江黎明2021年10月第十四章BiochipTechnology第一節(jié)概述一、生物芯片的概念二、DNA芯片一、基因表達譜研究一、原位合成DNA芯片制作二、DNA微陣列芯片制作一、待測樣品的準備二、分子雜交反響三、檢測分析第二節(jié)生物芯片的制作第三節(jié)DNA芯片使用的根本流程第四節(jié)蛋白質(zhì)芯片第五節(jié)生物芯片的根本操作和流程二、DNA測序三、基因突變檢測四、基因診斷五、蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用六、藥物研發(fā)目錄*2

生物芯片將會改變生命科學(xué)的研究方式，革新醫(yī)學(xué)診斷和治療，極大地提高人口素質(zhì)和健康水平。第一節(jié)概述

薩瑟恩提出的核酸雜交理論，即標記的核酸分子能夠與被固化的與之互補配對的核酸分子雜交。（EdwinMellorSouthern）Southern雜交可以被看作是生物芯片的雛形。*5桑格和吉爾伯特創(chuàng)造了現(xiàn)在廣泛使用的DNA測序方法，并由此在1980年獲得了諾貝爾獎。（FrederickSanger）（WalterGilbert）*61989，Stephen

Fodor(斯蒂文·弗爾多)創(chuàng)造了高密度生物芯片和芯片閱讀器，為生物芯片產(chǎn)業(yè)開創(chuàng)及開展奠定了良好的根底。*71995，Stanford大學(xué)的P.Brown實驗室創(chuàng)造了第一塊以玻璃為載體的基因微矩陣芯片；將cDNA密集點樣在玻璃片上，進行基因表達譜研究和SNP分析。*8一、生物芯片的概念狹義的生物芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細胞芯片和組織芯片等。廣義的生物芯片還包括用于研制生物計算機的生物芯片、將健康細胞與電子集成電路結(jié)合起來的仿生芯片、縮微化的實驗室即芯片實驗室。*9生物芯片的根本原理與特征：“芯片〞特征：“分子雜交〞原理：生物分子間的相互特異識別作用〔如:DNA分子之間、蛋白分子之間、DNA與蛋白分子之間以及自組裝單分子膜之間等〕高通量、高集成、并行化、微型化、自動化、連續(xù)化*10根據(jù)芯片的用途可分為兩大類*11二、DNA芯片又被稱為基因芯片(genechips)、DNA陣列(DNAarray)、cDNA芯片(cDNAchips)、寡核苷酸陣列(oligonucleotidearray)等。DNA芯片是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量預(yù)先合成的DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物外表；使用時與標記的樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析從而得出樣品的遺傳信息。*12*13有此類產(chǎn)品研制能力的公司不多,如Affimetrix公司。〔一〕從支持物來分主要有：*143.微板型這種芯片實質(zhì)上是一種具有高密度、小容量測試孔的小型酶聯(lián)免疫檢測板〔如PE公司等〕。*15*16原位合成芯片DNA微陣列研發(fā)小組Affymatrix公司Fodor研究組斯坦福大學(xué)Brown實驗室制作方式原位化學(xué)合成收集探針，顯微打印探針類型寡核苷酸cDNA、基因片段、寡核苷酸、RNA等探針長度短，小于50nt較長，100~500nt或更長最高集成度10~40萬點陣/cm21~10萬點陣/cm2專利保護專利控制嚴格無專利控制〔二〕根據(jù)制作方式可分為兩大類：*17原位合成芯片(syntheticgenechip)DNA微集陣列(DNAmicroarray〕基因芯片的制作方式原位合成直接點樣分子印章法分子印章法針式點樣噴墨點樣壓電打印法*18第二節(jié)生物芯片的制作一、原位合成DNA芯片的制作支持物經(jīng)化學(xué)處理,外表活性羥基(OH)連接光敏保護基(X),選用光刻掩模(M1)保護非聚合部位；2.用激光點光源照射聚合部位,去除光敏保護基(X),暴露活性羥基(OH)；

4.更換掩模(M2)，激光點光源照射下一個位點；5.脫保護，偶聯(lián)第二個核苷酸(如dCMP)；6.重復(fù)上述步驟，直至合成完所需探針。*19合成過程光刻掩模1光刻掩模2(一)探針的設(shè)計與制備

DNA微集陣列探針可用人工合成寡核苷酸、基因組DNA或cDNA中的目的基因片段；可為雙鏈DNA、單鏈DNA或RNA，亦可用肽核酸(PNA)等。二.DNA微集陣列芯片的制作肽核酸(peptidenucleicacid,PNA)——PNA分子內(nèi)不會形成二級、三級結(jié)構(gòu)；DNA與PNA雜交不需要鹽離子。*21探針制備：探針的純化：探針的選擇：cDNA探針用于基因表達譜分析；寡核苷酸探針用于基因突變檢測。陽性對照陰性對照空白對照脫鹽、除酶及去除過剩的DNA等。DNA芯片探針實驗組探針對照組探針*22固相支持物分為實性材料和膜性材料兩類：最常用的玻片預(yù)處理方法：實性材料有硅芯片、玻片和瓷片等；膜性材料有聚丙烯膜、尼龍膜和硝酸纖維膜。(二)支持物的類型與預(yù)處理*23采用多聚賴氨酸包被，氨基硅烷化，醛基化等方法，使其外表衍生出氨基或醛基。1.噴墨打印將合成用探針溶液放入打印墨盒內(nèi)，由電腦依據(jù)預(yù)定的程序在xyz方向自動控制打印噴頭在芯片支持物上移動，并將特定的探針試劑噴印到特定位點。噴印上去的試劑即以固相合成原理與該處支持物發(fā)生偶聯(lián)反響。(三)探針的打印*241)玻璃片基的處理：使玻璃外表獲得羥基、醛基、氨基等活性基團；優(yōu)點：本錢低，操作簡單，密度高(幾十萬點cm2)，轉(zhuǎn)移過程中探針溶液損失小。2.針式打印缺點：定量準確性、重現(xiàn)性不好。2)點樣針沾取探針溶液；3)點樣針把探針點到玻片外表，讓探針末端的化學(xué)集團與玻片外表的集團形成共價鍵。*252202芯片點樣儀

生產(chǎn)商：Bio-Rad；性能介紹：分辨率：1.25um(x，y軸)和0.25um(Z軸)。

重復(fù)性：3um；球面精確性：l0um。一次制成芯片數(shù)：126塊芯片，每塊玻片點樣量>82,000個點。*26氨基修飾的玻片，可以一定能量的紫外線進行照射，使DNA探針中的胸腺嘧啶殘基，與支持物上帶正電的氨基形成共價鍵而固定在玻片外表；醛基修飾的玻片，可使氨基末端修飾探針的氨基，與玻片上的醛基形成Schiff堿，使DNA探針固定在玻片外表。(四)探針的固化*27

一、待測樣品的制備用PCR或反轉(zhuǎn)錄法標記時，可用熒光標記底物(dNTP)，

也可標記引物的5’末端。第三節(jié)DNA芯片使用的根本流程雙色熒光標記：待測樣品用Cy3；對照用Cy5。常用于標記的熒光分子有：Cy3、Cy5、FITC、TRITC

和生物素等。組織細胞或其他材料提取核酸純化純核酸核酸純化隨機引物延伸、PCR或反轉(zhuǎn)錄標記*28類型：固-液相雜交(固相：探針；液相：靶核酸)。特點：探針的數(shù)量>>

靶基因的數(shù)量反響動力學(xué)：呈線性關(guān)系信號強度∝

(樣品)靶基因的量空間位阻效應(yīng)：探針—靶分子；探針—探針2.雜交反響條件優(yōu)化PNA分子內(nèi)無帶負電荷的磷酸基團。1.芯片雜交的特點：3.Nnogen公司研制出的電子基因芯片。二、分子雜交反響*29檢測芯片熒光信號有兩類儀器：1、利用電荷偶合裝置檢測的攝像儀；2、激光共聚焦掃描儀。所謂激光共聚焦，是指激發(fā)光路和發(fā)射光路分別在兩個位置上聚焦。應(yīng)注意如何有效防止來自雜質(zhì)的熒光信號，提高信/噪比。三、檢測分析*30(入射)激光束發(fā)射光濾鏡檢測透鏡檢測器共聚焦針孔熒光束光束別離器(分光鏡)物鏡支持物由樣品發(fā)射的熒光圖14-4共聚焦掃描示意圖反光鏡樣品放大器數(shù)模轉(zhuǎn)換器計算機*31*32*33根本原理：蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子之間在空間構(gòu)象上能特異性的相互識別和相互結(jié)合。——又稱蛋白質(zhì)陣列(proteinarray)*34第四節(jié)蛋白質(zhì)芯片最常用的探針：抗體檢測方法：標記檢測法、直接檢測法4.不同的McAb可通過機械點涂方式固定在膜性載體外表.一、芯片的制作1.作為探針的多肽(或蛋白質(zhì))，可原位合成，也可

先合成后固化。2.蛋白質(zhì)芯片的載體常選擇膜性材料，如尼龍膜、NC膜、聚偏氟乙烯膜等。3.蛋白質(zhì)芯片的載體的處理方法與核酸芯片載體

相似。*351.待檢測樣品抗原從體液、組織細胞,或從cDNA表達文庫中提取多肽和蛋白質(zhì)。2.假設(shè)作蛋白質(zhì)組學(xué)研究，應(yīng)同時制備正常與病變組織的蛋白質(zhì)樣品。3.蛋白質(zhì)樣品的標記：采用熒光素(Cy3、Cy5)、放

射性同位素等，也可用酶標法標記。二、樣品的制備*361.標記的多肽樣品與探針之間的反響有：用激光掃描儀、磷光成像儀、質(zhì)譜儀、酶標儀等檢測后,再用相應(yīng)的軟件對獲得的信號分析。三、生化反響Ag+AbH+R[Ag-Ab][H-R]2.反響結(jié)束后即行洗脫。等等。四、檢測分析*37第五節(jié)生物芯片在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用一、基因差異表達譜分析*38二、DNA測序三、基因突變的檢測四、基因診斷五、藥物研究開發(fā)六、蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用一、DNA芯片與基因差異表達譜分析*39(一)探針的設(shè)計與芯片的制作(二)待測樣品核酸的提取、擴增與標記(三)雜交反響與雜交后清洗(四)掃描與分析(五)結(jié)果與討論

cDNA*40(一)探針的設(shè)計與芯片的制作1.探針的設(shè)計--寡核苷酸探針設(shè)計原那么(1)完全互補性：對目的基因或相關(guān)序列的保守區(qū)而言，PM

探針。(3)探針的豐度：針對靶基因序列設(shè)計多個(3個以上)寡核苷

酸探針。(2)高度特異性：對基因家族的某個成員或?qū)Σ煌锓N屬

的同一基因而言。(4)單堿基錯配：即設(shè)計MM(mis-match)探針：作內(nèi)參照(衡

量探針的特異性)。(5)設(shè)陽性對照：采用看家基因β-actin或GADPH基因作為陽性對照。*41離心2.探針的制備(細菌培養(yǎng)平板)cDNA文庫

挑取

cDNA克隆

擴增培養(yǎng)(液體培養(yǎng))PCR擴增擴增產(chǎn)物電泳(鑒定含靶序列的克隆)相應(yīng)的

PCR產(chǎn)物+

異丙醇打印加DMSO溶解

揮干乙醇70％乙醇洗滌取沉淀*42(1)玻片的清洗4.探針的打印與固化3.玻片的多聚-L-賴氨酸預(yù)處理(1)編輯打印程序、探針打印(2)紫外線照射(使探針與玻片交聯(lián)結(jié)合)(3)80℃烘干固定、室溫避光保存(2)用多聚-L-賴氨酸處理玻片NaOH乙醇浸泡振蕩至少2hr；雙蒸水反復(fù)漂洗。多聚-L-賴氨酸溶液浸泡振蕩15min~1hr；雙蒸水反復(fù)漂洗；離心、45℃枯燥。*43反轉(zhuǎn)錄熒光標記：組織或細胞抽提總RNA分離

mRNAAAA…AAA3’oligodT引物dNTP,RT-ase熒光標記dCTP或…SS-cDNATTTTTT5’(二)待測樣品核酸的提取、擴增與標記*44(Cy3為紅色,標記處理組；Cy5為綠色,標記對照組)后續(xù)步驟：1.終止反響降解模板(總RNA或mRNA)；2.過柱濾去游離的熒光核苷酸；3.洗脫、濃縮、真空枯燥獲取純化的核酸樣品；4.溶解(DEPC處理的水)成樣品液*45本卷須知：假設(shè)用Cy3-dCTP或Cy5-dCTP(分別標記2種樣品)，那么應(yīng)相應(yīng)調(diào)整其余3種dNTP的濃度。對同一種dNTP，既要參加熒光標記的，也要參加非標記的(如Cy3-dCTP與dCTP)，并調(diào)整兩者的比例，使雜交信號最強。不同來源的樣品分別用不同顏色的熒光素標記(Cy3為紅色,標記處理組；Cy5為綠色,標記對照組)，以便比較分析；*46芯片雜交與常規(guī)分子雜交相似，但探針不標記，而待測核酸(液相)標記。分析過程：預(yù)雜交雜交洗滌干燥檢測(掃描與分析)影響因素：探針堿基組成及其濃度靶核酸長度、堿基組成及其濃度溫度雜交液的組成條件設(shè)置：高離子強度、高樣品濃度、長時間、低溫度(雜交)(三)雜交反響與雜交后清洗*471.圖像分析將掃描得到的Cy3/Cy5文件通過劃格，確定陽性雜交點及其背景，過濾(減去)背景，得到基因表達的熒光信號強度(值)。通常用Cy3/Cy5熒光強度的比值來鑒別差異表達基因(多用平均值表示)。(四)掃描與分析*48(1)標準化處理將某些看家基因Cy3/Cy5熒光強度平均比值調(diào)節(jié)為1。(2)比值分析一般認為，Cy3/Cy5在范圍內(nèi)不存在顯著的差異表達基因；假設(shè)超出此范圍，那么存在差異表達基因。2.數(shù)據(jù)的標準化處理與分析*49(1)cDNA探針的質(zhì)量控制PCR產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳鑒定：應(yīng)顯示單一清晰條帶。(2)總RNA的提取與鑒定1)電泳鑒定：應(yīng)顯2條帶(18SrRNA及28SrRNA)；2)紫外吸收值測定：A260/A280均應(yīng)在之間。3.結(jié)果與討論*50(3)雜交結(jié)果的掃描與分析對照組(以綠色Cy5標記)，見圖14-6中的(1)所示每個探針3個點的陽性雜交信號均一性及3次實驗的重復(fù)性均較好?？瞻着c陰性對照均無信號或很弱,[圖(1)和圖(2)中倒1行第13-18個點及第7-12個點]圖(1)和圖(2)中倒1行第1-6個熒光點分別代表陽性參照GAPDH的Cy3和Cy5信號強度，且Cy3/Cy5=1.0處理組(以紅色Cy3標記)，見圖14-6中的(2)所示說明：探針是特異的，結(jié)果是可靠的。*51BiologicalSampleFunctionalInformation紅色表示上調(diào)；黃色表示不變；綠色表示下調(diào)(4)圖像重疊分析*52紅色Cy3標記處理組，綠色Cy5標記對照組用基因芯片檢測基因表達譜的過程*53小結(jié)只能對序列作重測序(resequencing)雜交測序(sequencingbyhybridization,SBH)是用DNA芯片上的探針與樣品核酸的靶序列進行分子雜交，再據(jù)雜交圖譜排列出靶DNA的堿基順序。舉例：二、DNA測序DNA芯片上原位合成8mer探針

{具48(65536)個點陣}12nt的靶序列雜交雜交圖譜*54〔一〕探針設(shè)計的疊瓦式策略(tilingstrategy)以突變區(qū)每個堿基為中心依次向左、右兩邊延伸，選取一定長度(15-25個堿基)的靶序列，合成與其互補的寡核苷酸片段作為野生型探針；然后將中央位點的堿基分別替換成其它三種堿基，得到3個突變型的探針。三、基因突變的檢測每組探針之間像疊瓦片一樣錯開一個堿基；N個堿基長度的突變區(qū)就需要N組探針，每組含1個野生型和3個突變型的探針；共獲4N個探針。然后以下一個位為中心，設(shè)計另一組探針。*55靶分子…GCAAACGAGTCAAAAGTCC野生型探針AC突變型探針GT以下一個位點為中A心設(shè)計另一組探針： C

GT對稱中心......................................................................................................................N組探針；4N個探針*56寡核苷酸探針設(shè)計、合成，在其末端加上10~15個堿基的polyT作為連接分子臂，分子臂末端進行氨基修飾，如加上氨基臂PO4(CH2)6NH2。玻片通常先采用氨基硅烷(3-氨丙基三甲氧基硅烷等)處理，再以1,4-苯二異硫氰酸鹽處理，使氨基轉(zhuǎn)化為具有可與氨基反響交聯(lián)的異硫氰酸基。將加有polyT分子臂和氨基臂PO4(CH2)6NH2的寡核苷酸探針在處理后的玻片上點樣、反響而牢固地