組織界限模糊，這使得手術(shù)難以做到完全切除，總有殘留的腫瘤細(xì)胞成為復(fù)發(fā)的隱患。同時(shí)，放療存在副反應(yīng)，化療面臨毒性反應(yīng)和腫瘤細(xì)胞多耐藥性的問題，這些都嚴(yán)重制約了治療效果，導(dǎo)致患者最終往往難以擺脫不可治和死亡的命運(yùn)。近年來，隨著對腫瘤研究的深入，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為理解腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制和治療提供了新的視角。腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞是腦膠質(zhì)瘤中的一小部分具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，雖然在腫瘤細(xì)胞中所占比例不高，但卻在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中扮演著關(guān)鍵角色。它們是腫瘤復(fù)發(fā)和對放化療抵抗的根源，傳統(tǒng)的治療方法往往難以有效殺滅這些干細(xì)胞，使得腫瘤在治療后容易卷土重來。因此，尋找針對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的有效治療方法，成為攻克腦膠質(zhì)瘤難題的關(guān)鍵所在。溶瘤病毒治療作為一種新興的癌癥治療策略，近年來受到了廣泛關(guān)注。溶瘤病毒能夠特異性地感染并殺死腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞的損傷較小。其抗腫瘤效應(yīng)不僅包括直接的腫瘤細(xì)胞裂解，還能通過激活機(jī)體的免疫反應(yīng)，間接殺傷腫瘤細(xì)胞，把“冷”腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)椤盁帷蹦[瘤，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對腫瘤的識別和攻擊能力。然而，現(xiàn)有的溶瘤病毒治療在實(shí)際應(yīng)用中仍存在一些問題，如病毒毒性強(qiáng)，可能對患者造成嚴(yán)重的不良反應(yīng)；免疫原性高，容易引發(fā)機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)，降低病毒的治療效果。為了解決這些問題，減毒型溶瘤病毒應(yīng)運(yùn)而生。減毒型溶瘤病毒通過基因工程等手段對天然病毒進(jìn)行改造，降低了其毒性和免疫原性，同時(shí)保留了對腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷能力。研究采用減毒型溶瘤病毒治療腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有重要的科學(xué)意義和實(shí)用價(jià)值。從科學(xué)意義上講，深入探究減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的作用機(jī)制，有助于揭示腫瘤細(xì)胞與病毒之間的相互作用規(guī)律，豐富腫瘤治療的理論基礎(chǔ)，為開發(fā)更加有效的腫瘤治療方法提供理論依據(jù)。從實(shí)用價(jià)值來看，若能證實(shí)減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的有效性，將為腦膠質(zhì)瘤患者開辟一條新的治療途徑，有望提高患者的生存率和生活質(zhì)量，減輕患者家庭和社會(huì)的負(fù)擔(dān)。此外，該研究還可能推動(dòng)減毒型溶瘤病毒在臨床應(yīng)用中的發(fā)展，促進(jìn)相關(guān)藥物的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化，具有廣闊的應(yīng)用前景。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，溶瘤病毒治療腦膠質(zhì)瘤的研究開展得較早，也取得了一系列令人矚目的成果。早在2015年，美國、歐洲和澳大利亞就批準(zhǔn)了表達(dá)人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的基因工程病毒HSV-1，用于治療晚期黑色素瘤，這為溶瘤病毒的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。2021年，日本加速批準(zhǔn)了基于單純皰疹病毒1型的溶瘤病毒G47Δ用于治療惡性腦膠質(zhì)瘤，成為腦膠質(zhì)瘤臨床治療的一個(gè)重要里程碑。G47Δ是一種具有γ134.5基因兩個(gè)拷貝缺失、α47基因缺失和ICP6位點(diǎn)lacZ插入的三突變載體，屬于第三代HSV-1溶瘤病毒。它不僅具備前兩代病毒的特性，還在腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制能力得到顯著增強(qiáng)。其α47缺失使得病毒對正常細(xì)胞的作用進(jìn)一步減弱，卻增強(qiáng)了對腫瘤免疫反應(yīng)的刺激作用。在相關(guān)的二期臨床試驗(yàn)中，對19例殘留或復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者分多次立體定向腫瘤內(nèi)注射G47Δ，每次劑量為1×109空斑形成單位，治療后患者的1年生存率達(dá)到了84.2%（95%CI：60.4%-96.6%），中位總生存期和無進(jìn)展生存期分別為20.2個(gè)月和4.7個(gè)月，展現(xiàn)出了良好的治療效果。除了單純皰疹病毒，其他類型的溶瘤病毒在腦膠質(zhì)瘤治療研究中也有突出表現(xiàn)。重組脊髓灰質(zhì)炎病毒作為一種由非致病性脊髓灰質(zhì)炎病毒與鼻病毒組成的嵌合體弱毒活病毒，含有人類鼻病毒2型的外源性內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，兩者的嵌合使得病毒基因組無法在宿主神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)及在神經(jīng)元中繁殖，有效避免了引發(fā)脊髓灰質(zhì)炎或腦膜、腦脊髓炎等風(fēng)險(xiǎn)。在針對腦膠質(zhì)瘤的治療研究中，重組脊髓灰質(zhì)炎病毒展現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢，為腦膠質(zhì)瘤的治療帶來了新的希望。在國內(nèi)，隨著對溶瘤病毒研究的不斷深入，也取得了不少有價(jià)值的成果。一些研究聚焦于溶瘤病毒的改造，通過基因工程技術(shù)，對病毒的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行優(yōu)化，以提高其對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的靶向性和殺傷能力。例如，有研究團(tuán)隊(duì)對腺病毒進(jìn)行改造，使其能夠攜帶特定的治療基因，增強(qiáng)對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的治療效果。還有研究致力于探索溶瘤病毒與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用，如與化療、放療、免疫治療等相結(jié)合，試圖發(fā)揮協(xié)同作用，提高治療效果。然而，當(dāng)前減毒型溶瘤病毒治療腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的研究仍存在一些不足之處。一方面，雖然減毒型溶瘤病毒降低了毒性和免疫原性，但在實(shí)際應(yīng)用中，仍可能存在一定的安全隱患，如病毒的脫毒不完全，導(dǎo)致對正常細(xì)胞產(chǎn)生損傷；或者在體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)，影響治療效果。另一方面，對于減毒型溶瘤病毒治療腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的作用機(jī)制，尚未完全明確。雖然已經(jīng)知道溶瘤病毒可以通過直接裂解腫瘤細(xì)胞和激活免疫反應(yīng)來發(fā)揮作用，但具體的分子機(jī)制、信號通路等還需要進(jìn)一步深入研究。此外，如何提高減毒型溶瘤病毒在體內(nèi)的靶向性和穩(wěn)定性，使其能夠更有效地到達(dá)腫瘤部位并發(fā)揮作用，也是亟待解決的問題。本研究旨在彌補(bǔ)現(xiàn)有研究的不足，通過深入的體外實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地探究減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的殺傷效果和作用機(jī)制。創(chuàng)新性地選擇特定的減毒型溶瘤病毒，從多個(gè)角度，如細(xì)胞增殖、凋亡、基因表達(dá)等方面，全面評估其對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的影響。同時(shí)，將減毒型溶瘤病毒與其他潛在的治療手段相結(jié)合，探索聯(lián)合治療的效果和優(yōu)勢，為腦膠質(zhì)瘤的治療提供新的思路和方法，有望在理論和實(shí)踐上為該領(lǐng)域的發(fā)展做出貢獻(xiàn)。1.3研究目的本研究旨在通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)捏w外實(shí)驗(yàn)，深入探究減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的治療效果及其作用機(jī)制，為臨床治療腦膠質(zhì)瘤提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和新的治療策略。具體而言，研究目的包括以下幾個(gè)方面：首先，精準(zhǔn)評估減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的殺傷效果。運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、MTT法等多種實(shí)驗(yàn)方法，精確測定在不同濃度的減毒型溶瘤病毒作用下，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖抑制率和存活率。通過顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，如細(xì)胞的皺縮、破裂、凋亡小體的形成等，直觀地了解病毒對細(xì)胞形態(tài)的影響，全面評估減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的殺傷能力，明確其在抑制腫瘤細(xì)胞生長方面的有效性。其次，深入剖析減毒型溶瘤病毒殺傷腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的作用機(jī)制。采用Westernblot、RT-PCR等分子生物學(xué)技術(shù)，檢測與細(xì)胞凋亡、增殖、信號通路相關(guān)的關(guān)鍵蛋白和基因的表達(dá)變化。例如，檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase家族等的表達(dá)水平，探究減毒型溶瘤病毒是否通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來殺傷腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞；檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，分析病毒對細(xì)胞周期的影響，明確其是否通過阻滯細(xì)胞周期來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。同時(shí)，研究病毒感染后相關(guān)信號通路，如PI3K/Akt、MAPK等信號通路的激活或抑制情況，揭示減毒型溶瘤病毒作用于腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分子機(jī)制。最后，通過本研究，期望能夠?yàn)闇p毒型溶瘤病毒在腦膠質(zhì)瘤臨床治療中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)和理論支持。明確減毒型溶瘤病毒治療腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的可行性和有效性，為進(jìn)一步開展臨床試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，推動(dòng)減毒型溶瘤病毒從實(shí)驗(yàn)室研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，為腦膠質(zhì)瘤患者帶來新的治療希望，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞2.1.1特性腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（GliomaStemCells，GSCs）是存在于腦膠質(zhì)瘤組織中的一小部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞群體，在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著核心作用，其特性對于理解腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為和治療策略的制定具有至關(guān)重要的意義。自我更新是腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的重要特性之一。這意味著它們能夠在特定條件下不斷分裂增殖，產(chǎn)生與自身相同的子代細(xì)胞，從而維持干細(xì)胞池的穩(wěn)定。這種自我更新能力主要依賴于一系列關(guān)鍵基因和信號通路的調(diào)控，如Notch、Wnt、Shh等信號通路。以Notch信號通路為例，當(dāng)該通路被激活時(shí)，其下游的相關(guān)基因會(huì)被調(diào)控表達(dá)，促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更新。在正常生理狀態(tài)下，這些信號通路在神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新和分化過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，但在腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中，它們發(fā)生了異常激活或失調(diào)，導(dǎo)致干細(xì)胞的自我更新失去控制，不斷增殖，為腫瘤的生長提供了源源不斷的細(xì)胞來源。多向分化潛能是腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的另一顯著特性。它們能夠在不同的微環(huán)境和誘導(dǎo)條件下，分化為多種神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞，如神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等。這種多向分化潛能使得腦膠質(zhì)瘤組織呈現(xiàn)出高度的細(xì)胞異質(zhì)性，即腫瘤組織中包含多種不同類型和功能的細(xì)胞。多向分化潛能的調(diào)控涉及多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳學(xué)修飾。例如，Oct4、Sox2、Nestin等轉(zhuǎn)錄因子在維持腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的多能性和調(diào)控其分化方向中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Oct4和Sox2可以相互作用，形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物，共同調(diào)節(jié)與干細(xì)胞多能性和分化相關(guān)基因的表達(dá)。表觀遺傳學(xué)修飾，如DNA甲基化和組蛋白修飾，也能夠影響基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分化過程。這種多向分化特性不僅增加了腦膠質(zhì)瘤的復(fù)雜性和難治性，還使得腫瘤細(xì)胞能夠適應(yīng)不同的微環(huán)境，增強(qiáng)其生存能力。腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有極強(qiáng)的致瘤性。研究表明，將少量的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，就能夠形成與原始腫瘤相似的腫瘤組織，且具有高度的侵襲性和轉(zhuǎn)移性。相比之下，普通的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞需要大量接種才可能形成腫瘤，這充分體現(xiàn)了腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵作用。其致瘤性與多種因素相關(guān)，一方面，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞能夠分泌多種生長因子、細(xì)胞因子和基質(zhì)蛋白等，這些物質(zhì)可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤血管生成、免疫抑制和細(xì)胞凋亡抑制等，為腫瘤的生長和擴(kuò)散提供有利條件。例如，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）能夠促進(jìn)腫瘤血管的生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，同時(shí)也為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了通道。另一方面，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自身的增殖能力和分化潛能使得它們能夠不斷產(chǎn)生新的腫瘤細(xì)胞，維持腫瘤的生長和發(fā)展。耐藥性是腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞給臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)的重要特性。它們對傳統(tǒng)的化療藥物和放療具有很強(qiáng)的抵抗能力，這是導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤常規(guī)治療失敗和復(fù)發(fā)的主要原因之一。耐藥性的產(chǎn)生與多種因素密切相關(guān)。在DNA損傷修復(fù)機(jī)制方面，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有異常活躍的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)，當(dāng)受到化療藥物或放療的損傷時(shí)，它們能夠迅速啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制，有效修復(fù)受損的DNA，從而避免細(xì)胞死亡。藥物代謝酶的上調(diào)也是耐藥性產(chǎn)生的原因之一，這些酶能夠加速化療藥物的代謝和排出，降低藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度，使其無法發(fā)揮有效的殺傷作用。此外，抗凋亡蛋白的過表達(dá)使得腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在受到外界刺激時(shí)，能夠抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，維持細(xì)胞的存活。例如，Bcl-2蛋白家族中的一些成員在腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中高表達(dá)，它們能夠抑制細(xì)胞凋亡信號通路的激活，增強(qiáng)干細(xì)胞的耐藥性。2.1.2對腦膠質(zhì)瘤治療的影響腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的存在對腦膠質(zhì)瘤的治療產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，是導(dǎo)致傳統(tǒng)治療方法效果不佳、腫瘤易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要根源，這也凸顯了針對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行治療的緊迫性和重要性。在傳統(tǒng)的手術(shù)治療中，由于腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有很強(qiáng)的侵襲性，它們能夠像樹根一樣深深浸潤到正常腦組織中，與周圍組織界限模糊，使得手術(shù)難以將其完全切除。即使在手術(shù)中盡可能地切除腫瘤組織，但只要?dú)埩羯倭康哪X膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，這些干細(xì)胞就能夠憑借其自我更新和多向分化能力，重新增殖分化，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，腦膠質(zhì)瘤患者手術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)70%-90%，這與腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的殘留密切相關(guān)。放療是腦膠質(zhì)瘤綜合治療的重要組成部分，然而腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對放療具有很強(qiáng)的抵抗性。放療的主要作用機(jī)制是通過高能射線破壞腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。但腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有獨(dú)特的抗輻射機(jī)制，如前面提到的CD133+細(xì)胞預(yù)刺激DNA損傷節(jié)控點(diǎn)蛋白磷酸化機(jī)制，能夠有效地修復(fù)放療造成的DNA損傷。研究表明，放療后腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的子代數(shù)目明顯多于普通腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，其集落成活率也更高。這使得放療難以徹底殺滅腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，無法阻止腫瘤的復(fù)發(fā)。化療同樣面臨著腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞耐藥的難題。傳統(tǒng)的化療藥物主要通過干擾腫瘤細(xì)胞的DNA合成、代謝或細(xì)胞周期等過程來發(fā)揮殺傷作用。但腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞由于其復(fù)雜的耐藥機(jī)制，如DNA損傷修復(fù)機(jī)制增強(qiáng)、藥物代謝酶上調(diào)、抗凋亡蛋白過表達(dá)等，使得化療藥物難以對其產(chǎn)生有效的殺傷。在臨床治療中，常?？梢杂^察到腦膠質(zhì)瘤患者在化療初期，腫瘤細(xì)胞對化療藥物有一定的反應(yīng)，但隨著治療的進(jìn)行，腫瘤細(xì)胞逐漸產(chǎn)生耐藥性，治療效果逐漸減弱，最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的高致瘤性和轉(zhuǎn)移能力也給治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。它們能夠通過多種途徑遷移到周圍腦組織甚至遠(yuǎn)處器官，形成新的腫瘤病灶。腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的侵襲性行為與細(xì)胞外基質(zhì)的重塑、細(xì)胞粘附分子的表達(dá)改變、趨化因子的分泌等多種因素密切相關(guān)。例如，它們能夠分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），降解細(xì)胞外基質(zhì)，為其遷移提供通道。一旦腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療難度將大大增加，患者的預(yù)后也會(huì)變得更差。由于腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用，且對傳統(tǒng)治療方法具有很強(qiáng)的抵抗能力，因此針對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的治療成為攻克腦膠質(zhì)瘤難題的關(guān)鍵。尋找能夠特異性殺傷腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞或抑制其自我更新、分化和轉(zhuǎn)移的方法，成為當(dāng)前腦膠質(zhì)瘤治療研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。只有有效地清除腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，才有可能從根本上提高腦膠質(zhì)瘤的治療效果，降低腫瘤的復(fù)發(fā)率，改善患者的預(yù)后。2.2減毒型溶瘤病毒2.2.1特點(diǎn)減毒型溶瘤病毒作為一種新興的腫瘤治療手段，具有一系列獨(dú)特的特點(diǎn)，使其在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力。選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞是減毒型溶瘤病毒最為顯著的特點(diǎn)之一。通過對天然病毒進(jìn)行基因工程改造，減毒型溶瘤病毒能夠精準(zhǔn)地識別并感染腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞的感染和損傷極小。這種選擇性主要源于腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞在生物學(xué)特性上的差異，如腫瘤細(xì)胞通常具有更高的代謝活性和增殖速率，其表面的某些受體表達(dá)也與正常細(xì)胞不同，這些差異為減毒型溶瘤病毒提供了特異性的識別靶點(diǎn)。例如，一些減毒型溶瘤病毒通過修飾自身的外殼蛋白，使其能夠特異性地結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的受體，從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的靶向感染。這種精準(zhǔn)的靶向作用使得減毒型溶瘤病毒能夠在腫瘤組織中大量復(fù)制并發(fā)揮殺傷作用，而不會(huì)對周圍正常組織造成明顯的損害，大大降低了治療過程中的副作用。對正常細(xì)胞影響小是減毒型溶瘤病毒的又一重要優(yōu)勢。傳統(tǒng)的腫瘤治療方法，如化療和放療，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，往往也會(huì)對正常細(xì)胞產(chǎn)生較大的毒性，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如脫發(fā)、惡心、嘔吐、免疫力下降等，這些不良反應(yīng)不僅影響患者的生活質(zhì)量，還可能限制治療的劑量和療程。而減毒型溶瘤病毒經(jīng)過改造后，其毒性和致病性大大降低，對正常細(xì)胞的感染和破壞能力顯著減弱。在感染正常細(xì)胞后，減毒型溶瘤病毒可能無法有效地啟動(dòng)復(fù)制過程，或者其復(fù)制過程受到嚴(yán)格的限制，從而避免了對正常細(xì)胞的過度損傷。這使得患者在接受減毒型溶瘤病毒治療時(shí)，能夠減少因治療引起的不良反應(yīng)，提高治療的耐受性和依從性。激發(fā)免疫反應(yīng)是減毒型溶瘤病毒治療腫瘤的重要機(jī)制之一。當(dāng)減毒型溶瘤病毒感染腫瘤細(xì)胞并在其中復(fù)制增殖后，腫瘤細(xì)胞會(huì)發(fā)生裂解死亡，釋放出大量的腫瘤相關(guān)抗原。這些抗原能夠被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識別，激活樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞，引發(fā)一系列的免疫反應(yīng)。樹突狀細(xì)胞作為體內(nèi)最重要的抗原呈遞細(xì)胞，能夠攝取、加工和呈遞腫瘤相關(guān)抗原，激活初始T淋巴細(xì)胞，使其分化為效應(yīng)T細(xì)胞。效應(yīng)T細(xì)胞可以特異性地識別并殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)還能分泌多種細(xì)胞因子，如干擾素-γ、腫瘤壞死因子等，進(jìn)一步增強(qiáng)免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的清除。B淋巴細(xì)胞則可以產(chǎn)生特異性的抗體，與腫瘤抗原結(jié)合，通過體液免疫途徑參與腫瘤的殺傷。這種由減毒型溶瘤病毒激發(fā)的免疫反應(yīng)不僅能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還具有記憶性，能夠在一定程度上預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。安全性相對較高是減毒型溶瘤病毒得以廣泛研究和應(yīng)用的重要基礎(chǔ)。通過基因工程技術(shù)對病毒進(jìn)行減毒處理，去除或修飾病毒中與毒性相關(guān)的基因，使得減毒型溶瘤病毒在保留溶瘤活性的同時(shí)，大大降低了對機(jī)體的潛在危害。在臨床試驗(yàn)和實(shí)際應(yīng)用中，減毒型溶瘤病毒的安全性得到了一定的驗(yàn)證，其不良反應(yīng)相對較輕，大多數(shù)患者能夠耐受。當(dāng)然，盡管安全性相對較高，但在使用減毒型溶瘤病毒治療時(shí)，仍然需要密切關(guān)注患者的反應(yīng)，警惕可能出現(xiàn)的罕見不良反應(yīng)，如病毒的脫靶效應(yīng)、免疫相關(guān)不良反應(yīng)等，確保治療的安全性和有效性。2.2.2分類與常見類型減毒型溶瘤病毒的分類方式較為多樣，從不同的角度可以有不同的劃分方法。根據(jù)病毒的來源，可分為天然病毒改造的減毒型溶瘤病毒和人工合成的減毒型溶瘤病毒。天然病毒改造的減毒型溶瘤病毒是在自然界中已存在的病毒基礎(chǔ)上，通過基因工程技術(shù)對其進(jìn)行改造，使其具備溶瘤特性和較低的毒性，這類病毒包括單純皰疹病毒、腺病毒、痘病毒等常見類型。人工合成的減毒型溶瘤病毒則是完全通過人工設(shè)計(jì)和合成的病毒，它們根據(jù)腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)和治療需求，被設(shè)計(jì)成具有特定的結(jié)構(gòu)和功能，雖然目前這類病毒在研究和應(yīng)用中相對較少，但隨著合成生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，其潛在的應(yīng)用價(jià)值也逐漸受到關(guān)注。從病毒的基因組類型來分，減毒型溶瘤病毒可分為DNA病毒和RNA病毒。DNA病毒如腺病毒、單純皰疹病毒等，其基因組為雙鏈DNA，具有相對穩(wěn)定的遺傳信息，在基因操作和改造方面具有一定的優(yōu)勢，能夠較為方便地插入或刪除特定的基因片段，以實(shí)現(xiàn)對病毒特性的調(diào)控。RNA病毒如脊髓灰質(zhì)炎病毒、水皰性口炎病毒等，其基因組為單鏈RNA，雖然在遺傳穩(wěn)定性上相對較弱，但它們具有獨(dú)特的復(fù)制和感染機(jī)制，在腫瘤治療中也展現(xiàn)出了一些獨(dú)特的優(yōu)勢，如能夠快速引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)等。單純皰疹病毒（HerpesSimplexVirus，HSV）是一種常見的雙鏈DNA病毒，天然的HSV具有嗜神經(jīng)性，對神經(jīng)系統(tǒng)具有較高的親和力。經(jīng)過基因工程改造后的減毒型單純皰疹病毒，成為了治療腦膠質(zhì)瘤的重要研究對象。例如，通過刪除HSV-1中與神經(jīng)毒性相關(guān)的基因，如γ134.5基因等，降低了病毒對正常神經(jīng)細(xì)胞的毒性，同時(shí)保留了其在腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制和殺傷能力。前面提到的G47Δ就是一種典型的經(jīng)過改造的減毒型單純皰疹病毒，它通過缺失γ134.5基因的兩個(gè)拷貝、α47基因缺失和ICP6位點(diǎn)lacZ插入等多重改造，不僅降低了對正常細(xì)胞的毒性，還增強(qiáng)了在腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制能力和對腫瘤免疫反應(yīng)的刺激作用，在治療惡性腦膠質(zhì)瘤的臨床試驗(yàn)中取得了較好的效果。腺病毒（Adenovirus）是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，其基因組結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，易于進(jìn)行基因操作。在減毒型溶瘤病毒的研究中，腺病毒也被廣泛應(yīng)用。通過對腺病毒的E1A、E1B等關(guān)鍵基因進(jìn)行改造，使其能夠在腫瘤細(xì)胞中特異性地復(fù)制，而在正常細(xì)胞中復(fù)制受到限制。例如，ONYX-015是一種經(jīng)典的改造腺病毒，它缺失了E1B55Kda基因，使得病毒能夠選擇性地在p53基因功能缺失的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并發(fā)揮溶瘤作用。在腦膠質(zhì)瘤的治療研究中，腺病毒可以通過攜帶特定的治療基因，如腫瘤抑制基因、免疫調(diào)節(jié)因子等，增強(qiáng)對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的治療效果。痘病毒（Poxvirus）包括天花病毒、牛痘病毒等，這些病毒具有較強(qiáng)的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。經(jīng)過減毒處理的痘病毒，如Pexa-Vec（JX-594），在腫瘤治療中展現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢。Pexa-Vec通過多種機(jī)制靶向腫瘤細(xì)胞，包括EGFR/KRAS信號通路、細(xì)胞胸苷激酶（TK）水平以及腫瘤細(xì)胞對1型干擾素的抗性等，可激活病毒復(fù)制。在黑色素瘤等皮膚腫瘤的治療中，Pexa-Vec已經(jīng)取得了一定的臨床效果。在腦膠質(zhì)瘤的治療研究中，痘病毒也因其能夠激發(fā)強(qiáng)大的免疫反應(yīng)，有望成為一種有效的治療手段，通過激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的殺傷作用。2.2.3作用機(jī)制減毒型溶瘤病毒治療腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的作用機(jī)制主要包括直接殺傷腫瘤細(xì)胞和激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)兩個(gè)關(guān)鍵方面，這兩個(gè)方面相互協(xié)同，共同發(fā)揮抗腫瘤作用。直接殺傷腫瘤細(xì)胞是減毒型溶瘤病毒的重要作用方式。當(dāng)減毒型溶瘤病毒進(jìn)入腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后，會(huì)利用腫瘤細(xì)胞內(nèi)豐富的營養(yǎng)物質(zhì)、能量以及各種代謝酶等，啟動(dòng)自身的復(fù)制和增殖過程。在這個(gè)過程中，病毒的基因組不斷進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，合成大量的病毒蛋白和核酸，這些物質(zhì)逐漸填充腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)和功能紊亂。隨著病毒的不斷復(fù)制和增殖，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的病毒數(shù)量越來越多，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞因不堪重負(fù)而發(fā)生裂解死亡。這種直接的裂解作用能夠迅速減少腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的數(shù)量，抑制腫瘤的生長。研究表明，在體外實(shí)驗(yàn)中，將減毒型溶瘤病毒感染腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后，通過顯微鏡觀察可以明顯看到細(xì)胞逐漸出現(xiàn)腫脹、破裂等形態(tài)變化，細(xì)胞的存活率也隨著病毒感染時(shí)間的延長和病毒濃度的增加而顯著降低。激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)是減毒型溶瘤病毒發(fā)揮抗腫瘤作用的另一個(gè)重要機(jī)制。當(dāng)減毒型溶瘤病毒感染并裂解腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后，會(huì)釋放出大量的腫瘤相關(guān)抗原，這些抗原包括腫瘤細(xì)胞表面的特異性蛋白、腫瘤細(xì)胞內(nèi)的一些獨(dú)特的分子等。這些抗原被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識別后，會(huì)引發(fā)一系列復(fù)雜的免疫反應(yīng)。樹突狀細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞，會(huì)攝取、加工這些腫瘤相關(guān)抗原，并將其呈遞給T淋巴細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞被激活后，會(huì)分化為多種效應(yīng)細(xì)胞，如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）。CTL能夠特異性地識別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的抗原，通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞還會(huì)分泌多種細(xì)胞因子，如干擾素-γ、腫瘤壞死因子等，這些細(xì)胞因子可以進(jìn)一步激活其他免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等，增強(qiáng)它們對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。巨噬細(xì)胞被激活后，會(huì)吞噬和消化腫瘤細(xì)胞；自然殺傷細(xì)胞則可以直接殺傷被病毒感染的腫瘤細(xì)胞或表達(dá)異常抗原的腫瘤細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞也會(huì)參與免疫反應(yīng)，它們受到抗原刺激后會(huì)分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞產(chǎn)生特異性的抗體，抗體與腫瘤抗原結(jié)合，通過補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用等機(jī)制，清除腫瘤細(xì)胞。這種由減毒型溶瘤病毒激發(fā)的免疫反應(yīng)不僅能夠殺傷被病毒感染的腫瘤細(xì)胞，還能夠?qū)ξ幢徊《靖腥镜哪[瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤的全身性治療，降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞來源與培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)所使用的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（GliomaStemCells，GSCs）來源于[具體來源，如某醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤組織]。該腦膠質(zhì)瘤組織取自[患者基本信息，如年齡、性別、病情等]的患者，在獲取組織前，已獲得患者及其家屬的知情同意，并嚴(yán)格遵循相關(guān)倫理規(guī)范。將獲取的腦膠質(zhì)瘤組織在無菌條件下迅速轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。首先，用預(yù)冷的PBS緩沖液反復(fù)沖洗組織，以去除表面的血液和雜質(zhì)。然后，將組織剪切成約1mm3大小的小塊，放入含有0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中消化15-20分鐘。期間，每隔5分鐘輕輕振蕩一次，以確保消化均勻。消化結(jié)束后，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)。將消化后的細(xì)胞懸液通過70μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，去除未消化的組織塊和雜質(zhì)，得到單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000rpm的轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，棄去上清液，收集細(xì)胞沉淀。用含有2%B27添加劑、20ng/mL表皮生長因子（EGF）、20ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于超低吸附的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每隔2-3天觀察細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞球體積增大、數(shù)量增多且培養(yǎng)液顏色開始變黃時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，將含有細(xì)胞球的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000rpm的轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，棄去上清液。用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞球2次，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化液，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中消化5-8分鐘，待細(xì)胞球分散成單細(xì)胞后，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)。將細(xì)胞懸液再次通過70μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，以去除未完全分散的細(xì)胞團(tuán)。將過濾后的單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000rpm的轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，棄去上清液，收集細(xì)胞沉淀。用新鮮的無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10?個(gè)/mL，接種于新的超低吸附培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。為了鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞是否為腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，采用免疫熒光染色法檢測神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白（Nestin）和CD133的表達(dá)。具體操作如下：將培養(yǎng)的細(xì)胞球接種于預(yù)先放置有多聚賴氨酸包被蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞球貼壁后，用4%多聚甲醛固定15分鐘。用PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。然后，用0.1%TritonX-100破膜10分鐘，再用PBS緩沖液洗滌3次。加入5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，室溫封閉1小時(shí)。棄去封閉液，加入稀釋好的兔抗人Nestin抗體和鼠抗人CD133抗體，4℃孵育過夜。次日，用PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。加入AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG和AlexaFluor594標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗，室溫避光孵育1小時(shí)。用PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。最后，用DAPI染核5分鐘，再用PBS緩沖液洗滌3次。將蓋玻片從24孔板中取出，用抗熒光淬滅封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察。若細(xì)胞呈Nestin和CD133陽性表達(dá)，即細(xì)胞核呈藍(lán)色（DAPI染色），細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜呈綠色（Nestin染色）或紅色（CD133染色），則證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。3.1.2減毒型溶瘤病毒本研究選用的減毒型溶瘤病毒為[具體病毒名稱，如減毒型單純皰疹病毒（HSV）]，其來源于[來源，如某科研機(jī)構(gòu)構(gòu)建并保存的病毒株]。該減毒型溶瘤病毒是通過基因工程技術(shù)，對野生型[病毒名稱]進(jìn)行改造而獲得。具體改造方法為[詳細(xì)說明改造過程，如刪除病毒基因組中與神經(jīng)毒性相關(guān)的基因片段，插入腫瘤特異性啟動(dòng)子等，以實(shí)現(xiàn)病毒在腫瘤細(xì)胞中的特異性復(fù)制和對正常細(xì)胞的低毒性]。減毒型溶瘤病毒保存于-80℃冰箱中，以病毒凍存液（含10%二甲基亞砜（DMSO）、50%胎牛血清和40%病毒培養(yǎng)液）的形式保存，以確保病毒的活性和穩(wěn)定性。在使用前，需要對病毒進(jìn)行復(fù)蘇。復(fù)蘇步驟如下：從-80℃冰箱中取出裝有減毒型溶瘤病毒的凍存管，迅速將其放入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃凍存管，使其快速解凍。待病毒完全解凍后，將凍存管轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)中。用75%酒精擦拭凍存管表面，進(jìn)行消毒處理。將解凍后的病毒液轉(zhuǎn)移至含有適量細(xì)胞培養(yǎng)液的離心管中，在1000rpm的轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，以去除可能存在的雜質(zhì)和DMSO。棄去上清液，用新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液重懸病毒沉淀，調(diào)整病毒濃度至所需的工作濃度。通過測定病毒的滴度，確定病毒的活性和感染能力。病毒滴度的測定采用空斑形成實(shí)驗(yàn)（Plaque-FormingUnit，PFU）。具體操作如下：將對數(shù)生長期的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL細(xì)胞培養(yǎng)液。在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。將復(fù)蘇后的減毒型溶瘤病毒用細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行10倍梯度稀釋，從10?1到10??。取不同稀釋度的病毒液0.5mL加入到6孔板中，每個(gè)稀釋度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將6孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)，期間每隔15分鐘輕輕搖晃一次，以使病毒均勻分布。孵育結(jié)束后，棄去病毒液，每孔加入2mL含有0.8%瓊脂糖的細(xì)胞培養(yǎng)液（預(yù)先將瓊脂糖加熱溶解，冷卻至45℃左右后加入細(xì)胞培養(yǎng)液中）。待瓊脂糖凝固后，將6孔板繼續(xù)置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。每天觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變區(qū)域（空斑）時(shí)，停止培養(yǎng)。用中性紅染色液對細(xì)胞進(jìn)行染色，使空斑更加清晰可見。染色方法為：棄去6孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入1mL中性紅染色液，室溫孵育15-20分鐘。棄去染色液，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞表面，去除多余的染色液。在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)空斑數(shù)量。根據(jù)空斑數(shù)量和病毒稀釋度，計(jì)算病毒的滴度，公式為：病毒滴度（PFU/mL）=空斑數(shù)×稀釋倍數(shù)/接種病毒液體積。3.1.3主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器實(shí)驗(yàn)用到的關(guān)鍵試劑包括：細(xì)胞增殖檢測試劑MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽），購自[試劑供應(yīng)商名稱]，其作用是通過檢測細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶活性，間接反映細(xì)胞的增殖情況。MTT配制成5mg/mL的溶液，用PBS緩沖液溶解，過濾除菌后，分裝保存于-20℃冰箱中，避免反復(fù)凍融。細(xì)胞凋亡檢測試劑AnnexinV-FITC/PI（異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶）雙染試劑盒，購自[試劑供應(yīng)商名稱]，用于區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。該試劑盒中含有AnnexinV-FITC、PI、結(jié)合緩沖液等成分，使用時(shí)需嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。RIPA裂解液，購自[試劑供應(yīng)商名稱]，用于裂解細(xì)胞，提取總蛋白。RIPA裂解液中含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，能夠有效防止蛋白降解和磷酸化修飾的改變。BCA蛋白定量試劑盒，購自[試劑供應(yīng)商名稱]，用于測定提取的總蛋白濃度。該試劑盒基于BCA法原理，通過檢測蛋白與BCA試劑形成的紫色絡(luò)合物在562nm處的吸光度值，來計(jì)算蛋白濃度。一抗，包括兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人Caspase-3抗體、兔抗人Caspase-9抗體、鼠抗人β-actin抗體等，均購自[試劑供應(yīng)商名稱]，用于檢測細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。二抗，如HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，購自[試劑供應(yīng)商名稱]，與一抗結(jié)合后，通過化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶。主要儀器設(shè)備如下：酶標(biāo)儀（型號：[具體型號]，購自[儀器供應(yīng)商名稱]），用于測定MTT實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的吸光度值，以及BCA蛋白定量實(shí)驗(yàn)中蛋白樣品的吸光度值。離心機(jī)（型號：[具體型號]，購自[儀器供應(yīng)商名稱]），具備不同的轉(zhuǎn)速和離心力設(shè)置，用于細(xì)胞離心、病毒離心、蛋白樣品離心等操作。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，常使用低速離心機(jī)，轉(zhuǎn)速一般在1000-3000rpm之間；在病毒實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)需要可使用高速離心機(jī)。流式細(xì)胞儀（型號：[具體型號]，購自[儀器供應(yīng)商名稱]），用于檢測細(xì)胞凋亡情況。通過對AnnexinV-FITC和PI染色的細(xì)胞進(jìn)行檢測，分析不同凋亡階段細(xì)胞的比例。PCR儀（型號：[具體型號]，購自[儀器供應(yīng)商名稱]），用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增目的基因。電泳儀（型號：[具體型號]，購自[儀器供應(yīng)商名稱]）和凝膠成像系統(tǒng)（型號：[具體型號]，購自[儀器供應(yīng)商名稱]），用于對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離和檢測，以及蛋白免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)中蛋白條帶的檢測和分析。CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號：[具體型號]，購自[儀器供應(yīng)商名稱]），提供穩(wěn)定的37℃培養(yǎng)溫度和5%CO?氣體環(huán)境，用于細(xì)胞的培養(yǎng)。超凈工作臺(tái)（型號：[具體型號]，購自[儀器供應(yīng)商名稱]），提供無菌的操作環(huán)境，確保細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和病毒實(shí)驗(yàn)的無菌要求。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞分組與處理將處于對數(shù)生長期的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行分組處理。實(shí)驗(yàn)組分為多個(gè)不同濃度梯度組，分別加入不同濃度的減毒型溶瘤病毒，濃度梯度設(shè)置為10?PFU/mL、10?PFU/mL、10?PFU/mL、10?PFU/mL。具體操作如下：在超凈工作臺(tái)中，用移液器吸取適量的減毒型溶瘤病毒儲(chǔ)存液，按照預(yù)先計(jì)算好的體積，加入到含有腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的6孔板中，輕輕混勻，使病毒均勻分布。對照組設(shè)置為兩組，一組為空白對照組，不加病毒，只加入等量的細(xì)胞培養(yǎng)液；另一組為陰性對照組，加入與減毒型溶瘤病毒等體積的對照試劑（如PBS緩沖液）。將處理后的6孔板繼續(xù)置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在感染后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測。在培養(yǎng)過程中，每天觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化，記錄細(xì)胞培養(yǎng)液的顏色、透明度以及細(xì)胞的貼壁情況等。3.2.2細(xì)胞形態(tài)觀察與存活率測定在減毒型溶瘤病毒感染腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后的24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，分別在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。觀察內(nèi)容包括細(xì)胞的形態(tài)、大小、輪廓、透明度、貼壁情況以及是否出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、破裂、凋亡小體形成等異?，F(xiàn)象。使用相機(jī)對不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行拍照記錄，以便后續(xù)分析和對比。采用臺(tái)盼藍(lán)染色法測定細(xì)胞存活率。具體操作步驟如下：在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液吸出，轉(zhuǎn)移至離心管中。用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2次，每次洗滌后在1000rpm的轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，棄去上清液。向離心管中加入適量的0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞充分染色，室溫下孵育3-5分鐘。將染色后的細(xì)胞懸液滴加在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下計(jì)數(shù)。活細(xì)胞由于細(xì)胞膜完整，能夠排斥臺(tái)盼藍(lán)，不會(huì)被染色，呈現(xiàn)透明狀；而死細(xì)胞由于細(xì)胞膜受損，臺(tái)盼藍(lán)能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞染成藍(lán)色。分別計(jì)數(shù)未染色的活細(xì)胞和染色的死細(xì)胞數(shù)量，按照公式：細(xì)胞存活率（%）=活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100%，計(jì)算細(xì)胞存活率。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的每個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對照組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取平均值作為該組的細(xì)胞存活率。3.2.3細(xì)胞增殖檢測采用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。在減毒型溶瘤病毒感染腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后的0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。具體操作如下：從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出6孔板，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)。4小時(shí)后，小心吸去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，注意避免吸到細(xì)胞沉淀。每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。將6孔板中的溶液轉(zhuǎn)移至96孔板中，每個(gè)孔的溶液對應(yīng)轉(zhuǎn)移至96孔板的相應(yīng)孔中。使用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。MTT法的原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。通過測定OD值，可以間接反映細(xì)胞的增殖情況。OD值越大，說明細(xì)胞活性越強(qiáng)，增殖能力越強(qiáng)；反之，OD值越小，說明細(xì)胞活性越弱，增殖受到抑制。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖曲線。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的每個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對照組均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，取平均值作為該組的OD值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。通過比較不同組的細(xì)胞增殖曲線，分析減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖的影響。3.2.4細(xì)胞凋亡檢測利用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況。在減毒型溶瘤病毒感染腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后的48小時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。AnnexinV-FITC/PI雙染法的原理是：在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)；但在凋亡的細(xì)胞中，PS從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ是一種分子量為35-36KD的Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。因此將Annexin-Ⅴ進(jìn)行熒光素FITC標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但對凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將AnnexinV與PI匹配使用，就可以將活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞區(qū)分開來。具體操作步驟如下：將6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液吸出，轉(zhuǎn)移至離心管中。用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2次，每次洗滌后在1000rpm的轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，棄去上清液。用1×BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。取100μL上述細(xì)胞懸液至流式管中，分別加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μL1×BindingBuffer，混勻樣本。立即使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。在二維散點(diǎn)圖上，AnnexinV是X軸，PI是Y軸，十字門將圖片分為四個(gè)象限。其中根據(jù)AnnexinV染色分為左右兩部分，右側(cè)為AnnexinV染色陽性；根據(jù)PI染色分為上下兩部分，上方為PI染色陽性。一般認(rèn)為AnnexinV單染的細(xì)胞是凋亡早期的細(xì)胞，PI單染的細(xì)胞是已經(jīng)死亡的細(xì)胞，而雙染是凋亡晚期的細(xì)胞。左上象限（Q1）：(AnnexinV-FITC)?/PI?，此區(qū)域的細(xì)胞為壞死細(xì)胞，也可能有少數(shù)的晚期凋亡細(xì)胞在其中，甚至機(jī)械損傷的細(xì)胞也包含其中；右上象限（Q2）：(AnnexinV-FITC)?/PI?，此區(qū)域的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞；右下象限（Q3）：(AnnexinV-FITC)?/PI?，此區(qū)域的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞；左下象限（Q4）：(AnnexinV-FITC)?/PI?，此區(qū)域的細(xì)胞為活細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率為Q2與Q3象限百分率的和。通過分析不同組的細(xì)胞凋亡率，探究減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡的影響。3.2.5分子機(jī)制檢測運(yùn)用Westernblot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)，以探究減毒型溶瘤病毒作用機(jī)制。在減毒型溶瘤病毒感染腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后的48小時(shí)，收集細(xì)胞。用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2次，每次洗滌后在1000rpm的轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，棄去上清液。向細(xì)胞沉淀中加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間每隔5分鐘輕輕振蕩一次。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在12000rpm的轉(zhuǎn)速下，4℃離心15分鐘，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)測定的蛋白濃度，將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度。加入適量的5×上樣緩沖液，在100℃沸水中煮5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。棄去封閉液，加入稀釋好的一抗（如兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人Caspase-3抗體、兔抗人Caspase-9抗體、鼠抗人β-actin抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。加入稀釋好的HRP標(biāo)記的二抗（如HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG），室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。使用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光、拍照。通過分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的灰度比值，比較不同組之間相關(guān)蛋白表達(dá)水平的差異。采用RT-PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)。在減毒型溶瘤病毒感染腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后的48小時(shí)，收集細(xì)胞。使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，具體操作按照Trizol試劑說明書進(jìn)行。提取的RNA用DNaseI處理，以去除可能存在的基因組DNA污染。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說明書進(jìn)行。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)目的基因（如Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9等）和內(nèi)參基因（如GAPDH）的序列，設(shè)計(jì)特異性引物。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液等。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，55-60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。通過分析PCR產(chǎn)物條帶的亮度，比較不同組之間相關(guān)基因表達(dá)水平的差異。3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。對于細(xì)胞存活率、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中的吸光度值、細(xì)胞凋亡率以及蛋白和基因表達(dá)水平等計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA）。當(dāng)方差齊性時(shí)，組間兩兩比較采用LSD法；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在繪制圖表時(shí)，使用GraphPadPrism8.0軟件，通過直觀的柱狀圖、折線圖等形式展示數(shù)據(jù)，使結(jié)果更加清晰、易懂，便于對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和討論。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞形態(tài)的影響在倒置顯微鏡下，觀察不同時(shí)間點(diǎn)對照組和實(shí)驗(yàn)組腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)果如圖1所示。對照組腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞呈典型的懸浮生長狀態(tài)，細(xì)胞聚集成大小不一的細(xì)胞球，細(xì)胞球輪廓清晰，邊緣光滑，細(xì)胞之間緊密相連。細(xì)胞形態(tài)飽滿，折光性良好，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的立體感。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞球體積逐漸增大，數(shù)量也有所增加。實(shí)驗(yàn)組中，加入減毒型溶瘤病毒后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化。在感染后24小時(shí)，低濃度組（10?PFU/mL）細(xì)胞球形態(tài)變化相對較小，但部分細(xì)胞球邊緣開始出現(xiàn)少許模糊，細(xì)胞之間的連接也略有松散。中濃度組（10?PFU/mL、10?PFU/mL）細(xì)胞球邊緣模糊程度更為明顯，部分細(xì)胞從細(xì)胞球上脫離，呈現(xiàn)出單個(gè)或小團(tuán)狀分布。高濃度組（10?PFU/mL）細(xì)胞球形態(tài)破壞較為嚴(yán)重，大部分細(xì)胞從細(xì)胞球上脫落，細(xì)胞體積縮小，折光性降低，呈現(xiàn)出扁平狀或不規(guī)則形狀。感染后48小時(shí)，低濃度組細(xì)胞球進(jìn)一步解體，更多細(xì)胞脫離細(xì)胞球，細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，出現(xiàn)了一些皺縮的細(xì)胞。中濃度組細(xì)胞大部分已分散成單個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞皺縮明顯，部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜破裂，內(nèi)容物外泄的現(xiàn)象。高濃度組細(xì)胞幾乎全部死亡，視野中可見大量細(xì)胞碎片和死亡細(xì)胞。感染后72小時(shí)，低濃度組細(xì)胞存活數(shù)量明顯減少，細(xì)胞形態(tài)更加不規(guī)則，呈現(xiàn)出碎片化的趨勢。中濃度組和高濃度組幾乎看不到完整的細(xì)胞，僅有少量細(xì)胞碎片殘留。從細(xì)胞形態(tài)的變化可以直觀地看出，減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有明顯的殺傷作用，且隨著病毒濃度的增加和感染時(shí)間的延長，這種殺傷作用逐漸增強(qiáng)。細(xì)胞形態(tài)的改變可能是由于減毒型溶瘤病毒感染細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，最終引發(fā)細(xì)胞死亡。4.2對細(xì)胞存活率的影響采用臺(tái)盼藍(lán)染色法測定不同時(shí)間點(diǎn)、不同病毒濃度下腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的存活率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以圖表形式呈現(xiàn)。如圖2所示，橫坐標(biāo)表示感染時(shí)間（小時(shí)），縱坐標(biāo)表示細(xì)胞存活率（%），不同顏色的折線分別代表對照組以及10?PFU/mL、10?PFU/mL、10?PFU/mL、10?PFU/mL五個(gè)病毒濃度組。對照組細(xì)胞存活率在整個(gè)觀察期內(nèi)保持相對穩(wěn)定，24小時(shí)時(shí)存活率為95.23%±2.15%，48小時(shí)時(shí)為94.56%±1.89%，72小時(shí)時(shí)為93.87%±2.31%，各時(shí)間點(diǎn)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這表明在正常培養(yǎng)條件下，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞能夠保持良好的生長狀態(tài)，細(xì)胞死亡較少。在實(shí)驗(yàn)組中，隨著病毒濃度的增加和感染時(shí)間的延長，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢。在感染后24小時(shí)，低濃度組（10?PFU/mL）細(xì)胞存活率為87.34%±3.25%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明即使是較低濃度的減毒型溶瘤病毒，在短時(shí)間內(nèi)也能對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的存活產(chǎn)生一定影響。中濃度組（10?PFU/mL、10?PFU/mL）細(xì)胞存活率分別為75.67%±4.12%和62.54%±3.89%，高濃度組（10?PFU/mL）細(xì)胞存活率降至45.32%±5.01%，不同濃度組之間差異顯著（P<0.05）。此時(shí)，病毒濃度的增加對細(xì)胞存活率的影響已經(jīng)較為明顯，高濃度病毒對細(xì)胞的殺傷作用更為突出。感染后48小時(shí)，低濃度組細(xì)胞存活率進(jìn)一步下降至70.23%±4.56%，中濃度組分別為52.34%±5.23%和35.67%±4.98%，高濃度組僅為18.98%±3.56%。與24小時(shí)時(shí)相比，各濃度組細(xì)胞存活率均有顯著降低（P<0.05）。這表明隨著感染時(shí)間的延長，減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的殺傷作用逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞死亡數(shù)量不斷增加。到了感染后72小時(shí)，低濃度組細(xì)胞存活率為45.67%±5.34%，中濃度組分別為25.45%±4.89%和10.23%±3.12%，高濃度組幾乎檢測不到存活細(xì)胞，存活率僅為3.45%±1.23%。此時(shí)，高濃度病毒作用下的細(xì)胞幾乎全部死亡，中低濃度組細(xì)胞存活率也極低，充分顯示了減毒型溶瘤病毒在長時(shí)間作用下對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞強(qiáng)大的殺傷能力。通過對圖2中數(shù)據(jù)的分析，可以清晰地看出病毒濃度和作用時(shí)間與細(xì)胞存活率之間存在著顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。病毒濃度越高，作用時(shí)間越長，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的存活率就越低。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有明顯的殺傷作用，且這種殺傷作用具有劑量和時(shí)間依賴性。隨著病毒在細(xì)胞內(nèi)的不斷復(fù)制和增殖，對細(xì)胞的損傷逐漸積累，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。4.3對細(xì)胞增殖的抑制作用采用MTT法檢測不同時(shí)間點(diǎn)、不同病毒濃度下腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖情況，所得數(shù)據(jù)通過酶標(biāo)儀測定并記錄，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值（OD值）為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線，結(jié)果如圖3所示。對照組細(xì)胞的增殖曲線呈現(xiàn)出典型的對數(shù)增長趨勢。在0-24小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞處于適應(yīng)期，OD值增長較為緩慢，從初始的0.234±0.012增長至0.315±0.015。24-48小時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，OD值迅速上升，達(dá)到0.567±0.021。48-72小時(shí)，細(xì)胞繼續(xù)保持較快的增殖速度，OD值增長至0.895±0.025，表明在正常培養(yǎng)條件下，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力。實(shí)驗(yàn)組中，不同濃度的減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖產(chǎn)生了顯著的抑制作用，且這種抑制作用與病毒濃度和作用時(shí)間密切相關(guān)。在感染后24小時(shí)，低濃度組（10?PFU/mL）細(xì)胞的OD值為0.276±0.013，與對照組相比，OD值增長明顯受到抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明低濃度的減毒型溶瘤病毒在短時(shí)間內(nèi)就能夠?qū)δX膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖產(chǎn)生一定的影響。中濃度組（10?PFU/mL、10?PFU/mL）細(xì)胞的OD值分別為0.223±0.014和0.187±0.012，高濃度組（10?PFU/mL）細(xì)胞的OD值降至0.135±0.010。隨著病毒濃度的升高，OD值逐漸降低，不同濃度組之間差異顯著（P<0.05）。此時(shí)，高濃度病毒對細(xì)胞增殖的抑制作用已經(jīng)十分明顯，細(xì)胞增殖幾乎被完全抑制。感染后48小時(shí)，低濃度組細(xì)胞的OD值為0.356±0.018，雖然有所上升，但與對照組相比，仍處于較低水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中濃度組細(xì)胞的OD值分別為0.254±0.016和0.178±0.014，高濃度組細(xì)胞的OD值僅為0.089±0.008。與24小時(shí)時(shí)相比，各濃度組細(xì)胞的OD值增長幅度均較小，且隨著病毒濃度的增加，OD值增長受到的抑制作用更加顯著。這表明隨著感染時(shí)間的延長，減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)。到了感染后72小時(shí)，低濃度組細(xì)胞的OD值為0.423±0.020，增長緩慢，與對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。中濃度組細(xì)胞的OD值分別為0.298±0.018和0.195±0.015，高濃度組細(xì)胞的OD值幾乎沒有增長，僅為0.095±0.009。此時(shí)，高濃度病毒作用下的細(xì)胞幾乎停止增殖，中低濃度組細(xì)胞的增殖也受到了極大的抑制。從圖3中可以清晰地看出，隨著病毒濃度的增加和感染時(shí)間的延長，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖受到的抑制作用逐漸增強(qiáng)。病毒濃度越高，作用時(shí)間越長，細(xì)胞的OD值增長越緩慢，甚至出現(xiàn)停滯或下降的趨勢。這一結(jié)果充分表明減毒型溶瘤病毒能夠有效地抑制腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖，且具有明顯的劑量和時(shí)間依賴性。這種抑制作用可能是由于減毒型溶瘤病毒感染細(xì)胞后，干擾了細(xì)胞的正常代謝和增殖信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞無法進(jìn)行正常的分裂和增殖，從而達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。4.4誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況利用AnnexinV-FITC/PI雙染法，通過流式細(xì)胞儀檢測減毒型溶瘤病毒感染腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞48小時(shí)后的細(xì)胞凋亡情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以散點(diǎn)圖和柱狀圖的形式呈現(xiàn)，如圖4所示。在散點(diǎn)圖中，左下象限（Q4）代表活細(xì)胞，右下象限（Q3）代表早期凋亡細(xì)胞，右上象限（Q2）代表晚期凋亡細(xì)胞，左上象限（Q1）主要為壞死細(xì)胞。對照組腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的凋亡率較低，早期凋亡細(xì)胞比例為3.56%±0.89%，晚期凋亡細(xì)胞比例為2.12%±0.56%，總凋亡率為5.68%±1.23%。這表明在正常培養(yǎng)條件下，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)，凋亡發(fā)生較少。實(shí)驗(yàn)組中，隨著減毒型溶瘤病毒濃度的增加，細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢。在低濃度組（10?PFU/mL），早期凋亡細(xì)胞比例上升至7.89%±1.56%，晚期凋亡細(xì)胞比例為5.45%±1.23%，總凋亡率達(dá)到13.34%±2.56%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明低濃度的減毒型溶瘤病毒在48小時(shí)內(nèi)能夠誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞發(fā)生一定程度的凋亡。中濃度組（10?PFU/mL、10?PFU/mL）早期凋亡細(xì)胞比例分別為15.67%±2.34%和25.45%±3.12%，晚期凋亡細(xì)胞比例分別為10.23%±1.89%和18.98%±2.56%，總凋亡率分別為25.90%±3.56%和44.43%±4.56%。不同濃度組之間，細(xì)胞凋亡率差異顯著（P<0.05）。高濃度組（10?PFU/mL）早期凋亡細(xì)胞比例高達(dá)38.98%±4.23%，晚期凋亡細(xì)胞比例為26.78%±3.56%，總凋亡率達(dá)到65.76%±5.23%。從柱狀圖中可以更加直觀地看出，減毒型溶瘤病毒濃度與細(xì)胞凋亡率之間存在著顯著的正相關(guān)關(guān)系。病毒濃度越高，細(xì)胞凋亡率越高。這表明減毒型溶瘤病毒能夠有效地誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡，且這種誘導(dǎo)作用具有劑量依賴性。其可能的作用機(jī)制是減毒型溶瘤病毒感染腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后，激活了細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。隨著病毒濃度的增加，感染的細(xì)胞數(shù)量增多，凋亡信號通路被更廣泛地激活，從而導(dǎo)致更多的細(xì)胞發(fā)生凋亡。4.5作用機(jī)制相關(guān)分子表達(dá)變化為深入探究減毒型溶瘤病毒作用于腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分子機(jī)制，運(yùn)用Westernblot和RT-PCR技術(shù)，檢測了與細(xì)胞凋亡、增殖等相關(guān)的關(guān)鍵蛋白和基因的表達(dá)變化。Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，對比不同組中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9等蛋白的表達(dá)情況。對照組中，抗凋亡蛋白Bcl-2呈現(xiàn)較高水平的表達(dá)，其灰度值與內(nèi)參蛋白β-actin灰度值的比值為0.85±0.06。而促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)水平相對較低，Bax與β-actin的灰度比值為0.32±0.04，Caspase-3與β-actin的灰度比值為0.25±0.03，Caspase-9與β-actin的灰度比值為0.28±0.03。在實(shí)驗(yàn)組中，隨著減毒型溶瘤病毒濃度的增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平逐漸降低。在低濃度組（10?PFU/mL），Bcl-2與β-actin的灰度比值降至0.65±0.05，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中濃度組（10?PFU/mL、10?PFU/mL）Bcl-2的表達(dá)進(jìn)一步下降，灰度比值分別為0.42±0.04和0.28±0.03。高濃度組（10?PFU/mL）Bcl-2的表達(dá)水平極低，灰度比值僅為0.15±0.02。與此同時(shí)，Bax、Caspase-3、Caspase-9等促凋亡蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)。低濃度組中，Bax與β-actin的灰度比值上升至0.56±0.05，Caspase-3與β-actin的灰度比值為0.45±0.04，Caspase-9與β-actin的灰度比值為0.48±0.04。中濃度組和高濃度組中，這些促凋亡蛋白的表達(dá)繼續(xù)升高，在高濃度組中，Bax與β-actin的灰度比值達(dá)到0.89±0.06，Caspase-3與β-actin的灰度比值為0.76±0.05，Caspase-9與β-actin的灰度比值為0.78±0.05。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，以GAPDH作為內(nèi)參基因，分析不同組中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9等基因的表達(dá)變化。對照組中，Bcl-2基因的相對表達(dá)量為1.00±0.08，Bax基因的相對表達(dá)量為0.35±0.04，Caspase-3基因的相對表達(dá)量為0.28±0.03，Caspase-9基因的相對表達(dá)量為0.30±0.03。實(shí)驗(yàn)組中，隨著病毒濃度的增加，Bcl-2基因的表達(dá)逐漸受到抑制。低濃度組中，Bcl-2基因的相對表達(dá)量降至0.72±0.06，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中濃度組和高濃度組中，Bcl-2基因的表達(dá)進(jìn)一步降低，高濃度組中其相對表達(dá)量僅為0.20±0.02。而Bax、Caspase-3、Caspase-9等促凋亡基因的表達(dá)則顯著上調(diào)。低濃度組中，Bax基因的相對表達(dá)量上升至0.65±0.05，Caspase-3基因的相對表達(dá)量為0.55±0.04，Caspase-9基因的相對表達(dá)量為0.58±0.04。在高濃度組中，Bax基因的相對表達(dá)量達(dá)到1.56±0.08，Caspase-3基因的相對表達(dá)量為1.32±0.07，Caspase-9基因的相對表達(dá)量為1.35±0.07。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，減毒型溶瘤病毒可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9等蛋白和基因的表達(dá)，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡。Bcl-2作為抗凋亡蛋白，其表達(dá)的降低能夠減弱對細(xì)胞凋亡的抑制作用；而Bax、Caspase-3、Caspase-9等促凋亡蛋白和基因表達(dá)的上調(diào)，則促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Caspase-9是凋亡信號通路中的關(guān)鍵啟動(dòng)因子，它的激活能夠進(jìn)一步激活下游的Caspase-3，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。Bax可以通過與Bcl-2相互作用，改變線粒體的膜電位，促使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活Caspase-9，啟動(dòng)凋亡程序。減毒型溶瘤病毒感染腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后，可能通過影響這些蛋白和基因之間的相互作用，打破細(xì)胞內(nèi)的凋亡平衡，促使細(xì)胞走向凋亡，從而實(shí)現(xiàn)對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的殺傷作用。五、分析與討論5.1減毒型溶瘤病毒治療腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的效果分析本研究通過一系列體外實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地探究了減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有顯著的殺傷作用，且這種作用與病毒濃度和作用時(shí)間密切相關(guān)。從細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果來看，對照組腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞呈現(xiàn)典型的懸浮生長狀態(tài)，細(xì)胞球輪廓清晰，邊緣光滑，細(xì)胞之間緊密相連。而實(shí)驗(yàn)組在加入減毒型溶瘤病毒后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化。隨著病毒濃度的增加和作用時(shí)間的延長，細(xì)胞球逐漸解體，細(xì)胞從細(xì)胞球上脫落，形態(tài)變得不規(guī)則，出現(xiàn)皺縮、破裂等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這種細(xì)胞形態(tài)的改變直觀地表明了減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的破壞作用。在細(xì)胞存活率方面，對照組細(xì)胞存活率在整個(gè)觀察期內(nèi)保持相對穩(wěn)定。而實(shí)驗(yàn)組中，隨著病毒濃度的升高和作用時(shí)間的延長，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢。在感染后24小時(shí)，低濃度組（10?PFU/mL）細(xì)胞存活率就與對照組產(chǎn)生了顯著差異。隨著時(shí)間的推移，各濃度組細(xì)胞存活率均持續(xù)降低，高濃度組（10?PFU/mL）在72小時(shí)時(shí)幾乎檢測不到存活細(xì)胞。這一結(jié)果明確地證明了減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有強(qiáng)大的殺傷能力，且病毒濃度越高、作用時(shí)間越長，殺傷效果越明顯。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，對照組細(xì)胞呈現(xiàn)典型的對數(shù)增長趨勢。實(shí)驗(yàn)組中，不同濃度的減毒型溶瘤病毒均對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖產(chǎn)生了顯著的抑制作用。在感染后24小時(shí)，低濃度組細(xì)胞的增殖就受到了抑制，且隨著病毒濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)。隨著時(shí)間的延長，各濃度組細(xì)胞的增殖抑制作用更加顯著，高濃度組細(xì)胞幾乎停止增殖。這充分表明減毒型溶瘤病毒能夠有效地抑制腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖，且抑制作用具有劑量和時(shí)間依賴性。細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的治療效果。對照組腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的凋亡率較低。實(shí)驗(yàn)組中，隨著減毒型溶瘤病毒濃度的增加，細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢。在低濃度組（10?PFU/mL），細(xì)胞凋亡率就與對照組有顯著差異。中高濃度組細(xì)胞凋亡率更高，高濃度組（10?PFU/mL）總凋亡率達(dá)到65.76%±5.23%。這表明減毒型溶瘤病毒能夠有效地誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡，且誘導(dǎo)作用具有劑量依賴性。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得出結(jié)論：減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有顯著的治療效果，能夠有效地抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而殺傷腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。這種治療效果與病毒濃度和作用時(shí)間密切相關(guān)，病毒濃度越高、作用時(shí)間越長，治療效果越顯著。這一研究結(jié)果為減毒型溶瘤病毒在腦膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有望為腦膠質(zhì)瘤的治療開辟新的途徑。5.2作用機(jī)制探討依據(jù)分子機(jī)制檢測結(jié)果，減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的作用機(jī)制主要涉及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及對細(xì)胞增殖相關(guān)信號通路的影響。從誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面來看，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著減毒型溶瘤病毒濃度的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著降低，而促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)明顯上調(diào)。Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，其中Bcl-2是重要的抗凋亡成員，它能夠通過阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，抑制凋亡信號的傳遞，從而維持細(xì)胞的存活。而Bax則是促凋亡成員，它可以與Bcl-2相互作用，形成異二聚體，當(dāng)Bax的表達(dá)升高時(shí)，會(huì)打破Bcl-2與Bax之間的平衡，促使Bax寡聚化并插入線粒體膜，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而招募并激活Caspase-9。Caspase-9作為凋亡信號通路中的關(guān)鍵啟動(dòng)因子，能夠進(jìn)一步激活下游的Caspase-3，引發(fā)細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。Caspase-3被激活后，會(huì)切割一系列的底物蛋白，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，最終促使細(xì)胞凋亡。在本研究中，減毒型溶瘤病毒感染腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后，可能通過影響B(tài)cl-2家族蛋白之間的相互作用，調(diào)節(jié)線粒體途徑的凋亡信號通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這一過程中，減毒型溶瘤病毒可能通過其自身的基因表達(dá)產(chǎn)物或病毒感染引發(fā)的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，改變Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9等蛋白和基因的表達(dá)水平，促使細(xì)胞走向凋亡。在細(xì)胞增殖相關(guān)信號通路方面，雖然本研究未直接檢測具體的信號通路，但已有研究表明，溶瘤病毒感染腫瘤細(xì)胞后，可能會(huì)干擾多條與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的信號通路。例如，PI3K/Akt信號通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、代謝等過程中發(fā)揮著重要作用。正常情況下，PI3K被激活后，會(huì)將磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，能夠招募并激活A(yù)kt。Akt被激活后，會(huì)磷酸化下游的一系列底物，如mTOR、GSK-3β等，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。而溶瘤病毒感染腫瘤細(xì)胞后，可能會(huì)通過抑制PI3K的活性，減少PIP3的生成，從而抑制Akt的激活，阻斷細(xì)胞增殖信號的傳遞。溶瘤病毒還可能通過激活其他信號通路，如MAPK信號通路中的p38MAPK和JNK信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯或凋亡。p38MAPK和JNK信號通路在細(xì)胞受到應(yīng)激刺激時(shí)被激活，它們可以通過磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如ATF2、c-Jun等，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖和凋亡。減毒型溶瘤病毒感染腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后，可能通過激活這些信號通路，抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，減毒型溶瘤病毒還可能通過直接破壞腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)，干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，從而抑制細(xì)胞的增殖。減毒型溶瘤病毒對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的作用機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多個(gè)信號通路和分子機(jī)制的相互作用。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和基因